Name: Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj metodę tworzenia dwuwymiarowych organoidów jelitowych świń z pomiarem TEER i komorą Ussinga. Model ten odzwierciedla fizjologiczne właściwości rodzimego jelita i stanowi alternatywę dla tradycyjnych eksperymentów zwierzęcych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Federalnemu Ministerstwu Żywności i Rolnictwa (BLE# 28N-2-071-00) za dofinansowanie.

Do niniejszego protokołu wykorzystano dwie zdrowe świnie (rasa Bentheim Blacked Pied; 1 samiec, 1 samica; w wieku 4,5 miesiąca; o masie około 65 kg), które zostały uśmiercone za pomocą pistoletucaptive bolt oraz upuszczania krwi. Zgodnie z ustawą o ochronie zwierząt, czynność ta (ubój i pobranie tkanek) nie jest klasyfikowana jako eksperyment na zwierzętach, jednak musiała zostać zgłoszona do urzędnika ds. dobrostanu zwierząt (nr rejestracyjny TiHo-T-2023-15) Fundacji Uniwersytetu Medycyny Weterynaryjnej w Hanowerze.
1. Powlekanie wkładów
UWAGA: Wszystkie etapy są przeprowadzane z użyciem sterylnych materiałów w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie kroki protokołu są wykonywane na lodzie, chyba że wskazano inaczej.
<ol>
	<li> rozmrozić zamrożoną błonę podstawną na lodzie przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc na lodzie w temperaturze 4 °C. W probówce stożkowej wymieszać błonę podstawną w stosunku 1:40 (v/v) z lodowatym, sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS).</li>
	<li>Wyjąć sterylne płytki z wkładkami z opakowania. Do komory apikalnej każdego wkładu dodać 200 µL mieszaniny błony podstawnej.</li>
	<li>Założyć pokrywkę płytki wielodołkowej i inkubować przez co najmniej 1,5 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.</li>
	<li>Przed wysianiem komórek ostrożnie odessać roztwór. Należy upewnić się, że końcówka nie dotyka membrany podczas odsysania.</li>
</ol>
2. Generowanie 2D monowarstw organoidów
UWAGA: Organoidy jelita grubego świni są generowane i hodowane zgodnie z opisem dla organoidów jelita cienkiego (wyrostka) świni25. Po wygenerowaniu organoidów 3D należy je hodować przez co najmniej 3-4 tygodnie, wykonując cotygodniowe pasażowanie w celu zapewnienia spójnego wzrostu. Liczba komórek w każdej kopule zawierającej organoidy 3D, które są rozpuszczane w kolejnych krokach, jest wystarczająca do pokrycia pojedynczego filtra transmembranowego. Przed generowaniem monowarstwy organoidy 3D poddano optycznej kontroli jakości w celu sprawdzenia poprzedniego wzrostu oraz ewentualnego zanieczyszczenia (Rysunek 1).
<img alt="Morfologia komórkowa podczas krioterapii; obraz mikroskopowy porównujący integralność strukturalną, skala 100 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67666/67666fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentatywne organoidy 3D. Trójwymiarowe (A) organoidy jelita czczego oraz (B) organoidy okrężnicy są dokładnie badane pod mikroskopem przed wytworzeniem monowarstw. Szczególną uwagę poświęca się ocenie wcześniejszych wzorców wzrostu, integralności strukturalnej oraz obecności wszelkich zanieczyszczeń lub kontaminacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67666/67666fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę do organoidów (Tabela 1) z dołków zawierających 3D organoidy krypt. Dodać 1 mL schłodzonego PBS do każdego dołka i delikatnie rozpuścić błonę podstawną, pipetując w górę i w dół końcówką p1000.</li>
	<li>Zebrać wszystkie rozpuszczone organoidy do probówki 15 mL wypełnionej uprzednio 10 mL schłodzonego PBS. Odwirować probówkę przy 250 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Odessać nadsącz.</li>
	<li>Resuspendować osad w 1 mL ciepłej (37 °C) 0,05 % (v/v) trypsyny/EDTA (na tym etapie można połączyć zawartość dwóch probówek). Inkubować przez 5 min w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej, a następnie natychmiast przenieść na lód, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>Resuspendować na lodzie 20 razy końcówką p1000, a następnie kolejne 15 razy końcówką p1000 i p200. Dodać 10 mL schłodzonego DMEM uzupełnionego o 10% (v/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS).</li>
	<li>Odwirować probówkę przy 1 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadsącz i resuspendować osad w 1 mL pożywki dla monowarstwy (Tabela 1).</li>
	<li>Określić liczbę żywych komórek na mL przy użyciu komory Neubauera zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Usunąć w tym momencie roztwór powlekający z komory apikalnej i zastąpić go 500 µL ciepłej (37 °C) pożywki dla monowarstwy. Dodać 3 mL pożywki dla monowarstwy do komory basolateralnej.</li>
	<li>Wyznaczyć oporność pustą (TEER) dla każdego pustego wkładu transwell, zgodnie z opisem w kroku 3. Czas, w którym w komorze apikalnej nie ma pożywki, powinien być jak najkrótszy, aby zapobiec wysychaniu komórek.</li>
	<li>Usunąć apikalną pożywkę dla monowarstwy i dodać do komory apikalnej każdego transwellu 2 x 105 komórek nabłonkowych w 500 µL pożywki dla monowarstwy w przypadku hodowli 2D jelita cienkiego (jejunum) oraz 1,5 x 105 komórek nabłonkowych w 500 µL pożywki dla monowarstwy w przypadku hodowli 2D jelita grubego.</li>
	<li>Wymieniać pożywkę i mierzyć TEER co 2-3 dni. Pomiar TEER należy przeprowadzić przed wymianą pożywki. Ostrożnie odessać pożywkę z komory apikalnej i basalnej i zastąpić ją 500 µL lub 3 mL świeżej, ciepłej (37 °C) pożywki.
	<ol>
		<li>W przypadku organoidów jejunum: w 16. dniu po wysianiu zmienić pożywkę dla monowarstwy na pożywkę różnicującą (Tabela 1). W przypadku organoidów jelita grubego: zmienić pożywkę w 7. dniu na pożywkę różnicującą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieniać pożywkę różnicującą codziennie i przeprowadzać pomiar TEER przy każdej wymianie pożywki. W 18. dniu (dla organoidów jejunum) lub 9. dniu (dla organoidów jelita grubego) po wysianiu przystąpić do eksperymentów funkcjonalnych.</li>
</ol>
3. Pomiar transepitelialnej oporności elektrycznej (TEER)
UWAGA: Wszystkie pomiary są wykonywane w komorze bezpieczeństwa, aby uniknąć kontaminacji. Przed wysiewaniem komórek każdy pusty, powlekany transwell jest mierzony w celu uzyskania indywidualnych wartości tła. Woltomierz zapisuje wartości na podłączonym urządzeniu USB.
<ol>
	<li>Oczyścić elektrodę w kształcie pałeczek 70% (v/v) etanolem i pozostawić do całkowitego wyschnięcia. W międzyczasie wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją pod komorą laminarną.</li>
	<li>Wprowadzić krótkie ramię elektrody do przedziału apikalnego insertów, a długie ramię do przedziału basolateralnego insertu. Należy unikać kontaktu krótkiego ramienia z warstwą komórek.</li>
	<li>Zmierzyć transepithelial electrical resistance (TEER) dla każdego transwellu. Pozostawić woltomierzem do ustabilizowania się odczytu w celu zapewnienia dokładności pomiaru. Wartości TEER zmierzyć, klikając przycisk Store.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.2 i 3.3 dla pozostałych studni. Po dotarciu do ostatniej studni woltomierz wyświetli prośbę o zapisanie danych na urządzeniu USB. Kliknąć Save.</li>
	<li>Oczyścić elektrodę po każdej płytce oraz po zakończeniu pomiarów i pozostawić do całkowitego wyschnięcia przed schowaniem.</li>
	<li>Od zmierzonych wartości komórkowych odjąć wartości tła określone przed wysianiem komórek.</li>
</ol>
4. Badania transportu elektrofizjologicznego z wykorzystaniem komory Ussinga
UWAGA: Badania elektrofizjologiczne transportu przeprowadza się przy użyciu komory Ussinga, składającej się z dwóch przedziałów oddzielonych nabłonkiem. Komora ta jest połączona z układem voltage clamp za pomocą elektrod Ag/AgCl. Technika ta umożliwia śledzenie aktywnych procesów transportu elektrogennego nabłonka poprzez zmiany prądu zwarcia (Isc) indukowanego przez układ voltage clamp, a także oporu tkanki (Rt) obliczanego na podstawie prawa Ohma. Wartości Isc i Rt są rejestrowane co 6 s przez cały czas trwania eksperymentu. Podczas eksperymentu badana tkanka jest napowietrzana karbogenem i inkubowana w zmodyfikowanych roztworach Krebsa-Henseleita w celu zapewnienia warunków żywotności. Do roztworów buforowych dodaje się indometacynę (10 µM), aby zahamować syntezę prostaglandyn26.
<ol>
	<li>Podgrzać roztwory buforu śluzówkowego i surowiczego do 37 °C i napowietrzyć karbogenem. Złożyć pojedyncze komory, używając pustego wkładu dla każdej z nich. Upewnić się, że strony apikalne transwelli są skierowane w tym samym kierunku.</li>
	<li>Wypełnić wszystkie komory 5 mL uprzednio podgrzanego roztworu buforu śluzówkowego (Tabela 2). Podłączyć wszystkie elektrody z clampora napięcia do poszczególnych komór zgodnie z instrukcją producenta. Upewnić się, że pęcherzyki gazu nie zakłócają pracy elektrod, aby zapewnić poprawność pomiaru.</li>
	<li>Skalibrować oprogramowanie komory Ussinga dla tych warunków, klikając przycisk Rf/dpI w oprogramowaniu clampora napięcia. Rezystancja wszystkich użytych pustych wkładów powinna być taka sama (~ 70 Ohm), a prąd powinien wynosić około 0 mV (± 5 mV). Jeśli tak nie jest w przypadku niektórych komór, należy sprawdzić prawidłowe rozmieszczenie elektrod lub obecność pęcherzyków powietrza w systemie.</li>
	<li>Wyjąć wszystkie elektrody i wylać zużyty roztwór buforu. Otworzyć wszystkie poszczególne komory i wyjąć puste wkłady. Upewnić się, że zachowano kolejność poszczególnych komór.</li>
	<li>Przenieść płytkę z wkładami z inkubatora do komory bezpieczeństwa. Ostrożnie odessać medium bazolateralne i apikalne.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 500 µL ciepłego (37 °C) buforu śluzówkowego do komory apikalnej oraz 3 mL buforu surowiczego do komory bazolateralnej. Odessać bufory i powtórzyć czynność 2x.</li>
	<li>Wyjąć wkłady z płytki. Delikatnie usunąć podpory wkładów. Umieścić wkłady w komorach Ussinga, upewniając się, że orientacja wkładów jest taka sama jak podczas fazy kalibracji. Złożyć poszczególne komory zgodnie z Rysunkiem 2.</li>
	<li>Wypełnić komory od strony bazolateralnej komórek 5 mL buforu surowiczego (Tabela 2), a komorę od strony apikalnej 5 mL buforu śluzówkowego.</li>
	<li>Podłączyć elektrody i rurki do napowietrzania do każdej pojedynczej komory. Rozpocząć pomiar w oprogramowaniu Ussinga. Pozostawić na 15 min w celu wyrównania stanu równowagi.</li>
	<li>Zmienić warunki z obwodu otwartego na warunki zwarcia. Równoważyć od 5 min do 10 min. Dodać 10 µM forskoliny do komory surowiczej. 
	UWAGA: Dodanie forskoliny można zastąpić innymi odczynnikami/substancjami, w zależności od badanych odcinków jelita i pytań badawczych.</li>
	<li>Po 15 min dodać kolejne odczynniki w ten sam sposób co forskolinę lub zakończyć pomiar. Usunąć rurki do napowietrzania i elektrody z poszczególnych komór. Wlać roztwory buforowe z obu komór do naczynia.</li>
	<li>Rozmontować komory i utylizować wkłady lub wykorzystać je do dalszych analiz (np. immunohistochemii lub analizy ekspresji).</li>
</ol>
<img alt="Schemat eksperymentu z zaciskaniem napięcia; dwuwymiarowa monowarstwa błony; pomiar μA/mV; układ śluzówkowy/surowiczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67666/67666fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schematyczna budowa komory Ussinga. Przedstawiono obie komory przedzielone błoną z wyhodowaną 2D monowarstwą. Obie komory są napowietrzane karbogenem; napięcie i prąd są monitorowane przez dwie elektrody w każdej komorze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67666/67666fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
5. Analiza danych generowanych przez układ komory Ussinga
<ol>
	<li>Zaimportuj dane wygenerowane przez oprogramowanie do clampingu napięciowego do odpowiedniego edytora arkuszy kalkulacyjnych.</li>
	<li>Aby wyznaczyć wartości podstawowe Isc i Rt, oblicz średnią z 10 kolejnych punktów danych pobranych 10 min po zainicjowaniu warunków zwarcia. Każda pojedyncza komora służy jako powtórzenie techniczne, natomiast każde przejście organoidów służy jako powtórzenie biologiczne.</li>
	<li>Aby ocenić wpływ zastosowanych czynników, oblicz średnią z 10 kolejnych punktów danych bezpośrednio przed dodaniem czynnika. Porównaj tę średnią z maksymalną (lub minimalną) wartością zaobserwowaną po zastosowaniu czynnika. Uzyskane dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD).</li>
</ol>

<ol><li>Hornbuckle, W. E., Tennant, B. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornbuckle%2C+WE+%22Clinical+Biochemistry+of+Domestic+Animals%22">Clinical Biochemistry of Domestic Animals</a>. , Academic Press. 367-406 (1997).</li>
<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cells%3A+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).</li>
<li>Pham, T. A., Lawley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+insights+on+intestinal+dysbiosis+during+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Emerging insights on intestinal dysbiosis during bacterial infections.</a> Curr Opin Microbiol. 17 (100), 67-74 (2014).</li>
<li>Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis+and+inflammation+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeostasis and inflammation in the intestine.</a> Cell. 140 (6), 859-870 (2010).</li>
<li>Ternhag, A., Torner, A., Svensson, A., Ekdahl, K., Giesecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+effects+of+bacterial+gastrointestinal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term effects of bacterial gastrointestinal infections.</a> Emerg Infect Dis. 14 (1), 143-148 (2008).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+principles+of+humane+experimental+technique%22">The principles of humane experimental technique</a>. , Methuen & Co. Limited. London. (1959).</li>
<li>Zietek, T., Boomgaarden, W. A. D., Rath, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening%2C+oral+bioavailability+and+regulatory+aspects%3A+A+need+for+human+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Drug screening, oral bioavailability and regulatory aspects: A need for human organoids.</a> Pharmaceutics. 13 (8), 1280(2021).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), e66465(2013).</li>
<li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell Tissue Res. 365 (1), 123-134 (2016).</li>
<li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell Tissue Res. 375 (2), 409-424 (2019).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+intestinal+enteroids%3A+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> J Virol. 93 (5), e01682-e01718 (2019).</li>
<li>Min, S., Kim, S., Cho, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+tract+modeling+using+organoids+engineered+with+cellular+and+microbiota+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches.</a> Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminopeptidase+N+expression%2C+not+interferon+responses%2C+determines+the+intestinal+segmental+tropism+of+porcine+deltacoronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Aminopeptidase N expression, not interferon responses, determines the intestinal segmental tropism of porcine deltacoronavirus.</a> J Virol. 94 (14), e00480-e00520 (2020).</li>
<li>van der Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 375(2020).</li>
<li>van der Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced%2C+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Res. 28, 165-171 (2018).</li>
<li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+piglet+intestinal+3D+organoids+from+cryopreserved+epithelial+crypts+and+establishment+of+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture of piglet intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers.</a> J Vis Exp. (192), e64917(2023).</li>
<li>Ussing, H. H., Zerahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+transport+of+sodium+as+the+source+of+electric+current+in+the+short-circuited+isolated+frog+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 23 (2-3), 110-127 (1951).</li>
<li>Dengler, F., Kraetzig, A., Gabel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+protects+porcine+colon+epithelium+from+hypoxia-induced+damage+on+a+functional+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Butyrate protects porcine colon epithelium from hypoxia-induced damage on a functional level.</a> Nutrients. 13 (2), 305(2021).</li>
<li>Guschlbauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-resveratrol+and+epsilon-viniferin+decrease+glucose+absorption+in+porcine+jejunum+and+ileum+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A+Mol+Integr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Trans-resveratrol and epsilon-viniferin decrease glucose absorption in porcine jejunum and ileum in vitro.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165 (3), 313-318 (2013).</li>
<li>Herrmann, J., Hermes, R., Breves, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+and+intraepithelial+metabolism+of+short-chain+fatty+acids+%28SCFA%29+in+the+porcine+proximal+colon+are+influenced+by+SCFA+concentration+and+luminal+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A+Mol+Integr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport and intraepithelial metabolism of short-chain fatty acids (SCFA) in the porcine proximal colon are influenced by SCFA concentration and luminal pH.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 158 (1), 169-176 (2011).</li>
<li>Klinger, S., Breves, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+inhibits+porcine+intestinal+glucose+and+alanine+transport%3A+Potential+roles+of+Na%28%2B%29%2FK%28%2B%29-ATPase+activity%2C+protein+kinase+A%2C+AMP-activated+protein+kinase+and+the+association+of+selected+nutrient+transport+proteins+with+detergent+resistant+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Resveratrol inhibits porcine intestinal glucose and alanine transport: Potential roles of Na(+)/K(+)-ATPase activity, protein kinase A, AMP-activated protein kinase and the association of selected nutrient transport proteins with detergent resistant membranes.</a> Nutrients. 10 (3), 302(2018).</li>
<li>Leonhard-Marek, S., Hempe, J., Schroeder, B., Breves, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+chloride+secretion+across+the+jejunum+and+colon+of+pigs+as+affected+by+age+and+weaning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of chloride secretion across the jejunum and colon of pigs as affected by age and weaning.</a> J Comp Physiol B. 179 (7), 883-896 (2009).</li>
<li>Schroeder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventive+effects+of+the+probiotic+Escherichia+coli+strain+Nissle+1917+on+acute+secretory+diarrhea+in+a+pig+model+of+intestinal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Preventive effects of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 on acute secretory diarrhea in a pig model of intestinal infection.</a> Dig Dis Sci. 51 (4), 724-731 (2006).</li>
<li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), e0256143(2021).</li>
<li>Ferreira, S. H., Moncada, S., Vane, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indomethacin+and+aspirin+abolish+prostaglandin+release+from+the+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+New+Biol%22%5BJournal%5D)">Indomethacin and aspirin abolish prostaglandin release from the spleen.</a> Nat New Biol. 231 (25), 237-239 (1971).</li>
<li>Dykstra, G. D., Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+bovine+organoid+technology+using+small+and+large+intestinal+monolayer+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Advancements in bovine organoid technology using small and large intestinal monolayer interfaces.</a> J Vis Exp. (208), e67010(2024).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cells+as+a+model+for+studying+physiological+properties+and+toxin-induced+effects+on+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells.</a> PLoS One. 16 (10), e0257824(2021).</li>
<li>Beduneau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+Caco-2%2FHT29-MTX+co-culture+model+mimicking+variable+permeabilities+of+the+human+intestine+obtained+by+an+original+seeding+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">A tunable Caco-2/HT29-MTX co-culture model mimicking variable permeabilities of the human intestine obtained by an original seeding procedure.</a> Eur J Pharm Biopharm. 87 (2), 290-298 (2014).</li>
<li>Markov, A. G., Veshnyakova, A., Fromm, M., Amasheh, M., Amasheh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+expression+of+claudin+proteins+correlates+with+tight+junction+barrier+properties+in+rat+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Segmental expression of claudin proteins correlates with tight junction barrier properties in rat intestine.</a> J Comp Physiol B. 180 (4), 591-598 (2010).</li>
<li>Pearce, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+tight+junction+composition+and+macromolecular+permeability+among+different+intestinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types.</a> BMC Biology. 16 (1), 19(2018).</li>
<li>Legen, I., Salobir, M., Kerc, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+intestinal+epithelia+as+models+for+absorption+enhancement+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Comparison of different intestinal epithelia as models for absorption enhancement studies.</a> Int J Pharm. 291 (1-2), 183-188 (2005).</li>
<li>Moeser, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+signaling+pathways+activated+by+weaning+mediate+intestinal+dysfunction+in+the+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stress signaling pathways activated by weaning mediate intestinal dysfunction in the pig.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292 (1), G173-G181 (2007).</li>
<li>Moeser, A. J., Ryan, K. A., Nighot, P. K., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+dysfunction+induced+by+early+weaning+is+attenuated+by+delayed+weaning+and+mast+cell+blockade+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal dysfunction induced by early weaning is attenuated by delayed weaning and mast cell blockade in pigs.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (2), G413-G421 (2007).</li>
<li>Seamon, K. B., Padgett, W., Daly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin%3A+unique+diterpene+activator+of+adenylate+cyclase+in+membranes+and+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Forskolin: unique diterpene activator of adenylate cyclase in membranes and in intact cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (6), 3363-3367 (1981).</li>
<li>Herrmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+diversity+of+electrogenic+glucose+transport+characteristics+in+the+small+intestines+of+weaned+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A+Mol+Integr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Segmental diversity of electrogenic glucose transport characteristics in the small intestines of weaned pigs.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 163 (1), 161-169 (2012).</li>
<li>Wright, E. M., Martin, M. G., Turk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+absorption+in+health+and+disease--sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intestinal absorption in health and disease--sugars.</a> Best Pract Res Clin Gastroenterol. 17 (6), 943-956 (2003).</li>
<li>Crane, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+-dependent+transport+in+the+intestine+and+other+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Na+ -dependent transport in the intestine and other animal tissues.</a> Fed Proc. 24 (5), 1000-1006 (1965).</li>
<li>Inagaki, A., Yamaguchi, S., Ishikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amiloride-sensitive+epithelial+Na%2B+channel+currents+in+surface+cells+of+rat+rectal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Amiloride-sensitive epithelial Na+ channel currents in surface cells of rat rectal colon.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286 (2), C380-C390 (2004).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych konfliktów interesów, które moglibyśmy zadeklarować.

Protokół ten opisuje metodę przekształcania ustalonych organoidów 3D świń w pojedyncze komórki, które są następnie wysiewane na błonach transwell w celu utworzenia nienaruszonej monowarstwy. Taka konfiguracja zapewnia dostęp do wierzchołkowej strony komórek, ułatwiając korzystanie z komór Ussing do monitorowania procesów absorpcyjnych i wydzielniczych.
Pierwszym i kluczowym krokiem w tym wieloetapowym procesie jest precyzyjna dezintegracja organoidów 3D. Osiągnięcie równomiernego wysiewu pojed...

Przewód pokarmowy odgrywa kluczową rolę w trawieniu, wchłanianiu składników odżywczych i wydalaniu odpadów z kałem1. Dodatkowo działa jako bariera przed patogenami, rola wspierana przez zróżnicowany skład komórkowy, w tym komórki macierzyste, komórki kubkowe wytwarzające śluz, komórki enteroendokrynne i enterocyty absorpcyjne2. Homeostaza jelit może zostać zakłócona przez różne czynniki, takie jak infekcje bakteryjne3 lub procesy zapalne4, co prowadzi do poważnych konsekwencji dla organizmu, takich jak złe wchłanianie, biegunka, a nawet śmierć5. Badanie takich patofizjologicznych scenariuszy jest zwykle wykonywane przy użyciu zwierząt laboratoryjnych lub, zgodnie z zasadą 3R6, kultur komórkowych pochodzących od różnych gatunków. Dokładne przewidywanie i możliwość przenoszenia wyników mają kluczowe znaczenie w przypadku korzystania z modeli specyficznych dla gatunku7. Pomimo tej potrzeby zauważalny jest brak kultur komórkowych pochodzących od świń, które odpowiednio odwzorowują złożoność i funkcjonalność przewodu pokarmowego.
Aby sprostać temu wyzwaniu, które dotyczy również innych gatunków, opracowano trójwymiarowe (3D) organoidy w próbie odtworzenia fizjologicznej złożoności klasy GIT<sup="xref">8. Początkowo organoidy tworzono z jelit ludzkich i myszy; Do tej pory z powodzeniem opracowano i wyhodowano również organoidy świń pochodzące od młodych i dorosłych świń9,10. Od momentu powstania te organoidy świńskie zostały wykorzystane w kilku badaniach, koncentrujących się głównie na infekcjach jelitowych11,12,13,14. Badania mające na celu scharakteryzowanie właściwości fizjologicznych, takich jak transport składników odżywczych czy procesy wydzielnicze, pozostają ograniczone15. Może to być spowodowane orientacją organoidów jelitowych, z powierzchnią wierzchołkową skierowaną do wewnątrz, a stroną podstawno-boczną na zewnątrz, co ogranicza dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Ograniczenie to zostało rozwiązane poprzez udaną hodowlę organoidów świń w formacie dwuwymiarowym16, metoda, która została jeszcze bardziej rozwinięta dzięki wykorzystaniu zamrożonej tkanki do ich generowania17.
Hodowla organoidów świń w 2D zapewnia dostęp do obu stron nabłonka, umożliwiając zastosowanie sprawdzonych metod do badania procesów transportu przez warstwę nabłonkową. Jedną z takich metod jest Ussing chamber18, która umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym elektrogenicznych procesów absorpcyjnych i wydzielniczych w całym nabłonku. Szerokie zastosowanie tego systemu umożliwiło kompleksowe zrozumienie funkcji jelit świń in vivo, obejmującej całą oś jelitową. Obejmuje to badania nad transportem monosacharydów lub transportem krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych lub reakcjami na wtórne metabolity roślinne, takie jak resweratrol, które wpływają na charakterystykę transportu jelitowego19,20,21,22,23,24. Znaczna część danych z tych badań ułatwia bezpośrednie porównania między dobrze scharakteryzowanymi warunkami in vivo a środowiskiem in vitro organoidów świń, pogłębiając naszą wiedzę na temat ich fizjologicznego znaczenia.
W tym badaniu prezentujemy protokół do generowania i hodowli monowarstw 2D z organoidów 3D świń. Dodatkowo szczegółowo opisujemy podejście metodologiczne do ilościowego określania procesów transportu jelitowego przy użyciu techniki komory usinga. Protokół oferuje narzędzia do badania cech absorpcyjnych i wydzielniczych in vitro w organoidach jelita czczego i jelita grubego, co pozwala na bezpośrednie porównanie z dobrze scharakteryzowanymi warunkami in vivo. Przyszłe zastosowania tego protokołu mogą obejmować badanie skutków substancji farmakologicznych lub toksykologicznych, a także badanie interakcji między nabłonkiem a patogenami.

<table><tbody><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>8,33,922</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-10432</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrażać w razie potrzeby</td></tr><tr><td>accujet S</td><td>Brand GmbH + Co KG, Wertheim, Niemcy</td><td>26351</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>12634010</td><td>Przechowywać pod adresem 4 &deg; C</td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>17504044</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby</td></tr><tr><td>CaCl2.2 H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>C3306</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>D(+)-Glukoza (wasserfrei)</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.08337</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-13027 Przechowywać</td><td>w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>M4125</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Niemcy</td><td>154938</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Zestaw elektrod (AgCl/PtIr/Std.)</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Niemcy</td><td>#1316</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus&nbsp;</td><td>Eppendorf SE, Hamburg, Gemany</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus&nbsp;</td><td>Eppendorf SE, Hamburg, Gemany</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>EVOM3 Ręczny nabłonkowy miernik woltomierzy Ohm Światowe</td><td>instrumenty precyzyjne, Sarasota, USA</td><td>EVM-MT-03-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Niemcy</td><td>F7524</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrażać w razie potrzeby</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Niemcy</td><td>F6886</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrażać w razie potrzeby</td></tr><tr><td>gasprofi 1 SCS micro</td><td>WLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Niemcy</td><td>60,04,000</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin 1</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-P1097</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>35050061</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni.&nbsp;</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Niemcy</td><td>1090571000</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Niemcy</td><td>H0887</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & st.; C</td></tr><tr><td>Herasafe 2025 Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>51033316</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator ICO105</td><td>Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Niemcy</td><td>62,20,143</td><td></td></tr><tr><td>Indometacyna</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>I7378</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.04936</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Niemcy</td><td>G7513</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby</td></tr><tr><td>LWRN Supernatant</td><td>własnej roboty&nbsp;</td><td></td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni C. W razie potrzeby rozmrozić. Suplement LWRN jest produkowany zgodnie z Miyoshi et al. (2012)</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL</td><td>Corning Incorporated - Life Sciences</td><td>354234</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. W razie potrzeby ostrożnie rozmrozić na lodzie</td></tr><tr><td>Megafuge 1.OR</td><td>Heraeus Instruments, Osterode, Niemcy</td><td>75003060</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6 H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.05833</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Na2HPO4.2H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.06580</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Niemcy</td><td>A7250</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.06404</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.06346</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.06329</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Neubauer improved chamber</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rh&ouml; n, Niemcy</td><td>40442712</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX70 odwrócony mikroskop</td><td>Olympus Corporation, Hamburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>15140122</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby</td></tr><tr><td>PolymyxinB</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Niemcy</td><td>P4932-1MU</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby</td></tr><tr><td>Statyw mikroskopu Primovert z lornetką</td><td>Zeiss</td><td>415510-1101-000</td><td></td></tr><tr><td>rm EGF</td><td>Prepotech, New Jersey, USA</td><td>315-09</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-10295</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby</td></tr><tr><td>Snapwell 3801</td><td>Corning Incorporated - Nauki Biologiczne</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Base System</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Niemcy</td><td>#1317</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Diffusion</td><td>Chamber Scientific Instruments, Simmerath, Niemcy</td><td>SKU 1307</td><td></td></tr><tr><td>Cęgi napięciowe/prądowe VCC6</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Niemcy</td><td>SKU 1310</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-10583</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Rozmrozić w razie potrzeby</td></tr></tbody></table>

dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids Reflecting the Physiological Properties of Native Gut

Przewód pokarmowy (GIT) służy zarówno do trawienia pokarmu i pobierania składników odżywczych, ale także jako bariera ochronna przed patogenami. Tradycyjnie badania w tej dziedzinie opierały się na eksperymentach na zwierzętach, ale rośnie zapotrzebowanie na alternatywne metody, które są zgodne z zasadami 3R - zastępuj, redukuj i udoskonalaj. Organoidy świń okazały się obiecującym narzędziem, oferującym dokładniejszą replikację warunków in vivo in vitro niż tradycyjne modele komórkowe. Jednym z głównych wyzwań związanych z organoidami jelitowymi jest ich powierzchnia wierzchołkowa skierowana do wewnątrz i powierzchnia podstawno-boczna skierowana na zewnątrz. To ograniczenie można przezwyciężyć, tworząc dwuwymiarowe (2D) warstwy organoidów na wkładkach transwell (zwanych dalej wkładkami), zapewniając dostęp do obu powierzchni. W tym badaniu z powodzeniem opracowaliśmy dwuwymiarowe hodowle organoidów jelita czczego i jelita grubego świń. Proces hodowli obejmuje dwie kluczowe fazy: najpierw tworzenie monowarstwy komórkowej, a następnie różnicowanie komórek za pomocą dostosowanych pożywek. Wzrost komórek jest śledzony poprzez pomiar przeznabłonkowego oporu elektrycznego, który stabilizuje się do 8 dnia w przypadku organoidów okrężnicy i 16 dnia w przypadku organoidów jelita czczego. Po 2-dniowej fazie różnicowania nabłonek jest gotowy do analizy. Aby określić ilościowo i śledzić aktywne procesy transportu elektrogenicznego, takie jak wydzielanie chlorków, stosujemy technikę komory usselga. Metoda ta pozwala na pomiar w czasie rzeczywistym i szczegółową charakterystykę procesów transportu nabłonkowego. Ten innowacyjny model in vitro, w połączeniu ze sprawdzonymi technikami, takimi jak komora usselga, zapewnia solidną platformę do fizjologicznej charakterystyki przewodu pokarmowego świń w ramach 3R. Otwiera również możliwości badania mechanizmów patofizjologicznych i opracowywania potencjalnych strategii terapeutycznych.

Niniejszy protokół umożliwia niezawodne generowanie dwuwymiarowych (2D) monowarstw świńskich poprzez dysagregację trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z jelita czczo i okrężnicy świń. W ciągu okresu hodowli trwającego 16 dni dla organoidów jelita czczego oraz 9 dni dla organoidów okrężnicy powstają nienaruszone monowarstwy. Monowarstwy te mogą być następnie wykorzystane do oceny elektrogennych i fizjologicznych właściwości transportowych z użyciem komory Ussinga.
Po rozbiciu organoidów...

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

The gastrointestinal tract (GIT) serves both in the digestion of food and the uptake of nutrients but also as a protective barrier against pathogens. ...

Naszym celem jest opracowanie i scharakteryzowanie modelu opartego na organoidach, który naśladuje przewód pokarmowy i porównuje go z żywymi świniami, a także koncentruje się na charakterystyce transportu. Przejście od klasycznego eksperymentu na zwierzętach na. W naszej dziedzinie fizjologii przewodu pokarmowego do.Model in vitro oparty na organoidach, który naśladuje sytuację in vivo. Połączyliśmy nasz model organoidów w jelicie cienkim i grubym z. Które można wykorzystać do zbadania charakterystyki transportu w czasie rzeczywistym, aby umożliwić porównanie naszego modelu z sytuacją żywej świni.Zwłaszcza w dziedzinie badań związanych ze zwierzętami gospodarskimi modele alternatywne dla klasycznych eksperymentów na zwierzętach są rzadkie. Pokonujemy to ograniczenie, wykorzystując nasz model przewodu pokarmowego świni oparty na organoidach. Planujemy wykorzystać nasz model jelitowy oparty na organoidach do zbadania wpływu bakterii chorobotwórczych u świń.Ma to na celu zrozumienie mechanizmów chorobotwórczości tych bakterii. Na początek wymieszaj świeżo rozmrożoną błonę podstawną w stosunku 1:40 z lodowatym sterylnym PBS w stożkowej probówce. Dodaj 200 mikrolitrów tej mieszanki do komory wierzchołkowej każdej wkładki w sterylnych płytkach.Załóż pokrywkę płytki dołka i inkubuj przez co najmniej 1,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji ostrożnie zassać roztwór, nie dotykając membrany. Usunąć podłoże organoidowe ze studzienek zawierających trójwymiarowe organoidy kryptowe.Aby rozpuścić błonę podstawną, dodaj jeden mililitr lodowatego PBS do studzienki i pipetuj w górę iw dół za pomocą końcówki P1000. Zbierz wszystkie rozpuszczone organoidy w 15-mililitrowej probówce wypełnionej 10 mililitrami lodowatego PBS. Odwirować probówkę o sile 250 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odessaniu supernatantu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze ciepłej 0,05% trypsyny EDTA. Inkubuj probówkę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej, a następnie umieść ją na lodzie, aby zatrzymać reakcję. Za pomocą końcówki P1000 pipetuj w górę i w dół 20 razy, aby dokładnie ponownie zawiesić organoidy, a następnie powtórz kolejne 15 razy, używając końcówki P1000 z końcówką P200 przymocowaną na górze.Teraz dodaj 10 mililitrów lodowatego DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą cielęcą lub FCS. Odwirować probówkę o sile 1000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze podłoża jednowarstwowego.Korzystając z komory Neubauera, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić liczbę żywych komórek na mililitr. Teraz zastąp roztwór powlekający z komory wierzchołkowej 500 mikrolitrami pożywki jednowarstwowej, odpuszczonej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i dodaj trzy mililitry pożywki jednowarstwowej do podstawowej komory bocznej. Usuń wierzchołkowy nośnik jednowarstwowy.W przypadku hodowli 2D dodać 500 mikrolitrów jednowarstwowej pożywki zawierającej odpowiednią ilość komórek do komory wierzchołkowej każdej transwell i inkubować komórki. W celu przeznabłonkowego oporu elektrycznego lub pomiaru TEAR wyczyść elektrodę pałeczki 70% etanolem i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Wprowadź krótkie ramię elektrody pałeczki do komory wierzchołkowej, a długie ramię do podstawowej bocznej komory wkładek.Następnie włącz i pozwól. Miernik zrównoważ się, aby uzyskać stabilny pomiar, a następnie kliknij przycisk przechowywania, aby zarejestrować wartości TEAR. Po zmierzeniu ostatniego dołka kliknij zapisz, aby zapisać dane na urządzeniu USB.Wyczyść elektrodę po każdej płytce i na końcu pomiaru. Pozostaw elektrodę do całkowitego wyschnięcia przed przechowywaniem. Odejmij puste wartości TEAR określone przed wysiewem komórek od zmierzonych wartości komórkowych.Zmień pożywkę i mierz TEAR co dwa do trzech dni, upewniając się, że TEAR jest mierzony przed zmianą podłoża. Ostrożnie dodaj 500 mikrolitrów lub trzy mililitry świeżej, ciepłej pożywki różnicującej do przegródek wierzchołkowych i podstawowych. W dniu 18 w przypadku organoidów jelita czczego lub w dziewiątym dniu w przypadku organoidów okrężnicy, po wysianiu przystąp do eksperymentów funkcjonalnych.Rozgrzej roztwory buforowe śluzówki i surowicy do 37 stopni Celsjusza i napowietrz karbogenem. Zmontuj pojedyncze komory za pomocą pustej wkładki dla każdej pojedynczej komory, upewniając się, że wszystkie wierzchołkowe boki transwell są skierowane w tym samym kierunku. Napełnij wszystkie komory pięcioma mililitrami wstępnie podgrzanego roztworu buforowego błony śluzowej.Podłącz wszystkie elektrody od voltage clamp do poszczególnych komór zgodnie z instrukcjami producenta. Aby skalibrować oprogramowanie studzienki Ussing, kliknij przycisk RFDPI w oprogramowaniu cęgowym napięcia. Upewnij się, że rezystancja wszystkich pustych wkładek wynosi około 70 omów, a prąd wynosi około zero miliwoltów.Usuń wszystkie elektrody i wyrzuć zużyty roztwór buforowy. Otwórz poszczególne komory, wyjmij puste wkładki i zachowaj porządek komór. Teraz pod szafką bezpieczeństwa ostrożnie zassaj podłoże podstawno-boczne i wierzchołkowe z płytki.Przemyć komórki 500 mikrolitrami ciepłego buforu błony śluzowej w komorze wierzchołkowej i trzema mililitrami buforu surowiczego w komorze podstawno-bocznej. Wyjmij wkładki z płyty i delikatnie zdejmij ich wsporniki. Umieść wkładki w komorach Ussing, upewniając się, że orientacja jest zgodna z fazą kalibracji.Po złożeniu poszczególnych komór należy wypełnić komory skierowane w stronę podstawno-boczną komórek pięcioma mililitrami buforu surowiczego, a te skierowane w stronę wierzchołkową pięciomililitrami buforu błony śluzowej. Podłącz elektrody i rurki napowietrzające do każdej komory z osobna i rozpocznij pomiar w oprogramowaniu Ussing. Zmień warunki z otwartego obwodu na tryb zwarcia w oprogramowaniu.Po pięciu do 10 minutach równoważenia dodaj 10 mikromolowych forskoliny do komory surowiczej. Po 15 minutach przerwij pomiar, wyjmij rurki napowietrzające i elektrody z komór i zdemontuj komory. Wartości transnabłonkowego oporu elektrycznego stopniowo wzrastały podczas uprawy, osiągając szczyt na poziomie 150 omów razy centymetr kwadratowy dla jelita czczego po 18 dniach i 200 omów kwadratowych dla organoidów okrężnicy po dziewięciu dniach.Wartości podstawowego prądu zwarciowego były istotnie niższe w organoidach jelita czczego niż w organoidach okrężnicy, podczas gdy wartości oporu podstawowego nie wykazały istotnych różnic. Leczenie forskoliną znacznie zwiększyło podstawowe wartości prądu zwarciowego w organoidach jelita czczego z 0,86 do 27,78 mikroamperów na centymetr kwadratowy, a w organoidach okrężnicy z 3,83 do 28,78 mikroamperów na centymetr kwadratowy.

two-dimensional-porcine-intestinal-organoids-reflecting-physiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół pozwala na różnicowanie ludzkich komórek pluripotencjalnych w organoidy jelitowe. Protokół naśladuje normalny rozwój człowieka poprzez różnicowanie komórek w populację ostatecznej endodermy, endodermy jelita tylnego, a następnie nabłonka jelitowego. To sprawia, że protokół nadaje się zarówno do badania rozwoju jelit, jak i zastosowań modelowania chorób.

Generowanie organoidów jelitowych pochodzących z hiPSC do zastosowań w modelowaniu rozwoju i choroby

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Ten protokół opisuje model wierzchołkowego martwiczego zapalenia jelit (NEC) w naczyniu, wykorzystujący enteroidy jelita cienkiego z odwróconą polaryzacją, umożliwiającą dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Zapewniamy protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia przerwania nabłonka związanego z NEC oraz metodę określania żywotności enteroidów wierzchołkowych poddanych protokołowi NEC-in-a-dish.

In vitro Wierzchołkowy model enteroidalny martwiczego zapalenia jelit

Obecny protokół opisuje ustanowienie systemu organoidów mysiego okrężnicy do badania aktywności i funkcjonowania komórek macierzystych okrężnicy w modelu nokautu klaudyny-7.

Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

Tutaj opisujemy protokół hodowli organoidów 3D jelit świń z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych. Opisujemy również metodę tworzenia monowarstw komórkowych pochodzących z organoidów 3D, umożliwiających dostęp do wierzchołkowej strony komórek nabłonkowych.

Hodowla organoidów 3D jelit prosiąt z kriokonserwowanych krypt nabłonkowych i tworzenie monowarstw komórkowych

Tutaj prezentujemy protokół do generowania organoidów jelitowych szczurów i używania ich w kilku dalszych zastosowaniach. Szczury są często preferowanym modelem przedklinicznym, a solidny układ organoidów jelitowych wypełnia zapotrzebowanie na system in vitro towarzyszący badaniom in vivo.

Wytwarzanie i manipulowanie organoidami jelitowymi szczurów

Integracja organoidów jelitowych psów i systemu mikroprzepływowego Gut-on-a-Chip oferuje odpowiednie modele translacyjne dla chorób jelit u ludzi. Przedstawione protokoły pozwalają na morfogenezę 3D i dynamiczne modelowanie jelit in vitro, pomagając w opracowaniu skutecznych metod leczenia chorób jelit u psów i ludzi z One Health.

Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

Niniejszy film przedstawia technikę izolacji DNA z gatunków mikroorganizmów zasiedlających jelito tylne termitów. Zaprezentowano również przygotowanie preparatu świeżego, który jest przydatny do wizualizacji mikrobioty jelitowej, a także przeprowadzono przegląd bogatego gatunkowo środowiska jelita.

Izolacja DNA z mikroorganizmów jelitowych termita (Zootermopsis angusticollis) oraz wizualizacja mikroorganizmów jelitowych

Poznaj metodę tworzenia dwuwymiarowych organoidów jelitowych świń z pomiarem TEER i komorą Ussinga. Model ten odzwierciedla fizjologiczne właściwości rodzimego jelita i stanowi alternatywę dla tradycyjnych eksperymentów zwierzęcych.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Przeglądaj więcej filmów