Name: Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę przeprogramowania makrofagów pochodzących z monocytów w modelu 3D in vitro. Technika ta umożliwia badanie plastyczności komórek immunologicznych i ich odpowiedzi na leki oraz mediatory lipidowe w kontekście immunologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Agencję Promocji Nauki i Technologii (ANPCyT-FONCYT) poprzez granty PICT 2018-3070 i 2021-I-A-00807 dla E.A.C.S. i PICT 2021-I-A-00716 dla A.E.E, oraz przez Narodową Radę Badań Naukowych i Technicznych (CONICET) poprzez grant 2022-0763 oraz przez Uniwersytet w Buenos Aires poprzez Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social (PIDAE) 2022 do A.E.E., E.A.C.S. i A.E.E. są zawodowymi badaczami w CONICET.

Wszyscy zdrowi ochotnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę, a badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Narodowej Akademii Medycznej (IMEX-CONICET-ANM) Argentyna. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i odczynników użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.
1. Izolacja jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMCs)
UWAGA: PBMC są izolowane z 40 ml antykoagulowanej krwi obwodowej z cytrynianem sodu na poziomie 3,8% i przy użyciu wirowania o gradiencie gęstości Ficoll-Hypaque (1077). Protokół ten jest wykonywany w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL2.
<ol>
	<li>Otrzymaną próbkę krwi obwodowej z antykoagulacją przenieść do odpowiednich probówek o pojemności 15 ml lub 50 ml w celu odwirowania.</li>
	<li>Odwirować próbki krwi o masie 200 × g przez 15 minut (przyspieszenie: 4 opóźnienia: 2, gdy maksimum wynosi 5) w temperaturze pokojowej w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego (PRP) na górze i frakcji komórkowej, w tym czerwonych i białych krwinek poniżej. Zobacz Rysunek 1.</li>
	<li>Przenieść górną frakcję (PRP) do probówek o pojemności 15 ml (jeśli osocze będzie przechowywane) i odwirować przy 600 × g przez 10 minut (maksymalne przyspieszenie i opóźnienie), aby uzyskać końcową frakcję osocza bez płytek krwi. Przechowywać osocze w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć frakcję komórkową otrzymaną z pierwszego wirowania, 2x (minimum) do 3x (maksimum) za pomocą sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (1x PBS) wstępnie podgrzanej w temperaturze pokojowej. Delikatnie homogenizować i używać tej rozcieńczonej frakcji do wirowania w gradiacji gęstości Ficoll-Hypaque.</li>
	<li>Przenieść 15 ml Ficoll-Hypaque do sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Następnie ostrożnie i powoli dodaj 30 ml rozcieńczonej krwi na wierzch figlu, unikając mieszania faz. Jeśli pracujesz z 10 ml lub mniej rozcieńczonej krwi, przenieś 4 ml Ficoll-Hypaque do probówki o pojemności 15 ml, a następnie dodaj 10 ml rozcieńczonej próbki krwi. 
	UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania frakcji jednojądrzastej.</li>
	<li>Odwirować probówkę zawierającą Ficoll i rozcieńczoną krew o stężeniu 600 × g przez 25 minut (przyspieszenie: 1; Opóźnienie: 0) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń część żółtej wierzchniej warstwy za pomocą sterylnej pipety Pasteura o pojemności 3 ml. Następnie za pomocą sterylnej pipety Pasteura ostrożnie zebrać granicę faz (jednojądrzastą frakcję "pierścieniową") utworzoną między żółtą warstwą wierzchnią a warstwą Ficollu. Ten "pierścień" zawiera interesujące nas komórki jednojądrzaste (PBMC). 
	UWAGA: Część pozostałej fazy osocza może zostać zebrana, ale należy unikać fazy Ficoll, ponieważ może ona być toksyczna dla PBMC.</li>
	<li>Przenieść zebrane PBMC do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej co najmniej 3 ml sterylnego 1x PBS. Następnie uzupełnij odpowiednią objętość sterylnego 1x PBS do 12-15 ml. Odwirować PBMC przy masie 600 × g (maksymalne przyspieszanie i zwalnianie) przez 10 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie umyć PBMC. Ponownie zawiesić osad komórkowy, dodając 1 ml sterylnego 1x PBS, a następnie uzupełnić do 12-14 ml dodatkowym sterylnym 1x PBS. Odwirować probówki o masie 600 × g (maksymalne przyspieszanie i zwalnianie) przez 10 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad PBMC w sterylnym 1x PBS zawierającym 2% inaktywowanej płodowej surowicy bydlęcej (1x PBS-2% FBS) i zwiększyć objętość do 10 ml. Użyj automatycznego licznika komórek lub policz komórki, przygotowując zawiesinę komórek 1:5 rozcieńczoną w sterylnym zimnie 1x PBS, a następnie (1:2) w błękit trypanowy, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:10. Do liczenia używaj mikroskopu świetlnego.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę PBMC w stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 8-10 °C. Ponownie zawiesić komórki w żądanej objętości sterylnego, zimnego 1x PBS-2% FBS, aby uzyskać końcowe stężenie 10-8 komórek/ml. Pozostawić te komórki w temperaturze 4 °C do następnego kroku. 
	UWAGA: Jeśli pobrane PBMC nie zostaną użyte tego samego dnia, zaleca się zamrożenie w fiolce kriogenicznej w stężeniu 108 komórek/ml w odpowiedniej pożywce do zamrażania (90% FBS zawierającej 10% dimetylosulfotlenku, DMSO). Przechowywać w temperaturze -80 °C w pojemniku z glikolu polietylenowego przez noc, aby umożliwić powolne zamarzanie komórek, minimalizując w ten sposób ich uszkodzenie. Następnego dnia przenieś komórki do pojemnika do przechowywania i pozostaw je w temperaturze -80 °C na kilka dni lub przenieś do zbiornika z ciekłym azotem na długi okres przechowywania.</li>
</ol>
2. Sortowanie monocytów CD14+ za pomocą kulek magnetycznych
UWAGA: Ilość monocytów CD14 znalezionych w PBMC zdrowych dawców jest zmienna w zależności od wieku i płci. Jeśli to możliwe, użyj licznika komórek, aby uzyskać % monocytów w każdej próbce, a następnie oblicz liczbę PBMC potrzebnych do posortowania wymaganych monocytów CD14. Jeśli licznik komórek nie jest dostępny, 10% monocytów na próbkę PBMC można uznać za szerokie podejście4,6,7,10,11,12,13.
monocyty CD14+ są izolowane za pomocą ludzkiego zestawu do pozytywnej selekcji CD145. Ustandaryzowaliśmy protokół izolacji przy użyciu 1 do 2 × 107 PBMC w 100 μL reakcji; Użyj tego współczynnika dla wyższych liczb. Sugerowana minimalna objętość reakcji to 100 μl, nawet przy liczbie komórek mniejszej niż 1 × 107 PBMC.
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek PBMC o stężeniu 1-2 × 108 komórek/ml w 1x PBS-2% FBS zawierającym 1 mM buforu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA) i przenieść żądaną ilość PBMC do probówki okrągłodennej z polistyrenu o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Dodaj 10 μl koktajlu pozytywnej selekcji na każde 100 μl zawiesiny komórkowej, dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 10 μl nanocząstek magnetycznych na 100 μl zawiesiny komórek, energicznie pipetować w górę iw dół ponad 5 razy, aby równomiernie zawiesić nanocząstki magnetyczne, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min. 
	UWAGA: Wirowanie nie jest zalecane.</li>
	<li>Dodaj 1x PBS-2% FBS-1 mM bufor EDTA, aby zwiększyć całkowitą objętość zawiesiny komórek do 2,5 ml. Delikatnie pipetuj komórki w probówce w górę i w dół 2-3 razy. Włóż probówkę do sortownika magnetycznego i odstaw ją na 5 minut.</li>
	<li>Weź magnes i odwróć go wraz z rurką jednym ciągłym ruchem, odrzucając frakcję supernatantu. Magnetycznie oznakowane ogniwa pozostaną wewnątrz tuby. Pozostaw magnes i rurkę odwrócone na 2-3 s, a następnie obróć je pionowo do pionu. 
	UWAGA: Pozostaw wszelkie zwisające krople z otworu tuby; Nie potrząsaj nimi ani nie osuszaj ich.</li>
	<li>Wyjmij probówkę z magnesu i ponownie dodaj 2,5 ml 1x PBS-2% FBS-1 mM buforu EDTA do probówki. Delikatnie pipetować zawiesinę komórek w górę i w dół 2-3 razy, aby ją wymieszać. Włóż rurkę z powrotem do magnesu i odłóż ją na 5 minut.</li>
	<li>Jednym ciągłym ruchem odwróć zarówno magnes, jak i rurkę, odrzucając frakcję supernatantu. Wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś ogniwa w odpowiedniej ilości buforu 1x PBS-2% FBS (bez EDTA). Pozytywnie wybrane komórki są teraz gotowe do użycia. 
	UWAGA: W magnesie wymagane są łącznie dwie 5-minutowe separacje.</li>
	<li>Przemyć posortowane komórki CD14 za pomocą 1x PBS-2% buforu FBS, doprowadzając zawiesinę komórek do 12-14 ml w celu rozcieńczenia pozostałego EDTA, a następnie odwirować przy 600 × g (maksymalne przyspieszenie i opóźnienie) przez 10 minut.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant i powtórzyć mycie, ponownie zawieszając osad komórkowy za pomocą 1 ml buforu FBS 1x PBS-2%, a następnie uzupełniając objętość do 12-14 ml. Odwirować probówki o masie 600 × g (maksymalne przyspieszanie i zwalnianie) przez 10 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić dodatnie wybrane monocyty CD14 w 2 ml 1x PBS-2% buforu FBS. Użyj automatycznego licznika komórek lub policz komórki, rozcieńczając zawiesinę komórek (1:5) w sterylnym zimnie 1x PBS, a następnie (1:2) w błękitu trypanowym za pomocą mikroskopu świetlnego. Pozostaw komórki na lodzie do czasu przygotowania hodowli. 
	UWAGA: Czystość komórek można zbadać za pomocą cytometrii przepływowej, pobierając 50 μl zawiesiny komórkowej i barwiąc ją pod kątem komórek CD14+ (klon HCD14). Zalecana jest czystość wyższa niż 90%.</li>
	<li>W przypadku hodowli należy odwirować zawiesinę komórek w stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 8-10 °C. Zawiesić osad przy stężeniu 106 komórek/ml za pomocą RPMI 1640 uzupełnionego 10% inaktywowanym FBS i 1% penicyliny-streptomycyny (RPMI-10% FBS-1% P/S). 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby używać wysokiej jakości FBS o niskiej zawartości endotoksyn, inaktywowanego termicznie. Utrzymuj zawsze na lodzie, aby uniknąć przylegania monocytów do plastikowej ścianki przed posiewem.</li>
</ol>
3. Różnicowanie i polaryzacja makrofagów pochodzących z monocytów (M-DM)
UWAGA: Hodowla M-DM jest przeprowadzana przez posiew 2,5 × 105 monocytów CD14+ na 48-dołkowych płytkach zawierających 500 μL RPMI-10% FBS-1% P/S i hodowla w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z CO2 (5%) przez 7 dni. Wybierz poddane działaniu substancji płytki, aby zwiększyć przyleganie monocytów do płytki.
<ol>
	<li>Zdefiniuj wszystkie warunki eksperymentalne do uruchomienia, w tym studzienki dla podstawowego M-DM (M0), zapalnego M1, M2a naprawy tkanek, regulatorowego M2c i żądanych warunków testowania.</li>
	<li>Odpipetować 250 μl zawiesiny komórkowej przygotowanej w kroku 2.11, aby wysiać 2,5 ×10 5 monocytów CD14+ w każdym dołku.</li>
	<li>Dodaj 250 μl RPMI-10% FBS-1% P/S plus 50 ng/ml M-CSF do każdego dołka, aby uzupełnić 500 μl całkowitej objętości.</li>
	<li>Inkubować płytkę do hodowli komórkowej w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 dni, aby umożliwić pierwszy etap różnicowania makrofagów. 
	UWAGA: Okresowo sprawdzaj różnicowanie kultur komórkowych, aby zobaczyć, czy zmiany morfologiczne wystąpiły zgodnie z oczekiwaniami lub czy istnieją niepożądane nieprzyłączone komórki.</li>
	<li>Wymień połowę pożywki hodowlanej (250 μl RPMI-10% FBS-1% P/S) w 4. dniu hodowli M-DM. Dodaj cytokiny lub odczynniki do warunków polaryzacji i hoduj je przez 3 dni (punktem końcowym jest dzień 7): LPS (1 ng / ml) plus IFNγ (50 ng / ml) dla M1, IL-4 (40 ng / ml) dla M2a, IL-10 (50 ng / ml) lub deksametazon (0,1 μM) dla M2c.</li>
	<li>Zbierz M-DM w dniu 7, aby przeprowadzić charakterystykę fenotypową, zbierz je do ekspresji mRNA, jak wskazano w następnych dwóch krokach, lub wykonaj test funkcjonalny.</li>
</ol>
4. Charakterystyka fenotypu powierzchniowego w spolaryzowanym M-DM za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Odrzucić całkowitą objętość pożywki hodowlanej (500 μl płytki 48-dołkowej) i dodać 200 μl 1x PBS-2% FBS-1 mM buforu EDTA do pobierania komórek. Inkubować przez 20 minut na lodzie, a następnie dodać 200 μl 1x PBS-2% FBS w celu rozcieńczenia buforu EDTA. Zebrać M-DM, pipetując w górę i w dół do mikroprobówek o pojemności 1,5 ml. Zebrane komórki przemyć raz 1x PBS-2% FBS i odwirować w temperaturze 800 × g przez 3 minuty.</li>
	<li>Zawiesić osad M-DM z 200 μl 1x PBS-5% FBS i przenieść je do 96-dołkowej mikropłytki okrągłodennej w celu zablokowania w temperaturze pokojowej na 15 minut. Odwirować komórki w temperaturze 800 × g przez 3 minuty.</li>
	<li>Przygotować odpowiednią kombinację bezpośrednio sprzężonych przeciwciał w 1x PBS-2% FBS. Zabarwić każdą studzienkę lub stan (1x) 50 μl panelu przeciwciał i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności. 
	UWAGA: W tym przypadku panel przeciwciał składał się z CD11b-APC/Cy7, CD64-APC, CD163-PerCP/Cy5.5, CD206-AlexaFluor 488, CD14-PECy7 i MERTK-biotyna plus Streptawidyna-PE. Pretiterowane stężenie przeciwciał podano w tabeli 1.</li>
	<li>Przepłukać zabarwiony M-DM, dodając 150 μl 1x PBS i odwirować przy 800 × g przez 3 min.</li>
	<li>Aby zmierzyć żywotność komórek, dodaj 100 μl barwnika do utrwalania żywotności Zombie Violet (1:1,000 w 1x PBS) i inkubuj w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.</li>
	<li>Przepłukać poplamione komórki, dodając 100 μl 1x PBS i odwirować przy 800 × g przez 3 min. Powtórzyć procedurę mycia, używając 200 μl 1x PBS.</li>
	<li>Fix poprzez ponowne zawieszenie osadu M-DM ze 100 μl odczynnika utrwalającego (z zestawu utrwalającego/przepuszczalnego) i inkubowanie go przez 20 minut na lodzie i w ciemności. 
	UWAGA: Aby uzyskać odpowiednie utrwalenie, konieczna jest prawidłowa homogenizacja osadu komórkowego.</li>
	<li>Umyj M-DM dodając 100 μL 1x PBS-2% FBS i odwiruj przy 800 × g przez 3 min. Powtórz procedurę mycia przy użyciu 200 μL 1x PBS-2% FBS.</li>
	<li>Zawiesić osad M-DM w 200 μl 1x PBS i uruchomić wybarwione komórki w cytometrze przepływowym.</li>
</ol>
5. Profil programu genowego do rozróżniania polaryzacji M-DM za pomocą qPCR
UWAGA: W 7 dniu hodowli, 2,5 × 105 M-DM może być zebrane przy użyciu odczynnika do ekstrakcji RNA w celu izolacji wysokiej jakości całkowitego RNA. Izolację RNA można również przeprowadzić przy użyciu alternatywnych metod, takich jak ekstrakcja RNA oparta na kolumnie i zestaw do elucji.
<ol>
	<li>Odrzucić całkowitą objętość pożywki hodowlanej i zlizowaną M-DM, dodając bezpośrednio 350 μl odczynnika ekstrakcyjnego. Homogenizować i przenieść tę zawiesinę komórkową do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml wolnej od RNazy/DNaz i kontynuować izolację RNA. 
	UWAGA: Jeśli izolacja RNA nie zostanie przeprowadzona tego samego dnia, próbka z kroku 5.1 może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez noc lub -20 °C przez okres do roku.</li>
	<li>Aby umożliwić całkowitą dysocjację kompleksu nukleoprotein, należy inkubować homogenizowane próbki z etapu 5.1 przez 5 minut w temperaturze 25 °C</li>
	<li>Dodać 70 μl chloroformu do każdej próbki. Bezpiecznie zakryj każdą probówkę, aby zapobiec wyciekom i dokładnie wymieszaj zawartość, potrząsając probówką. Inkubować próbki przez 2-3 minuty, a następnie odwirowywać próbki o masie 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ten krok całkowicie rozdzieli fazy na dolną fazę fenolowo-chloroformową, interfazę i bezbarwną górną fazę wodną. 
	UWAGA: Objętość chloroformu opiera się na stosunku 0,2 ml chloroformu na 1 ml odczynnika ekstrakcyjnego użytego na etapie lizy.</li>
	<li>Przenieś fazę wodną zawierającą RNA do nowej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml wolnej od RNazy/DNaz. 
	UWAGA: Pozostaw niewielką objętość podczas przyjmowania fazy wodnej, aby uniknąć przeniesienia jakichkolwiek warstw interfazowych lub organicznych.</li>
	<li>Dodać 175 μl izopropanolu do każdej próbki, aby wytrącić RNA. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C lub alternatywnie przez noc w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Objętość izopropanolu opiera się na stosunku 0,5 ml izopropanolu na ml odczynnika do ekstrakcji początkowej.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na dnie probówki wytrąci się biała żelowa osadzka całkowitego RNA. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Przemyć RNA, ponownie zawieszając biały żelowy osad w 350 μl 75% etanolu (1 ml na 1 ml odczynnika ekstrakcyjnego (v/v) używanego do lizy). 
	UWAGA: RNA może być przechowywane w 75% etanolu przez okres do 1 roku w temperaturze -20 °C lub do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Krótko zmieszać zawieszony osad i odwirować w temperaturze 7 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą mikropipety. Wysuszyć na powietrzu lub odkurzyć osad RNA przez 5-10 min. 
	UWAGA: Aby rozpuścić RNA, unikaj nadmiernego wysuszenia osadu RNA.</li>
	<li>Zawiesić osad w 20-30 μl wody wolnej od RNaz, pipetując w górę iw dół. Inkubować w łaźni wodnej lub bloku grzewczym ustawionym na 55-60 °C przez 10-15 minut. Przystąp do pomiaru stężenia RNA i przechowuj RNA w temperaturze -70 °C.</li>
	<li>Przeprowadzić odwrotną transkrypcję (kopię cDNA) przy użyciu 100-500 ng RNA (odpowiednio minimalnego i maksymalnego) w 20 μl objętości reakcyjnej, stosując zestaw do syntezy cDNA.</li>
	<li>Uruchom reakcje PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu 1 μl cDNA (5-25 ng).
	<ol>
		<li>Przygotuj mieszaninę reakcyjną dla każdej probówki (1x), używając 5 μl zielonej mieszanki SYBR (2x), 0,2 μl każdego startera (do przodu i do tyłu) i 3,6 μl wody wolnej od nukleaz. Wyskaluj wszystkie komponenty zgodnie z numerem próbki. Dokładnie wymieszaj mieszaninę reakcyjną i dozuj 9 μl do każdej probówki qPCR, a na koniec 1 μl cDNA, aby osiągnąć końcową całkowitą objętość 10 μl.</li>
		<li>Zaprogramuj protokół cykli termicznych na urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym w następujący sposób: 2-3 minuty w 98 °C (1x); 5-15 s w 98 °C plus 15-30 s w 60 °C (35-40x); na koniec uwzględnij analizę krzywej topnienia (65-95 °C) z przyrostem 0,5 °C przy 2-5 s/krok lub użyj domyślnego ustawienia urządzenia. 
		UWAGA: Reakcja ta została znormalizowana przy użyciu uniwersalnej mieszanki SYBR Green. Startery zalecane do analizy polaryzacji M-DM wymieniono w tabeli 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znormalizować wyniki, używając jako genu odniesienia eukariotycznego czynnika wydłużenia translacji 1 alfa 1 (EEF1A1) i sprawdzić swoistość amplifikowanych produktów poprzez analizę krzywych dysocjacji. 
	UWAGA: Analiza krzywej dysocjacji pozwala potwierdzić obecność w reakcji tylko jednego produktu amplifikacji qPCR.</li>
</ol>

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization.</a> Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).</li>
<li>Guilliams, M., Svedberg, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+tissue+imprinting+restrict+macrophage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Does tissue imprinting restrict macrophage plasticity.</a> Nat Immunol. 22 (2), 118-127 (2021).</li>
<li>Nowak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+monocyte+profile+in+patients+with+major+depressive+disorder+and+suicide+behaviour+and+how+ketamine+induces+anti-inflammatory+m2+macrophages+by+nmdar+and+mtor%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory m2 macrophages by nmdar and mtor.</a> EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).</li>
<li>Carestia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+promote+macrophage+polarization+toward+pro-inflammatory+phenotype+and+increase+survival+of+septic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice.</a> Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).</li>
<li>Olexen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+axl%28high%29+myeloid+cells+as+pathognomonic+marker+in+Langerhans+cell+histiocytosis+and+langerin+expression+dependence+of+mtor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Increased axl(high) myeloid cells as pathognomonic marker in Langerhans cell histiocytosis and langerin expression dependence of mtor inhibition.</a> Clin Immunol. 263, 110203(2024).</li>
<li>Ortiz Wilczynski, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthetic+phospholipid+C8-C1P+determines+pro-angiogenic+and+pro-reparative+features+in+human+macrophages+restraining+the+proinflammatory+M1-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype.</a> Front Immunol. 14, 1162671(2023).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+plasticity+in+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage plasticity in tissue repair and regeneration.</a> Am J Pathol. 185 (10), 2596-2606 (2015).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+Nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Carrera Silva, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%28%2B%29CD1a%28%2B%29+cells+circulate+in+pediatric+patients+with+active+Langerhans+cell+histiocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD207(+)CD1a(+) cells circulate in pediatric patients with active Langerhans cell histiocytosis.</a> Blood. 130 (17), 1898-1902 (2017).</li>
<li>Ferrer, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junin+virus+triggers+macrophage+activation+and+modulates+polarization+according+to+viral+strain+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity.</a> Front Immunol. 10, 2499(2019).</li>
<li>Gattas, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterotypic+tridimensional+model+to+study+the+interaction+of+macrophages+and+glioblastoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro.</a> Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).</li>
<li>Ortiz Wilczynski, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas6+signaling+tempers+Th17+development+in+patients+with+multiple+sclerosis+and+helminth+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Gas6 signaling tempers Th17 development in patients with multiple sclerosis and helminth infection.</a> PLoS Pathog. 16 (12), e1009176(2020).</li>
<li>Ambarus, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+validation+of+specific+phenotypic+markers+for+in+vitro+polarized+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic validation of specific phenotypic markers for in vitro polarized human macrophages.</a> J Immunol Methods. 375 (1-2), 196-206 (2012).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation%3A+Time+for+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment.</a> F1000Prime Rep. 6, 13(2014).</li>
<li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+programs+expressed+in+resting+and+IL-4+alternatively+activated+mouse+and+human+macrophages%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences.</a> Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).</li>
<li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+macrophage+polarization+in+vitro%3A+Maturation+and+activation+methods+compared%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li>
<li>Tiemessen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2BFOXP3%2B+regulatory+T+cells+induce+alternative+activation+of+human+monocytes%2Fmacrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells induce alternative activation of human monocytes/macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (49), 19446-19451 (2007).</li>
<li>Bosurgi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+function+in+tissue+repair+and+remodeling+requires+IL-4+or+IL-13+with+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macrophage function in tissue repair and remodeling requires IL-4 or IL-13 with apoptotic cells.</a> Science. 356 (6342), 1072-1076 (2017).</li>
<li>Sanin, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+framework+of+monocyte-derived+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">A common framework of monocyte-derived macrophage activation.</a> Sci Immunol. 7 (70), eabl7482(2022).</li>
<li>Rigamonti, E., Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+macrophage+functions+by+PPAR-alpha%2C+PPAR-gamma%2C+and+LXRS+in+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of macrophage functions by PPAR-alpha, PPAR-gamma, and LXRS in mice and men.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (6), 1050-1059 (2008).</li>
<li>Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+clearance+of+early+apoptotic+cells+by+human+macrophages+requires+M2c+polarization+and+MerTK+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires M2c polarization and MerTK induction.</a> J Immunol. 189 (7), 3508-3520 (2012).</li>
<li>Mccoll, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+induce+protein+S-dependent+phagocytosis+of+apoptotic+neutrophils+by+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids induce protein S-dependent phagocytosis of apoptotic neutrophils by human macrophages.</a> J Immunol. 183 (3), 2167-2175 (2009).</li>
<li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+Nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization.</a> Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).</li>
<li>Hawley, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNgamma+enhances+CD64-potentiated+phagocytosis+of+Treponema+pallidum+opsonized+with+human+syphilitic+serum+by+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFNgamma enhances CD64-potentiated phagocytosis of Treponema pallidum opsonized with human syphilitic serum by human macrophages.</a> Front Immunol. 8, 1227(2017).</li>
<li>Akinrinmade, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD64%3A+An+attractive+immunotherapeutic+target+for+M1-type+macrophage+mediated+chronic+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">CD64: An attractive immunotherapeutic target for M1-type macrophage mediated chronic inflammatory diseases.</a> Biomedicines. 5 (3), 56(2017).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation%3A+Time+for+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: Time for reassessment.</a> F1000Prime Rep. 6, 13(2014).</li>
<li>Sudan, B., Wacker, M. A., Wilson, M. E., Graff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+identify+markers+of+distinctly+activated+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to identify markers of distinctly activated human macrophages.</a> Front Immunol. 6, 253(2015).</li>
<li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+programs+expressed+in+resting+and+IL-4+alternatively+activated+mouse+and+human+macrophages%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic programs expressed in resting and IL-4 alternatively activated mouse and human macrophages: Similarities and differences.</a> Blood. 121 (9), e57-e69 (2013).</li>
<li>Platanitis, E., Decker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+networks+involving+STATs%2C+IRFs%2C+and+NFkappab+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory networks involving STATs, IRFs, and NFkappab in inflammation.</a> Front Immunol. 9, 2542(2018).</li>
<li>Laplante, M., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth+control+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth control and disease.</a> Cell. 149 (2), 274-293 (2012).</li>
<li>Covarrubias, A. J., Aksoylar, H. I., Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+macrophage+metabolism+and+activation+by+mTOR+and+Akt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Control of macrophage metabolism and activation by mTOR and Akt signaling.</a> Semin Immunol. 27 (4), 286-296 (2015).</li>
<li>Shahbazian, D., Parsyan, A., Petroulakis, E., Hershey, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eif4b+controls+survival+and+proliferation+and+is+regulated+by+proto-oncogenic+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Eif4b controls survival and proliferation and is regulated by proto-oncogenic signaling pathways.</a> Cell Cycle. 9 (20), 4106-4109 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Różnicowanie, aktywacja i polaryzacja makrofagów stały się głównym przedmiotem zainteresowania w immunologii, homeostazie tkanek, patogenezie chorób i rozwiązywaniu stanów zapalnych. Ponadto wyłaniający się obraz, że makrofagi tkankowe mogą pochodzić z krążących monocytów w warunkach zakłóconej homeostazy, podkreśla konieczność precyzyjnych modeli M-DM charakteryzujących się zdefiniowanymi fenotypami, programami transkrypcyjnymi i szlakami aktywacji.
W tym miejscu należy omówić kilka krytyczny...

Makrofagi, po raz pierwszy zidentyfikowane przez Metchnikoffa ze względu na ich zdolność fagocytową, są starożytnymi komórkami o fundamentalnym znaczeniu dla życia metazoan. Występujące powszechnie u dorosłych ssaków, wykazują niezwykłą różnorodność anatomiczną i funkcjonalną. Jako część jednojądrzastego systemu fagocytarnego, obok komórek dendrytycznych i monocytów, makrofagi odgrywają kluczową rolę w różnych procesach biologicznych, od rozwoju i homeostazy po odpowiedzi immunologiczne przeciwko patogenom1,2. Rezydujące makrofagi, wyspecjalizowane w mikrośrodowiskach tkankowych, działają jako strażnicy, monitorując stan tkanek i reagując na zmiany fizjologiczne i zagrożenia zewnętrzne. Uważa się, że ich ograniczona plastyczność jest ewolucyjną adaptacją do utrzymania homeostazy tkanek. W przeciwieństwie do tego, rekrutowane monocyty są bardziej elastyczne i mogą różnicować się w różne fenotypy makrofagów podczas stanu zapalnego. Ten podwójny wpływ stanu zapalnego i niszy tkankowej kształtuje różnorodność funkcjonalną makrofagów3. Tak więc, w zależności od lokalnego środowiska tkankowego, makrofagi pochodzące z monocytów (M-DM) mogą różnicować się w wiele podtypów. Lokalne metabolity, czynniki wzrostu, cytokiny i interakcja komórka-komórka4,5,6 opisują ich fenotypy i funkcje. Ponadto makrofagi są kluczowymi producentami czynników, które tłumią stan zapalny i napędzają rewaskularyzację oraz naprawę tkanek7,8.
Biorąc pod uwagę, że co najmniej trzy główne ramiona kontrolują polaryzację (warunki środowiska zewnętrznego, wewnętrznego i tkankowego), polaryzacja makrofagów powinna być postrzegana jako wielowymiarowa2. Głównymi przeszkodami i pułapkami w opisywaniu różnicowania i polaryzacji makrofagów są niejednorodne warunki eksperymentalne w literaturze oraz brak konsensusu co do definiowania terminów makrofagów w eksperymentach in vitro i in vivo9. Niemniej jednak rozpoczęto pewne ujednolicanie standardów eksperymentalnych dla różnych scenariuszy eksperymentalnych.
Aby lepiej zrozumieć ludzkie pole makrofagów, potrzebujemy ustandaryzowanych i dobrze zdefiniowanych modeli in vitro M-DM do łączenia, różnicowania, polaryzacji, fenotypu i przeprogramowywania, a także określonych funkcji. Naszym celem było ustalenie standaryzowanego modelu in vitro ludzkiego niespolaryzowanego M-DM M0 i makrofagów spolaryzowanych cytokinami w celu zbadania przeprogramowania przeprogramowania M-DM za pomocą cytometrii przepływowej i PCR w czasie rzeczywistym. Chociaż polaryzacja makrofagów jest procesem dynamicznym ze względu na ich wysoką plastyczność i zdolność do integrowania wielu sygnałów z otoczenia, scharakteryzowaliśmy tutaj niespolaryzowany M-DM (M0) i niektóre stany polaryzacji in vitro, jako klasyczne prozapalne, powszechnie rozpoznawane również jako M1, indukowane IFNγ i LPS. Podobnie, makrofagi M2 do naprawy tkanek i regulatora można zdefiniować jako M2a, gdy są indukowane przez IL-4 i M2c, gdy są stymulowane deksametazonem lub IL-10. Te polaryzujące stany uchwyciły migawkę szerokiego spektrum środowiska M-DM w czasie i przestrzeni, ale dają nam kilka kardynalnych punktów, aby ustawić mapę analityczną, gdzie zlokalizować warunki testowe.
Pomimo złożonej i dynamicznej kombinacji markerów powierzchniowych i programów transkrypcyjnych, podczas analizy in vitro M-DM, ustaliliśmy, że CD64, CD206, CD163, CD14 i MERTK mogą oddzielić niespolaryzowany stan M0, od indukowanego przez IFNγ/LPS M1a, indukowanego przez IL-4 M2a i IL-10 lub deksametazonu za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto ekspresję genów IRF1 i CXCL10 zdefiniowano jako specyficzną dla M1 indukowanego przez IFNγ / LPS; Transkrypty specyficzne dla IRF4, CCL22 i TGM2 dla M2a pochodzącego z IL-4; oraz gen MERTK dla M2c pochodzącego z deksametazonu, wyznaczając dodatkowe punkty kardynalne w celu porównania przeprogramowania skośnego M-DM poddanego innym bodźcom lub nawet hodowanego wspólnie z innymi typami komórek.

<table><tbody><tr><td>Mysz Alexa Fluor 488 anty-ludzka&nbsp; Klon przeciwciała CD206 15-2</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Kot# 321113; RRID:AB_571874</td><td></td></tr><tr><td>Mysz APC klon przeciwciała anty-ludzkiego CD64 10.1</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Kot# 305013; RRID:AB_1595539</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 szczurzy klon przeciwciała przeciw myszy/ludzkiemu CD11b M1/70</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Kot# 101226; RRID:AB_830642</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix / Cytoperm</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>Cat# 554714</td><td>zestaw utrwalający/przepuszczalny</td></tr><tr><td>Biotyna anty-ludzka Przeciwciało MERTK klon 590H11G1E3</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Kot# 367616; RRID:AB_2721500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt CFX-Connect&nbsp;</td><td>Bio-Rad, Hercules, Kalifornia, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pozytywnej selekcji człowieka EasySep CD14; Koktajl EasySep Pozytywna Selekcja; EasySep Nanocząstki magnetyczne; Easy Sep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada</td><td>Kat# 18058</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr Canto FACS&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, Stany Zjednoczone.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, Nowa Zelandia&nbsp;</td><td>Gibco&handel; &nbsp; Thermo Fisher Scientific Waltham, MA Stany Zjednoczone&nbsp;</td><td>Cat# 10091148</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS Cytiva</td><td>GE Healthcare - Nauki Przyrodnicze, USA</td><td>Kat# 17144003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC.</td><td>RRID:SCR_008520</td><td></td></tr><tr><td>Pryzmat GraphPad&nbsp; &nbsp;</td><td>Oprogramowanie GraphPad Inc.</td><td>RRID:SCR_002798</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA iScript, zawiera 5x mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji, odwrotną transkryptazę iScript, wodę wolną od nukleaz</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td>Cat# 1708891</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr kosmiczny Partec CyFlow&nbsp;</td><td>Sysmex Partec, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Streptavidin</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Cat# 405203</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 mysi klon przeciwciała anty-ludzkiego CD14 HCD14</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Kot# 325618; RRID:AB_830691</td><td></td></tr><tr><td>Mysi klon przeciwciała anty-ludzkiego CD163 PerCP/Cy5.5 GHI/61</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Kot# 333607; RRID:AB_1134006</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Średni</td><td>Gibco&handel; &nbsp; Thermo Fisher Scientific Waltham, MA Stany Zjednoczone&nbsp;</td><td>Cat# 11875119</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, zawiera Sso7d fusi&oacute za pośrednictwem przeciwciał na gorąco; n polimerazy, dNTP, MgCl2, SYBR Green I Dye, wzmacniacze, stabilizatory i mieszanka pasywnych barwników referencyjnych (w tym ROX i fluoresceina).</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td>Cat# 1725271</td><td></td></tr><tr><td>TriZol Odczynnik</td><td>Thermo Fisher Scientific Life Sciences Solutions Carlsbad, CA, USA&nbsp;</td><td>Kat#&nbsp; 15596026</td><td>odczynnik do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Zombie Violet Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend, San Diego, CA, USA.</td><td>Kot# 423113</td><td></td></tr></tbody></table>

przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Reprograming Model of Human Monocyte-derived Macrophages for In-vitro Assays

Komórki linii monocyty-makrofagi są wielofunkcyjne i znajdują się w prawie wszystkich tkankach ciała. Koordynują one fazy inicjacji i ustępowania odporności wrodzonej i nabytej, znacząco wpływając na odporność ochronną i patologiczne uszkodzenia o podłożu immunologicznym. Podczas gdy makrofagi rezydujące w tkankach odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy w stanie ustalonym, duże ilości monocytów są rekrutowane z krwi obwodowej do tkanki w wyniku uszkodzenia lub uszkodzenia stanu zapalnego. Makrofagi pochodzące z monocytów (M-DM) mogą różnicować się w wiele dynamicznych podtypów, a ich fenotypy i funkcje zależą od lokalnego środowiska tkankowego. 
Aby porównać różne bodźce lub warunki środowiskowe podczas różnicowania i polaryzacji M-DM, ustandaryzowaliśmy model in vitro ludzkiego niespolaryzowanego M-DM M0 i niektórych makrofagów spolaryzowanych cytokinami kardynalnymi, M1 pochodzącego z IFNγ/LPS, M2a pochodzącego z IL-4 oraz M2c pochodzącego z IL-10 lub deksametazonu, aby przeanalizować przeprogramowanie skośne M-DM za pomocą cytometrii przepływowej i PCR w czasie rzeczywistym. Odkryliśmy, że CD64, CD206, CD163, CD14 i MERTK mogą wyraźnie rozróżniać niespolaryzowane M0 i spolaryzowane M1, M2a i M2c za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto zdefiniowaliśmy IRF1 i CXCL10 jako specyficzne geny dla klasycznych transkryptów M1-, IRF4-, CCL22 i TGM2 pochodzących z IFNγ / LPS dla M2a pochodzących z IL-4 oraz genu MERTK dla M2c pochodzącego z deksametazonu. Podsumowując, nasz ustandaryzowany protokół M-DM może dostarczyć kardynalnej mapy in vitro do analizy zróżnicowania i polaryzacji ludzkiego M-DM pod wpływem różnych bodźców.

Na podstawie naszych wieloletnich badań nad charakterystyką makrofagów ustaliliśmy precyzyjną kombinację markerów, która wyraźnie odróżnia poszczególne subpopulacje M-DM in-vitro. Markery fenotypowe wybrano w oparciu o literaturę oraz szeroki screening przeprowadzony przez nas wcześniej9,14,15,16,17. Ponadto ustaliliśmy, że CD64, CD206, CD163, CD14 or...

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Cells of the monocyte-macrophage lineage are multifunctional and found in almost all body tissues. They coordinate innate and adaptive immunity&#180;s ...

W naszych badaniach zbadaliśmy linię monocytów i makrofagów, podkreślając jej niezwykłą plastyczność i zdolność do integracji wielu sygnałów z otoczenia w celu kształtowania odpowiedzi efektorowej podczas stanu zapalnego, naprawy tkanek i infekcji. Makrofagi znajdują się w całym ciele i koordynują inicjację i ustąpienie wrodzonej i przystosowanej odporności, wpływając na chronioną i immunologiczną patologię. Przeprogramowanie makrofagów jest najbardziej obiecującą funkcją w tej dziedzinie.Pojawiająca się technologia omiczna zrewolucjonizowała nasze rozumienie biologii makrofagów, zapewniając wgląd w ich różnorodność fenotypową, charakterystykę funkcjonalną, potencjał programowania i pochodzenie rozwojowe tych komórek. Główną przeszkodą i pułapką w odkrywaniu różnicowania i polaryzacji makrofagów są niejednorodne warunki i protokoły eksperymentalne w literaturze oraz brak konsensusu w definiowaniu terminu makrofagi. Pokazujemy wpływ przeprogramowania mediatora lekowego i lipidowego na polaryzację makrofagów i opracowujemy model 3D interakcji in vitro między komórkami makrofagów i glejaka.Dodatkowo wykazaliśmy, że płytki krwi licencjonują różnicowanie makrofagów pochodzących z monocytów do fenotypu N1. Na początek umieść antykoagulowane próbki krwi obwodowej w wirówce. Wiruj do 200G przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Obserwuj oddzielenie osocza bogatopłytkowego na górze i frakcji komórkowej, w tym czerwonych i białych krwinek, poniżej. Rozcieńczyć frakcję komórkową otrzymaną z pierwszego wirowania sterylnym PBS podgrzanym do temperatury pokojowej. Delikatnie homogenizować roztwór przed przystąpieniem do wirowania w gradiacji gęstości Ficoll-Hypaque.Przenieś 15 mililitrów Ficoll-Hypaque do sterylnej 15-mililitrowej probówki. Ostrożnie i powoli dodaj 30 mililitrów rozcieńczonej krwi na wierzch Ficollu, zapewniając minimalne mieszanie między fazami. Odwirować probówkę zawierającą Ficoll i rozcieńczoną krew w stężeniu 600 G przez 25 minut w temperaturze pokojowej.Za pomocą sterylnej trzymililitrowej pipety Pasteura usuń część żółtej górnej warstwy. Ostrożnie zebrać granicę faz między warstwą żółtą a warstwą Ficoll za pomocą sterylnej pipety Pasteura. Przenieś zebrane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC do nowej 15-mililitrowej probówki zawierającej co najmniej trzy mililitry sterylnego PBS.Uzupełnij probówkę sterylnym PBS, aby osiągnąć całkowitą objętość od 12 do 15 mililitrów. Następnie odwirować próbkę o temperaturze 600 G przez 10 minut. Następnie odkręć zawieszenie PBMC o masie 300 G przez pięć minut w temperaturze od 8 do 10 stopni Celsjusza.Ponownie zawieś komórki w żądanej objętości sterylnego zimnego PBS z 2% FBS. Utrzymuj komórki w temperaturze 4 stopni Celsjusza do następnego kroku. Przenieś żądaną objętość zawiesiny PBMC do pięciomililitrowej rurki z okrągłym dnem z polistyrenu.Następnie dodaj 10 mikrolitrów koktajlu pozytywnej selekcji na każde 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej. Zawiesinę dokładnie wymieszać przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie odpipetuj 10 mikrolitrów nanocząstek magnetycznych na 100 mikrolitrów zawiesiny komórek.Energicznie pipetuj w górę i w dół ponad pięć razy, aby zapewnić równomierne zawieszenie nanocząstek magnetycznych. Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodać PBS zawierający FBS i EDTA do zawiesiny, aby uzyskać całkowitą objętość do 2,5 mililitra. Delikatnie pipetuj komórki w górę i w dół dwa do trzech razy.Włóż probówkę do sortownika magnetycznego i pozostaw ją w spokoju na pięć minut. Odwróć magnes wraz z rurką jednym ciągłym ruchem. Trzymaj magnes i rurkę odwrócone przez dwie do trzech sekund przed przywróceniem ich do pozycji pionowej.Wyjmij rurkę z magnesu, a następnie ponownie dodaj 2,5 mililitra buforu PBS-FBS-EDTA do probówki. Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek w górę i w dół dwa do trzech razy, aby ją wymieszać. Włóż rurkę z powrotem do magnesu i odłóż ją na pięć minut.Jednym ciągłym ruchem ponownie odwróć magnes i rurkę, odrzucając frakcję supernatantu. Wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś ogniwa w odpowiedniej objętości PBS-FBS bez EDTA. Pozytywnie wybrane komórki są teraz gotowe do użycia.Teraz dodaj bufor PBS-FBS do posortowanych komórek CD14, zwiększając całkowitą objętość do 12 do 14 mililitrów, aby rozcieńczyć pozostały EDTA. Wirować w temperaturze 600G przez 10 minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić pozytywnie wybrane monocyty CD14 w dwóch mililitrach buforu PBS-FBS.Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Trzymaj komórki na lodzie do czasu przygotowania hodowli. W celu hodowli ponownie zawiesić osad w stężeniu miliona komórek na mililitr w uzupełnionym pożywce RPMI 1640.Odpipetować 250 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny komórek do każdego dołka na 48-dołkowej płytce. Do każdej studzienki dodać 250 mikrolitrów pożywki RPMI uzupełnionej antybiotykiem zawierającej 50 nanogramów na mililitr czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów. Inkubuj płytkę kultury komórkowej w wilgotnym inkubatorze, aby zainicjować różnicowanie makrofagów.W czwartym dniu różnicowania makrofagów należy wymienić połowę pożywki hodowlanej z każdej studzienki. Dodaj cytokiny lub odczynniki do pożądanych warunków polaryzacji i kontynuuj hodowlę przez kolejne trzy dni. Zbierz monocyty pochodzące z makrofagów w siódmym dniu w celu charakterystyki fenotypowej.Makrofagi M1 indukowane przez interferon gamma-plus lipopolisacharyd wykazywały najwyższą ekspresję CD64, brak CD206 oraz niskie poziomy CD163 i MERTK. Makrofagi M2a indukowane przez interleukinę 4 charakteryzowały się zwiększoną ekspresją CD206 i obniżonymi poziomami CD64, CD163 i MERTK. Makrofagi M2c indukowane przez interleukinę 10 lub deksametazon wykazywały zwiększoną ekspresję CD163 i CD14, pośrednie poziomy CD64 i wzrost ekspresji MERTK.

reprograming-model-human-monocyte-derived-macrophages-for-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie demonstrujemy test efferocytozy do badania klirensu komórek apoptotycznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Efferocytoza to wieloetapowy proces, w którym komórki apoptotyczne są pochłaniane przez fagocyty i degradowane w pęcherzykach zwanych efferosomami. Protokół ten zapewnia metodę wizualizacji zinternalizowanych i niezinternalizowanych części poszczególnych komórek apoptotycznych oraz ilościowego określenia efferocytozy.

Test esterocytozy utrwalonych: metoda badania wychwytu efferocytarnego komórek apoptotycznych przez makrofagi przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film pokazuje proces wstępowania pierwotnych monocytów do makrofagów. Pierwotne ludzkie monocyty można wyizolować i zróżnicować do fenotypu prozapalnego podobnego do M1 przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) lub do fenotypu przeciwzapalnego podobnego do M2 za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF).

Hodowla in vitro i różnicowanie pierwotnych monocytów do makrofagów

Ten film pokazuje aktywację białek kaspazy u ludzkich makrofagów za pomocą białek reporterowych dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Prodomeny kaspazy-1 są połączone z niefluorescencyjnymi fragmentami białek Wenus, które są rekrutowane do kompleksów inflamasomowych. Bliskość inflamasomów indukuje ponowne fałdowanie i fluorescencję fragmentów Wenus, potwierdzając aktywację kaspazy w makrofagach.

Wizualizacja aktywacji kaspazy w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Prezentowany tutaj jest protokół do wykrywania produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w hodowli żywych komórek za pomocą mikroskopii i barwienia fluorescencyjnego. Protokół ten można dalej rozszerzyć w celu zbadania specyficznych markerów białka MET za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten protokół opisuje solidne generowanie makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz metody ich późniejszej charakterystyki. Ekspresja markerów powierzchniowych komórek, ekspresja genów i testy funkcjonalne są wykorzystywane do oceny fenotypu i funkcji tych makrofagów pochodzących z iPSC.

Produkcja i charakterystyka ludzkich makrofagów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół oceny potencjału immunomodulacyjnego powierzchni implantów in vitro, mający na celu poprawę wiarygodności i odtwarzalności obecnych protokołów oraz promowanie dalszych badań. Profile cytokin wydzielniczych, ekspresję mRNA i markery powierzchni komórek monitorowano za pomocą makrofagów pochodzących z monocytów krwi w celu zbadania polaryzacji makrofagów hodowanych na tytanie.

Polaryzacja i charakterystyka ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów typu M1 i M2 na powierzchniach implantów

Biorąc pod uwagę ograniczone modele ksenoprzeszczepów dostępne do badania interakcji między ludzkim CART-em a komórkami szpikowymi, stworzyliśmy modele in vitro i in vivo , aby zrozumieć wpływ ludzkich makrofagów na komórki CART. Wyniki można potencjalnie uogólnić, aby ocenić rolę makrofagów w mikrośrodowisku guza i przetestować immunoterapie ukierunkowane na makrofagi.

Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo

Poznaj metodę przeprogramowania makrofagów pochodzących z monocytów w modelu 3D in vitro. Technika ta umożliwia badanie plastyczności komórek immunologicznych i ich odpowiedzi na leki oraz mediatory lipidowe w kontekście immunologii.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Przeglądaj więcej filmów