Model 2.5D do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance

Kwantyfikacja mechaniki komórkowej, która napędza kiełkowanie angiogenezy w żywych tkankach 3D, jest nadal trudna, a jednak konieczna, aby kontynuować postęp w dziedzinie medycyny regeneracyjnej. Protokół ten sprawia, że zadanie jest bardziej przystępne, łącząc dostępność metod ilościowych 2D z reprezentatywnością tkanek 3D. Istniejące metody kwantyfikacji sił komórkowych podczas angiogennego kiełkowania w żywej tkance ograniczają się do złożonego i kosztownego obliczeniowo wnioskowania o sile 3D.

Nasz protokół łączy kontrolę in vitro z przydatnością in vivo, dostosowując mikroskopię sił trakcyjnych do systemów X-vivo, oferując łatwą w użyciu, ale fizjologicznie istotną metodę przestrzennej czasowej charakterystyki siły mechanicznej. 2 Model Nav-D zachowuje kontekst fizjologiczny, umożliwiając jednocześnie ilościową analizę mechaniki komórkowej, oferując unikalne podejście do badania mechaniki napędzającej angiogenezę kiełkowania. Na początek odpipetuj 120 mikrolitrów roztworu silanu do każdej studzienki 12-dołkowej płytki ze szklanym dnem.

Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po inkubacji przemyć studzienki trzykrotnie absolutnym etanolem za pomocą butelki z rozpylaczem, wysuszyć płytkę za pomocą gazowego azotu. Odpipetować 11,5 mikrolitra świeżo przygotowanej mieszaniny poliakryloamidu lub żelu PAA na szklane dno każdej studzienki.

Delikatnie umieść 13-milimetrowe szkiełko nakrywkowe na wierzchu każdej kropli. Po polimeryzacji dodaj PBS do studzienki. Za pomocą wygiętej igły delikatnie poluzuj szkiełko nakrywkowe z żelu PAA.

Następnie użyj pęsety, aby usunąć szkiełko nakrywkowe ze studni. Dodaj 75 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr sulfonamidu sampa, rozpuszczonego w ultraczystej wodzie na żele PAA. Umieść płytkę pod światłem ultrafioletowym 365 nanometrów na pięć minut.

Szybko spłucz sulfa sampa na żelach za pomocą PBS. Następnie umyj funkcjonalizowane żele PAA dwukrotnie PBS przez 10 minut każdy. Odpipetować 50 mikrolitrów roztworu kolagenu 4 na funkcjonalizowane żele PAA i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia umyj żele dwa razy PBS i pozostaw do wyschnięcia na pięć minut. Dodaj 50 mikrolitrów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka lub pożywki EKG na wierzch żeli. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez godzinę.

Na początek, za pomocą sterylnej pęsety chirurgicznej, przenieś tętnicę szyjną świni z butelki transportowej zawierającej zmodyfikowany roztwór CREB na dużą szalkę Petriego wypełnioną sterylnym PBS. Usuń nadmiar tkanki otaczającej tętnicę szyjną za pomocą pęsety chirurgicznej i skalpela. Odetnij od dwóch do trzech centymetrów od obu końców tętnicy za pomocą skalpela, aby wyeliminować obszary w pobliżu rozwidleń tętnic.

Za pomocą cienkiej pęsety z okrągłą końcówką i skalpela usuń powięź tętniczą otaczającą tętnicę szyjną. Za pomocą pęsety przenieś oczyszczoną tętnicę szyjną na nową dużą szalkę Petriego wypełnioną PBS. Przetnij tętnicę na pierścienie o szerokości około dwóch milimetrów.

Następnie przenieś pierścienie na rozgrzaną małą szalkę Petriego zawierającą podłoże EKG. Umieść pierścienie w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na początek, za pomocą pęsety z okrągłą końcówką, przenieś pierścień tętnicy szyjnej świni ze środka EKG na średniej wielkości szalkę Petriego wypełnioną PBS.

Za pomocą pęsety z okrągłą końcówką i skalpela przetnij pierścień na pół, a następnie rozetnij pół pierścienia na arkusze o szerokości około dwóch milimetrów, aby utworzyć arkusze tętnicze o wymiarach dwa na dwa milimetry. Za pomocą pęsety z okrągłą końcówką przytrzymaj arkusz tętniczy z tyłu i umieść arkusz na krawędzi żelu PAA z wewnętrzną wyściółką śródbłonka skierowaną w stronę podłoża PAA. Następnie za pomocą pęsety delikatnie przesuń arkusz tętniczy do środka hydrożelu PAA, nie dotykając żelu.

Dodaj 50 mikrolitrów pożywki EKG na arkusz tętniczy, upewniając się, że kropla pozostaje na żelu. Za pomocą pęsety z okrągłą końcówką umieść suche 13-milimetrowe szkiełko nakrywkowe na arkuszu tętniczym na podłożu PAA w podłożu. Użyj wewnętrznej krawędzi szklanego dna, aby delikatnie opuścić szkiełko nakrywkowe, aż średnia kropla rozprzestrzeni się pod spodem.

Pozwól chusteczce przyczepić się w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez pięć godzin. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki EKG do każdej studzienki. Inkubować arkusz tętniczy na podłożu PAA w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.

Następnego dnia za pomocą wygiętej igły ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe i usuń je z arkusza tętniczego za pomocą pęsety. Usuń pożywkę z dołka i otaczającej tkanki za pomocą ssania próżniowego bez dotykania tkanki, dodaj 10 mikrolitrów kropli mieszanki żelu kolagenu typu 1 na każdy arkusz tętniczy. Pozostaw żel do polimeryzacji przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po inkubacji delikatnie dodaj jeden mililitr podgrzanej pożywki EKG do każdej studzienki. Przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 24 godziny. Zwiększoną skuteczność mocowania arkuszy tętniczych zaobserwowano, gdy zastosowano 13-milimetrowy nieobrobiony szkiełko nakrywkowe, minimalizując siły podczas jego usuwania.

Po 24 godzinach posiewu tętnicy szyjnej świni w systemie 2,5D sprawdź, czy nie ma angiogenezy kiełkującej. Jeśli zaobserwuje się angiogenezę kiełkowania, odśwież pożywkę EKG i umieść 12-dołkową płytkę w uchwycie stage w ogrzanym do 37 stopni Celsjusza pudełku inkubacyjnym mikroskopu. Wybierz obiektyw mikroskopu w zależności od potrzeb obrazowania.

Ustaw czas ekspozycji i dostosuj płaszczyznę ostrości za pomocą obrazowania z kontrastem fazowym. Następnie dodaj kanał fluorescencyjny do obrazowania koralików fluorescencyjnych i ponownie ustaw czas ekspozycji. Zaznacz wiele obszarów zainteresowania w próbce i dostosuj płaszczyznę ostrości dla każdej pozycji.

Zdefiniuj interesujący Cię upływ czasu, wybierając przedział czasu od 5 do 20 minut i czas trwania od 4 do 24 godzin. Włącz system ustawiania ostrości, aby utrzymać stabilną ostrość przez cały czas trwania zdjęcia poklatkowego. Następnie, aby uzyskać mikroskopię siły pociągowej, dodaj 5% SDS w ultraczystej wodzie do studzienki i poczekaj kilka minut, aż wyrastające komórki oderwą się.

Uzyskaj stos Z markerów fluorescencyjnych w podłożu PAA dla każdej wybranej pozycji, aby uzyskać stan zrelaksowany markerów fluorescencyjnych jako obraz odniesienia. Korzystając z niestandardowych kodów MATLAB, wybierz obrazy poklatkowe i referencyjne do przetwarzania obrazu oraz zdefiniuj parametry do analizy. Wyrównaj i przytnij obrazy poklatkowe względem najlepszego obrazu referencyjnego W celu uzyskania precyzyjnej analizy.

Zmierz przemieszczenie markerów fluorescencyjnych w hydrożelu PAA, wykonując asymetrię obrazu cząstek i asymetrię między obrazem poklatkowym a obrazem referencyjnym. Skonfiguruj analizę asymetrii obrazu vel, aby podzielić obrazy na okna przesłuchań o wymiarach 32 na 32 piksele z nakładaniem się 0,5. Na koniec oblicz siły trakcji komórkowej na podstawie właściwości mechanicznych żelu PAA.

W modelach 2,5D i 3D arkusza tętniczego świń zaobserwowano tworzenie się kiełków komórkowych, przypominających wzorce angiogenne, podczas gdy model 2D nie wykazał angiogenezy kiełkowania. Sztywność miękkiego podłoża hydrożelu PAA sprzyjała wczesnej angiogenezie kiełkowania tętnic w porównaniu ze sztywniejszym substratem PAA, wykazując efekty sztywności matrycy. Mikroskopia sił trakcyjnych wykazała, że kiełki komórkowe wykazywały siły ciągnące na wypukłościach i siły pchające wzdłuż osi kiełków, napędzane przez komórki prowadzące i popychające.