Przygotowanie przemytych ludzkich płytek krwi do ilościowych badań przepływu metabolicznego
10 stycznia 2025
Metabolizm płytek krwi jest interesujący, szczególnie w odniesieniu do roli nadmiernej i hipoaktywności płytek krwi w krwawieniach i zaburzeniach zakrzepowych. Izolowanie płytek krwi z osocza jest konieczne w przypadku niektórych testów metabolicznych; Przedstawiono metodę izolacji metabolitów wewnątrzkomórkowych z przemytych płytek krwi
.Badałem wpływ ostrej ekspozycji na estrogen na centralny metabolizm węgla w płytkach krwi oraz płytki krwi w spoczynku i aktywowane trombiną. Próbujemy ustalić, czy ostra ekspozycja na estrogeny na płytki krwi przyczynia się do wzrostu ryzyka zakrzepicy związanego ze stosowaniem doustnych środków antykoncepcyjnych. Badania nad zdrowiem kobiet są w dużej mierze niedofinansowane.
Projekt ten był częścią szerszego wezwania NIH do zajęcia się lukami w wiedzy na temat zdrowia kobiet. Pomimo tego, że środki antykoncepcyjne są dostępne od ponad 50 lat, nadal nie znamy dokładnego mechanizmu, który powoduje wyższe ryzyko zakrzepu. Zmienność biologiczna.
Tradycyjne techniki hodowli komórkowej nie mają zastosowania do płytek krwi, co oznacza, że płytki krwi pochodzą od dawców o różnych genotypach. Potrzebne są duże rozmiary próbek, co podkreśla potrzebę powtarzalnej procedury izolacji płytek krwi. Istniejące protokoły płukania płytek krwi są pisane dla ekspertów w dziedzinie biologii płytek krwi
.Istnieje wiele unikalnych wyzwań związanych z pracą nad płytkami krwi, które mój protokół podkreśla dla początkujących badaczy płytek krwi. Na początek podgrzej łaźnię wodną do 37 stopni Celsjusza i umieść w niej zmodyfikowany bufor Tyrode'a zawierający glukozę. Połącz pełną krew pobraną ze wszystkich wakutainerów w 50-mililitrowej stożkowej probówce polipropylenowej.
Za pomocą końcówki do pipet ze skosem pobrana próbka o odpowiedniej objętości w celu zliczenia komórek. Ostrożnie zassać pipetą o wąskim otworze, aby usunąć powstałe pęcherzyki. Następnie pozwól krwi odpocząć w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 25 minut.
Aby zapobiec aktywacji podczas wirowania, dodaj prostaglandynę I2 i apyrazę do krwi pełnej i odwróć probówkę raz, aby wymieszać próbkę. Następnie odwiruj krew pełną o masie 250G przez 15 minut bez przerwy w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zbierz PRP, który pojawia się jako górna żółta warstwa nad kożuchową sierścią i czerwoną warstwą krwi, do nowej, pochylonej 50-mililitrowej stożkowej rurki wzdłuż ściany.
Pozwól PRP odpocząć przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji wymieszaj PRP z 500 nanomolowymi prostaglandynami I2 i 0,02 jednostki na mililitr apirazy. Odwirować mieszaninę o sile 1 000 G przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez przyspieszenia i bez przerwy.
Teraz za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia o szerokim otworze odessaj supernatant do objętości masowej, a następnie użyj jednomililitrowej pipety z nieodciętą końcówką, aby zassać pozostałą ciecz w pobliżu granulki. Następnie dodaj prostaglandynę I2 i bufor Tyrode zawierający apirazę do granulki, po boku stożkowej rurki. Używając końcówki ze skosem i jednomililitrowej końcówki do pipety, delikatnie ponownie zawiesić granulkę kilka razy.
Po ponownym zawieszeniu osadu użyj pipety do przenoszenia o szerokim otworze, aby przenieść go do nowej stożkowej rurki, pozostawiając wszelkie czerwone krwinki lub widocznie zlepione komórki. Następnie należy pobrać próbkę do cytometrii przepływowej za pomocą końcówki pipety ze skosem ściętym. Resztę płytek krwi inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby inhibitory mogły się zużyć.
Po inkubacji delikatnie wymieszać próbkę pipetą o szerokim otworze i podzielić próbki na porcje do cytometrii przepływowej. Średni odzysk płytek krwi z krwi pełnej wynosił około 52%, przy czym zanieczyszczenie białych krwinek pozostało poniżej 0,1% po procesie mycia. Ekspozycja na selektynę P była niska przez cały proces mycia, ale znacznie wzrosła po leczeniu trombiną.
Poziomy związanego fibrynogenu początkowo wzrosły po pierwszym spinie 1000G, ale spadły poniżej 5% po drugim spinie, ponownie znacznie wzrastając po leczeniu trombiną. Płytki krwi z powodzeniem bramkowano pod kątem wielkości, singletów i dodatniego wyniku CD42a przed pomiarem markerów aktywacji. Leczenie trombiną prowadziło do znacznego wzrostu ekspresji selektyny P i fibrynogenu w porównaniu z grupą kontrolną.
Na początek pobierz umyte płytki krwi z próbek krwi ludzkiej. Po wstępnym schłodzeniu mikrowirówki do zera stopni Celsjusza, zawiesinę płytek krwi zebrać w częściowo zamrożonym roztworze soli fizjologicznej w stosunku 1:6. Odwirować mieszaninę w temperaturze 16 000 G przez 10 minut w temperaturze zero stopni Celsjusza.
Odessać supernatant do oddzielnej probówki do mikrowirówki. Następnie dodaj 0,5 mililitra wstępnie schłodzonego metanolu: wody o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do ugaszonego granulatu i energicznie wiruj przez jedną minutę. Próbkę zamrozić w ciekłym azocie i rozmrozić w temperaturze zero stopni Celsjusza.
Zawiesinę należy ponownie odwirować w temperaturze 16 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant w nowej probówce do mikrowirówki. Po wysuszeniu supernatantu przez noc, suchy ekstrakt należy ponownie zawiesić w 150 mikrolitrach wody klasy LC/MS i mieszać przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Krótko przemieszaj i przenieś ekstrakt do probówki mikrowirówkowej o średnicy 0,22 mikrometra, aby usunąć resztki komórek.
Odwirowywać próbkę przez pięć minut w temperaturze 16 000 G i czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu odpipetować dodatkowe 50 mikrolitrów wody na filtr i ponownie wirować przez pięć minut w temperaturze 16 000 G i czterech stopniach Celsjusza. Na koniec zebrać filtrat do analizy.
Produkcja mleczanu była dodatnia we wszystkich próbkach dawców, podczas gdy glukoza i octan były konsekwentnie spożywane, przy czym trombina zwiększała te strumienie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje wpływ ostrej ekspozycji na estrogen na centralny metabolizm węglowy płytek krwi, koncentrując się na tym, w jaki sposób może on przyczyniać się do zwiększonego ryzyka zakrzepowego związanego ze stosowaniem doustnej antykoncepcji. Przedstawiono w nim metodę efektywnej izolacji metabolitów wewnątrzkomórkowych z przemytych płytek krwi, co jest niezbędne do przeprowadzania analiz metabolicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Metabolizm płytek krwi
- Ryzyko zakrzepowe związane ze stosowaniem estrogenów i doustnej antykoncepcji
- Badania nad zdrowiem kobiet
Wstęp
- Nadaktywność i niedoczynność płytek krwi wiążą się z zaburzeniami krwotocznymi i zakrzepowymi.
- Tradycyjnie niedofinansowany obszar badań w zakresie zdrowia kobiet.
- Konieczność stosowania powtarzalnych protokołów izolacji płytek krwi ze względu na zmienność biologiczną między dawcami.
Zastosowane metody
- Izolacja metabolitów wewnątrzkomórkowych z przemytych płytek krwi.
- Do przeprowadzenia analiz metabolicznych wykorzystano ludzkie próbki krwi.
- Zastosowanie cytometrii przepływowej oraz innych technik eksperymentalnych do analizy.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja płytek krwi ze średnią wydajnością na poziomie 52% i minimalnym zanieczyszczeniem.
- Obróbka trombiną znacząco zwiększyła ekspresję P-selectiny oraz fibrynogenu na płytkach krwi.
- Zaobserwowano zmiany w poziomach mleczanów, glukozy i octanu podczas przeprowadzonych analiz.
Wnioski
- Badanie prezentuje niezawodny protokół izolacji i analizy metabolicznej płytek krwi.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów ryzyka zakrzepowego związanego z estrogenami w kontekście zdrowia kobiet.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe badania strumieni metabolicznych w ludzkich płytkach krwi wymagają wysoce zestandaryzowanych protokołów izolacji, aby zapewnić powtarzalność i zminimalizować zmienność biologiczną. Metoda ta umożliwia precyzyjną kontrolę liczby płytek i środowiska metabolicznego, co wspiera rzetelną walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Wiarygodne przygotowanie płytek stanowi podstawę badań translacyjnych nad zaburzeniami metabolicznymi i zakrzepowymi, bezpośrednio wpływając na decyzje dotyczące portfolio w obszarach chorób układu sercowo-naczyniowego oraz zdrowia kobiet.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków metabolicznych płytek krwi istotnych dla mechanizmów chorobowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez izolację płytek krwi w stanie spoczynku oraz reagujących na bodźce.
- Ułatwia uzyskanie wiarygodnych wyników prognostycznych w ocenie fenotypu metabolicznego w próbkach pochodzących od różnych dawców.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalne preparaty płytek krwi o niskim stopniu aktywacji do dalszych analiz metabolicznych.
- Standaryzuje ilość materiału wejściowego do ilościowej analizy strumieni metabolicznych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na metabolizm i aktywację płytek krwi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie odczytów metabolicznych z fenotypami płytek krwi istotnymi dla danej choroby w celu opracowania translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez minimalizację zmienności między dawcami oraz zmienności proceduralnej.
- Wspiera dostosowane do ryzyka opracowywanie celów metabolicznych w programach dotyczących zakrzepicy i zaburzeń krzepnięcia krwi.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół izolacji płytek krwi integruje się z continuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając metaboliczne badania oparte na hipotezach oraz wspierając identyfikację związków wiodących w badaniach nad chorobami układu krążenia i chorobami metabolicznymi.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących odpowiedzi metabolicznych płytek krwi na bodźce lub związki chemiczne.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowane próbki płytek krwi gotowe do analizy, zapewniając powtarzalność pomiarów metabolicznych.
- Analityka: Dostarcza wyników ilościowych, takich jak produkcja mleczanu i zużycie substratu, do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy metaboliczne in vitro z klinicznymi czynnikami ryzyka i strategiami biomarkerowymi.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Ustanawia protokół wielokrotnego użytku dla różnorodnych badań metabolicznych i aktywacyjnych w ramach wielu programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad metabolizmem płytek krwi i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne preparaty płytek krwi dla wysokoprzepustowych procesów badawczych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez umożliwienie solidnego fenotypowania metabolicznego i priorytetyzacji celów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowany do ryzyka postęp prac oraz porównywalność międzyprogramową w badaniach nad metabolizmem i zakrzepicą.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga specjalistycznej wiedzy w zakresie biologii i obchodzenia się z płytkami krwi w celu zminimalizowania artefaktów aktywacji.
- Wymaga dostępu do infrastruktury analitycznej obejmującej cytometrię przepływową, wirowanie oraz LC/MS.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów izolacji i analiz pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Można potrzebować adaptacji metody dla różnych populacji dawców lub modeli chorobowych.
- Wrażliwość płytek krwi na siły ścinania oraz ryzyko aktywacji nakładają praktyczne ograniczenia na przepustowość i sposób obchodzenia się z próbkami.
