Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy
31 stycznia 2025
Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.
Badamy naprawę płuc po infekcji wirusowej. Naszym celem jest zrozumienie mechanizmów, za pomocą których komórki odpornościowe pośredniczą w naprawie nabłonka oraz tego, jak przebudowa po uszkodzeniu wirusowym i późniejsza naprawa może wpłynąć na przyszłe patologie chorobowe. Protokół ten rozwiązuje problem niezgodności trawienia płuc zoptymalizowanego pod kątem komórek nabłonka i zrębu lub komórek odpornościowych.
Nasze badania wymagają wyizolowania żywotnych komórek zarówno z przedziałów immunologicznych, jak i nieimmunologicznych. Ponadto zaproponowaliśmy strategię bramkowania dla podzbiorów nabłonka i makrofagów, która, mamy nadzieję, przyniesie korzyści tej dziedzinie. Nasze laboratorium bada wzajemne oddziaływanie między komórkami odpornościowymi i nabłonkowymi w drogach oddechowych w warunkach stanu ustalonego i w odpowiedzi na wyzwania środowiskowe.
Naszym ostatecznym celem jest określenie, w jaki sposób najlepiej modulować tę komunikację, aby usprawnić naprawę tkanek i zapobiec rozwojowi choroby. Na początek spryskaj mysz 70% etanolem. Za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych i kleszczy numer siedem wykonaj nacięcie w jamie brzusznej i przetnij bocznie otrzewną.
Wykonaj małe nacięcie w membranie, aby uwolnić podciśnienie. Następnie wytnij przeponę i dolną klatkę piersiową z jamy ciała, aby odsłonić płuca i serce. Za pomocą 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27, wykonaj fuzję płuc za pomocą pięciu mililitrów dwumilimolowego EDTA w DPBS.
Przeciąć pionowo przez mostek i wzdłuż boków, aby otworzyć klatkę piersiową i odsłonić tchawicę. Użyj cienkich nożyczek i kleszczy numer siedem, aby usunąć jak najwięcej mięśni i tkanki łącznej bez nakłuwania tchawicy lub płuc. Następnie owiń tchawicę szwem 2/0, ustawiając ją tak, jakby chciała ją związać, ale nie dokręcaj.
Wykonaj boczne nacięcie w tchawicy i włóż cewnik. Następnie mocno zaciśnij szew, aby zamocować cewnik na miejscu. Napompuj płuca jednym mililitrem DPBS za pomocą strzykawki.
Następnie powoli odciągnąć strzykawkę, aby wyciągnąć DPBS. Ponownie napompuj płuca tym samym DPBS i ponownie pociągnij strzykawkę, aby zebrać płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego lub BAL. Odłącz strzykawkę od cewnika, pozostawiając wprowadzony cewnik
.Dozuj zebrany zawór do mikroprobówki wirówkowej. Następnie napełnij tę samą strzykawkę o pojemności jednego mililitra jednym mililitrem dypazy. Przymocować strzykawkę do cewnika i napompować płuca za pomocą dypazy.
Podczas wyjmowania cewnika zaciśnij szew wokół tchawicy, aby zapobiec wyciekowi dypasy. Za pomocą nożyczek przetnij bocznie tchawicę. Usuń płuca z jamy ciała, przecinając tkankę łączną wzdłuż tylnej części klatki piersiowej, jednocześnie ciągnąc płuca i tchawicę do góry.
Następnie usuń serce z płuc. Umieść płuca w pięciu mililitrach DPBS na lodzie. Zawór wirowy o stężeniu 400 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Za pomocą pipety odessać supernatant i ponownie zawiesić granulkę w 100 mikrolitrach RPMI. Na początek wypreparuj pięć płatów płuc pobranych od myszy i wyrzuć tkankę łączną. Posiekaj wypreparowaną tkankę płucną nożyczkami przez minutę na szkiełku podstawowym.
Za pomocą nożyczek preparacyjnych przenieś posiekaną tkankę płucną do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie dodaj trzy mililitry mieszanki trawiennej i pipetuj mieszaninę trawienia płuc w górę iw dół dwa do trzech razy. Na koniec dodaj osad komórek odzyskany z BAL ponownie zawieszony w RPMI.
Umieść rurkę pod kątem 45 stopni w wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 140 obr./min w 37 stopniach Celsjusza na 40 minut. Po inkubacji wyjmij probówkę z shakera i umieść ją na lodzie. Pipetować mieszaninę trawienia płuc w górę i w dół pięć do sześciu razy.
Przefiltruj mieszaninę przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Przemyj pozostałe komórki przez filtr i zneutralizuj enzymy za pomocą 10 mililitrów 5% FBS w pożywce RPMI. Odwirować próbkę o sile 600 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Odessać supernatant za pomocą aspiratora próżniowego. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze buforu do lizy ACK i inkubować przez trzy minuty w temperaturze pokojowej w celu lizy czerwonych krwinek. Następnie dodaj dziewięć mililitrów PBS i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać roztwór.
Ponownie odwiruj próbkę i użyj aspiratora próżniowego, aby usunąć supernatant, a następnie ponownie zawieś osad komórkowy w jednym mililitrze aktywowanego fluorescencją bufora do sortowania komórek. Przefiltrować zawiesinę przez siatkę o wielkości 64 mikrometrów do probówki mikrowirówkowej w celu analizy metodą cytometrii przepływowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie spoczynku oraz po zakażeniu wirusem grypy. Przedstawia on strategie bramkowania w celu identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i mieloidalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Immunologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Badanie koncentruje się na mechanizmach regeneracji płuc po infekcji wirusowej.
- Kluczowe jest zrozumienie roli komórek odpornościowych w naprawie nabłonka.
- Badania podejmują wyzwania związane z izolacją żywych komórek z różnych przedziałów płuc.
- Analizuje oddziaływania między komórkami odpornościowymi a nabłonkowymi w drogach oddechowych.
Cel badania
- Wyizolowanie żywotnych komórek odpornościowych i nieodpornościowych z płuc myszy.
- Opracowanie strategii bramkowania w celu identyfikacji specyficznych subpopulacji komórek.
- Zbadanie wpływu uszkodzeń wirusowych i procesów naprawczych na przyszłe patologie chorobowe.
Zastosowane metody
- Izolacja żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy.
- Strategie bramkowania w celu identyfikacji podgrup komórek nabłonkowych i mieloidalnych.
- Analiza mechanizmów naprawy płuc po infekcji grypą.
- Ocena interakcji między komórkami immunologicznymi a nabłonkowymi.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja odrębnych populacji komórek odpornościowych i nieodpornościowych.
- Identyfikacja specyficznych subpopulacji komórek nabłonkowych i makrofagów.
- Wnioski dotyczące mechanizmów naprawy płuc po infekcji wirusowej.
- Wkład w zrozumienie przyszłych patologii chorób związanych z uszkodzeniem płuc.
Wnioski
- Protokół ten zwiększa możliwości badania odpowiedzi immunologicznych w płucach.
- Zapewnia on cenne narzędzia do badania mechanizmów naprawy nabłonka.
- Wyniki mogą dostarczyć informacji dla przyszłych badań nad chorobami układu oddechowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Jednoczesna izolacja żywych populacji komórek mieloidalnych i nabłonkowych z płuc myszy umożliwia kompleksową analizę interakcji międzykomórkowych w modelach chorób układu oddechowego. Możliwość ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz zwiększa pewność prognostyczną na etapach walidacji celu i wczesnego odkrywania leków. Metoda ta usprawnia podejmowanie decyzji dotyczących portfela badawczego poprzez dostarczanie wysokiej jakości, multiparametrycznych zawiesin pojedynczych komórek do dalszych analiz.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie badanie interakcji odpornościowo-nabłonkowych, które są kluczowe dla walidacji celu w modelach chorób płuc.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie oceny funkcjonalnej zarówno przedziałów immunologicznych, jak i nieimmunologicznych.
- Ułatwia badanie ścieżek naprawy i przebudowy po urazie w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane zawiesiny jednokomórkowe odpowiednie do cytometrii przepływowej i procesów przesiewowych opartych na FACS.
- Poprawia powtarzalność testów poprzez standaryzację izolacji komórek z populacji immunologicznych i nabłonkowych.
- Umożliwia zastosowanie ilościowych strategii bramkowania w celu wiarygodnej identyfikacji subpopulacji komórek zarówno w stanie prawidłowym, jak i chorobowym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z istotnymi dla przebiegu choroby modelami mysimi, co umożliwia translacyjne odkrywanie biomarkerów w badaniach nad układem oddechowym.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych do walidacji przedklinicznej, umożliwiając analizę odpowiedzi specyficznych dla danych komórek na infekcję lub uraz.
- Zmniejsza niejednoznaczność biologiczną w modelach przedklinicznych poprzez rejestrację zróżnicowanych populacji komórek w ramach jednego procesu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje etapy wczesnego odkrywania i badań przedklinicznych, wspierając procesy od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego w modelach chorób układu oddechowego.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących interakcji odpornościowo-nabłonkowych oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych w regeneracji płuc.
- Screening: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych na temat podzbiorów komórek do dalszego screeningu związków chemicznych lub genetycznego.
- Analityka: Zapewnia wieloparametryczne wyniki cytometrii przepływowej do analizy porównawczej stanów chorobowych i kontrolnych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z punktami końcowymi badań przedklinicznych w modelach infekcji, alergii, włóknienia i nowotworów.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Ustanawia zstandaryzowany, skalowalny protokół, który można dostosować do różnych programów badawczych w zakresie układu oddechowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad chorobami płuc.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje izolację komórek, zwiększa powtarzalność i wspiera analizy wysokoprzepustowe.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez umożliwienie generowania solidnych danych multiparametrycznych na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów i modeli do dalszego rozwoju w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w sekcji płuc myszy, trawieniu enzymatycznym oraz analizie metodą cytometrii przepływowej.
- Niezbędny jest dostęp do aparatury FACS oraz infrastruktury analitycznej umożliwiającej bramkowanie wieloparametryczne.
- Wymagana jest standaryzacja strategii bramkowania i protokołów przygotowania próbek pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji w różnych modelach mysich chorób układu oddechowego, jednak może wymagać optymalizacji pod kątem konkretnych punktów końcowych.
- Żywotność i uzysk komórek zależą od precyzyjnego wykonania etapów dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej.
