Name: Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Naucz się izolacji żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy. Ta metoda pozwala badać mechanizmy naprawy płuc po infekcji wirusowej i interakcje między komórkami immunologicznymi a nabłonkowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z National Institutes of Health (R35GM150816 i P30DK043351), Fundacji Charlesa H. Hooda i Harvard Stem Cell Institute. Dziękujemy Alexandrowi Mannowi i wszystkim pozostałym członkom laboratorium Franklina za ich pomoc i rady w projektowaniu i udoskonalaniu schematów bramkowania cytometrii przepływowej i analiz. Dziękujemy również Immunology Flow Cytometry Core w Harvard Medical School. Analizę cytometrii przepływowej przeprowadzono przy użyciu FlowJo. Schematy rysunkowe zostały stworzone przy użyciu oprogramowania BioRender.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Harvard Medical School (numery grantów: R35GM150816 i P30DK043351). Do eksperymentów wykorzystano samice myszy C57BL/6J w wieku 8-12 tygodni. Ten protokół jest również odpowiedni dla samców myszy. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Rozmrozić niezbędne enzymy na lodzie, w tym dyspazę, liberazę i DNAzę.</li>
	<li>Przygotuj inne niezbędne odczynniki. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml 5 ml 2 mM EDTA w DPBS i wyposaż ją w igłę 27 G. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml DPBS i podłącz cewnik.</li>
</ol>
2. Zbieranie płuc
<ol>
	<li>Rozpocznij eutanazję myszy od wstrzyknięcia dootrzewnowego mieszaniny 400-500 mg/kg i 25-100 mg/kg ketaminy/ksylazyny (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Kontynuuj sekcję, gdy mysz przestanie reagować na uszczypnięcie poduszki stopy (~5 min). 
	UWAGA: Do eutanazji stosuje się mieszaninę ketaminy i ksylazyny zamiast dwutlenku węgla, aby zapobiec krwotokowi wywołanemu uduszeniem i infiltracji komórek odpornościowych, która może zakłócić wyniki. Krok 2.3 służy jako drugorzędna fizyczna metoda eutanazji.</li>
	<li>Spryskaj mysz 70% etanolem. Wypreparuj mysz za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych i kleszczy #7. Wykonaj nacięcie w jamie brzusznej za pomocą nożyczek i przetnij bocznie otrzewną.
	<ol>
		<li>Wykonaj małe nacięcie w membranie, aby uwolnić podciśnienie. Wytnij przeponę i dolną klatkę piersiową z jamy ciała, aby odsłonić płuca i serce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać perfuzję płuc za pomocą 5 ml 2 mM EDTA w DPBS w strzykawce o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę 27 G. Perfuzja odbywa się poprzez wejście igły do podstawy serca, skierowaną z lewej komory do prawej komory i powolne dozowanie płynu ze strzykawki18. 
	UWAGA: Perfuzja powinna być wykonywana powoli, aby zapobiec pęknięciu układu krwionośnego.</li>
	<li>Otwórz klatkę piersiową na mostku, odcinając boki klatki piersiowej, a następnie przetnij pionowo mostek, aby odsłonić tchawicę19. Odetnij jak najwięcej mięśni i tkanki łącznej za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy #7 bez nakłuwania tchawicy lub płuc.</li>
	<li>Owiń tchawicę szwem (rozmiar 2-0) tak, jakby chciał go związać, ale bez zaciskania. Odciąć tchawicę z boku i wprowadzić cewnik. Szczelnie zamocuj szew wokół cewnika, mocno naciągając szew. Nie należy wprowadzać cewnika na więcej niż 1 cm do płuc.</li>
	<li>Napompuj płuca 1 ml DPBS. Wyciągnąć DPBS, powoli odciągając strzykawkę. Ponownie napompuj płuca tym samym DPBS i ponownie odciągnij strzykawkę, aby pobrać płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF).</li>
	<li>Odłączyć strzykawkę od cewnika, pozostawiając cewnik włożony. Dozować BALF do probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Napełnij tę samą strzykawkę o pojemności 1 ml 1 ml dypazy i ponownie podłącz do cewnika. Dozować strzykawkę, aby napełnić płuca za pomocą dipozy. Podczas wyjmowania cewnika zaciśnij szew wokół tchawicy, aby zapobiec wyciekowi dypasy.</li>
	<li>Przeciąć tchawicę bocznie. Usuń płuca z jamy ciała, przecinając tkankę łączną wzdłuż tylnej części klatki piersiowej, używając kleszczy do pociągnięcia płuc i tchawicy do góry.</li>
	<li>Usuń serce z płuc. Umieść płuca w 5 ml DPBS na lodzie.</li>
	<li>Na tym etapie wziąć oddzielony BALF i wirować w dół przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant może być podany i przechowywany w zależności od potrzeb. Powinna być widoczna osadka komórkowa, którą można zawiesić w 100 μl RPMI. 
	UWAGA: Na przystąpienie do trawienia można poczekać do 2 godzin, co pozwala na zebranie wielu myszy jednocześnie.</li>
</ol>
3. Trawienie płuc
<ol>
	<li>Przygotuj mieszankę do trawienia. Dodać 83 μg/ml liberazy (50 μl roztworu podstawowego) i 100 μg/ml DNAzy (15 μl roztworu podstawowego) w 3 ml RPMI na płuco.</li>
	<li>Rozetnij pięć płatów płuc i odrzuć tkankę łączną19,20. Posiekaj płuco nożyczkami przez 1 minutę na szklanym szkiełku.</li>
	<li>Przenieść posiekane płuco do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą nożyczek do preparowania. Dodać osad komórkowy odzyskany z BALF i ponownie zawieszony w RPMI do probówki wirówkowej. Dodać 3 ml mieszanki trawiącej do probówki zawierającej próbkę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Pipetować mieszaninę trawienia płuc w górę i w dół 2-3 razy. Umieścić w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min z rurkami wytrawiającymi umieszczonymi pod kątem 45 stopni na 40 min.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
<ol>
	<li>Wyjmij probówki wirówkowe o pojemności 50 ml z wytrząsarki orbitalnej i umieść je na lodzie. Pipetować mieszankę trawienia płuc w górę iw dół 5-6 razy. Przefiltruj przez sitko o pojemności 70 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml. Umyj pozostałe komórki przez filtr i zneutralizuj enzymy za pomocą 10 ml 5% FBS w RPMI.</li>
	<li>Wirować przez 5 min w 4 °C przy 600 x g. Odessać supernatant za pomocą aspiratora próżniowego lub pipety. Zawiesić w 1 ml buforu do lizy ACK i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w celu lizy czerwonych krwinek (RBC). Dodaj 9 ml PBS i pipetuj w górę iw dół.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 600 x g. Odessać supernatant za pomocą aspiratora próżniowego lub pipety. Zawiesić w 1 ml buforu FACS (1% FBS w PBS) i przefiltrować przez siatkę 64 μm do probówki mikrowirówkowej za pomocą pipety p1000.</li>
</ol>
5. Cytometria przepływowa i dalsze analizy
<ol>
	<li>Jeśli wykonujesz cytometrię przepływową lub sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją na 96-dołkowej płytce, wybarwij około 1-2 miliony komórek na dołek lub 8% frakcji zawiesiny płuc.</li>
	<li>Zakręć komórkami w dół. Wszystkie wirowania w 96-dołkowej płytce powinny być wykonywane przez 2,5 minuty (4 °C) w temperaturze 600 x g. Strząsnąć supernatant i przemyć komórki jeden raz, ponownie zawieszając w 200 μl DPBS. Obróć w dół i przesuń.</li>
	<li>Jeśli komórki mają być barwione do analizy cytometrii przepływowej, należy postępować zgodnie z następującą procedurą barwienia.
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w żywym/martwym barwniku Zombie (1:150) i bloku Fc (1:250) w 25 μl DPBS na 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę do barwienia przeciwciał w stężeniu 2x w buforze FACS. 
		UWAGA: Mieszanina barwiąca powinna zawierać wszystkie markery w panelu szpikowym (Tabela 1) lub panelu nabłonkowym (Tabela 2) w ich wskazanych stężeniach.</li>
		<li>Dodać 25 μl mieszanki barwiącej do 25 μl zawiesiny płucnej w płytce i inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności. Całkowita objętość barwienia powinna teraz wynosić 50 μl, a przeciwciała pierwszorzędowe powinny być na poziomie końcowego stężenia 1x barwienia.</li>
		<li>Dodać 150 μl buforu FACS, wirować przez 2,5 minuty w temperaturze 4 °C przy 600 x g i strzepać supernatant. Przemyć dwukrotnie w 200 μl buforu FACS.</li>
		<li>Jeśli wymagane jest barwienie wewnątrzkomórkowe, przymocuj komórki za pomocą wewnątrzkomórkowego zestawu do utrwalania. Jeśli barwienie wewnątrzkomórkowe nie jest wymagane, komórki można utrwalić na 20 minut w 4% PFA w DPBS.</li>
		<li>Utrwalacz zmyć trzykrotnie 200 μl buforu FACS. Próbki mogą być przechowywane w stanie zawieszonym w 200 μl buforu FACS w temperaturze 4 °C w ciemności przez 2-3 dni. Przed uruchomieniem próbek można dodać kulki zliczające w celu ilościowego określenia liczby komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli komórki mają zostać posortowane, postępuj zgodnie z następującą procedurą barwienia.
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 1x barwiącej mieszance przeciwciał z blokiem Fc (1:250). Inkubować przez 30 minut na lodzie w ciemności.</li>
		<li>Dodać 150 μl buforu FACS, wirować przez 2,5 minuty w temperaturze 4 °C przy 600 x g i strzepać supernatant. Przemyć trzykrotnie 200 μl buforu FACS i ponownie zawiesić w 200 μl buforu FACS przed sortowaniem. 
		UWAGA: Zaleca się dodanie do komórek barwnika żywotności, takiego jak DAPI, przed sortowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Isolation of Immune and Non&mdash;Immune Cells from Mouse Lungs for Flow Cytometry

<ol><li>Wanner, A., Salathé, M., O'Riordan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucociliary+clearance+in+the+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Mucociliary clearance in the airways.</a> Am J Respir Crit Care Med. 154 (6), 1868-1902 (1996).</li>
<li>Mason, R. J., Williams, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+alveolar+cell.+Defender+of+the+alveolus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">Type II alveolar cell. Defender of the alveolus.</a> Am Rev Respir Dis. 115 (1), 81-91 (1977).</li>
<li>Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+epithelial+type+II+cell%3A+defender+of+the+alveolus+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited.</a> Respir Res. 2 (1), 33-46 (2001).</li>
<li>Basil, M. C., Alysandratos, K. -D., Kotton, D. N., Morrisey, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+repair+and+regeneration%3A+Advanced+models+and+insights+into+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lung repair and regeneration: Advanced models and insights into human disease.</a> Cell Stem Cell. 31 (4), 439-454 (2024).</li>
<li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages%3A+plasticity+in+a+tissue-specific+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nat Rev Immunol. 14 (2), 81-93 (2014).</li>
<li>Gschwend, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+rely+on+GM-CSF+from+alveolar+epithelial+type+2+cells+before+and+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages rely on GM-CSF from alveolar epithelial type 2 cells before and after birth.</a> J Exp Med. 218 (1), e20210745(2021).</li>
<li>Gillich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+cell-type+specialization+in+the+alveolus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary cell-type specialization in the alveolus.</a> Nature. 586 (7831), 785-789 (2020).</li>
<li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nat Commun. 10 (1), 3964(2019).</li>
<li>Chakarov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+interstitial+macrophage+populations+coexist+across+tissues+in+specific+subtissular+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches.</a> Science. 363 (6432), eaat3773(2019).</li>
<li>Tsukui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-producing+lung+cell+atlas+identifies+multiple+subsets+with+distinct+localization+and+relevance+to+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Collagen-producing lung cell atlas identifies multiple subsets with distinct localization and relevance to fibrosis.</a> Nat Commun. 11 (1), 1920(1920).</li>
<li>Aegerter, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza-induced+monocyte-derived+alveolar+macrophages+confer+prolonged+antibacterial+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection.</a> Nat Immunol. 21 (2), 145-157 (2020).</li>
<li>Johansson, C., Kirsebom, F. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+respiratory+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in respiratory viral infections.</a> Mucosal Immunol. 14 (4), 815-827 (2021).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+alveolar+macrophages+autonomously+determine+severe+outcome+of+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived alveolar macrophages autonomously determine severe outcome of respiratory viral infection.</a> Sci Immunol. 7 (71), eabj5761(2022).</li>
<li>Moll, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+transplantation+of+syngeneic+lung+adenocarcinoma+cells+to+study+PD-L1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression.</a> J Vis Exp. (143), e58101(2019).</li>
<li>Warshamana, G. S., Corti, M., Brody, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1%2C+PDGF%2C+TGF-%CE%B21+expression+by+primary+mouse+bronchiolar-alveolar+epithelial+and+mesenchymal+cells%3A+TNF-%CE%B1+induces+TGF-%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">TNF-α, PDGF, TGF-β1 expression by primary mouse bronchiolar-alveolar epithelial and mesenchymal cells: TNF-α induces TGF-β1.</a> Exp Mol Pathol. 71 (1), 13-33 (2001).</li>
<li>Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+murine+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 14 (3), 309-315 (1996).</li>
<li>Quantius, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+infects+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+of+the+distal+lung%3A+Impact+on+Fgfr2b-driven+epithelial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Influenza virus infects epithelial stem/progenitor cells of the distal lung: Impact on Fgfr2b-driven epithelial repair.</a> PLoS Pathog. 12 (5), e1005544(2016).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22BIO+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> BIO Protoc. 11 (8), e3988(2021).</li>
<li>Morton, J., Snider, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+collection+and+processing+of+lungs+from+aged+mice+for+histological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pathobiol+Aging+Age+Relat+Dis%22%5BJournal%5D)">Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies.</a> Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676(2017).</li>
<li>Bijgaart, R. J. E., van den Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+live+imaging+of+lung+metastasis+and+their+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo live imaging of lung metastasis and their microenvironment.</a> J Vis Exp. (108), e53741(2016).</li>
<li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+immune+cells+from+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of immune cells from the liver.</a> Int Immunopharmacol. 85, 106632(2020).</li>
<li>Short, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+damages+the+alveolar+barrier+by+disrupting+epithelial+cell+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Influenza virus damages the alveolar barrier by disrupting epithelial cell tight junctions.</a> Eur Respir J. 47 (3), 954-966 (2016).</li>
<li>Laidlaw, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+help+guides+formation+of+CD103%2B+lung-resident+memory+CD8%2B+T+cells+during+influenza+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell help guides formation of CD103+ lung-resident memory CD8+ T cells during influenza viral infection.</a> Immunity. 41 (4), 633-645 (2014).</li>
<li>D'Agostino, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+isolation+and+characterization+of+lung+tissue-resident+memory+T+cells+and+airway-trained+innate+immunity+after+intranasal+vaccination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for isolation and characterization of lung tissue-resident memory T cells and airway-trained innate immunity after intranasal vaccination in mice.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101652(2022).</li>
<li>Waal, A. M., de Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+cells+interact+with+immune+cells+and+bacteria+to+shape+the+microenvironment+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis.</a> Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).</li>
<li>Bhattacharya, J., Westphalen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-epithelial+interactions+in+pulmonary+alveoli%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli.</a> Semin Immunopathol. 38 (4), 461-469 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten określa trawienie płuc myszy, które izoluje około 20-25 milionów komórek na mysz z 90%-95% żywotnością. Dodatkowo pozwala na pobieranie BALF do dalszej analizy. Otrzymana zawiesina komórek jest kompatybilna z wieloma technikami laboratoryjnymi, w tym cytometrią przepływową i sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją w celu wyizolowania komórek do sekwencjonowania lub hodowli komórek. Krótko, po perfuzji, zbiera się BALF, a płuca są napełniane dypazą. Płuca są następnie siekane i trawione w roztworze libe...

Płuco składa się z dróg oddechowych, pęcherzyków płucnych i śródmiąższu. Komórki immunologiczne i nieimmunologiczne znajdują się w tych przedziałach, przyczyniając się zarówno do homeostatycznej funkcji płuc (wymiany gazowej), jak i obrony gospodarza przed zniewagami środowiskowymi, takimi jak infekcje wirusowe. Duże i małe drogi oddechowe, czyli oskrzela i oskrzeliki, są wyściełane komórkami nabłonkowymi. Dominującymi komórkami nabłonkowymi w tych regionach są komórki maczugowe i rzęskowe, które są odpowiedzialne za wydzielanie cząsteczek ochronnych i ułatwianie klirensu śluzowo-rzęskowego1. Pęcherzyki płucne są najbardziej dystalnymi strukturami w płucach, wyściełanymi dwoma typami komórek nabłonkowych, komórkami pęcherzyków płucnych typu I (ATI) i komórkami pęcherzyków płucnych typu II (ATII). ATI są odpowiedzialne za wymianę gazową, a ATII wydzielają i poddają recyklingowi środki powierzchniowo czynne, aby zapewnić odpowiednie napięcie powierzchniowe2,3. ATII są samoodnawiające się i mogą również różnicować się w ATI, co jest szczególnie istotne po uszkodzeniu płuc4. Dodatkowo, ATII zapewniają wspierającą niszę dla głównego typu komórek odpornościowych zasiedlającego niszę pęcherzykową, makrofagów pęcherzykowych (AMs)5,6. Poza nabłonkiem fibroblasty, komórki śródbłonka i makrofagi śródmiąższowe (IM) (które mogą być związane zarówno z nerwami, jak i naczyniami) tworzą śródmiąższ7,8,9,10. W odpowiedzi na infekcję i uraz liczne komórki płuc obumierają, a komórki odpornościowe, w tym monocyty i neutrofile, infiltrują do tkanki11,12. Monocyty naciekające płuca różnicują się w makrofagi i mogą przyczyniać się do długoterminowego rozwoju kompartmentu makrofagów13.
Obecne metody przygotowania zawiesin jednokomórkowych z płuc myszy są zazwyczaj oparte na kolagenazie i wymagają fizycznej dysocjacji tkanki14. Może to skutkować małą liczbą żywotnych populacji komórek nieodpornych. Niektóre protokoły izolacji komórek nabłonkowych są oparte na dyspazie i dają wyższy odsetek żywych komórek nabłonkowych; Jednak protokoły te na ogół nie badają wydajności i żywotności komórek odpornościowych15,16,17. Cytometria przepływowa jest powszechną metodą stosowaną do rozróżniania populacji komórek w strawionej tkance. Na początku badania bramkowanie metodą cytometrii przepływowej dla AM, IM, monocytów i neutrofili jest wyraźnie zaznaczone. Jednak podczas stanu zapalnego proces bramkowania staje się zmienny i trudny do interpretacji ze względu na kontinuum ekspresji markerów powierzchniowych naciekających monocytów różnicujących się w makrofagi. W związku z tym przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół przedstawia również strategie bramkowania w celu identyfikacji interesujących populacji komórek szpikowych po zakażeniu.
Solidna dysocjacja komórek nabłonka płuc i komórek szpikowych jest niezbędna do rozpoznania ich funkcji homeostatycznych i zapalnych. Metoda równoległego izolowania tych przedziałów komórkowych umożliwi dalsze analizy kluczowych typów komórek, które zarówno utrzymują zdrowie, jak i napędzają chorobę. Schematyczny przegląd przepływu pracy tego protokołu można znaleźć w Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml z końcówką ślizgową</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr><td>probówka do mikrowirówek 1,7 ml</td><td>DOT Scientific</td><td>RN1700-GMT</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 10 ml (jednorazowe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-567-603</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml z końcówką BD Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>75846-756</td><td></td></tr><tr><td>123 sztuk eKoraliki Liczenie koralików</td><td>Thermo Scientific</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 12-kanałowa (30-300UL)</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>7112-3300</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd</td><td>VWR</td><td>100503-917</td><td></td></tr><tr><td>Igła 23 G ze zwykłym skosem</td> Igła <td>VWR</td><td>305194</td><td></td></tr><tr><td>27 G ze zwykłym skosem</td> Pipety <td>VWR</td><td>BD305109</td><td></td></tr><tr><td>5 ml (jednorazowe)</td>Probówki wirówkowe <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>170373</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>28-108</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa okrągła płyta dolna</td><td>Corning</td><td>3797</td><td></td></tr><tr><td>ACK bufor lizujący</td><td>Gibco</td><td>A100492-01</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-mysie CD11c</td><td>BioLegend</td><td>117311</td><td></td></tr><tr><td>Anty-F4/80 Szczurze przeciwciało monoklonalne (PE (fikoerytryna)/Cy7)</td><td>BioLegend</td><td>123114</td><td></td></tr><tr><td>APC anty-mysie CD64 (Fc&gamma; RI)</td><td>BioLegend</td><td>139306</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyjanine7 anty-mysie CD45</td><td>BioLegend</td><td>103115</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Osłonowane osłonione cewniki dożylne</td><td>VWR</td><td>381423</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 przeciw myszom I-A/I-E (MHC-II)BioLegend</td><td></td> <td>107632</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 przeciw myszy/człowiekowi CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101235</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Myszy przeciw myszom Violet 605 Ly-6C</td><td>BioLegend</td><td>128036</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 711 przeciw myszom CD45</td><td>BioLegend</td><td>103147</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cd140a (PDGFRA) Przeciwciało monoklonalne (APA5), PE-cyjanina7, eBioscience</td><td>Life Technologies</td><td>25-1401-82</td><td></td></tr><tr><td>CD170 (Siglec F) Przeciwciało monoklonalne (1RNM44N), PE</td><td>Life Technologies</td><td>12170280</td><td></td></tr><tr><td>Sitka komórkowe</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppenodorf</td><td>5910R</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej (DNaza)</td><td>Milipore Sigma</td><td>DN25-100MG</td><td>Rozpuszczona w stężeniu 20 mg/ml w DPBS w postaci roztworu podstawowego przechowywanego w temperaturze -20 °; C</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>VWR</td><td>76176-668</td><td>Rozmrożony raz i przechowywany jako 1 ml porcji w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne (Dumont #7)</td><td>Narzędzia do nauki</td> pięknej <td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Narzędzia do nauki o naprawie</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Zestaw</td><td></td> do mocowania eBioscience 14190250 <td></td></tr><tr><td>Life</td><td>Technologies</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>TX89125170HU</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GeminiBio</td><td>100-106</td><td>Rozmrożony raz i inaktywowany termicznie przed długotrwałym przechowywaniem w postaci podwielokrotności w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>FITC Anti-Mouse CD31 Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>102406</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-875-093</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>podstawowe Fisher Scientific</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>zbiornik z podziałką</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1930-2235</td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>Corning</td><td>432128</td><td></td></tr><tr><td>Wstrzyknięcie hydrocholozydu ketaminy (100 mg / ml)</td> <td>Dechra Mieszanina</td><td></td><td>eutanazji ketaminy i ksylazyny może być przechowywana w 30 mg / ml chlorowodorku ketaminy i 4,5 mg / ml ksylazyny w sterylnych DPBS przez okres do jednego miesiąca.</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401119001</td><td>rozpuszczony w stężeniu 5 mg/ml w DPBS w postaci roztworu podstawowego przechowywanego w temperaturze -20 °; C</td></tr><tr><td>Pokrywki do płytek 96-dołkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-731</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora orbitalnego</td><td>Barnstead Lab-Line</td><td>SHKE4000</td><td></td></tr><tr><td>pipeta p1000</td><td>Eppenodorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>p1000 końcówki</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>pipeta p200</td><td>końcówki Eppenodorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>p200</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1110-1700</td><td></td></tr><tr><td>PE anty-mysie CD326 (Ep-CAM)</td><td>BioLegend</td><td>118206</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie PerCP/Cyjanina5,5</td><td>BioLegend</td><td>123614</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cyjanina5,5 anty-mysie Ly-6G</td><td>BioLegend</td><td>127616</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid&nbsp;</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony anty-mysz CD16/32 </td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>Określany jako "blok Fc" w tekście </td></tr><tr><td>Butelka ze spryskiwaczem</td><td>VWR</td><td>23609-182</td><td></td></tr><tr><td>Szew (rozmiar 2-0)</td><td>VWR</td><td>100190-026</td><td></td></tr><tr><td>Podkłady</td><td>VWR</td><td>56617-014</td><td></td></tr><tr><td>Xysed (ksylazyna 100mg/mL)</td><td>Pivetal</td><td></td><td>Zobacz nuty hydrocholorydu ketaminy powyżej.&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do naprawy Zombie Aqua BioLegend</td><td></td><td>423102</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung

Płuco jest stale narażone na patogeny i inne szkodliwe bodźce środowiskowe, co czyni je podatnym na uszkodzenia, dysfunkcje i rozwój chorób. Badania wykorzystujące mysie modele infekcji dróg oddechowych, alergii, zwłóknienia i raka miały kluczowe znaczenie dla ujawnienia mechanizmów progresji choroby i zidentyfikowania celów terapeutycznych. Jednak większość badań skoncentrowanych na płucach myszy priorytetowo traktuje izolację komórek odpornościowych lub komórek nabłonkowych, a nie obu populacji jednocześnie. W tym miejscu opisujemy metodę przygotowania kompleksowej zawiesiny pojedynczej komórki zarówno populacji immunologicznych, jak i nieimmunologicznych, nadającej się do cytometrii przepływowej i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją. Populacje te obejmują komórki nabłonkowe, komórki śródbłonka, fibroblasty i różne podzbiory komórek szpikowych. Protokół ten pociąga za sobą płukanie oskrzeli i pęcherzyków płucnych, a następnie napompowanie płuc za pomocą dypazy. Płuca są następnie trawione w mieszaninie liberazy. Ta metoda przetwarzania uwalnia wiele różnych typów komórek i skutkuje zawiesiną pojedynczej komórki, która nie wymaga ręcznej dysocjacji od filtra, sprzyjając przeżyciu komórek i uzyskując dużą liczbę żywych komórek do dalszych analiz. W tym protokole definiujemy również schematy bramkowania dla podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych zarówno w płucach nieleczonych, jak i zakażonych grypą. Jednoczesna izolacja żywych komórek immunologicznych i nieimmunologicznych jest kluczem do badania przesłuchów międzykomórkowych i głębszego zrozumienia biologii płuc w zdrowiu i chorobie.

Prawidłowy proces trawienia pozwoli na uzyskanie około 20-25 milionów komórek o żywotności 90%-95%. Jeśli do 8% frakcji płuca dodano około 25 000 kuleczek liczących, kuleczki powinny stanowić 1%-3% zarejestrowanych zdarzeń. Po bramkowaniu singletów około 90%-95% komórek powinno być negatywnych pod względem Zombie Aqua (co wskazuje na żywotność) (Rysunek 2A, Rysunek 3A).
Z komórek CD45+ jako makrofagi definiuje się komórki C...

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

The lung is continuously exposed to pathogens and other noxious environmental stimuli, rendering it vulnerable to damage, dysfunction, and the development ...

Badamy naprawę płuc po infekcji wirusowej. Naszym celem jest zrozumienie mechanizmów, za pomocą których komórki odpornościowe pośredniczą w naprawie nabłonka oraz tego, jak przebudowa po uszkodzeniu wirusowym i późniejsza naprawa może wpłynąć na przyszłe patologie chorobowe. Protokół ten rozwiązuje problem niezgodności trawienia płuc zoptymalizowanego pod kątem komórek nabłonka i zrębu lub komórek odpornościowych.Nasze badania wymagają wyizolowania żywotnych komórek zarówno z przedziałów immunologicznych, jak i nieimmunologicznych. Ponadto zaproponowaliśmy strategię bramkowania dla podzbiorów nabłonka i makrofagów, która, mamy nadzieję, przyniesie korzyści tej dziedzinie. Nasze laboratorium bada wzajemne oddziaływanie między komórkami odpornościowymi i nabłonkowymi w drogach oddechowych w warunkach stanu ustalonego i w odpowiedzi na wyzwania środowiskowe.Naszym ostatecznym celem jest określenie, w jaki sposób najlepiej modulować tę komunikację, aby usprawnić naprawę tkanek i zapobiec rozwojowi choroby. Na początek spryskaj mysz 70% etanolem. Za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych i kleszczy numer siedem wykonaj nacięcie w jamie brzusznej i przetnij bocznie otrzewną.Wykonaj małe nacięcie w membranie, aby uwolnić podciśnienie. Następnie wytnij przeponę i dolną klatkę piersiową z jamy ciała, aby odsłonić płuca i serce. Za pomocą 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27, wykonaj fuzję płuc za pomocą pięciu mililitrów dwumilimolowego EDTA w DPBS.Przeciąć pionowo przez mostek i wzdłuż boków, aby otworzyć klatkę piersiową i odsłonić tchawicę. Użyj cienkich nożyczek i kleszczy numer siedem, aby usunąć jak najwięcej mięśni i tkanki łącznej bez nakłuwania tchawicy lub płuc. Następnie owiń tchawicę szwem 2/0, ustawiając ją tak, jakby chciała ją związać, ale nie dokręcaj.Wykonaj boczne nacięcie w tchawicy i włóż cewnik. Następnie mocno zaciśnij szew, aby zamocować cewnik na miejscu. Napompuj płuca jednym mililitrem DPBS za pomocą strzykawki.Następnie powoli odciągnąć strzykawkę, aby wyciągnąć DPBS. Ponownie napompuj płuca tym samym DPBS i ponownie pociągnij strzykawkę, aby zebrać płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego lub BAL. Odłącz strzykawkę od cewnika, pozostawiając wprowadzony cewnik.Dozuj zebrany zawór do mikroprobówki wirówkowej. Następnie napełnij tę samą strzykawkę o pojemności jednego mililitra jednym mililitrem dypazy. Przymocować strzykawkę do cewnika i napompować płuca za pomocą dypazy.Podczas wyjmowania cewnika zaciśnij szew wokół tchawicy, aby zapobiec wyciekowi dypasy. Za pomocą nożyczek przetnij bocznie tchawicę. Usuń płuca z jamy ciała, przecinając tkankę łączną wzdłuż tylnej części klatki piersiowej, jednocześnie ciągnąc płuca i tchawicę do góry.Następnie usuń serce z płuc. Umieść płuca w pięciu mililitrach DPBS na lodzie. Zawór wirowy o stężeniu 400 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Za pomocą pipety odessać supernatant i ponownie zawiesić granulkę w 100 mikrolitrach RPMI. Na początek wypreparuj pięć płatów płuc pobranych od myszy i wyrzuć tkankę łączną. Posiekaj wypreparowaną tkankę płucną nożyczkami przez minutę na szkiełku podstawowym.Za pomocą nożyczek preparacyjnych przenieś posiekaną tkankę płucną do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie dodaj trzy mililitry mieszanki trawiennej i pipetuj mieszaninę trawienia płuc w górę iw dół dwa do trzech razy. Na koniec dodaj osad komórek odzyskany z BAL ponownie zawieszony w RPMI.Umieść rurkę pod kątem 45 stopni w wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 140 obr./min w 37 stopniach Celsjusza na 40 minut. Po inkubacji wyjmij probówkę z shakera i umieść ją na lodzie. Pipetować mieszaninę trawienia płuc w górę i w dół pięć do sześciu razy.Przefiltruj mieszaninę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Przemyj pozostałe komórki przez filtr i zneutralizuj enzymy za pomocą 10 mililitrów 5% FBS w pożywce RPMI. Odwirować próbkę o sile 600 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odessać supernatant za pomocą aspiratora próżniowego. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze buforu do lizy ACK i inkubować przez trzy minuty w temperaturze pokojowej w celu lizy czerwonych krwinek. Następnie dodaj dziewięć mililitrów PBS i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać roztwór.Ponownie odwiruj próbkę i użyj aspiratora próżniowego, aby usunąć supernatant, a następnie ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze aktywowanego fluorescencją bufora do sortowania komórek. Przefiltrować zawiesinę przez siatkę o wielkości 64 mikrometrów do probówki mikrowirówkowej w celu analizy metodą cytometrii przepływowej.

isolation-live-myeloid-epithelial-cell-populations-from-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek śródbłonka płuc. Metoda ta obejmuje mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanki płucnej oraz dwuetapowy proces oczyszczania z wykorzystaniem przeciwciał anty-PECAM-1 oraz anty-ICAM-2 sprzężonych z kuleczkami magnetycznymi, co pozwala na uzyskanie czystej populacji komórek śródbłonka pochodzenia głównie naczyniowego mikroskopowego.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc noworodków myszy

W niniejszym artykule prezentujemy izolację mysich rezydentnych mezenchymalnych komórek macierzystych płuc (lung MSC), ich ekspansję, charakterystykę oraz analizę właściwości immunomodulacyjnych.

Izolacja &amp;#38; Charakterystyka barwnika Hoechstniski CD45ujemny Mezenchymalne komórki macierzyste płuc myszy

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Opisujemy metodę szybkiej izolacji pierwotnych pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) myszy za pomocą negatywnej selekcji cytometrycznej. Uzyskane komórki AECII wykazują wysoką żywotność oraz czystość i nadają się do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych dotyczących ich roli w schorzeniach układu oddechowego, takich jak choroby autoimmunologiczne lub zakaźne.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu II myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

Ten film demonstruje technikę in vitro do identyfikacji komórek odpornościowych znajdujących się w płucach myszy. Po wyizolowaniu docelowych komórek odpornościowych z mysiej tkanki płucnej, są one znakowane powierzchniowo za pomocą koktajlu przeciwciał znakowanych fluoroforem przeciwko specyficznym markerom na wrodzonych i nabytych komórkach odpornościowych. Dodatkowo monocyty, makrofagi i komórki dendrytyczne są znakowane za pomocą markera wewnątrzkomórkowego. Różne typy komórek...

Metoda in vitro do identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych znajdujących się w płucach myszy

Ten protokół opisuje technikę izolacji w celu uzyskania pierwotnych mezenchymalnych komórek zrębu rezydujących w płucach od szczurów, poprzez zastosowanie trawienia enzymatycznego, separacji gradientu gęstości, przylegania plastiku i selekcji kulek magnetycznych CD146+.

Izolacja mezenchymalnych komórek zrębowych płuc rezydentnych CD146 + z płuc szczura

Ten protokół opisuje użycie cytometrii przepływowej do identyfikacji zmian w składzie komórek odpornościowych, profilu cytokin i profilu chemokiny w środowisku płucnym po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu, mysim modelu udaru niedokrwiennego.

Charakterystyka komórek odpornościowych i mediatorów prozapalnych w środowisku płucnym

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Protokół opisany poniżej jest prostym i skutecznym sposobem na izolację komórek zawierających retinoidy z wysoce heterogenicznych populacji komórek płuc poprzez wykorzystanie specyficznej autofluorescencji retinoidów i zastosowanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Izolacja komórek płuc zawierających retinoidy przez sortowanie komórek

Protokół ten przedstawia metodę opartą na cytometrii przepływowej, która izoluje żywotne komórki nabłonkowe typu II (AECII) z płuc noworodków, młodocień lub dorosłych myszy (zakażonych lub niezakażonych). Takie podejście umożliwia późniejszym badaniam molekularnym i/lub funkcjonalnym AECII identyfikację ich roli podczas zapalenia i infekcji płuc.

Izolacja komórek nabłonkowych typu II pęcherzyka z płuc noworodkowych, młodociowych i dorosłych myszy, przystosowanych do zakaźnych warunków eksperymentalnych

Naucz się izolacji żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy. Ta metoda pozwala badać mechanizmy naprawy płuc po infekcji wirusowej i interakcje między komórkami immunologicznymi a nabłonkowymi.

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

Przeglądaj więcej filmów