Ocena fagocytozy mikrogleju resztek mieliny in vitro pod wpływem wielokrotnej stymulacji magnetycznej

[Prowadzący] Zakres naszych badań koncentruje się na badaniach w zakresie neurorehabilitacji i terapii symulacji magnetycznej. Protokół ten może dostarczyć nowych pomysłów na stymulację magnetyczną w badaniu, w jaki sposób wpływa ona na wyraźną funkcję. W przyszłości skupimy się na neurorehabilitacji i terapii stymulacją magnetyczną.

[Instruktor] Na początek zdobądź odciętą głowę samicy szczura. Rozetnij głowę na lodzie. Za pomocą nożyczek przetnij czaszkę na pół, aby całkowicie odsłonić mózg i ułatwić jego całkowite usunięcie. Użyj nożyczek i kleszczy, aby skrupulatnie i aseptycznie wyciąć błony, móżdżek i hipokamp. Oczyść mózg trzy razy za pomocą PBS, aby usunąć resztki krwi lub tkanki. Przenieś oczyszczony mózg do 10 mililitrów sterylnego roztworu sacharozy o stężeniu 0,32 molowym. Za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych pokrój tkankę mózgową na kawałki, aby uzyskać mieszaninę tkanki mózgowej i sacharozy. Następnie przenieś mieszaninę tkanki mózgowej i sacharozy do 50-mililitrowego sterylnego homogenizatora. Dodaj 30 mililitrów sterylnego roztworu sacharozy o stężeniu 0,32 mola. Użyj szklanego homogenizatora o pojemności 50 mililitrów, aby zmielić tkankę przez dwie minuty. Aby uzyskać jednorodność gładkiej tkanki mózgowej. Rozcieńczyć tkankę mózgową homogenat do 90 mililitrów sterylnym roztworem sacharozy o objętości 0,32 mola i dokładnie wymieszać. Dodaj 20 mililitrów sterylnego roztworu sacharozy o stężeniu 0,83 mola do sześciu sterylnych, cienkościennych probówek ultrawirówek polipropylenowych. Następnie powoli dozuj 15 mililitrów mieszanki mózgowej do górnej części probówek. Wyrównaj objętości sterylnym roztworem sacharozy o stężeniu 0,32 molowym. Aby zebrać surowe szczątki mieliny, najpierw wstępnie schłodzić i ultra wirować wirnik o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować próbkę o sile 75 000 G przez 45 minut, a następnie zebrać resztki mieliny z granicy faz między dwiema gęstościami sacharozy za pomocą sterylnej pipety pastwiskowej. W celu pierwszej separacji izotonicznej i oczyszczenia przenieś zebrany roztwór resztek mieliny do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Dostosuj objętość do 35 mililitrów za pomocą wstępnie schłodzonego sterylnego PBS i przenieś do nowej probówki homogenizatora. Po homogenizacji przez trzy minuty równomiernie rozprowadź resztki mieliny w sześciu 38,5 mililitrowych, sterylnych, cienkościennych, polipropylenowych probówkach do ultrawirówek. Uzupełnić objętość sterylnym PBS, a następnie odwirować. W celu drugiego izotonicznego rozdziału i oczyszczenia, ponownie zawiesić stały biały osad w 10 mililitrach wstępnie schłodzonego sterylnego PBS, aby uzyskać zawiesinę resztek mieliny. Rozprowadzić zawiesinę do probówek ultrawirówek jak poprzednio i odwirować. Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Zawiesić stały biały osad w sześciu mililitrach sterylnego PBS. Podziel zawiesinę resztek mieliny na sześć 1,5 probówek wirówkowych i ponownie odwiruj. Na koniec ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach wstępnie schłodzonego sterylnego PBS po wyrzuceniu supernatantu. Rozmrozić wymagane resztki mieliny w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub w lodowatej wodzie i odwirować jak poprzednio przez 10 minut. Ponownie zawiesić resztki mieliny w 200 mikrolitrach 50 mikromolowego roztworu CFSE. Zawiesinę inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut, a następnie ponownie odwirować. Odrzucić supernatant, a następnie przemyć próbki trzykrotnie 500 mikrolitrami sterylnego PBS. Ponownie zawiesić resztki mieliny w 100 mikrolitrach wstępnie schłodzonego sterylnego PBS, aby uzyskać zawiesinę fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny. Przechowuj próbkę w temperaturze -80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. W przypadku powtarzającej się stymulacji magnetycznej in vitro ustaw częstotliwość leczenia na 20 Hz, intensywność zabiegu na 1% maksymalnej intensywności wyjściowej, a czas stymulacji na pięć sekund. Uwzględnij okres odpoczynku trwający 20 sekund i podaj 600 impulsów w ciągu jednego czasu zabiegu wynoszącego 2,5 minuty. Po wstępnym określeniu parametrów stymulacji magnetycznej należy ustawić kierunek cewki prostopadle do podłoża i ustawić ją w górę. Wysterylizuj cewkę stymulacji magnetycznej alkoholem, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek. Po dodaniu 50 mikromolowców CFSE, umieść 1000 komórek BV-2 na 24-dołkowych płytkach przez noc, a następnie odessać starą pożywkę pipetą i natychmiast dodać świeżą pożywkę bez surowicy. Zmień pożywkę na pożywkę bez surowicy i traktuj komórki jednym mikrogramem na mililitr lipopolisacharydu przez 12 godzin. Po 12 godzinach interwencji lipopolisacharydowej dodaj 100 mikrogramów na mililitr resztek mieliny do pożywki do kohodowli w ciemności. Poddaj komórki wielokrotnej stymulacji magnetycznej, jak wykazano wcześniej. Rozpyl alkohol na płytkę, aby ją wysterylizować przed powrotem do inkubatora. Po okresie kohodowli z fragmentami mieliny, niewchłonięte resztki mieliny delikatnie przemyj PBS. Napraw komórki 4% paraformaldehydem przez 15 minut. Następnie dodaj 150 mikrolitrów PBS zawierających 10% albuminy surowicy osła i 0,3% Triton X-100 do studzienek i inkubuj. Po umyciu studzienek PBS dodać do studzienek roztwór przeciwciała pierwszorzędowego w stosunku od 100 do 200 i inkubować na zimno. Następnie inkubuj komórki w przeciwciałie drugorzędowym w stosunku od 100 do 300 przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem pod mikroskopem konfokalnym. Komórki mikrogleju BV-2 wykazywały znaczne zmniejszenie fagocytozy resztek mieliny po leczeniu lipopolisacharydami. który został odwrócony po wielokrotnej interwencji stymulacji magnetycznej. Analiza ilościowa potwierdziła znaczny spadek powierzchni szczątków mieliny w komórkach BV-2 w grupie lipopolisacharydowej w porównaniu z kontrolą, ze znaczącym wzrostem w grupie stymulowanej magnetycznie poddawanej działaniu lipopolisacharydu. Odsetek mikrogleju IBA-1 kolokalizowanego z resztkami mieliny był znacznie niższy w grupie LPS w porównaniu z kontrolą, podczas gdy stymulacja magnetyczna znacznie zwiększyła ten odsetek. Zależny od czasu wzrost fagocytozy mikrogleju zaobserwowano w grupie stymulowanej magnetycznie leczonej lipopolisacharydem w naszej grupie wykazującej znacznie wyższy wychwyt resztek mieliny.