Name: Przygotowanie przemytych ludzkich płytek krwi do ilościowych badań przepływu metabolicznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj metodę izolacji metabolitów wewnątrzkomórkowych z przemytych ludzkich płytek krwi do badań metabolicznych. Protokół umożliwia analizę wpływu estrogenów na metabolizm płytek i ryzyko zakrzepowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr Emily Janus-Bell i Clarisse Mouriaux z laboratorium dr Pierre'a Mangina oraz Katrinie Bark z laboratorium dr Jorge DiPaoli za ich wskazówki i rady.

Badanie uzyskało zatwierdzenie Instytucjonalnej Rady Przeglądowej (Institutional Review Board) Uniwersytetu Kolorado w Medical Campus Anschutz. Od wszystkich uczestników badania uzyskano pisemną zgodę. Uczestnicy zgłosili, że nie spożywali alkoholu przez ostatnie 48 h ani nie przyjmowali niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) przez poprzednie dziesięć dni. Projekt ten jest finansowany przez Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi (National Heart, Lung, and Blood Institute) Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach dotacji numer R61HL141794.
1. Pobieranie krwi
<ol>
	<li>Przygotuj stanowisko do pobrania krwi. Zaleca się, aby krew pobierał wykwalifikowany flebotomista.</li>
	<li>Wykonaj wenipunkcję w zgięciu łokcia, używając igły 19 G.</li>
	<li>Pobierz pierwsze ~2 mL krwi do probówki próżniowej bez dodatków i zutylizuj ją. Ma to na celu usunięcie cząsteczek sygnałowych pochodzących z uszkodzonych komórek śródbłonka, które mogłyby aktywować płytki krwi. Po pobraniu początkowych 2 mL zdejmij stazę, aby zmniejszyć naprężenia ścinające oddziałujące na płytki krwi.</li>
	<li>Pobierz pozostałą krew do probówek próżniowych z cytrynianem dekstrozą antykoagulacyjną (ACD-A) w stosunku 14:3 (krew:ACD-A). Po pobraniu krwi delikatnie odwróć każdą probówkę, aby wymieszać krew z antykoagulantem.</li>
</ol>
2. Przemywanie płytek krwi
<img alt="Proces izolacji płytek krwi, schemat wirowania z prędkością obr. i etapami czasowymi, przebieg pracy laboratoryjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67639/67639fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Kolejne etapy wirowania i resuspensji stosowane podczas przemywania płytek krwi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67639/67639fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
UWAGA: Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. W przypadku ich powstania należy usunąć je za pomocą pipet transferowych, szczególnie przed wirowaniem. Przy każdym otwieraniu i zamykaniu probówek z krwią/płytkami zaleca się wydmuchanie powietrza do wnętrza probówki przed zamknięciem zakrętki w celu zwiększenia poziomu CO2.
<ol>
	<li>Podgrzej wirówkę do 37 °C aby ograniczyć wpływ temperatury. Pomiędzy poszczególnymi etapami wirowania w protokole należy utrzymywać temperaturę w wirówce na poziomie 37 °C.</li>
	<li>Podgrzej kąpiel wodną do 37 °CUmieść zmodyfikowany bufor Tyroda z glukozą w kąpieli wodnej. 
	UWAGA: zmodyfikowany przepis na bufor Tyrode’a znajduje się w Plik uzupełniający 1.</li>
	<li>Połączyć pobraną krew pełną ze wszystkich probówek typu vacutainer w 50 ml stożkowych probówkach z polipropylenu. Używając ściętej pod kątem końcówki pipety, odciąć ją w... 45° pod kątem, pobierz odpowiednią objętość próbki w celu przeprowadzenia zliczenia komórek (patrz Liczenie komórek).</li>
	<li>Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, ostrożnie odsysając je za pomocą pipety transferowej o wąskiej średnicy.</li>
	<li>Pozostawić krew w kąpieli wodnej na 25 minut w temperaturze 37 °C Pozwala to płytkom krwi w stanie odwracalnie aktywowanym (np. w wyniku pobrania z organizmu, przenoszenia z probówki do probówki itp.) na powrót do stanu spoczynku.</li>
	<li>Aby zapobiec aktywacji podczas wirowania, należy dodać 500 nM prostaglandyny I2 (PGI2) oraz 0,02 J/ml apirazy do krwi pełnej i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę raz. Usunąć wszelkie powstałe pęcherzyki powietrza za pomocą pipety transferowej o wąskim otworze. 
	UWAGA: Instrukcje dotyczące prawidłowego PGI2 a przepis na apyrazę znajduje się w Plik uzupełniający 1.</li>
	<li>Odwirować krew pełną w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego (PRP) (15 minut przy 250 x g) g dla 42 ml krwi pełnej) bez hamowania (37 °C).</li>
	<li>Ostrożnie przenieś PRP (górną żółtą warstwę powyżej warstwy leukocytów i erytrocytów) do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml, używając pipety transferowej z szerokim otworem.</li>
	<li>Podczas przenoszenia przechylić czystą probówkę stożkową i delikatnie spuścić PRP po ściance probówki. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Pozostaw około 3 mm PRP, aby uniknąć zaburzenia warstwy leukocytów (warstwy białych krwinek znajdującej się pomiędzy PRP a czerwonymi krwinkami). W przypadku jej zaburzenia w pipecie transferowej pojawi się nagły biały wir.</li>
	<li>Wykonaj odliczanie komórek (Patrz Liczenie płytek krwi) w celu ustalenia objętości resuspensji dla kolejnego etapu płukania.</li>
	<li>Pozostawić do odpoczynku na 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Za pomocą końcówki do pipety o ściętym wierzchołku pobierz próbkę do cytometrii przepływowej (patrz Cytometria przepływowa).</li>
	<li>Dodać 500 nM PGI2 oraz 0,02 U/mL apirazy do PRP i wymieszać, delikatnie odwracając probówkę raz.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 1000 x g g w 37 °C (przyspieszenie: 0, hamowanie: 0). Nie używać funkcji hamowania. Osad nie jest zwarty, a gwałtowne hamowanie może spowodować ponowne wymieszanie próbek. </li>
	<li>Podczas wirowania określ objętość resuspensji. Przyjmij 75% odzysku. Ustal gęstość komórek na około 3x105 komórki/μL.</li>
	<li>Odssać znad osadu główną objętość naddatku za pomocą plastikowej pipety transferowej o szerokim otwarze, a pozostałą ilość cieczy w pobliżu osadu – za pomocą pipety 1 ml (z nieociętą końcówką). Należy unikać dotykania osadu znajdującego się na dnie probówki.</li>
	<li>Dodać 500 nM PGI2 oraz 0,02 U/mL apirazy do zmodyfikowanego buforu Tyrode’a. Powoli dodać wyliczoną ilość buforu z kroku 16, spływając strużką po ściance probówki stożkowej.</li>
	<li>Używając końcówki z ściętym końcem oraz końcówki do pipety o pojemności 1 ml, należy delikatnie resuspendować osad, powoli pipetując go w górę i w dół kilka razy.
	<ol>
		<li>Ustaw objętość na 300 μLcałkowicie wcisnąć tłok, znajdując się powyżej poziomu cieczy, następnie umieścić pipetę w cieczy i zwolnić tłok do pierwszego stopnia. Pozwoli to badaczowi na resuspensję osadu bez przypadkowego wytworzenia pęcherzyków powietrza, które mogłyby aktywować płytki krwi.</li>
		<li>Czasami na spodzie osadu widoczny jest pierścień czerwonych krwinek. Należy unikać ich resuspensji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po resuspensji pelletu należy użyć pipety transferowej z szerokim otworem, aby przenieść resuspendowany pellet do nowej probówki stożkowej, pozostawiając wszelkie erytrocyty lub widocznie zagregowane komórki.</li>
	<li>Powtórz kroki 11–20. Pamiętaj o dodaniu 500 nM PGI.2 oraz 0,02 J/ml z nowej alikwoty do zmodyfikowanego buforu Tyrode'a (nie używać ponownie zmodyfikowanego buforu Tyrode'a z kroku 18), PGI2 jest zbyt niestabilny).</li>
	<li>Pobrać próbkę do zliczenia komórek. W razie potrzeby skorygować stężenie płytek krwi, używając zmodyfikowanego buforu Tyrode’a.</li>
	<li>Użyj końcówki do pipety z ukośnym ścięciem, aby pobrać próbkę do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Pozostawić płytki krwi do odpoczynku przez 1 h w temperaturze 37 °C aby umożliwić ustąpienie działania inhibitorów oraz pozwolić wszelkim odwracalnie aktywowanym płytkom krwi na powrót do stanu spoczynku.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać za pomocą pipety o szerokim wlocie. Pobrać próbki do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Wypłukane, spoczywające płytki krwi są teraz gotowe do analizy metabolicznej.</li>
</ol>
3. Liczenie płytek krwi
<ol>
	<li>Płytki krwi można policzyć za pomocą automatycznego analizatora krwi (zgodnie z instrukcjami producenta) lub hemocytometru33.</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Przygotowanie
	<ol>
		<li>Szczegółowe protokoły oraz przeglądy najlepszych praktyk dotyczących przygotowania mieszanin przeciwciał i konfiguracji cytometru przepływowego do pomiaru aktywacji płytek krwi można znaleźć w innych źródłach34,35.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek
	<ol>
		<li>Podczas pobierania próbki do cytometrii przepływowej należy zebrać zawiesinę płytek krwi za pomocą końcówki pipety o ściętym brzegu. Powoli dodać ją do probówki do mikrocentryfugi zawierającej przeciwciała, a następnie delikatnie uderzyć palcem w dno probówki, aby wymieszać zawartość. Inkubować przez 30 s.</li>
		<li>Używając końcówki pipety o ściętym brzegu, przenieść mieszaninę zawiesiny płytek krwi i przeciwciał do odpowiedniego dołka na płytce 96-dołkowej.</li>
		<li>Natychmiast dodać do dołka utrwalacz w celu utrwalenia komórek.</li>
		<li>Analizę na cytometrze przepływowym przeprowadzić w ciągu 8 h od utrwalenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testy wrażliwości na agonistę
	<ol>
		<li>Po przemyciu odstawić dwie stożkowate probówki o pojemności 15 mL: jedną dla kontroli spoczynkowej i jedną jako kontrolę aktywowaną trombiną.</li>
		<li>Delikatnie nalać 100 μL zawiesiny płytek krwi do każdej probówki stożkowej, używając końcówki pipety o ściętym brzegu. Pozostawić w temperaturze 37 °C na 1 h.</li>
		<li>Po godzinie odpoczynku dodać 0,1 U/mL trombiny do jednej probówki (instrukcje przygotowania trombiny znajdują się w Pliku uzupełniającym 1), a do drugiej nośnik. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 min.</li>
		<li>Pobrać próbkę z każdej probówki do analizy cytometrycznej, aby określić wrażliwość płytek krwi na agonistę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pobieranie próbek do ilościowej analizy strumieni metabolicznych
<ol>
	<li>Gaszenie (Quenching) 
	UWAGA: Gaszenie metabolizmu jest niezbędnym krokiem w celu dokładnego pomiaru strumieni metabolicznych. Szybkie schłodzenie komórek i utrzymanie ich temperatury w 4 °C lub poniżej spowalnia metabolizm na tyle, że można założyć, iż został on w zasadzie zatrzymany, dzięki czemu pobrane komórki dokładnie odzwierciedlają metabolizm komórek z całej populacji. Można zastosować różne metody, jednak aby zrównoważyć potrzebę szybkiego schłodzenia i zminimalizować wycieki, należy użyć zimnej (-4 °C) soli fizjologicznej36. Jeśli sól będzie zakłócać późniejszą analizę, można użyć innego płynu (mieszaniny metanol/woda, etanolu itp.)37.
	<ol>
		<li>Przygotować i zamrozić alikwoty soli fizjologicznej. Każdy alikwot soli powinien mieć objętość 6-krotnie większą niż pożądana objętość próbki. 
		UWAGA: przepis na sól fizjologiczną znajduje się w Supplementary File 1.</li>
		<li>Wstępnie schłodzić mikrocentryfugę do 0 °C.</li>
		<li>Zebrać zawiesinę płytek w częściowo zamrożonej soli fizjologicznej (&lt; -4 °C) w stosunku 1:6 (np. zebrać 150 μL zawiesiny płytek do 750 μL soli w probówkach do mikrocentryfugi).  
		UWAGA: Nie pozostawiać roztworu płytek i soli na lodzie przez więcej niż 15 min.</li>
		<li>Wirować przy 16,000 x g, 0 °C przez 10 min.</li>
		<li>Zachować nadsącz do analizy metabolitów zewnątrzkomórkowych, a osad do ekstrakcji i pomiaru metabolitów wewnątrzkomórkowych. Oba komponenty przechowywać w -20 °C do momentu analizy.</li>
		<li>Powtórzyć ten proces w wybranym odstępie czasu i dla określonej liczby punktów czasowych pobierania próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja metabolitów wewnątrzkomórkowych
	<ol>
		<li>Do zgaszonego osadu dodać 0,5 mL wstępnie schłodzonej mieszaniny metanol-woda (7:3) w temperaturze -20 °C. Intensywnie mieszać w wirówce typu vortex przez 1 min.</li>
		<li>Zamrozić w ciekłym azocie, rozmrozić w 0 °C, a następnie powtórzyć tę czynność w dwóch kolejnych cyklach.</li>
		<li>Wirować zawiesiny przy 16,000 x g przez 10 minut w -4 °C.</li>
		<li>Zebrać nadsącz do nowej probówki do mikrocentryfugi.</li>
		<li>Wykorzystując osad z kroku 3, powtórzyć protokół ekstrakcji (kroki 1-3) z użyciem mieszaniny metanol:woda (50:50). Dodać drugi zebrany ekstrakt do pierwszego. Suszyć przez noc.</li>
		<li>Resuspendować wysuszony ekstrakt w 150 µL wody klasy LC-MS (lub innego rozpuszczalnika odpowiedniego dla zamierzonej analizy). Mieszać przez 15 minut w 4 °C. Krótko wymieszać w wirówce typu vortex i przenieść do probówek do mikrocentryfugi z filtrem 0,22 μm w celu usunięcia szczątków komórkowych. Wirować przez 5 minut przy 16,000 x g i 4 °C.</li>
		<li>Wyjąć z wirówki, nanieść pipetą dodatkowe 50 μL wody optima na filtr i ponownie wirować (5 min, 16,000 x g i 4 °C), aby wypłukać filtr. Zebrać do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Isolating Quiescent Platelets for Metabolic Research

<ol><li>Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fundamentals+in+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">New fundamentals in hemostasis.</a> Physiol Rev. 93 (1), 327-358 (2013).</li>
<li>Webera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+platelet+aggregation+with+trap-6+and+collagen+in+platelet+aggregometry+in+patients+with+venous+thromboembolism%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced platelet aggregation with trap-6 and collagen in platelet aggregometry in patients with venous thromboembolism.</a> Thromb Res. 107, 325-328 (2002).</li>
<li>Herbert, J. M., Bernat, A., Maffrand, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+platelets+in+experimental+venous+thrombosis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Importance of platelets in experimental venous thrombosis in the rat.</a> Blood. 80 (9), 2281-2286 (1992).</li>
<li>Puurunen, M. K., Hwang, S. J., O'donnell, C. J., Tofler, G., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+function+as+a+risk+factor+for+venous+thromboembolism+in+the+framingham+heart+study%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet function as a risk factor for venous thromboembolism in the framingham heart study.</a> Thromb Res. 151, 57-62 (2017).</li>
<li>Montoro-Garcia, S., Schindewolf, M., Stanford, S., Larsen, O. H., Thiele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+platelets+in+venous+thromboembolism%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">The role of platelets in venous thromboembolism.</a> Semin Thromb Hemost. 42 (3), 242-251 (2016).</li>
<li>Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+and+platelets%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Thrombosis and platelets: An update.</a> Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2017).</li>
<li>Yeung, J., Li, W., Holinstat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+signaling+and+disease%3A+Targeted+therapy+for+thrombosis+and+other+related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Platelet signaling and disease: Targeted therapy for thrombosis and other related diseases.</a> Pharmacol Rev. 70 (3), 526-548 (2018).</li>
<li>Ferreiro, J. L., Gomez-Hospital, J. A., Angiolillo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+abnormalities+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diab+Vasc+Dis+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet abnormalities in diabetes mellitus.</a> Diab Vasc Dis Res. 7 (4), 251-259 (2010).</li>
<li>Buergy, D., Wenz, F., Groden, C., Brockmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-platelet+interaction+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor-platelet interaction in solid tumors.</a> Int J Cancer. 130 (12), 2747-2760 (2012).</li>
<li>Gkaliagkousi, E., Passacquale, G., Douma, S., Zamboulis, C., Ferro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+in+essential+hypertension%3A+Implications+for+antiplatelet+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Platelet activation in essential hypertension: Implications for antiplatelet treatment.</a> Am J Hypertens. 23 (3), 229-236 (2010).</li>
<li>Fidler, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+GLUT1+and+GLUT3+reveals+multiple+roles+for+glucose+metabolism+in+platelet+and+megakaryocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Deletion of GLUT1 and GLUT3 reveals multiple roles for glucose metabolism in platelet and megakaryocyte function.</a> Cell Rep. 20 (4), 881-894 (2017).</li>
<li>Fidler, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+is+required+for+platelet+hyperactivation+in+a+murine+model+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism is required for platelet hyperactivation in a murine model of type 1 diabetes.</a> Diabetes. 68 (5), 932-938 (2019).</li>
<li>Kulkarni, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+glycolysis+fuels+platelet+activation%3A+Small-molecule+modulators+of+platelet+metabolism+as+anti-thrombotic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Aerobic glycolysis fuels platelet activation: Small-molecule modulators of platelet metabolism as anti-thrombotic agents.</a> Haematologica. 104 (4), 806-818 (2019).</li>
<li>Ghatge, M., Flora, G. D., Nayak, M. K., Chauhan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+metabolic+profiling+reveals+glycolytic+and+1-carbon+metabolites+are+essential+for+gp+vi-stimulated+human+platelets-brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelet metabolic profiling reveals glycolytic and 1-carbon metabolites are essential for gp vi-stimulated human platelets-brief report.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (2), 409-416 (2024).</li>
<li>Ravera, S., Signorello, M. G., Panfoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+metabolic+flexibility%3A+A+matter+of+substrate+and+location%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Platelet metabolic flexibility: A matter of substrate and location.</a> Cells. 12 (13), (2023).</li>
<li>Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+preparation+for+function+testing+in+the+laboratory+and+clinic%3A+Historical+and+practical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects.</a> Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).</li>
<li>Mustard, J. F., Perry, D. W., Ardille, N. G., Packham, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+suspensions+of+washed+platelets+from+humans%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Preparation of suspensions of washed platelets from humans.</a> British Journal of Haematology. 22, 193-204 (1972).</li>
<li>Cazenave, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+washed+platelet+suspensions+from+human+and+rodent+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood.</a> Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).</li>
<li>Fine, K., Ashbrook, P., Brigden, L., Maldonado, J., Didishelm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-filtered+human+platelets.+Ultrastructure%2C+function%2C+and+role+of+proteins+in+inhibition+of+aggregation+by+aspirin%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Gel-filtered human platelets. Ultrastructure, function, and role of proteins in inhibition of aggregation by aspirin.</a> Am J Pathol. 84 (1), (1976).</li>
<li>Weiss, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+to+isolate+quiescent+washed+platelets+from+human+whole+blood+and+generate+platelet+releasate+under+clinical+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol to isolate quiescent washed platelets from human whole blood and generate platelet releasate under clinical conditions.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102150(2023).</li>
<li>Burzynski, L. C., Pugh, N., Clarke, M. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+isolation+and+activation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Platelet isolation and activation assays.</a> Bio Protoc. 9 (20), e3405(2019).</li>
<li>Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection%2C+platelet+isolation+and+measurement+of+platelet+count+and+size+in+mice-a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide.</a> Platelets. 30 (6), 698-707 (2018).</li>
<li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+platelets+from+mouse+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of platelets from mouse blood.</a> J Vis Exp. (147), (2019).</li>
<li>Aibibula, M., Naseem, K. M., Sturmey, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+and+metabolic+flexibility+in+blood+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism and metabolic flexibility in blood platelets.</a> J Thromb Haemost. 16 (11), 2300-2314 (2018).</li>
<li>Ravi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+plasticity+in+resting+and+thrombin-activated+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metabolic plasticity in resting and thrombin-activated platelets.</a> PLoS One. 10 (4), e0123597(2015).</li>
<li>Nayak, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+inhibitor+of+pyruvate+dehydrogenase+kinases%2C+inhibits+platelet+aggregation+and+arterial+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">an inhibitor of pyruvate dehydrogenase kinases, inhibits platelet aggregation and arterial thrombosis.</a> Blood Advances. 2, (2018).</li>
<li>Hadley, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormones%2C+age%2C+and+sex+affect+platelet+responsiveness+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Hormones, age, and sex affect platelet responsiveness in vitro.</a> Transfusion. 62 (9), 1882-1893 (2022).</li>
<li>Paglia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+metabolomic+study+of+platelets+reveals+the+expression+of+discrete+metabolic+phenotypes+during+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Comprehensive metabolomic study of platelets reveals the expression of discrete metabolic phenotypes during storage.</a> Transfusion. 54 (11), 2911-2923 (2014).</li>
<li>Sake, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopically+nonstationary+%2813%29c+metabolic+flux+analysis+in+resting+and+activated+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Isotopically nonstationary (13)c metabolic flux analysis in resting and activated human platelets.</a> Metab Eng. 69, 313-322 (2022).</li>
<li>Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+metabolic+flux+analysis+in+metabolic+engineering%3A+Methods%2C+tools+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">A guide to metabolic flux analysis in metabolic engineering: Methods, tools and applications.</a> Metab Eng. 63, 2-12 (2021).</li>
<li>Larsen, M. T., Kuhlmann, M., Hvam, M. L., Howard, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin-based+drug+delivery%3A+Harnessing+nature+to+cure+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Albumin-based drug delivery: Harnessing nature to cure disease.</a> Mol Cell Ther. 4 (3), (2016).</li>
<li>Balduini, C. L., Noris, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((latelet+count+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">latelet count and aging.</a> Haematologica. 9 (6), 953-955 (2014).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Using+a+hemacytometer+to+count+cells%22">Using a hemacytometer to count cells</a>. , (2023).</li>
<li>Spurgeon, B. E. J., Naseem, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+flow+cytometry%3A+Instrument+setup%2C+controls%2C+and+panel+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin+Cytom%22%5BJournal%5D)">Platelet flow cytometry: Instrument setup, controls, and panel performance.</a> Cytometry B Clin Cytom. 98 (1), 19-27 (2020).</li>
<li>Van Velzen, J. F., Laros-Van Gorkom, B. A., Pop, G. A., Van Heerde, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+flow+cytometry+for+evaluation+of+platelet+surface+antigens+and+activation+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Multicolor flow cytometry for evaluation of platelet surface antigens and activation markers.</a> Thromb Res. 130 (1), 92-98 (2012).</li>
<li>Sake, C. L., Newman, D. M., Boyle, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quenching+methods+for+metabolite+recovery+in+photoautotrophic+synechococcus+sp.+Pcc+7002%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quenching methods for metabolite recovery in photoautotrophic synechococcus sp. Pcc 7002.</a> Biotechnol Prog. 36 (5), e3015(2020).</li>
<li>Sapcariu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+extraction+of+proteins+and+metabolites+from+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Simultaneous extraction of proteins and metabolites from cells in culture.</a> MethodsX. 1, 74-80 (2014).</li>
<li>Rana, A., Westein, E., Niego, B., Hagemeyer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-dependent+platelet+aggregation%3A+Mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Shear-dependent platelet aggregation: Mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Front Cardiovasc Med. 6, 141(2019).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+shear-induced+platelet+activation%3A+High+shear+stresses+for+short+exposure+time%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Quantification of shear-induced platelet activation: High shear stresses for short exposure time.</a> Artif Organs. 39 (7), 576-583 (2015).</li>
<li>Ardlie, N., Perry, D., Packham, M., Mustard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+apyrase+on+stability+of+suspensions+of+washed+rabbit+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), (1971).</li>
<li>Rao, G. H. R., Reddy, K. R., Hagert, K., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ph+on+the+prostacyclin+%28pg12%29+mediated+inhibition+of+platelet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Medicine%22%5BJournal%5D)">Influence of ph on the prostacyclin (pg12) mediated inhibition of platelet function.</a> Prostaglandins Medicine. 4, 263-273 (1980).</li>
<li>Navred, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+flow+cytometric+method+for+detection+of+inherited+platelet+disorders-a+comparison+to+the+gold+standard+light+transmission+aggregometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A simplified flow cytometric method for detection of inherited platelet disorders-a comparison to the gold standard light transmission aggregometry.</a> PLoS One. 14 (1), e0211130(2019).</li>
<li>Aldrighi, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+status+decreases+after+menopause%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Platelet activation status decreases after menopause.</a> Gynecol Endocrinol. 20 (5), 249-257 (2005).</li>
<li>Bausset, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+storage+of+platelet-rich+plasma+homemade+product%5BTitle%5D)+AND+%22Biores+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Formulation and storage of platelet-rich plasma homemade product.</a> Biores Open Access. 1 (3), 115-123 (2012).</li>
<li>Nayak, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+enzyme+pyruvate+kinase+m2+regulates+platelet+function+and+arterial+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The metabolic enzyme pyruvate kinase m2 regulates platelet function and arterial thrombosis.</a> Blood. 137 (12), 1658-1668 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zgłoszenia konfliktu interesów.

Płytki krwi są bardzo wrażliwe na środowisko, w tym na naprężenia ścinające i obecność agonistów38,39. To sprawia, że płytki krwi są trudne do opanowania i izolacji, co sprawia, że stosowanie inhibitorów i pipet o szerokim otworze ma kluczowe znaczenie40. Właściwe przechowywanie i przygotowanie ChOG2 ma zasadnicze znaczenie, ponieważ nieprzygotowanie PGI2 w podstawowym PBS spowoduje szybką degradację PGI2<s...

Płytki krwi to małe (2-4 μm średnicy), bezjądrzaste komórki, które odgrywają ważną rolę w hemostazie, ściśle regulowanym procesie tworzenia skrzepów1. Chociaż płytki krwi są niezbędne dla integralności naczyń krwionośnych, są również zaangażowane w niepożądane zdarzenia zdrowotne. Płytki krwi biorą udział w zakrzepicy żył głębokich (DVT) i zakrzepicy tętniczej (AT), które są skrzepami, które zamykają naczynia krwionośne, prowadząc do miejscowego zmniejszenia dopływu krwi lub, jeśli kawałki skrzepu oderwą się (zatorują), mogą blokować dopływ krwi do płuc, serca lub mózgu2,3,4,5,6,7. Nadreaktywność płytek krwi to choroba współistniejąca z nadciśnieniem, cukrzycą i rakiem, prowadząca do zwiększonej częstości występowania zakrzepicy żył głębokich i AT8,9,10. Aktywacja i metabolizm płytek krwi są ze sobą ściśle powiązane11,12, co prowadzi do wzrostu zainteresowania metabolizmem płytek krwi jako strategią terapeutyczną13,14. Toczy się dyskusja na temat dokładnego przeprogramowania metabolicznego, które następuje po aktywacji, a jest to aktywna dziedzina nauki15. To zwiększone zainteresowanie dysfunkcją płytek krwi w chorobie i jej powiązaniami z metabolizmem podkreśla potrzebę powtarzalnej metody izolowania płytek krwi i badania ich metabolizmu.
Ludzkie płytki krwi są zazwyczaj uzyskiwane przez nakłucie żyły, a następnie izolowane z krwi pełnej. Umyte płytki krwi są oddzielane od pełnej krwi poprzez kolejne etapy płukania i wirowania16. Zostało to pierwotnie zrobione przez grupę Mustarda 17 i nieznacznie zmodyfikowane przez grupę Cazenave'a group18. Inną alternatywą są płytki krwi z filtrem żelowym, które można uzyskać z osocza bogatopłytkowego (PRP) za pomocą chromatografii wykluczania wielkości przy użyciu wypełnionej kolumny kulek żelu agarozowego19. Istnieje wiele protokołów mycia zarówno krwi ludzkiej, jak i gryzoniowej i są zoptymalizowane pod kątem różnych testów20,21,22,23, ale nie do pomiaru metabolizmu płytek krwi.
Techniki badania metabolizmu płytek krwi obejmują pomiary bioenergetyczne za pomocą analizatora Seahorse XF11,24,25,26,27, pomiary strumienia zewnątrzkomórkowego11,13,24, metabolomika14,28, oraz analiza strumienia metabolicznego wspomagana izotopami (13C-MFA)29. W badaniach metabolomicznych celem jest zazwyczaj określenie zmienionych szlaków między dwoma różnymi stanami (na przykład spoczynkowe a aktywowane płytki krwi14). Badania metabolomiczne obejmują zastosowanie chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS). Badania te można przeprowadzić dla metabolitów wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowych i często są one sprzężone z analizą szlaku lub analizą głównych składowych (PCA)14,28. Analiza strumienia metabolicznego wspomagana izotopami (13C-MFA) polega na podawaniu komórkom znakowanego substratu znanego jako znacznik i mierzeniu, w jaki sposób ten znacznik rozprzestrzenia się w sieci reakcyjnej z LC-MS. Technika ta pozwala na obliczanie strumieni przez szlaki metaboliczne z rozdzielczością poziomu reakcji29,30. W krwi pełnej i osoczu bogatopłytkowym (PRP) stężenie paliwa (glukozy, glutaminy, octanu itp.) podlega zmienności między dawcami, a albumina i globulina wiążąca hormony płciowe obecne w osoczu mogą zmieniać aktywne stężenie hormonów, leków i innych biologicznie istotnych cząsteczek31. Płukane płytki krwi oferują metodę zawieszania płytek krwi w środowisku zdefiniowanym przez użytkownika, w tym o znanych stężeniach paliwa, która jest zgodna z 13C-MFA32.
Opisana tutaj jest metoda mycia płytek krwi w celu wytworzenia płytek krwi, które mogą być użyte w testach metabolicznych. W protokole powstają płytki krwi w stanie spoczynku z niskim zanieczyszczeniem krwinek czerwonych i krwinek białych. Stan aktywacji płytek krwi monitorowano za pomocą cytometrii przepływowej markerów aktywacji płytek krwi. Protokół ten w sposób powtarzalny osiąga co najmniej 30%-40% regeneracji płytek krwi w stosunku do liczby płytek krwi we krwi pełnej. Przemyte płytki krwi uzyskane tą techniką nadają się do technik analizy metabolicznej, a wewnątrzkomórkowa metoda ekstrakcji metabolitów może być dostosowana do analizy wybranej przez użytkownika (LC-MS, GC-MS, test fotometryczny itp.).

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; Filtr M Probówki Spin-X</td><td>Millapore-Sigma</td><td>CLS8160</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Igła 19 G x 3/4"</td><td>Flebotomia</td><td>McKesson</td><td>448406</td> Corporation</tr><tr><td>21 G Igła 1,5 cala z blokadą luer Amazon</td><td></td><td>B0C39PJD23</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa, półpowierzchniowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>675101</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Vaccutainery ACD-A&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>364606</td> Adapter <td>do flebotomii</td></tr><tr><td></td><td>McKesson Corporation</td><td>609</td><td></td></tr><tr><td>Wacik nasączony alkoholem</td> do flebotomii <td>VWR</td><td>15648-916</td><td>Flebotomia</td></tr><tr><td>Apiraza z ziemniaków</td><td>Sigma</td><td>A6410-100UN</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>CD42a Przeciwciało monoklonalne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-0428-42</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Chłodzony Mikrowirówka&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002441</td><td>Quenching</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>FITC Przeciwciało anty-fibrynogenowe</td><td>Abcam</td><td>4217</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Cytometr</td><td>przepływowy Beckman Coulter</td><td>82922828</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Gaza</td><td>VWR</td><td>76049-110</td><td>Flebotomia</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Ludzka alfa-trombina</td><td>Prolytix</td><td>HCT-0020</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>VWR</td><td>87003-292</td><td>Ogólne</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Pipeta do przenoszenia o wąskim otworze</td><td>VWR</td><td>16001-176</td><td>Mycie płytek krwi</td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>PECy5 Mysz Anti-Human CD62P</td><td>BD Pharmingen</td><td>551142</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Pokrywa płytki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0626</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe z polipropylenu 15 ml</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Polipropylen 50 ml probówki stożkowe</td><td>VWR</td><td>352070</td><td>Mycie płytek krwi</td></tr><tr><td>Prostaglandyna I2 (sól sodowa)</td> <td>Cayman Chemical</td><td>18220</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>SKC Inc. C-Chip Jednorazowe hemocytometry</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td> Strzykawka <td>do liczenia komórek</td></tr><tr><td></td><td>BD Pharmingen</td><td>14-823-41</td><td>Przygotowanie</td></tr> <tr><td>odczynnikaOpaska uciskowa</td><td>VWR</td><td>76235-371</td><td>Flebotomia</td></tr><tr><td>Vacutainer Uchwyt na igłę</td><td>BD</td><td>364815</td><td>Flebotomia</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>102091-234</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td>Mycie płytek</td></tr><tr><td>krwi Pipeta transferowa o szerokim otworze</td><td>VWR</td><td>76285-362</td><td>Mycie płytek krwi</td></tr></tbody></table>

przygotowanie przemytych ludzkich płytek krwi do ilościowych badań przepływu metabolicznego

Preparation of Washed Human Platelets for Quantitative Metabolic Flux Studies

Płytki krwi to komórki krwi, które odgrywają integralną rolę w hemostazie i wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Nadpobudliwość i hipoczynność płytek krwi są związane z zaburzeniami metabolicznymi, zwiększając ryzyko zarówno zakrzepicy, jak i krwawienia. Aktywacja płytek krwi i metabolizm są ze sobą ściśle powiązane, przy czym istnieje wiele metod pomiaru tych pierwszych, ale stosunkowo niewiele w przypadku tych drugich. Aby zbadać metabolizm płytek krwi bez ingerencji innych komórek krwi i składników osocza, płytki krwi muszą być izolowane, co nie jest trywialne ze względu na wrażliwość na ścinanie płytek krwi i zdolność do nieodwracalnej aktywacji. Przedstawiono protokół izolacji (przemywania płytek krwi), w wyniku którego powstają płytki krwi w stanie spoczynku, wrażliwe na stymulację przez agonistów płytek krwi. Kolejne etapy wirowania z dodatkiem inhibitorów płytek krwi stosuje się w celu wyizolowania płytek krwi z krwi pełnej i ponownego ich zawieszenia w kontrolowanym, izosmotycznym buforze. Ta metoda w sposób powtarzalny zapewnia 30%-40% odzysk płytek krwi z krwi pełnej przy niskiej aktywacji, mierzonej za pomocą markerów wydzielania ziarnistości i aktywności integryny. Liczba płytek krwi i stężenie paliwa mogą być precyzyjnie kontrolowane, aby umożliwić użytkownikowi badanie różnych sytuacji metabolicznych.

Reprezentatywne wyniki na Rysunku 2 przedstawiają 6 różnych dawców krwi, w tym 3 mężczyzn i 3 kobiety. Wydajność otrzymywania płytek krwi w stosunku do krwi pełnej pokazano na Rysunku 2A. Ostateczna odzyskalność płytek wynosiła średnio 52% ± 3% (odchylenie standardowe, n=6). Końcową liczbę płytek w stosunku do zanieczyszczenia leukocytami zmierzono za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego. Liczba leukocytów stanowiła mniej niż 0,1% wszystkich komóre...

Metabolizm płytek krwi jest interesujący, szczególnie w odniesieniu do roli nadmiernej i hipoaktywności płytek krwi w krwawieniach i zaburzeniach zakrzepowych. Izolowanie płytek krwi z osocza jest konieczne w przypadku niektórych testów metabolicznych; Przedstawiono metodę izolacji metabolitów wewnątrzkomórkowych z przemytych płytek krwi.

Przygotowanie przemytych ludzkich płytek krwi do ilościowych badań przepływu metabolicznego

Platelets are blood cells that play an integral role in hemostasis and the innate immune response. Platelet hyper- and hypoactivity have been implicated ...

Badałem wpływ ostrej ekspozycji na estrogen na centralny metabolizm węgla w płytkach krwi oraz płytki krwi w spoczynku i aktywowane trombiną. Próbujemy ustalić, czy ostra ekspozycja na estrogeny na płytki krwi przyczynia się do wzrostu ryzyka zakrzepicy związanego ze stosowaniem doustnych środków antykoncepcyjnych. Badania nad zdrowiem kobiet są w dużej mierze niedofinansowane.Projekt ten był częścią szerszego wezwania NIH do zajęcia się lukami w wiedzy na temat zdrowia kobiet. Pomimo tego, że środki antykoncepcyjne są dostępne od ponad 50 lat, nadal nie znamy dokładnego mechanizmu, który powoduje wyższe ryzyko zakrzepu. Zmienność biologiczna.Tradycyjne techniki hodowli komórkowej nie mają zastosowania do płytek krwi, co oznacza, że płytki krwi pochodzą od dawców o różnych genotypach. Potrzebne są duże rozmiary próbek, co podkreśla potrzebę powtarzalnej procedury izolacji płytek krwi. Istniejące protokoły płukania płytek krwi są pisane dla ekspertów w dziedzinie biologii płytek krwi.Istnieje wiele unikalnych wyzwań związanych z pracą nad płytkami krwi, które mój protokół podkreśla dla początkujących badaczy płytek krwi. Na początek podgrzej łaźnię wodną do 37 stopni Celsjusza i umieść w niej zmodyfikowany bufor Tyrode'a zawierający glukozę. Połącz pełną krew pobraną ze wszystkich wakutainerów w 50-mililitrowej stożkowej probówce polipropylenowej.Za pomocą końcówki do pipet ze skosem pobrana próbka o odpowiedniej objętości w celu zliczenia komórek. Ostrożnie zassać pipetą o wąskim otworze, aby usunąć powstałe pęcherzyki. Następnie pozwól krwi odpocząć w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 25 minut.Aby zapobiec aktywacji podczas wirowania, dodaj prostaglandynę I2 i apyrazę do krwi pełnej i odwróć probówkę raz, aby wymieszać próbkę. Następnie odwiruj krew pełną o masie 250G przez 15 minut bez przerwy w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zbierz PRP, który pojawia się jako górna żółta warstwa nad kożuchową sierścią i czerwoną warstwą krwi, do nowej, pochylonej 50-mililitrowej stożkowej rurki wzdłuż ściany.Pozwól PRP odpocząć przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji wymieszaj PRP z 500 nanomolowymi prostaglandynami I2 i 0,02 jednostki na mililitr apirazy. Odwirować mieszaninę o sile 1 000 G przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez przyspieszenia i bez przerwy.Teraz za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia o szerokim otworze odessaj supernatant do objętości masowej, a następnie użyj jednomililitrowej pipety z nieodciętą końcówką, aby zassać pozostałą ciecz w pobliżu granulki. Następnie dodaj prostaglandynę I2 i bufor Tyrode zawierający apirazę do granulki, po boku stożkowej rurki. Używając końcówki ze skosem i jednomililitrowej końcówki do pipety, delikatnie ponownie zawiesić granulkę kilka razy.Po ponownym zawieszeniu osadu użyj pipety do przenoszenia o szerokim otworze, aby przenieść go do nowej stożkowej rurki, pozostawiając wszelkie czerwone krwinki lub widocznie zlepione komórki. Następnie należy pobrać próbkę do cytometrii przepływowej za pomocą końcówki pipety ze skosem ściętym. Resztę płytek krwi inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby inhibitory mogły się zużyć.Po inkubacji delikatnie wymieszać próbkę pipetą o szerokim otworze i podzielić próbki na porcje do cytometrii przepływowej. Średni odzysk płytek krwi z krwi pełnej wynosił około 52%, przy czym zanieczyszczenie białych krwinek pozostało poniżej 0,1% po procesie mycia. Ekspozycja na selektynę P była niska przez cały proces mycia, ale znacznie wzrosła po leczeniu trombiną.Poziomy związanego fibrynogenu początkowo wzrosły po pierwszym spinie 1000G, ale spadły poniżej 5% po drugim spinie, ponownie znacznie wzrastając po leczeniu trombiną. Płytki krwi z powodzeniem bramkowano pod kątem wielkości, singletów i dodatniego wyniku CD42a przed pomiarem markerów aktywacji. Leczenie trombiną prowadziło do znacznego wzrostu ekspresji selektyny P i fibrynogenu w porównaniu z grupą kontrolną.Na początek pobierz umyte płytki krwi z próbek krwi ludzkiej. Po wstępnym schłodzeniu mikrowirówki do zera stopni Celsjusza, zawiesinę płytek krwi zebrać w częściowo zamrożonym roztworze soli fizjologicznej w stosunku 1:6. Odwirować mieszaninę w temperaturze 16 000 G przez 10 minut w temperaturze zero stopni Celsjusza.Odessać supernatant do oddzielnej probówki do mikrowirówki. Następnie dodaj 0,5 mililitra wstępnie schłodzonego metanolu: wody o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do ugaszonego granulatu i energicznie wiruj przez jedną minutę. Próbkę zamrozić w ciekłym azocie i rozmrozić w temperaturze zero stopni Celsjusza.Zawiesinę należy ponownie odwirować w temperaturze 16 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant w nowej probówce do mikrowirówki. Po wysuszeniu supernatantu przez noc, suchy ekstrakt należy ponownie zawiesić w 150 mikrolitrach wody klasy LC/MS i mieszać przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Krótko przemieszaj i przenieś ekstrakt do probówki mikrowirówkowej o średnicy 0,22 mikrometra, aby usunąć resztki komórek.Odwirowywać próbkę przez pięć minut w temperaturze 16 000 G i czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu odpipetować dodatkowe 50 mikrolitrów wody na filtr i ponownie wirować przez pięć minut w temperaturze 16 000 G i czterech stopniach Celsjusza. Na koniec zebrać filtrat do analizy.Produkcja mleczanu była dodatnia we wszystkich próbkach dawców, podczas gdy glukoza i octan były konsekwentnie spożywane, przy czym trombina zwiększała te strumienie.

preparation-washed-human-platelets-for-quantitative-metabolic-flux

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje technikę różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi. Hematopoetyczne komórki progenitorowe macierzyste — wyizolowane z ludzkiej krwi pępowinowej — różnicują się w dojrzałe megakariocyty w obecności trombopoetyny. Dojrzałe megakariocyty wytwarzają cytoplazmatyczne rozszerzenia zwane propłytkami, które dają początek pojedynczym płytkom krwi.

Metoda in vitro do różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Ten film pokazuje analizę mętnościową w celu oceny indukowanej kolagenem agregacji płytek krwi w wstępnie potraktowanych, umytych ludzkich płytkach krwi. Studzienki kontrolne wykazują agregację indukowaną kolagenem, podczas gdy wysokie stężenie inhibitorów blokuje kanały Pannexin-1, hamując w ten sposób agregację płytek krwi indukowaną kolagenem, widoczną niezmienionym zmętnieniem.

Analiza turbidymetryczna w celu monitorowania indukowanej kolagenem agregacji wstępnie leczonych ludzkich płytek krwi

Leukocyty krwi i płytki krwi mogą być używane jako marker ogólnego zdrowia bioenergetycznego danej osoby, a więc mają potencjał do monitorowania procesów patologicznych i wpływu leczenia. Tutaj opisujemy metodę izolacji i pomiaru funkcji mitochondriów oraz wybuchu oksydacyjnego w tych komórkach.

Bioenergetyka i wybuch oksydacyjny: protokoły izolacji i oceny ludzkich leukocytów i płytek krwi

Tutaj pokazujemy, że izolowane ludzkie płytki krwi mogą być używane jako dostępny model ex vivo do badania adaptacji metabolicznych w odpowiedzi na inhibitor kompleksu I rotenon. Podejście to wykorzystuje śledzenie izotopowe i względną kwantyfikację za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas i może być stosowane w różnych projektach badawczych.

Analiza LC-MS ludzkich płytek krwi jako platforma do badania metabolizmu mitochondrialnego

Opisujemy prostą metodę izolacji umytych płytek krwi od ludzkiej krwi, a następnie pomiary agregacji płytek krwi wywołanej przez agonistę za pomocą mętności. Jako przykład stosujemy tę metodę do badania odpowiedzi agregacyjnej ludzkich płytek krwi na kolagen po wstępnej inkubacji z inhibitorem kanału Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Zmętnienie na ludzkich płukanych płytkach krwi: wpływ inhibitora pannexin1 Brilliant Blue FCF na agregację indukowaną kolagenem

Ta praca opisuje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania adhezji, rozprzestrzeniania się i wydzielania płytek krwi pod przepływem. Ta wszechstronna platforma umożliwia badanie funkcji płytek krwi w badaniach mechanistycznych nad zakrzepicą i hemostazą.

Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

W tym artykule opisujemy metodę oceny śródbłonkowego uwalniania czynnika von Willebranda i późniejszego wychwytywania płytek krwi pod wpływem stresu ścinającego płyn w odpowiedzi na bodźce zapalne za pomocą systemu komór przepływowych in vitro.

Badanie patofizjologii czynnika von Willebranda przy użyciu modelu komory przepływowej tworzenia się czynnika von Willebranda i sznurka płytkowego

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Tutaj krew myszy została pobrana w obecności antykoagulantu. Płytki krwi oczyszczono za pomocą pożywki gradientowej joheksolu przy użyciu wirowania z niską prędkością. Płytki krwi aktywowano trombiną w celu zbadania, czy są one zdolne do życia. Jakość oczyszczonych płytek krwi analizowano za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii.

Oczyszczanie płytek krwi z krwi myszy

Tworzenie się płytek krwi z prokoagulantem jest skorelowane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Przedstawiono dokładny protokół izolacji przemytych płytek krwi od krwi ludzkiej, mający na celu ilościowe określenie ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które są charakterystycznymi cechami płytek krwi prokoagulantu.

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Poznaj metodę izolacji metabolitów wewnątrzkomórkowych z przemytych ludzkich płytek krwi do badań metabolicznych. Protokół umożliwia analizę wpływu estrogenów na metabolizm płytek i ryzyko zakrzepowe.

Przygotowanie przemytych ludzkich płytek krwi do ilościowych badań przepływu metabolicznego

Przeglądaj więcej filmów