Name: Ocena fagocytozy mikrogleju resztek mieliny in vitro pod wpływem wielokrotnej stymulacji magnetycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj metodę oceny fagocytozy mikrogleju resztek mieliny in vitro pod wpływem wielokrotnej stymulacji magnetycznej. Technika ta wykorzystuje linię komórkową BV-2 i wspiera badania nad neurorehabilitacją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82302877, 82172541), Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Hunan (2023JJ30549).

Tutaj, trzy samice szczurów SD (w wieku 2-3 tygodni) zostały użyte do ekstrakcji resztek mieliny metodą wirowania z gradientem sacharozy. Wszystkie szczury zostały zakupione w Animal Core Facility Uniwersytetu Medycznego w Nankinie w Nankinie w Chinach (licencja na zwierzęta: SYXK (Su) 2021-0023). Wszystkie szczury były hodowane w warunkach kontrolnych (temperatura 22 ± 2 °C, okres 12 godzin/12 godzin światła/ciemności, wilgotność względna 55% ± 5%). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Nankinie (nr IACUC-1903031 i nr IACUC-2005001) i miały na celu zminimalizowanie cierpienia i liczby wykorzystywanych zwierząt.
1. Izolacja mieliny
UWAGA: Szczątki mieliny zostały wydobyte zgodnie z wcześniejszym opisem, a niektóre modyfikacje zostały wykonane27. Upewnij się, że wszystkie kroki zostały wykonane w temperaturze 4 °C i w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Izolacja surowej mieliny
	<ol>
		<li>Ekstrakcja tkanki mózgowej
		<ol>
			<li>Po znieczuleniu pentobarbitalem (50 mg/kg, wstrzyknięcie dootrzewnowe) należy ocenić głębokość znieczulenia na podstawie reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Odetnij głowy samicom szczurów. Wypreparuj całą głowę na lodzie i przetnij czaszkę nożyczkami, aby w pełni odsłonić mózg i ułatwić usunięcie całego mózgu.</li>
			<li>Wytnij błony, móżdżek i hipokamp nożyczkami i kleszczami w sposób skrupulatny i aseptyczny, aby zapobiec zanieczyszczeniu mieszaniny sacharozy w tkance mózgowej. Oczyść mózg 3 razy za pomocą PBS, aby usunąć resztki krwi lub tkanki.</li>
			<li>Przenieś oczyszczone mózgi do 10 ml 0,32 M sterylnego roztworu sacharozy i pokrój tkankę mózgową nożyczkami mikrochirurgicznymi na 5 mm3 kawałki, aby uzyskać mieszaninę sacharozy w tkance mózgowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Homogenizacja tkanki mózgowej
		<ol>
			<li>Przenieś mieszaninę sacharozy z tkanką mózgową do sterylnego homogenizatora o pojemności 50 ml i dodaj 30 ml 0,32 M sterylnego roztworu sacharozy. Użyj szklanego homogenizatora o pojemności 50 ml do homogenizacji przez 2 minuty, aby uzyskać gładki homogenat tkanki mózgowej.</li>
			<li>Rozcieńczyć homogenat tkanki mózgowej do 90 ml 0,32 M sterylnego roztworu sacharozy, wymieszać i powoli dozować do górnej części sześciu 38,5 ml sterylnych cienkościennych ultrawirówek polipropylenowych o pojemności 38,5 ml zawierających 20 ml sterylnego roztworu sacharozy o 0,83 M. Dodać 15 ml homogenatu do każdej probówki wirówkowej, a następnie wyrównać 0,32 M sterylnym roztworem sacharozy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zbieranie surowych szczątków mieliny
		<ol>
			<li>Schłodzić wirnik ultrawirówki w temperaturze 4 °C i odwirować próbkę w temperaturze 75 000 x g przez 45 minut. Po zakończeniu procesu wirowania zebrać resztki mieliny z granicy faz między dwiema gęstościami sacharozy za pomocą sterylnej probówki Pasteura. 
			UWAGA: Podczas procesu pobierania należy bezwzględnie zachować ostrożność i unikać przypadkowego pobrania innych składników zanieczyszczonej próbki.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pierwsza separacja i oczyszczanie izotoniczne
	<ol>
		<li>Przenieść zebrany roztwór resztek mieliny do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dostosować objętość do 35 ml za pomocą wstępnie schłodzonego sterylnego buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przenieś roztwór do nowego sterylnego homogenizatora o pojemności 50 ml i homogenizuj przez 2 minuty, aby uzyskać homogenat.</li>
		<li>Rozprowadź równomiernie resztki mieliny w sześciu sterylnych cienkościennych probówkach ultrawirówek polipropylenowych o pojemności 38,5 ml, dodając sterylny bufor PBS. Poddać probówki wirowaniu w temperaturze 75 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Druga separacja i oczyszczanie izotoniczne
	<ol>
		<li>Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić stały biały osad w 10 ml wstępnie schłodzonego sterylnego buforu PBS w celu uzyskania zawiesiny resztek mieliny. Rozprowadzić zawiesinę równomiernie w dwóch sterylnych, cienkościennych probówkach ultrawirówkowych z polipropylenu o pojemności 38,5 ml, z objętością zrównoważoną przez dodanie sterylnego buforu PBS.</li>
		<li>Odwirować próbki w temperaturze 4 °C i przy 75 000 x g przez 45 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczona kolekcja mieliny
	<ol>
		<li>Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić stały biały osad w 6 ml sterylnego buforu PBS. Zawiesinę resztek mieliny podzielić na sześć probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml, a następnie poddać odwirowaniu w temperaturze 4 °C i 12 000 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić stały biały osad w 100 μl wstępnie schłodzonej, sterylnej, buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie ilościowe pozostałości mieliny
	<ol>
		<li>Pobrać 3 μl zawiesiny resztek mieliny w celu ilościowego określenia zawartości białka za pomocą zestawu do oznaczania ilościowego białka BCA. Pozostałą zawiesinę resztek mieliny należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Fluorescencyjne znakowanie resztek mieliny
<ol>
	<li>Inkubacja estru N-sukcynimidylu dioctanu karboksyfluoresceiny
	<ol>
		<li>Rozmrozić wymagane resztki mieliny w temperaturze 4 °C lub lodowatej wody i odwirować w temperaturze 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić resztki mieliny w 200 μl roztworu estru N-sukcynimidylu dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE; 50 μM).</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Po okresie inkubacji odwirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i przemyć próbki 3x 500 μl sterylnego buforu PBS. Po procesie płukania ponownie zawiesić resztki mieliny w 100 μl wstępnie schłodzonego sterylnego buforu PBS w celu uzyskania zawiesiny fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny, które mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Hodowla mikrogleju
<ol>
	<li>Hodowla komórek BV-2 w nawilżonym 5% CO2 w temperaturze 37 °C w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% (v/v) FBS, penicyliną (100 U/mL) i streptomycyną (100 U/ml). Wysiewaj prawie 50% komórek Bv-2 na płytce 12-dołkowej i 24-dołkowej w celu dalszych testów.</li>
</ol>
4. Wielokrotna stymulacja magnetyczna in vitro
<ol>
	<li>Wykonaj interwencję powtarzanej stymulacji magnetycznej in vitro z następującymi ustawieniami: częstotliwość zabiegu 20 Hz, intensywność zabiegu 1% maksymalnej intensywności wyjściowej (tj. 0,035 Tesli), czas stymulacji 5 s, okres odpoczynku 20 s. Podaj 600 impulsów w czasie pojedynczego zabiegu 2,5 min.</li>
	<li>Podczas stymulacji magnetycznej ustaw środek cewki w jednej linii ze środkiem płytki hodowlanej i upewnij się, że cewka ściśle przylega do dna płytki hodowlanej.
	<ol>
		<li>Określ z góry parametry stymulacji magnetycznej i ustal kierunek cewki stymulacji magnetycznej tak, aby była prostopadła do podłoża i zorientowana w kierunku do góry. Wysterylizuj cewkę stymulacji magnetycznej alkoholem, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek.</li>
		<li>Następnie wyjmij płytkę do hodowli komórkowej z inkubatora i umieść ją nad cewką stymulacji magnetycznej w celu stymulacji magnetycznej. Wysterylizuj płytkę, spryskując ją alkoholem, a następnie włóż ją z powrotem do inkubatora. Utrzymuj płytkę przykrytą przez cały proces.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Badanie fagocytozy mikrogleju resztek mieliny
<ol>
	<li>Powtórny zabieg stymulacji magnetycznej dla grupy LPS+rMS
	<ol>
		<li>Użyj CFSE (50 μM) do oznakowania resztek mieliny w celu oceny fagocytozy. Płytka 1 x 104 komórki BV-2 na płytkach 24-dołkowych przez noc. Zmień pożywkę na pożywkę bez surowicy i traktuj komórki lipopolisacharydem (LPS; 1 μg/ml) przez 12 godzin. Delikatnie odessać starą pożywkę za pomocą pipety, a następnie natychmiast dodać nową pożywkę bez surowicy za pomocą pipety.</li>
		<li>Po 12-godzinnym okresie interwencji LPS dodaj resztki mieliny (100 μg/ml) do pożywki w celu kohodowli w ciemnych warunkach. Poddaj komórki powtarzającym się interwencjom stymulacji magnetycznej, jak opisano w kroku 4.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunofluorescencja i obrazowanie
	<ol>
		<li>Delikatnie przemyć niezaadsorbowane resztki mieliny PBS i utrwalić komórki 4% PFA przez 15 minut. Zablokować komórki PBS zawierającym 10% albuminy surowicy osła i 0,3% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, następnie przemyć PBS i inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (IBA-1, 1:200) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi (1: 300, mysz) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego 40x i 20x.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Osso, L. A., Hughes, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mature+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mature myelin.</a> Nat Neurosci. 27 (8), 1449-1461 (2024).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+debris+phagocytosis+in+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Myelin debris phagocytosis in demyelinating disease.</a> Glia. 72 (11), 1934-1954 (2024).</li>
<li>Kopper, T. J., Gensel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+as+an+inflammatory+mediator%3A+Myelin+interactions+with+complement%2C+macrophages%2C+and+microglia+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury.</a> J Neurosci Res. 96 (6), 969-977 (2018).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+microglia+and+macrophages+in+brain+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurosci+Ther%22%5BJournal%5D)">Phagocytic microglia and macrophages in brain injury and repair.</a> CNS Neurosci Ther. 28 (9), 1279-1293 (2022).</li>
<li>Filbin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin-associated+inhibitors+of+axonal+regeneration+in+the+adult+mammalian+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Myelin-associated inhibitors of axonal regeneration in the adult mammalian CNS.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (9), 703-713 (2003).</li>
<li>Sen, M. K., Mahns, D. A., Coorssen, J. R., Shortland, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+microglia+and+astrocytes+in+phagocytosis+and+myelination%3A+Insights+from+the+cuprizone+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The roles of microglia and astrocytes in phagocytosis and myelination: Insights from the cuprizone model of multiple sclerosis.</a> Glia. 70 (7), 1215-1250 (2022).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglial+phagocytosis+in+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of microglial phagocytosis in ischemic stroke.</a> Front Immunol. 12, 790201(2021).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology of microglia.</a> Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+nanovesicle+protects+against+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+enhancing+myelin+clearance+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22ACS%22%5BJournal%5D)">Neutrophil nanovesicle protects against experimental autoimmune encephalomyelitis through enhancing myelin clearance by microglia.</a> ACS. 16 (11), 18886-18897 (2022).</li>
<li>Cignarella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+activation+on+microglia+promotes+myelin+debris+clearance+and+remyelination+in+a+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">TREM2 activation on microglia promotes myelin debris clearance and remyelination in a model of multiple sclerosis.</a> Acta Neuropathol. 140 (4), 513-534 (2020).</li>
<li>Dufor, T., Lohof, A. M., Sherrard, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+stimulation+as+a+therapeutic+approach+for+brain+modulation+and+repair%3A+Underlying+molecular+and+cellular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Magnetic stimulation as a therapeutic approach for brain modulation and repair: Underlying molecular and cellular mechanisms.</a> Int J Mol Sci. 24 (22), 16456(2023).</li>
<li>Martin, D. M., McClintock, S. M., Forster, J. J., Lo, T. Y., Loo, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+enhancing+effects+of+rTMS+administered+to+the+prefrontal+cortex+in+patients+with+depression%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+individual+task+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Depress+Anxiety%22%5BJournal%5D)">Cognitive enhancing effects of rTMS administered to the prefrontal cortex in patients with depression: A systematic review and meta-analysis of individual task effects.</a> Depress Anxiety. 34 (11), 1029-1039 (2017).</li>
<li>Kamo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+peripheral+magnetic+stimulation+for+impairment+and+disability+in+people+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+Syst+Rev%22%5BJournal%5D)">Repetitive peripheral magnetic stimulation for impairment and disability in people after stroke.</a> Cochrane Database Syst Rev. 9 (9), CD011968(2022).</li>
<li>Wang, Y., Wang, L., Ni, X., Jiang, M., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+repetitive+transcranial+magnetic+stimulation+with+different+application+parameters+for+post-stroke+cognitive+impairment%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Fron+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Efficacy of repetitive transcranial magnetic stimulation with different application parameters for post-stroke cognitive impairment: A systematic review.</a> Fron Neurosci. 18, 1309736(2024).</li>
<li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+magneto-acoustic+stimulation+attenuates+synaptic+plasticity+impairment+through+the+activation+of+Piezo1+in+alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Research%22%5BJournal%5D)">Transcranial magneto-acoustic stimulation attenuates synaptic plasticity impairment through the activation of Piezo1 in alzheimer's disease mouse model.</a> Research. 6, 0130(2023).</li>
<li>Zhai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+trans-spinal+magnetic+stimulation+promotes+microglial+phagocytosis+of+myelin+debris+after+spinal+cord+injury+through+LRP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Repeated trans-spinal magnetic stimulation promotes microglial phagocytosis of myelin debris after spinal cord injury through LRP-1.</a> Exp Neurol. 379, 114844(2024).</li>
<li>Qin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+transcranial+magnetic+stimulation+ameliorates+cognitive+deficits+in+mice+with+radiation-induced+brain+injury+by+attenuating+microglial+pyroptosis+and+promoting+neurogenesis+via+BDNF+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Comm+Signal%22%5BJournal%5D)">Repetitive transcranial magnetic stimulation ameliorates cognitive deficits in mice with radiation-induced brain injury by attenuating microglial pyroptosis and promoting neurogenesis via BDNF pathway.</a> Cell Comm Signal. 22 (1), 216(2024).</li>
<li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+astrocytes+responses+contribute+to+alleviating+inflammatory+damage+by+repetitive+transcranial+magnetic+stimulation+in+rats+with+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia and astrocytes responses contribute to alleviating inflammatory damage by repetitive transcranial magnetic stimulation in rats with traumatic brain injury.</a> Neurochem Res. 49 (9), 2636-2651 (2024).</li>
<li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+transcranial+magnetic+stimulation+improves+neurological+function+and+promotes+the+anti-inflammatory+polarization+of+microglia+in+ischemic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Repetitive transcranial magnetic stimulation improves neurological function and promotes the anti-inflammatory polarization of microglia in ischemic rats.</a> Front Cell Neurosci. 16, 878345(2022).</li>
<li>Jannati, A., Oberman, L. M., Rotenberg, A., Pascual-Leone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+mechanisms+of+brain+plasticity+by+transcranial+magnetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Assessing the mechanisms of brain plasticity by transcranial magnetic stimulation.</a> Neuropsychopharmacol. 48 (1), 191-208 (2023).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+theta-burst+stimulation+improves+motor+function+by+inhibiting+neuronal+pyroptosis+and+regulating+microglial+polarization+via+TLR4%2FNF%CE%BAB%2FNLRP3+signaling+pathway+in+cerebral+ischemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammat%22%5BJournal%5D)">Intermittent theta-burst stimulation improves motor function by inhibiting neuronal pyroptosis and regulating microglial polarization via TLR4/NFκB/NLRP3 signaling pathway in cerebral ischemic mice.</a> J Neuroinflammat. 19 (1), 141(2022).</li>
<li>Eichler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cytokines+mediate+plasticity+induced+by+10+Hz+repetitive+magnetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial cytokines mediate plasticity induced by 10 Hz repetitive magnetic stimulation.</a> J Neurosci. 43 (17), 3042-3060 (2023).</li>
<li>Kent, S. A., Miron, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+regulation+of+central+nervous+system+myelin+health+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia regulation of central nervous system myelin health and regeneration.</a> Nat Rev Immunol. 24 (1), 49-63 (2024).</li>
<li>Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+multiple+sclerosis%3A+Protectors+turn+destroyers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia in multiple sclerosis: Protectors turn destroyers.</a> Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).</li>
<li>Sarlus, H., Heneka, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease.</a> J Clin Invest. 127 (9), 3240-3249 (2017).</li>
<li>Cantuti-Castelvetri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+cholesterol+clearance+limits+remyelination+in+the+aged+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defective cholesterol clearance limits remyelination in the aged central nervous system.</a> Science. 359 (6376), 684-688 (2018).</li>
<li>Norton, W. T., Poduslo, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain%3A+Method+of+myelin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain: Method of myelin isolation.</a> J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+An+immunobiologic+process%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: An immunobiologic process.</a> Immunity. 44 (3), 463-475 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powtarzalna stymulacja magnetyczna (rMS) to nieinwazyjna technika neurostymulacji, która jest szeroko stosowana w leczeniu różnych zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych, w tym zaburzeń poznawczych, choroby Alzheimera (AD), udaru, uszkodzenia mózgu i urazu rdzenia kręgowego (SCI). rMS wykorzystuje pulsacyjne pole magnetyczne do modulowania potencjału błonowego neuronów, selektywnie wpływając na pobudliwość neuronalną w układzie nerwowym11. Oprócz wpływu na neurony, wykazano, że rMS reguluje f...

Mielina to stabilna, rurkowata struktura błonowa otaczająca aksony wytwarzane przez oligodendrocyty w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Ta osłonka mielinowa odgrywa kluczową rolę w ułatwianiu szybkiej i wydajnej propagacji potencjałów czynnościowych1. Jednak różne zaburzenia neurologiczne, takie jak stwardnienie rozsiane (SM), udar mózgu i urazy urazowe, w tym uraz rdzenia kręgowego (SCI) i urazowe uszkodzenie mózgu (TBI), mogą prowadzić do utraty integralności mieliny. Powoduje to powstawanie szczątków mieliny w wyniku przerwania osłonki mielinowej i bezpośredniego uszkodzenia struktur mielinowych2,3,4. Nagromadzenie resztek mieliny nie tylko utrudnia remielinizację i regenerację funkcjonalną, ale także zaostrza stan zapalny układu nerwowego5,6. Dlatego skuteczne usuwanie resztek mieliny jest niezbędne do rozwiązania zapalenia układu nerwowego, promowania regeneracji aksonów i przywracania homeostazy w układzie nerwowym po chorobach neurologicznych.
Szczątki mieliny są głównie usuwane przez fagocyty, takie jak makrofagi i mikroglej w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Mikroglej, rezydujące komórki odpornościowe OUN, stale badają swoje środowisko pod kątem potencjalnych zagrożeń i chronią OUN, usuwając uszkodzoną mielinę i resztki mieliny. Co więcej, fagocytoza mikrogleju odgrywa kluczową rolę w promowaniu neurogenezy poprzez usuwanie zanieczyszczeń7,8. Coraz więcej dowodów sugeruje, że zwiększenie fagocytozy mikrogleju resztek mieliny może złagodzić szkodliwe skutki stanu zapalnego, zmniejszyć uszkodzenie OUN i promować regenerację aksonów po uszkodzeniu nerwów. 4,9,10.
Terapia stymulacją magnetyczną, nieinwazyjna technika neuromodulacji, zyskała szerokie zastosowanie w leczeniu różnych zaburzeń neurologicznych11. Warto zauważyć, że powtarzająca się przezczaszkowa stymulacja magnetyczna (rTMS) okazała się obiecującym podejściem terapeutycznym w chorobie Alzheimera (AD), urazie mózgu i udarze12,13,14. Niedawne badanie wykazało, że rTMS może zwiększać fagocytozę mikrogleju beta-amyloidu (Aβ) i apolipoproteiny E (ApoE), hamując w ten sposób patologiczny postęp AD w modelach zwierzęcych15. Podobnie, nasze ostatnie badania wykazały, że powtarzająca się przezrdzeniowa stymulacja magnetyczna (rTSMS) sprzyja fagocytozie mikrogleju resztek mieliny po urazie rdzenia kręgowego u szczurów16.
Niemniej jednak, wpływ powtarzającej się stymulacji magnetycznej na mikroglej został głównie potwierdzony za pomocą eksperymentalnych modeli na zwierzętach17,18,19. Rzeczywiście, wykazano, że stymulacja magnetyczna moduluje pobudliwość neuronów poprzez indukcję prądów20. W związku z tym nie można pominąć faktu, że interakcja między neuronami a mikroglejem może wpływać na funkcję mikrogleju. W związku z tym konieczne jest przeprowadzenie eksperymentów in vitro w celu ustalenia, czy wpływ stymulacji magnetycznej na mikroglej jest niezależny od zmiany pobudliwości neuronalnej. Ostatnie badania zidentyfikowały modulacyjny wpływ powtarzalnej stymulacji magnetycznej na mikroglej w modelach eksperymentalnych. Niektóre badania wykazały, że powtarzająca się stymulacja magnetyczna może sprzyjać polaryzacji mikrogleju w kierunku M219,21. Jednak dalsze badania nad jego funkcją mikrogleju nie zostały jeszcze wyjaśnione. Warto zauważyć, że Amelie Eichler i in. interweniowali w wycinkach tkanki mózgowej in vitro przy użyciu stymulacji magnetycznej 10 Hz i odkryli, że stymulacja magnetyczna 10 Hz była w stanie promować uwalnianie cytokin z mikrogleju, aby wpływać na pobudliwość i plastyczność neuronów22. Chociaż badanie to poszerzyło wiedzę na temat wpływu stymulacji magnetycznej na mikroglej, konieczne są dalsze badania na poziomie komórkowym, aby w pełni wyjaśnić jej mechanizmy.
Dlatego ustaliliśmy protokół sprawdzający, czy stymulacja magnetyczna może promować fagocytozę resztek mieliny in vitro. W przeciwieństwie do szczątków mieliny po chorobie lub uszkodzeniu tkanek, które są produktem urazu, szczątki mieliny użyte w tym eksperymencie to kształt osłonki mielinowej po jej rozpadzie. Ponadto koncepcja szczątków mieliny jest produktem rozpadu mieliny. Jako pierwotne komórki fagocytarne mózgu, mikroglej odgrywa kluczową rolę w usuwaniu uszkodzonych komórek i resztek mieliny23, co jest związane z chorobami takimi jak stwardnienie rozsiane i choroba Alzheimera24,25. Wykazano, że nagromadzenie resztek mieliny zaostrza stan zapalny układu nerwowego i utrudnia regenerację26. Celem badania jest zbadanie potencjału stymulacji magnetycznej w celu wzmocnienia fagocytozy mikrogleju resztek mieliny, zmniejszając w ten sposób stan zapalny nerwów i wspierając regenerację OUN w stanach neurodegeneracyjnych i urazowych. Podsumowując, w badaniu zastosowano podejście oparte na kokulturze, w którym mikroglej jest hodowany wspólnie z resztkami mieliny i przeprowadzana jest wielokrotna stymulacja magnetyczna w celu zweryfikowania wpływu powtarzalnej stymulacji magnetycznej na zdolność fagocytarną mikrogleju.

<table><tbody><tr><td>Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI</td><td>Beyotime, Chiny</td><td>P0131</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw BCA</td><td>ThermoFisher Scientific, Ameryka</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Bv-2 komórka</td><td>ATCC</td><td>CBP60922</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa 12-dołkowe płytki</td><td>Biofil, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa 24-dołkowe płytki</td><td>Biofil, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokalne skanowanie laserowe Mikroskop</td><td>Zeiss, Niemcy</td><td>800</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do stałej temperatury</td><td>ThermoFisher Scientific, Ameryka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>MedChemExpress, Ameryka</td><td>HY-158820</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka DMEM</td><td>KeyGen, Chiny</td><td>KGL1202-500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, Ameryka</td><td>16250078</td><td></td></tr><tr><td>Iba1</td><td>Abcam, Ameryka</td><td>ab48004</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do stymulacji magnetycznej</td><td>Yiruide, Chiny</td><td>CCY-IA</td><td></td></tr><tr><td>Cewka do stymulacji magnetycznej</td><td>Yiruide, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>BioSharp, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>KeyGen, Chiny</td><td>KGL2210-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco, Ameryka</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>MedChemExpress, Ameryka</td><td>HY-B1779</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>KeyGen, Chiny</td><td>KGL2107-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman, Ameryka</td><td>L-100XP</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena fagocytozy mikrogleju resztek mieliny in vitro pod wpływem wielokrotnej stymulacji magnetycznej

Assessing Microglial Phagocytosis of Myelin Debris in vitro Under Repeated Magnetic Stimulation

Mikroglej, fagocyty rezydentne ośrodkowego układu nerwowego (OUN), odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu integralności i homeostazy OUN poprzez usuwanie uszkodzonych komórek, resztek komórkowych i resztek mieliny. Nagromadzenie resztek mieliny jest związane z szeregiem zaburzeń OUN, w tym stwardnieniem rozsianym, chorobą Alzheimera, urazowym uszkodzeniem mózgu i uszkodzeniem rdzenia kręgowego. Obecność resztek mieliny nie tylko zaostrza stan zapalny układu nerwowego, ale także hamuje potencjał regeneracyjny mieliny. Dlatego zwiększenie zdolności mikrogleju do usuwania resztek mieliny poprzez fagocytozę stanowi obiecującą strategię terapeutyczną. Stymulacja magnetyczna stała się innowacyjną metodą leczenia chorób OUN, a coraz więcej dowodów wskazuje na jej potencjał w promowaniu fagocytozy mikrogleju i wspieraniu regeneracji OUN. Aby dokładniej wyjaśnić wpływ stymulacji magnetycznej na usuwanie mikrogleju z resztek mieliny, zaprojektowaliśmy eksperyment in vitro obejmujący kokulturę mikrogleju i szczątków mieliny. Kokulturę poddano powtarzalnej stymulacji magnetycznej w celu oceny jej wpływu na aktywność fagocytarną mikrogleju w kontekście patologii OUN.

W niniejszym badaniu początkowo karmiono komórki mikrogleju BV-2 in vitro, wykorzystując wyizolowane szczątki mieliny pochodzenia mózgowego oraz powtarzalną stymulację magnetyczną w celu zwiększenia ich zdolności fagocytarnych. Następnie komórki mikrogleju BV-2 hodowano i poddano działaniu LPS przed stymulacją magnetyczną, aby w ten sposób naśladować stan mikrogleju in vivo w ramach rygorystycznej walidacji neurologicznej. W dalszej kolejności, po stymulacji LPS, zastosowano interwencję rMS. W celu wery...

Obecny protokół został opracowany do oceny wpływu powtarzalnej stymulacji magnetycznej na zdolność mikrogleju do fagocytozy resztek mieliny. W tym celu stworzono system kohodowli mikrogleju i szczątków mieliny in vitro.

Ocena fagocytozy mikrogleju resztek mieliny in vitro pod wpływem wielokrotnej stymulacji magnetycznej

Microglia, the resident phagocytes of the central nervous system (CNS), play a pivotal role in maintaining CNS integrity and homeostasis by removing ...

[Prowadzący] Zakres naszych badań koncentruje się na badaniach w zakresie neurorehabilitacji i terapii symulacji magnetycznej. Protokół ten może dostarczyć nowych pomysłów na stymulację magnetyczną w badaniu, w jaki sposób wpływa ona na wyraźną funkcję. W przyszłości skupimy się na neurorehabilitacji i terapii stymulacją magnetyczną.[Instruktor] Na początek zdobądź odciętą głowę samicy szczura. Rozetnij głowę na lodzie. Za pomocą nożyczek przetnij czaszkę na pół, aby całkowicie odsłonić mózg i ułatwić jego całkowite usunięcie. Użyj nożyczek i kleszczy, aby skrupulatnie i aseptycznie wyciąć błony, móżdżek i hipokamp. Oczyść mózg trzy razy za pomocą PBS, aby usunąć resztki krwi lub tkanki. Przenieś oczyszczony mózg do 10 mililitrów sterylnego roztworu sacharozy o stężeniu 0,32 molowym. Za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych pokrój tkankę mózgową na kawałki, aby uzyskać mieszaninę tkanki mózgowej i sacharozy. Następnie przenieś mieszaninę tkanki mózgowej i sacharozy do 50-mililitrowego sterylnego homogenizatora. Dodaj 30 mililitrów sterylnego roztworu sacharozy o stężeniu 0,32 mola. Użyj szklanego homogenizatora o pojemności 50 mililitrów, aby zmielić tkankę przez dwie minuty. Aby uzyskać jednorodność gładkiej tkanki mózgowej. Rozcieńczyć tkankę mózgową homogenat do 90 mililitrów sterylnym roztworem sacharozy o objętości 0,32 mola i dokładnie wymieszać. Dodaj 20 mililitrów sterylnego roztworu sacharozy o stężeniu 0,83 mola do sześciu sterylnych, cienkościennych probówek ultrawirówek polipropylenowych. Następnie powoli dozuj 15 mililitrów mieszanki mózgowej do górnej części probówek. Wyrównaj objętości sterylnym roztworem sacharozy o stężeniu 0,32 molowym. Aby zebrać surowe szczątki mieliny, najpierw wstępnie schłodzić i ultra wirować wirnik o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować próbkę o sile 75 000 G przez 45 minut, a następnie zebrać resztki mieliny z granicy faz między dwiema gęstościami sacharozy za pomocą sterylnej pipety pastwiskowej. W celu pierwszej separacji izotonicznej i oczyszczenia przenieś zebrany roztwór resztek mieliny do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Dostosuj objętość do 35 mililitrów za pomocą wstępnie schłodzonego sterylnego PBS i przenieś do nowej probówki homogenizatora. Po homogenizacji przez trzy minuty równomiernie rozprowadź resztki mieliny w sześciu 38,5 mililitrowych, sterylnych, cienkościennych, polipropylenowych probówkach do ultrawirówek. Uzupełnić objętość sterylnym PBS, a następnie odwirować. W celu drugiego izotonicznego rozdziału i oczyszczenia, ponownie zawiesić stały biały osad w 10 mililitrach wstępnie schłodzonego sterylnego PBS, aby uzyskać zawiesinę resztek mieliny. Rozprowadzić zawiesinę do probówek ultrawirówek jak poprzednio i odwirować. Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Zawiesić stały biały osad w sześciu mililitrach sterylnego PBS. Podziel zawiesinę resztek mieliny na sześć 1,5 probówek wirówkowych i ponownie odwiruj. Na koniec ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach wstępnie schłodzonego sterylnego PBS po wyrzuceniu supernatantu. Rozmrozić wymagane resztki mieliny w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub w lodowatej wodzie i odwirować jak poprzednio przez 10 minut. Ponownie zawiesić resztki mieliny w 200 mikrolitrach 50 mikromolowego roztworu CFSE. Zawiesinę inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut, a następnie ponownie odwirować. Odrzucić supernatant, a następnie przemyć próbki trzykrotnie 500 mikrolitrami sterylnego PBS. Ponownie zawiesić resztki mieliny w 100 mikrolitrach wstępnie schłodzonego sterylnego PBS, aby uzyskać zawiesinę fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny. Przechowuj próbkę w temperaturze -80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. W przypadku powtarzającej się stymulacji magnetycznej in vitro ustaw częstotliwość leczenia na 20 Hz, intensywność zabiegu na 1% maksymalnej intensywności wyjściowej, a czas stymulacji na pięć sekund. Uwzględnij okres odpoczynku trwający 20 sekund i podaj 600 impulsów w ciągu jednego czasu zabiegu wynoszącego 2,5 minuty. Po wstępnym określeniu parametrów stymulacji magnetycznej należy ustawić kierunek cewki prostopadle do podłoża i ustawić ją w górę. Wysterylizuj cewkę stymulacji magnetycznej alkoholem, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek. Po dodaniu 50 mikromolowców CFSE, umieść 1000 komórek BV-2 na 24-dołkowych płytkach przez noc, a następnie odessać starą pożywkę pipetą i natychmiast dodać świeżą pożywkę bez surowicy. Zmień pożywkę na pożywkę bez surowicy i traktuj komórki jednym mikrogramem na mililitr lipopolisacharydu przez 12 godzin. Po 12 godzinach interwencji lipopolisacharydowej dodaj 100 mikrogramów na mililitr resztek mieliny do pożywki do kohodowli w ciemności. Poddaj komórki wielokrotnej stymulacji magnetycznej, jak wykazano wcześniej. Rozpyl alkohol na płytkę, aby ją wysterylizować przed powrotem do inkubatora. Po okresie kohodowli z fragmentami mieliny, niewchłonięte resztki mieliny delikatnie przemyj PBS. Napraw komórki 4% paraformaldehydem przez 15 minut. Następnie dodaj 150 mikrolitrów PBS zawierających 10% albuminy surowicy osła i 0,3% Triton X-100 do studzienek i inkubuj. Po umyciu studzienek PBS dodać do studzienek roztwór przeciwciała pierwszorzędowego w stosunku od 100 do 200 i inkubować na zimno. Następnie inkubuj komórki w przeciwciałie drugorzędowym w stosunku od 100 do 300 przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem pod mikroskopem konfokalnym. Komórki mikrogleju BV-2 wykazywały znaczne zmniejszenie fagocytozy resztek mieliny po leczeniu lipopolisacharydami. który został odwrócony po wielokrotnej interwencji stymulacji magnetycznej. Analiza ilościowa potwierdziła znaczny spadek powierzchni szczątków mieliny w komórkach BV-2 w grupie lipopolisacharydowej w porównaniu z kontrolą, ze znaczącym wzrostem w grupie stymulowanej magnetycznie poddawanej działaniu lipopolisacharydu. Odsetek mikrogleju IBA-1 kolokalizowanego z resztkami mieliny był znacznie niższy w grupie LPS w porównaniu z kontrolą, podczas gdy stymulacja magnetyczna znacznie zwiększyła ten odsetek. Zależny od czasu wzrost fagocytozy mikrogleju zaobserwowano w grupie stymulowanej magnetycznie leczonej lipopolisacharydem w naszej grupie wykazującej znacznie wyższy wychwyt resztek mieliny.

assessing-microglial-phagocytosis-myelin-debris-vitro-under-repeated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Ten film demonstruje protokół ekstrakcji komórek mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgach myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek. Protokół obejmuje preparację uszkodzonej tkanki mózgowej zawierającej komórki mikrogleju, potraktowanie tkanki określonymi enzymami w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki oraz wykorzystanie kulek magnetycznych specyficznych dla receptora mikrogleju do wyizolowania komórek mikrogleju.

Izolowanie mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgu myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

Mikroglej to komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) o dużej zdolności do fagocytozy lub pochłaniania materiału w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu opisano szeroko stosowany, wiarygodny i wysoce ilościowy test do wizualizacji i pomiaru pochłaniania składników synaptycznych za pośrednictwem mikrogleju.

Test pochłaniania: protokół oceny interakcji między fagocytami OUN a neuronami

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Prezentujemy metody oceny zdolności fagocytarnej pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny i wewnątrzkomórkowego barwienia kropelkami lipidów.

In vitro Fagocytoza resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.

Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Opisujemy protokół izolowania komórek mikrogleju z podwzgórza myszy (lub równoważnych małych struktur mózgu) za pomocą magnetycznie aktywowanego sortowania komórek (MACS), w stosunkowo krótkim czasie. Mikroglej podwzgórza sortowany przez MACS może być używany do analizy ex vivo i może być posiany w celu przeprowadzenia testów in vitro.

Izolacja mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie

Poznaj metodę oceny fagocytozy mikrogleju resztek mieliny in vitro pod wpływem wielokrotnej stymulacji magnetycznej. Technika ta wykorzystuje linię komórkową BV-2 i wspiera badania nad neurorehabilitacją.

Ocena fagocytozy mikrogleju resztek mieliny in vitro pod wpływem wielokrotnej stymulacji magnetycznej

Przeglądaj więcej filmów