Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

W naszych badaniach zbadaliśmy linię monocytów i makrofagów, podkreślając jej niezwykłą plastyczność i zdolność do integracji wielu sygnałów z otoczenia w celu kształtowania odpowiedzi efektorowej podczas stanu zapalnego, naprawy tkanek i infekcji. Makrofagi znajdują się w całym ciele i koordynują inicjację i ustąpienie wrodzonej i przystosowanej odporności, wpływając na chronioną i immunologiczną patologię. Przeprogramowanie makrofagów jest najbardziej obiecującą funkcją w tej dziedzinie.

Pojawiająca się technologia omiczna zrewolucjonizowała nasze rozumienie biologii makrofagów, zapewniając wgląd w ich różnorodność fenotypową, charakterystykę funkcjonalną, potencjał programowania i pochodzenie rozwojowe tych komórek. Główną przeszkodą i pułapką w odkrywaniu różnicowania i polaryzacji makrofagów są niejednorodne warunki i protokoły eksperymentalne w literaturze oraz brak konsensusu w definiowaniu terminu makrofagi. Pokazujemy wpływ przeprogramowania mediatora lekowego i lipidowego na polaryzację makrofagów i opracowujemy model 3D interakcji in vitro między komórkami makrofagów i glejaka.

Dodatkowo wykazaliśmy, że płytki krwi licencjonują różnicowanie makrofagów pochodzących z monocytów do fenotypu N1. Na początek umieść antykoagulowane próbki krwi obwodowej w wirówce. Wiruj do 200G przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Obserwuj oddzielenie osocza bogatopłytkowego na górze i frakcji komórkowej, w tym czerwonych i białych krwinek, poniżej. Rozcieńczyć frakcję komórkową otrzymaną z pierwszego wirowania sterylnym PBS podgrzanym do temperatury pokojowej. Delikatnie homogenizować roztwór przed przystąpieniem do wirowania w gradiacji gęstości Ficoll-Hypaque.

Przenieś 15 mililitrów Ficoll-Hypaque do sterylnej 15-mililitrowej probówki. Ostrożnie i powoli dodaj 30 mililitrów rozcieńczonej krwi na wierzch Ficollu, zapewniając minimalne mieszanie między fazami. Odwirować probówkę zawierającą Ficoll i rozcieńczoną krew w stężeniu 600 G przez 25 minut w temperaturze pokojowej.

Za pomocą sterylnej trzymililitrowej pipety Pasteura usuń część żółtej górnej warstwy. Ostrożnie zebrać granicę faz między warstwą żółtą a warstwą Ficoll za pomocą sterylnej pipety Pasteura. Przenieś zebrane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC do nowej 15-mililitrowej probówki zawierającej co najmniej trzy mililitry sterylnego PBS.

Uzupełnij probówkę sterylnym PBS, aby osiągnąć całkowitą objętość od 12 do 15 mililitrów. Następnie odwirować próbkę o temperaturze 600 G przez 10 minut. Następnie odkręć zawieszenie PBMC o masie 300 G przez pięć minut w temperaturze od 8 do 10 stopni Celsjusza.

Ponownie zawieś komórki w żądanej objętości sterylnego zimnego PBS z 2% FBS. Utrzymuj komórki w temperaturze 4 stopni Celsjusza do następnego kroku. Przenieś żądaną objętość zawiesiny PBMC do pięciomililitrowej rurki z okrągłym dnem z polistyrenu.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów koktajlu pozytywnej selekcji na każde 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej. Zawiesinę dokładnie wymieszać przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie odpipetuj 10 mikrolitrów nanocząstek magnetycznych na 100 mikrolitrów zawiesiny komórek.

Energicznie pipetuj w górę i w dół ponad pięć razy, aby zapewnić równomierne zawieszenie nanocząstek magnetycznych. Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodać PBS zawierający FBS i EDTA do zawiesiny, aby uzyskać całkowitą objętość do 2,5 mililitra. Delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół dwa do trzech razy.

Włóż probówkę do sortownika magnetycznego i pozostaw ją w spokoju na pięć minut. Odwróć magnes wraz z rurką jednym ciągłym ruchem. Trzymaj magnes i rurkę odwrócone przez dwie do trzech sekund przed przywróceniem ich do pozycji pionowej.

Wyjmij rurkę z magnesu, a następnie ponownie dodaj 2,5 mililitra buforu PBS-FBS-EDTA do probówki. Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek w górę i w dół dwa do trzech razy, aby ją wymieszać. Włóż rurkę z powrotem do magnesu i odłóż ją na pięć minut.

Jednym ciągłym ruchem ponownie odwróć magnes i rurkę, odrzucając frakcję supernatantu. Wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś ogniwa w odpowiedniej objętości PBS-FBS bez EDTA. Pozytywnie wybrane komórki są teraz gotowe do użycia.

Teraz dodaj bufor PBS-FBS do posortowanych komórek CD14, zwiększając całkowitą objętość do 12 do 14 mililitrów, aby rozcieńczyć pozostały EDTA. Wirować w temperaturze 600G przez 10 minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić pozytywnie wybrane monocyty CD14 w dwóch mililitrach buforu PBS-FBS.

Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Trzymaj komórki na lodzie do czasu przygotowania hodowli. W celu hodowli ponownie zawiesić osad w stężeniu miliona komórek na mililitr w uzupełnionym pożywce RPMI 1640.

Odpipetować 250 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny komórek do każdego dołka na 48-dołkowej płytce. Do każdej studzienki dodać 250 mikrolitrów pożywki RPMI uzupełnionej antybiotykiem zawierającej 50 nanogramów na mililitr czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów. Inkubuj płytkę kultury komórkowej w wilgotnym inkubatorze, aby zainicjować różnicowanie makrofagów.

W czwartym dniu różnicowania makrofagów należy wymienić połowę pożywki hodowlanej z każdej studzienki. Dodaj cytokiny lub odczynniki do pożądanych warunków polaryzacji i kontynuuj hodowlę przez kolejne trzy dni. Zbierz monocyty pochodzące z makrofagów w siódmym dniu w celu charakterystyki fenotypowej.

Makrofagi M1 indukowane przez interferon gamma-plus lipopolisacharyd wykazywały najwyższą ekspresję CD64, brak CD206 oraz niskie poziomy CD163 i MERTK. Makrofagi M2a indukowane przez interleukinę 4 charakteryzowały się zwiększoną ekspresją CD206 i obniżonymi poziomami CD64, CD163 i MERTK. Makrofagi M2c indukowane przez interleukinę 10 lub deksametazon wykazywały zwiększoną ekspresję CD163 i CD14, pośrednie poziomy CD64 i wzrost ekspresji MERTK.