Name: Model 2.5D do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj model 2.5D do mechanicznej charakterystyki angiogenezy kiełkowania w tkance żywej. Ta metoda łączy mikroskopię sił trakcyjnych z dostępnością eksperymentalną, umożliwiając badanie mechaniki komórek liderów i podążających.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy ludziom z LifeTec za zebranie i transport tętnic szyjnych świń z lokalnej rzeźni; Leonowi Hermansowi, Pimowi van den Bersselaarowi i Adrià Villacrosa Ribas (TU/e, ICMS) za owocne dyskusje na temat procedur eksperymentalnych i analizy charakterystyki mechanicznej. Wyrażamy wdzięczność za wsparcie w postaci grantów od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (771168), Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (024.003.013), Akademii Fińskiej (307133, 316882, 330411 i 337531) oraz Centrów Doskonałości w Mechanostazie Komórkowej Fundacji Uniwersyteckiej åbo Akademi (CellMech).

Versatile 2.5D Model for Analyzing Cellular Sprouting in Porcine Arteries

<ol><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in health and disease.</a> Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).</li>
<li>Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFolkman%2C+J+%22Nat+Med%22">Nat Med</a>. 1, 27-30 (1995).</li>
<li>Kretschmer, M., Rüdiger, D., Zahler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Mechanical aspects of angiogenesis.</a> Cancers. 13 (19), 4987(2021).</li>
<li>Bordeleau, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffening+promotes+a+tumor+vasculature+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffening promotes a tumor vasculature phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (3), 492-497 (2017).</li>
<li>Blanco, R., Gerhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+and+Notch+in+tip+and+stalk+cell+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">VEGF and Notch in tip and stalk cell selection.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (1), a006569(2013).</li>
<li>Adams, R. H., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+angiogenesis+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 464-478 (2007).</li>
<li>Carmeliet, P., De Smet, F., Loges, S., Mazzone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+morphogenesis+and+antiangiogenesis+candidates%3A+tip+cells+lead+the+way%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Branching morphogenesis and antiangiogenesis candidates: tip cells lead the way.</a> Nat Rev Clin Oncol. 6, 315-326 (2009).</li>
<li>Salam, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+migration+of+human+mscs+through+fibrin+hydrogels+as+a+tool+for+formulation+optimisation%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Assessment of migration of human mscs through fibrin hydrogels as a tool for formulation optimisation.</a> Materials. 11 (9), 1781(2018).</li>
<li>Solbu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cell+migration+in+hydrogels%3A+An+overview+of+relevant+materials+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Assessing cell migration in hydrogels: An overview of relevant materials and methods.</a> Materials Today Bio. 18, 100537(2023).</li>
<li>Cao, W., Li, X., Zuo, X., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+endothelial+cells+into+photo-responsive+hydrogels+with+tunable+modulus+under+the+presence+of+pro-inflammatory+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerat+Biomater%22%5BJournal%5D)">Migration of endothelial cells into photo-responsive hydrogels with tunable modulus under the presence of pro-inflammatory macrophages.</a> Regenerat Biomater. 6 (5), 259-267 (2019).</li>
<li>Staton, C. A., Reed, M. W. R., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).</li>
<li>Staton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+assaying+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Path%22%5BJournal%5D)">Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Int J Exp Path. 85, 233-248 (2004).</li>
<li>Ngo, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+models+for+angiogenesis+research%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tissue+Regenerat%22%5BJournal%5D)">In Vitro models for angiogenesis research: A review.</a> Int J Tissue Regenerat. 5, 37-45 (2014).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+choroid+sprouting+assay+of+ocular+microvascular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An ex vivo choroid sprouting assay of ocular microvascular angiogenesis.</a> J Vis Exp. (162), e61677(2020).</li>
<li>Kapoor, A., Chen, C. G., Iozzo, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+aortic+ring+assay%3A+A+useful+ex+vivo+method+to+assess+biochemical+and+functional+parameters+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol+Plus%22%5BJournal%5D)">A simplified aortic ring assay: A useful ex vivo method to assess biochemical and functional parameters of angiogenesis.</a> Matrix Biol Plus. 6-7, 100025(2020).</li>
<li>Stiffey-Wilusz, J., Boice, J. A., Ronan, J., Fletcher, A. M., Anderson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+angiogenesis+assay+utilizing+commercial+porcine+carotid+artery%3A+Modification+of+the+rat+aortic+ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">An ex vivo angiogenesis assay utilizing commercial porcine carotid artery: Modification of the rat aortic ring assay.</a> Angiogenesis. 4 (1), 3-9 (2001).</li>
<li>Kniazeva, E., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+traction+and+ECM+density+influence+both+capillary+morphogenesis+and+maintenance+in+3-D%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell traction and ECM density influence both capillary morphogenesis and maintenance in 3-D.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297 (1), C179-C187 (2009).</li>
<li>Davidson, C. D., Wang, W. Y., Zaimi, I., Jayco, D. K. P., Baker, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+force-mediated+matrix+reorganization+underlies+multicellular+network+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Sc+Rep%22%5BJournal%5D)">Cell force-mediated matrix reorganization underlies multicellular network assembly.</a> Sc Rep. 9 (1), 12(2019).</li>
<li>Lyle, K. S., Corleto, J. A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+regulation+contributes+to+endothelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BioArchitecture%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics regulation contributes to endothelial morphogenesis.</a> BioArchitecture. 2 (6), 220-227 (2012).</li>
<li>Kniazeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+local+matrix+deformations+and+mechanical+properties+during+capillary+morphogenesis+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Integrat+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantification of local matrix deformations and mechanical properties during capillary morphogenesis in 3D.</a> Integrat Biol. 4 (4), 431-439 (2012).</li>
<li>Quintanilla, M. A., Hammer, J. A., Beach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-muscle+myosin+2+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-muscle myosin 2 at a glance.</a> J Cell Sci. 136 (5), jcs.260890(2023).</li>
<li>Fischer, R. S., Gardel, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+cortical+tension+by+myosin+II+guides+3D+endothelial+cell+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching.</a> Curr Biol. 19 (3), 260-265 (2009).</li>
<li>Yoon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+IIA%E2%80%93mediated+forces+regulate+multicellular+integrity+during+vascular+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Myosin IIA–mediated forces regulate multicellular integrity during vascular sprouting.</a> Mol Biol Cell. 30 (16), 1974-1984 (2019).</li>
<li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+characterization+of+mechanical+interactions+between+endothelial+cells+and+extracellular+matrix+during+angiogenic+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional characterization of mechanical interactions between endothelial cells and extracellular matrix during angiogenic sprouting.</a> Sci Rep. 6, 21362(2016).</li>
<li>Vaeyens, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+deformations+around+angiogenic+sprouts+correlate+to+sprout+dynamics+and+suggest+pulling+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Matrix deformations around angiogenic sprouts correlate to sprout dynamics and suggest pulling activity.</a> Angiogenesis. 23 (3), 315-324 (2020).</li>
<li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li>
<li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+forces+during+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">Physical forces during collective cell migration.</a> Nat Phys. 5 (6), 426-430 (2009).</li>
<li>Santos-Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+force+at+the+tip+-+modelling+tension+and+proliferation+in+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">The force at the tip - modelling tension and proliferation in sprouting angiogenesis.</a> PLoS Comput Biol. 11 (8), e1004436(2015).</li>
<li>Boreddy, S. R., Sahu, R. P., Srivastava, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzyl+isothiocyanate+suppresses+pancreatic+tumor+angiogenesis+and+invasion+by+inhibiting+HIF-%CE%B1%2FVEGF%2FRho-GTPases%3A+Pivotal+role+of+STAT-3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Benzyl isothiocyanate suppresses pancreatic tumor angiogenesis and invasion by inhibiting HIF-α/VEGF/Rho-GTPases: Pivotal role of STAT-3.</a> PLoS One. 6 (10), 0025799(2011).</li>
<li>Teng, R. J., Eis, A., Bakhutashvili, I., Arul, N., Konduri, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+superoxide+production+contributes+to+the+impaired+angiogenesis+of+fetal+pulmonary+arteries+with+in+utero+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased superoxide production contributes to the impaired angiogenesis of fetal pulmonary arteries with in utero pulmonary hypertension.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (1), L184-L195 (2009).</li>
<li>Costa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+division+coordinates+collective+cell+migration+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Asymmetric division coordinates collective cell migration in angiogenesis.</a> Nature Cell Biol. 18 (12), 1292-1301 (2016).</li>
<li>Slater, K., Partridge, J., Nandivada, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSlater%2C+K+%22Corning+tuning+the+elastic+moduli+of+Corning+Matrigel+and+collagen+I+3D+matrices+by+varying+the+protein+concentration%22">Corning tuning the elastic moduli of Corning Matrigel and collagen I 3D matrices by varying the protein concentration</a>. , Corning Incorporated, Life Sciences, MA USA. (2019).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+chain+flexibility+on+cell+adhesion%3A+Semi-flexible+model-based+analysis+of+cell+adhesion+to+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effect of chain flexibility on cell adhesion: Semi-flexible model-based analysis of cell adhesion to hydrogels.</a> Sci Rep. 9 (1), 2463(2019).</li>
<li>Motte, S., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+stiffening+in+collagen+i+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Strain stiffening in collagen i networks.</a> Biopolymers. 99 (1), 35-46 (2013).</li>
<li>Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tense+situation%3A+Forcing+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tense situation: Forcing tumour progression.</a> Nat Rev Cancer. 9 (2), 108-122 (2009).</li>
<li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Curr Prot Cell Biol. 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).</li>
<li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanically+active+heterotypic+E-cadherin%2FN-cadherin+adhesion+enables+fibroblasts+to+drive+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A mechanically active heterotypic E-cadherin/N-cadherin adhesion enables fibroblasts to drive cancer cell invasion.</a> Nat Cell Biol. 19 (3), 224-237 (2017).</li>
<li>Bazellières, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).</li>
<li>Uroz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+forces+at+the+cytokinetic+ring+regulate+cell+division+and+polyploidy+in+the+migrating+zebrafish+epicardium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Traction forces at the cytokinetic ring regulate cell division and polyploidy in the migrating zebrafish epicardium.</a> Nat Mater. 18 (9), 1015-1023 (2019).</li>
<li>Dong, C., Nastaran, Z., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDong%2C+C+%22Biomechanics+in+oncology%22">Biomechanics in oncology</a>. , Springer Nature. Switzerland, AG. (2018).</li>
<li>Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates%3A+A+guide+to+recent+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochim Biophys Acta. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li>
<li>Toyjanova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Viscoelastic+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">3D Viscoelastic traction force microscopy.</a> Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 881-886 (2013).</li>
<li>Steinwachs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+force+microscopy+of+cells+in+biopolymer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional force microscopy of cells in biopolymer networks.</a> Nat Meth. 13 (2), 171-176 (2016).</li>
<li>Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+traction+force+microscopy%3A+A+new+tool+for+quantifying+cell-matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions.</a> PLoS One. 6 (3), e17833(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Kiełkująca angiogeneza - tworzenie nowych naczyń krwionośnych - jest złożonym procesem regulowanym zarówno przez mechanizmy molekularne, jak i mechaniczne. Podczas gdy wiele modeli 3D zostało opracowanych w ciągu ostatnich dziesięcioleci w celu zbadania czynników molekularnych (np. sygnalizacji VEGF i Notch) kiełkującej angiogenezy, niewiele wiadomo o mechanice komórkowej ze względu na ograniczenia modelu. Mikroskopia sił trakcyjnych (TFM) jest dobrze znaną techniką ilościowego określania sił komórkowych w przestrzeni i czasie, w której deformacje podłoża 2D są przekształcane w trakcje komórkowe. Dlatego w tym protokole opisujemy model 2,5D ex vivo, co oznacza, że lokalnie zapewniamy komórkom środowisko 3D, zachowując prostotę modelu 2D, który pozwala na ilościowe określenie sił trakcyjnych podczas angiogenezy kiełkowania (ryc. 1). W tym celu przygotowaliśmy i wysialiśmy arkusz tętnicy świńskiej (śródbłonkiem do dołu; Rysunek 2) na wierzchu hydrożelu poliakryloamidowego (PAA) pokrytego kolagenem typu IV zawierającego markery fluorescencyjne. Po przymocowaniu arkusza tętniczego za pomocą szklanego szkiełka nakrywkowego o średnicy 13 mm (ryc. 3) dodajemy cienką warstwę hydrożelu kolagenu typu I, który umożliwia tworzenie kiełków komórkowych (ryc. 4). Korzystając z tego modelu, pokazujemy, że podczas kiełkowania komórkowego 22,23,24,25 komórki liderowe wywierają siły ciągnące (co zaobserwowano w literaturze 19,20,21,22), ale także, że komórki podążające wywierają siły popychające (ryc. 6). Rozdzielczość pola trakcyjnego uzyskana dzięki naszemu protokołowi pozwala na ilościowe analizy kinematyki i dynamiki komórkowej zarówno w czasie, jak i przestrzeni, które są typowe dla prac wykorzystujących mikroskopię sił trakcyjnych na zgodnych podłożach 37,38,39.
Ponadto wykazujemy wszechstronność tego 2,5-wymiarowego modelu angiogenezy kiełkowania ex vivo poprzez zmianę mechanicznych wskazówek mikrośrodowiska (ryc. 5). Podczas gdy angiogeneza kiełkowania zwykle zachodzi przy fizjologicznej sztywności 1 kPa35 - którą można naśladować za pomocą hydrożelu kolagenu 3D typu I, angiogeneza guza zachodzi w usztywnionym mikrośrodowisku40 - co wykracza poza zakres sztywności konwencjonalnych hydrożeli kolagenu 3D typu I. Sztywność podłoża PAA można łatwo regulować, zmieniając stosunek środków sieciujących w celu uzyskania wyższej sztywności podłoża. Korzystając z tego modelu, ujawniamy, że początek angiogenezy kiełkowania jest zależny od sztywności. Podłoża te nie tylko oferują przestrajalną sztywność, ale także umożliwiają systematyczną modulację różnych innych wskazówek mechanicznych, np. składu i gęstości matrycy. Ponadto model ten pozwala nam badać mechanikę komórkową przy jednoczesnym manipulowaniu regulatorami molekularnymi za pomocą warunkowania pożywki (np. wpływ hamowania na sygnalizację Notch na mechanikę komórkową) w celu zrozumienia mechanobiologicznych mechanizmów kiełkowania angiogenezy. Pokazuje to użyteczność tego 2,5-wymiarowego modelu ex vivo angiogenezy kiełkowania w próbce różnych mikrośrodowisk.
Prezentowany przez nas model wykorzystuje konwencjonalny TFM 2D, który oferuje prostszą analizę, wyższą rozdzielczość przestrzenną i łatwiejszą implementację w porównaniu z TFM 3D (lepkosprężysty), dzięki czemu jest bardziej dostępny i opłacalny26,41. Jednak TFM 3D (lepkosprężysty) zapewnia bardziej fizjologicznie odpowiednie środowisko, wychwytując siły trakcyjne we wszystkich trzech wymiarach i uwzględniając złożone właściwości mechaniczne macierzy zewnątrzkomórkowej, oferując głębszy wgląd w zachowanie komórek w bardziej realistycznym kontekście 42,43,44,45. Ten efekt wymiarowości również wskazuje na ograniczenie tego modelu 2,5D. Używamy TFM 2D przy założeniu, że komórki migrują na podłożu 2D. Chociaż tak jest w przypadku tego modelu 2,5D, komórki znajdują się w lokalnym środowisku 3D, a zatem przylegają do warstwy żelu kolagenu typu I i wywierają siły w tej warstwie żelu. Założenie, które przyjęliśmy w tej analizie, polega na tym, że warstwa żelu kolagenu typu I nie jest mechanicznie sprzężona (brak przenoszenia siły między tymi dwoma hydrożelami) z interfejsem PAA ze względu na różnicę rzędu wielkości w sztywności matrycy, co minimalizuje wpływ sił komórkowych na warstwę kolagenu typu I. To sprawia, że charakterystyka sił przy użyciu modelu 2,5D ex vivo jest uproszczonym odwzorowaniem sił generowanych przez ogniwa. Ponadto protokół ten wymaga precyzji i jest obszerny i obejmuje kilka etapów, w których próbki mogą zostać utracone, np. (i) trudności z widocznością komórek z powodu nadmiernej tkanki otaczającej arkusz tętniczy (ryc. 2), (ii) jedna na trzy próbki nie przyczepia się do substratu PAA (ryc. 3), (iii) nie wszystkie próbki zainicjują tworzenie kiełków komórkowych (ryc. 5), (iv) kiełki komórkowe nie tworzą się na podłożu PAA oraz (v) nieostre markery fluorescencyjne przy użyciu grubego arkusza tętniczego na hydrożelu PAA o niskiej sztywności. Dlatego zoptymalizowaliśmy tę metodę dla płytki 12-dołkowej, aby zapewnić wiele obszarów zainteresowania do przeprowadzenia mechanicznej analizy angiogenezy kiełkowania.
Podsumowując, przedstawione podejście do uproszczonej charakterystyki komórkowych sił trakcyjnych kiełkowania angiogenezy żywej warstwy tętniczej świni przy użyciu modelu 2,5D (Figura 7) może pomóc w tworzeniu dokładniejszych i trwalszych wglądów w interakcje mechaniczne podczas angiogenezy w natywnym kontekście tkankowym, ułatwiając badanie dynamicznych procesów komórkowych o zmniejszonej złożoności i lepszej odtwarzalności w porównaniu z systemami w pełni 3D. Może to poszerzyć naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób komórki reagują na sygnały mechaniczne w bardziej fizjologicznie istotnym środowisku, przy jednoczesnym zachowaniu analitycznej prostoty metod 2D. Wiedza ta może przyczynić się do postępu w dziedzinie inżynierii tkankowej w celu tworzenia naczyń krwionośnych, ale także znalezienia leków terapeutycznych zapobiegających angiogenezie nowotworów w celu ograniczenia wzrostu guza i zmniejszenia przerzutów.

Angiogeneza to proces tworzenia nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń krwionośnych. Proces ten jest niezbędny podczas rozwoju embrionalnego, gojenia się ran i progresji raka, z których wszystkie są związane ze zmianami biomechanicznymi w mikrośrodowisku1,2,3,4. Na początku angiogenezy niedotlenione lub uszkodzone tkanki uwalniają czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), który aktywuje komórki śródbłonka sąsiednich naczyń krwionośnych, tworząc kiełki śródbłonka - gdzie dwa odrębne fenotypy lidera i następcy są przyjmowane przez molekularny szlak sygnałowy Notch5. Po utworzeniu kiełków śródbłonka, zjawisku znanym jako angiogeneza kiełkowania, komórki liderowe degradują otaczającą macierz zewnątrzkomórkową, aby wspólnie migrować w kierunku bodźca VEGF bez utraty adhezji komórka-komórka z końcowymi komórkami podążającymi6,7.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci opisano coraz więcej testów angiogenezy kiełkowania, które badają zbiorową migrację komórek za pomocą różnych metodologii, z których każda oferuje różne korzyści i ograniczenia. Testy te oceniają skoordynowany ruch grup komórek, takich jak komórki śródbłonka, przez matryce 3D, umożliwiając badanie zachowań komórkowych, takich jak kiełkowanie, inwazja i migracja zbiorowa w kontrolowanym środowisku8,9,10. Testy angiogenezy kiełkowania in vivo zapewniają kompleksową ocenę w żywym organizmie, wychwytując skomplikowane interakcje, ale są czasochłonne, kosztowne, podatne na dużą zmienność i trudne do określenia ilościowego11,12. Testy angiogenezy kiełkowania in vitro umożliwiają precyzyjną kontrolę warunków eksperymentalnych z wysoką odtwarzalnością i precyzyjną kwantyfikacją, ale mogą nie w pełni replikować złożoności in vivo11,12,13. Natomiast testy angiogenezy kiełkowania ex vivo, z których test pierścienia aortalnego jest najczęściej wykonywanym modelem, wykorzystują tkanki na zewnątrz organizmu, zachowując znaczenie fizjologiczne, unikając jednocześnie powikłań in vivo14,15,16. Pomimo tego, że są trudne technicznie i czasami mają problemy z żywotnością tkanek, modele ex vivo oferują cenną równowagę między złożonością a kontrolą, co czyni je obiecującym podejściem do badania angiogenezy kiełkowania. Chociaż modele te były szeroko stosowane do badania molekularnych czynników powodujących angiogenezę kiełkowania, wpływ sygnałów mechanicznych i mechaniczne zachowanie komórek pozostają słabo poznane.
Migracja wielokomórkowa podczas angiogenezy kiełkowania jest wysoce zależna od mechaniki komórkowej, ponieważ siły skurczowe oparte na aktomiozynie regulują inwazję komórek śródbłonka do otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej17,18,19,20. W szczególności zaobserwowano, że silniki miozyny II bez mięśni, główne maszyny kurczliwe oparte na aktynie w obrębie klasy cell21, kontrolują komórkowe siły skurczu podczas angiogenezy kiełkowania22,23. Komórka lidera jest prawdopodobnie dominującym elementem generującym siłę kiełka, ponieważ deformacje otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej 3D są znacznie większe wokół komórki lidera, a konkretnie w pobliżu wypukłości komórkowych bogatych w aktynę23,24, w porównaniu do swoich obserwujących22,23,25. Pomimo rosnących dowodów na znaczenie kurczliwości komórkowej w angiogenezie kiełkowania w 3D, brakuje metody czasoprzestrzennej mechanicznej charakterystyki mechaniki komórkowej angiogenezy kiełkowania.
Ogólnym celem tego badania jest opracowanie metody, która pozwala na mechaniczną charakterystykę migracji komórkowej podczas kiełkowania. Osiągając czasoprzestrzenną charakterystykę sił mechanicznych w biologicznie istotnym kontekście, staramy się dostarczyć nowych informacji na temat tego, jak mechanika komórkowa wpływa na tworzenie się kiełków angiogennych. W tym celu opracowaliśmy system modeli 2,5D, tworząc hydrożel 2D z poliakrylamidu (PAA), umieszczając na nim arkusz tętnicy szyjnej i pokrywając go cienką warstwą żelu kolagenowego typu I, aby stworzyć zlokalizowane środowisko 3D dla komórek. Kiełki wielokomórkowe wyemigrowały z arkusza tętniczego na granicy faz PAA-żel kolagenowy. Zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami jest to, że hydrożel 2D PAA umożliwia analizy za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych (TFM) - dobrze znanej wszechstronnej techniki, w której komórki przylegają do elastycznego podłoża 2D i deformują substrat pod wpływem komórkowych sił trakcyjnych26. Odkształcenia te można wychwycić, a siły trakcji komórkowej można obliczyć na podstawie właściwości mechanicznych podłoża26. Adaptując TFM do stosowania w żywych tkankach ex vivo, dążymy do wypełnienia luki między kontrolą in vitro a znaczeniem in vivo, zapewniając bardziej kompleksowe zrozumienie sił mechanicznych podczas angiogenezy.

<table><tbody><tr><td>2% bis-akryloamid</td><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1610143</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td></td><td>Merck Life Science</td><td>60-24-2</td></tr><tr><td>3-(trimetoksysililo)metakrylan propylu</td><td>Bind-Silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159-100ML</td></tr><tr><td>40% akryloamid</td><td></td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td></tr><tr><td>Aboslute etanol (do analizy)</td><td></td><td>VWR International</td><td>1.00983.1000</td></tr><tr><td>Etanol absolutny (przemysłowy)</td><td></td><td>VWR International</td><td>83813.41</td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty 100%</td><td></td> <td>Merck</td><td>1000562500</td></tr><tr><td>Przeciwciało nadsiarczanu amonu</td><td>APS</td><td>Bio-Rad</td><td>7727-54-0</td></tr><tr><td>(pierwotne) - Przeciwciało kalponiny</td><td></td><td>ABCAM</td><td>AB46794</td></tr><tr><td>(pierwotne) - CD31</td><td></td><td>Serotec</td><td>MCA1746</td></tr><tr><td>przeciwciało (pierwotne) - &alfa;-aktyna mięśni gładkich</td><td>&alfa;SMA Przeciwciało</td><td>Dako</td><td>M0851</td></tr><tr><td>(wtórne) - kozio-anty-mysie-IgG1</td><td>Sondy molekularne</td> Alexa 488 <td></td><td>Przeciwciało A21121</td></tr><tr><td>(wtórne) - kozio-anty-mysie-IgG2a Sondy molekularne Alexa 555</td><td></td><td></td><td>Przeciwciało A21137</td></tr><tr><td>(wtórne) - koza-anty-królicze IgG Alexa 555</td><td></td><td>Sondy molekularne</td><td>A21428</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td></td><td>Astell</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>CaCl2</td><td>Calbiochem</td><td>208291-250GM</td></tr><tr><td>Kolagen typu I, ogon</td><td></td> szczura <td>Corning</td><td>354236</td></tr><tr><td>Kolagen typu IV, łożysko ludzkie Merck</td><td></td><td>Life Science</td><td>C5533-5MG</td></tr><tr><td>Podłoże do wzrostu komórek śródbłonka Podłoże</td><td>EKG</td><td>Promocell</td><td>C-22111</td></tr><tr><td>Pęseta z okrągłą końcówką z powłoką epoksydową</td><td>pęseta delikatna</td><td>Rubis Pinzette</td><td>E78144-2A</td></tr><tr><td>Marker fluorescencyjny, ciemnoczerwony</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>F8807</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, &Oslash; 13 mm, #1</td><td></td><td>Epredia</td><td>CB00130RA120MNZ0</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, &Oslash; 13 mm, #1.5</td><td></td><td>Epredia</td><td>CB00120RAC20MNZ0</td></tr><tr><td>Kwas chlorowodorkowy, 25%</td><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1.100316.1000</td></tr><tr><td>Bufor Krebs-Henseleit</td><td>Mikroskop Sigma-Aldrich</td><td>K3753</td>, oprogramowanie Leica Application Suite X, wersja 3.5.7.23225 Mikroskop Leica Microsystems, mikroskop epifluorescencyjny Leica DMi8 Leica Microsystems <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop, Nikon Ti2 Eclipse</td><td></td><td>Mikroskop Nikon</td><td></td></tr><tr><td>, oprogramowanie</td><td></td> NIS-Elements AR <td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametyloetano-1,2-diamina</td><td>TEMED</td><td>Merck Life Science</td><td>110-18-9</td></tr><tr><td>Butelka</td><td></td> Nalgene <td>Thermo Scientific</td><td>2187-0016</td></tr><tr><td>Igła, 21Gx1"</td><td></td><td>Henke Sass Wolf</td><td>HK4710008025</td></tr><tr><td>Surowica normalna, kozia</td><td></td><td>Gibco</td><td>10098792</td></tr><tr><td>Chlorowodorek</td><td></td> papaweryny <td>Sigma</td><td>61-25-6</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomiocyna (10 000 U/mL)</td><td>P/S</td><td>Gibco</td><td>15140163</td></tr> szalka <tr><td>Petriego, duża (145x20mm)</td><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td></tr><tr><td>szalka Petriego, mała (60x15mm)</td><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>628160</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P4417</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td></td><td>Merck Life Science</td><td>P2443-250G</td></tr><tr><td>Igła do nakłuwania, ostra zamknięta końcówka</td><td></td><td>nieznana</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel, nr 4</td><td></td><td>Swann-Morton</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>NaHCO3</td><td>VWR International</td><td>144-55-8</td></tr><tr><td>6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino)heksanian sulfosukcynimidylu</td><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne, nr 20</td><td></td><td>Swann-Morton</td><td></td></tr><tr><td>Prześcieradło</td><td></td> chirurgiczne <td></td><td>Pęseta chirurgiczna Foliodrape</td> 2775001</tr><tr><td>Pęseta</td><td></td> chirurgiczna <td>Lettix</td><td>400024</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td>Lampa UV Merck</td><td>9036-19-5</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Analytik Jena</td><td>95-0042-13&nbsp;</td></tr><tr><td>płytka studzienkowa, 96-dołkowa, F-dolna</td><td></td><td>płytka dołkowa Greiner Bio-one</td><td>655180</td></tr><tr><td>, szklane dno 12-dołkowa</td><td></td><td>MatTek</td><td>P12G-0-14-F</td></tr></tbody></table>

model 2.5d do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance

2.5D Model for Ex Vivo Mechanical Characterization of Sprouting Angiogenesis in Living Tissue

Angiogeneza kiełkowania to tworzenie nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń krwionośnych i ma ogromne znaczenie dla procesów fizjologicznych, takich jak wzrost i naprawa tkanek oraz procesy patologiczne, w tym rak i przerzuty. Wieloetapowy proces kiełkowania angiogenezy jest procesem napędzanym molekularnie i mechanicznie. Składa się z indukcji kiełka komórkowego przez czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych, selekcji komórek lidera / podążającego poprzez sygnalizację Notch, ukierunkowanej migracji komórek śródbłonka oraz fuzji i stabilizacji naczyń. Na przestrzeni lat opracowano różne modele angiogenezy kiełkowania, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw kiełkowania komórek. Pomimo postępów w zrozumieniu molekularnych czynników powodujących angiogenezę kiełkowania, rola sygnałów mechanicznych i mechanicznego czynnika napędzającego angiogenezę kiełkowania pozostaje niedostatecznie zbadana ze względu na ograniczenia w istniejących modelach. W tym badaniu zaprojektowaliśmy model 2,5D ex vivo, który umożliwia nam mechaniczne scharakteryzowanie kiełkowania komórkowego z tętnicy szyjnej świni za pomocą mikroskopii siły trakcji. Model identyfikuje wyraźne wzorce sił w obrębie kiełka, w których komórki liderowe wywierają siły ciągnące, a komórki podążające wywierają siły pchające na matrycę. Wszechstronność modelu pozwala na manipulowanie zarówno chemicznymi, jak i mechanicznymi wskazówkami, takimi jak sztywność matrycy, co zwiększa jego znaczenie dla różnych mikrośrodowisk. Tutaj pokazujemy, że początek kiełkującej angiogenezy jest zależny od sztywności. Zaprezentowany model 2,5D do ilościowego określania sił trakcyjnych komórek w kiełkującej angiogenezie oferuje uproszczoną, ale fizjologicznie istotną metodę, poszerzając naszą wiedzę na temat reakcji komórek na sygnały mechaniczne, co może przyczynić się do postępu w inżynierii tkankowej i strategiach terapeutycznych przeciwko angiogenezie guza.

Angiogeneza kiełkowania, fundamentalna dla rozwoju i choroby, obejmuje złożone procesy molekularne i mechaniczne. Przedstawiamy wszechstronny model 2,5D ex vivo, który analizuje kiełkowanie komórek z tętnic szyjnych świń, ujawniając angiogenezę zależną od sztywności i wyraźną mechanikę komórek lidera-podążacza. Model ten pomaga w rozwijaniu strategii inżynierii tkankowej i podejść do terapii nowotworów.

Model 2.5D do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance

Sprouting angiogenesis is the formation of new blood vessels from pre-existing vasculature and is of great importance for physiological such as tissue ...

Kwantyfikacja mechaniki komórkowej, która napędza kiełkowanie angiogenezy w żywych tkankach 3D, jest nadal trudna, a jednak konieczna, aby kontynuować postęp w dziedzinie medycyny regeneracyjnej. Protokół ten sprawia, że zadanie jest bardziej przystępne, łącząc dostępność metod ilościowych 2D z reprezentatywnością tkanek 3D. Istniejące metody kwantyfikacji sił komórkowych podczas angiogennego kiełkowania w żywej tkance ograniczają się do złożonego i kosztownego obliczeniowo wnioskowania o sile 3D.Nasz protokół łączy kontrolę in vitro z przydatnością in vivo, dostosowując mikroskopię sił trakcyjnych do systemów X-vivo, oferując łatwą w użyciu, ale fizjologicznie istotną metodę przestrzennej czasowej charakterystyki siły mechanicznej. 2 Model Nav-D zachowuje kontekst fizjologiczny, umożliwiając jednocześnie ilościową analizę mechaniki komórkowej, oferując unikalne podejście do badania mechaniki napędzającej angiogenezę kiełkowania. Na początek odpipetuj 120 mikrolitrów roztworu silanu do każdej studzienki 12-dołkowej płytki ze szklanym dnem.Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po inkubacji przemyć studzienki trzykrotnie absolutnym etanolem za pomocą butelki z rozpylaczem, wysuszyć płytkę za pomocą gazowego azotu. Odpipetować 11,5 mikrolitra świeżo przygotowanej mieszaniny poliakryloamidu lub żelu PAA na szklane dno każdej studzienki.Delikatnie umieść 13-milimetrowe szkiełko nakrywkowe na wierzchu każdej kropli. Po polimeryzacji dodaj PBS do studzienki. Za pomocą wygiętej igły delikatnie poluzuj szkiełko nakrywkowe z żelu PAA.Następnie użyj pęsety, aby usunąć szkiełko nakrywkowe ze studni. Dodaj 75 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr sulfonamidu sampa, rozpuszczonego w ultraczystej wodzie na żele PAA. Umieść płytkę pod światłem ultrafioletowym 365 nanometrów na pięć minut.Szybko spłucz sulfa sampa na żelach za pomocą PBS. Następnie umyj funkcjonalizowane żele PAA dwukrotnie PBS przez 10 minut każdy. Odpipetować 50 mikrolitrów roztworu kolagenu 4 na funkcjonalizowane żele PAA i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia umyj żele dwa razy PBS i pozostaw do wyschnięcia na pięć minut. Dodaj 50 mikrolitrów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka lub pożywki EKG na wierzch żeli. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez godzinę.Na początek, za pomocą sterylnej pęsety chirurgicznej, przenieś tętnicę szyjną świni z butelki transportowej zawierającej zmodyfikowany roztwór CREB na dużą szalkę Petriego wypełnioną sterylnym PBS. Usuń nadmiar tkanki otaczającej tętnicę szyjną za pomocą pęsety chirurgicznej i skalpela. Odetnij od dwóch do trzech centymetrów od obu końców tętnicy za pomocą skalpela, aby wyeliminować obszary w pobliżu rozwidleń tętnic.Za pomocą cienkiej pęsety z okrągłą końcówką i skalpela usuń powięź tętniczą otaczającą tętnicę szyjną. Za pomocą pęsety przenieś oczyszczoną tętnicę szyjną na nową dużą szalkę Petriego wypełnioną PBS. Przetnij tętnicę na pierścienie o szerokości około dwóch milimetrów.Następnie przenieś pierścienie na rozgrzaną małą szalkę Petriego zawierającą podłoże EKG. Umieść pierścienie w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na początek, za pomocą pęsety z okrągłą końcówką, przenieś pierścień tętnicy szyjnej świni ze środka EKG na średniej wielkości szalkę Petriego wypełnioną PBS.Za pomocą pęsety z okrągłą końcówką i skalpela przetnij pierścień na pół, a następnie rozetnij pół pierścienia na arkusze o szerokości około dwóch milimetrów, aby utworzyć arkusze tętnicze o wymiarach dwa na dwa milimetry. Za pomocą pęsety z okrągłą końcówką przytrzymaj arkusz tętniczy z tyłu i umieść arkusz na krawędzi żelu PAA z wewnętrzną wyściółką śródbłonka skierowaną w stronę podłoża PAA. Następnie za pomocą pęsety delikatnie przesuń arkusz tętniczy do środka hydrożelu PAA, nie dotykając żelu.Dodaj 50 mikrolitrów pożywki EKG na arkusz tętniczy, upewniając się, że kropla pozostaje na żelu. Za pomocą pęsety z okrągłą końcówką umieść suche 13-milimetrowe szkiełko nakrywkowe na arkuszu tętniczym na podłożu PAA w podłożu. Użyj wewnętrznej krawędzi szklanego dna, aby delikatnie opuścić szkiełko nakrywkowe, aż średnia kropla rozprzestrzeni się pod spodem.Pozwól chusteczce przyczepić się w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez pięć godzin. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki EKG do każdej studzienki. Inkubować arkusz tętniczy na podłożu PAA w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.Następnego dnia za pomocą wygiętej igły ostrożnie podnieś szkiełko nakrywkowe i usuń je z arkusza tętniczego za pomocą pęsety. Usuń pożywkę z dołka i otaczającej tkanki za pomocą ssania próżniowego bez dotykania tkanki, dodaj 10 mikrolitrów kropli mieszanki żelu kolagenu typu 1 na każdy arkusz tętniczy. Pozostaw żel do polimeryzacji przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po inkubacji delikatnie dodaj jeden mililitr podgrzanej pożywki EKG do każdej studzienki. Przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 24 godziny. Zwiększoną skuteczność mocowania arkuszy tętniczych zaobserwowano, gdy zastosowano 13-milimetrowy nieobrobiony szkiełko nakrywkowe, minimalizując siły podczas jego usuwania.Po 24 godzinach posiewu tętnicy szyjnej świni w systemie 2,5D sprawdź, czy nie ma angiogenezy kiełkującej. Jeśli zaobserwuje się angiogenezę kiełkowania, odśwież pożywkę EKG i umieść 12-dołkową płytkę w uchwycie stage w ogrzanym do 37 stopni Celsjusza pudełku inkubacyjnym mikroskopu. Wybierz obiektyw mikroskopu w zależności od potrzeb obrazowania.Ustaw czas ekspozycji i dostosuj płaszczyznę ostrości za pomocą obrazowania z kontrastem fazowym. Następnie dodaj kanał fluorescencyjny do obrazowania koralików fluorescencyjnych i ponownie ustaw czas ekspozycji. Zaznacz wiele obszarów zainteresowania w próbce i dostosuj płaszczyznę ostrości dla każdej pozycji.Zdefiniuj interesujący Cię upływ czasu, wybierając przedział czasu od 5 do 20 minut i czas trwania od 4 do 24 godzin. Włącz system ustawiania ostrości, aby utrzymać stabilną ostrość przez cały czas trwania zdjęcia poklatkowego. Następnie, aby uzyskać mikroskopię siły pociągowej, dodaj 5% SDS w ultraczystej wodzie do studzienki i poczekaj kilka minut, aż wyrastające komórki oderwą się.Uzyskaj stos Z markerów fluorescencyjnych w podłożu PAA dla każdej wybranej pozycji, aby uzyskać stan zrelaksowany markerów fluorescencyjnych jako obraz odniesienia. Korzystając z niestandardowych kodów MATLAB, wybierz obrazy poklatkowe i referencyjne do przetwarzania obrazu oraz zdefiniuj parametry do analizy. Wyrównaj i przytnij obrazy poklatkowe względem najlepszego obrazu referencyjnego W celu uzyskania precyzyjnej analizy.Zmierz przemieszczenie markerów fluorescencyjnych w hydrożelu PAA, wykonując asymetrię obrazu cząstek i asymetrię między obrazem poklatkowym a obrazem referencyjnym. Skonfiguruj analizę asymetrii obrazu vel, aby podzielić obrazy na okna przesłuchań o wymiarach 32 na 32 piksele z nakładaniem się 0,5. Na koniec oblicz siły trakcji komórkowej na podstawie właściwości mechanicznych żelu PAA.W modelach 2,5D i 3D arkusza tętniczego świń zaobserwowano tworzenie się kiełków komórkowych, przypominających wzorce angiogenne, podczas gdy model 2D nie wykazał angiogenezy kiełkowania. Sztywność miękkiego podłoża hydrożelu PAA sprzyjała wczesnej angiogenezie kiełkowania tętnic w porównaniu ze sztywniejszym substratem PAA, wykazując efekty sztywności matrycy. Mikroskopia sił trakcyjnych wykazała, że kiełki komórkowe wykazywały siły ciągnące na wypukłościach i siły pchające wzdłuż osi kiełków, napędzane przez komórki prowadzące i popychające.

25d-model-for-ex-vivo-mechanical-characterization-sprouting

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Ta metoda opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D w standaryzowanej platformie mikroprzepływowej. Platforma ta umożliwia badanie angiogennego kiełkowania sterowanego gradientem w 3D, w tym zespolenia i stabilizacji kiełków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.

Standaryzowany i skalowalny test do badania perfundowanego angiogennego kiełkowania 3D komórek śródbłonka pochodzących z iPSC in vitro

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Christopher C.W. Hughes opisuje użyteczność swojego systemu hodowlanego do badania angiogenezy in vitro. Wyjaśnia on znaczenie fibroblastów, które wydzielają krytyczny, choć niezidentyfikowany, rozpuszczalny czynnik umożliwiający komórkom śródbłonka tworzenie w hodowli naczyń, które rozgałęziają się, tworzą prawidłowe światła i ulegają anastomozie.

Christopher Hughes: Model in vitro do badania angiogenezy (wywiad)

Opisano nowy system in vitro do jednoczesnego obciążania czterech ścięgien w hodowli.

Mechaniczne obciążanie ścięgna ex vivo

Wykorzystanie mikroelektromechanicznych systemów (MEMS) do opracowywania narzędzi diagnostycznych

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływa na wiele zachowań komórek adherentnych. Sztywność macierzy zmienia się przestrzennie w obrębie tkanki i ulega modyfikacjom w różnych stanach chorobowych. W niniejszej pracy opracowujemy metody charakteryzacji zmienności przestrzennej sztywności w normalnej i zwłókniałej tkance płuc myszy z wykorzystaniem mikroindentacji za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Mikromechaniczna charakterystyka tkanki płucnej z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii siłowej

Tutaj prezentujemy protokół oparty na immunohistologicznej detekcji białka c-FOS, klasycznej technice używanej do identyfikacji populacji neuronów zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo.

Wykrywanie immunohistologiczne białka c-FOS: użyteczne narzędzie jako marker centralnych szlaków zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo

Poznaj model 2.5D do mechanicznej charakterystyki angiogenezy kiełkowania w tkance żywej. Ta metoda łączy mikroskopię sił trakcyjnych z dostępnością eksperymentalną, umożliwiając badanie mechaniki komórek liderów i podążających.

Model 2.5D do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance

Przeglądaj więcej filmów