Name: Ulepszona metodologia dostarczania płynu do płuc myszy: intubacja przy użyciu otoskopu konsumenckiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Poznaj metodę intubacji myszy przy użyciu otoskopu konsumenckiego do precyzyjnego dostarczania płynów do płuc. Ta technika zapewnia niezawodne podawanie terapeutyków z minimalnym urazem tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Abagail Boyd (University of South Alabama) dostarczyła kluczowych wskazówek dotyczących dostosowania naszego protokołu intubacji w oparciu o swoje doświadczenia. Larkin Kolls zapoznał pisarzy z technologią otoskopów domowych. Firma Penn Vector-Core stworzyła wektor wirusowy użyty w eksperymencie. Candice Fisher jest kierownikiem naszego laboratorium; Jest integralną częścią pracy, którą wykonujemy. Madison Robin utrzymywała porządek pracy, sterylność i organizację naszego wiwarium przez cały czas trwania tych eksperymentów.

Niezbędne jest, aby procedury te zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt (IACUC), wymieniony w protokole, a przed przystąpieniem do prac skonsultowano się z personelem weterynaryjnym. IACUC w naszej instytucji zatwierdził protokół przed rozpoczęciem eksperymentu i przeanalizował zawartość wideo przed przesłaniem. Wsparcie i szkolenie zapewnił Wydział Medycyny Porównawczej Uniwersytetu Tulane, aby zagwarantować najwyższy standard opieki nad wszystkimi naszymi zwierzętami laboratoryjnymi.
1. Przygotowanie
UWAGA: Schemat ustawienia przedstawiono na Rysunku 2.
<img alt="Konfiguracja stanowiska do pipetowania laboratoryjnego; pipety, probówki i statyw do przygotowania eksperymentu biochemicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67676/67676fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przygotowane stanowisko do intubacji prowadzonej przedstawiono na rysunku. Od lewej: Pipety do podawania, probówka z pęcherzykami do potwierdzenia prawidłowego umiejscowienia rurki endotrachealnej, pęseta, szpatułka, pediatryczne rozwieraki do nosa (omówione, ale niepotrzebne w tej procedurze), uchwyty pomocnicze, lampa powiększająca, statyw dla myszy z lejkiem nosowym, sonda światłowodowa, komora do indukcji anestezji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/67676fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol>
	<li>Oczyść klin zabezpieczający dołączony do zestawu do intubacji za pomocą gazika nasączonego izopropanolem. Nasuń czysty klin zabezpieczający (kolor zielony na filmie) na elastyczną kaniulę 20 G i w bezpieczny sposób wyrzuć dołączoną igłę. 
	UWAGA: Użyty zestaw do intubacji gryzoni (Tabela materiałów) zawiera kliny zabezpieczające. Są to małe, stożkowe tulejki, które pasują do elastycznego cewnika 20 G x 1 cal. Zapobiegają one uszkodzeniu carina przez cewnik.</li>
	<li>Przygotuj pozostałe niezbędne narzędzia, w tym telefon komórkowy, komercyjny otoskop, statyw dla myszy z lejkiem nosowym, pęsetę ząbkowaną wygiętą, przygotowaną rurkę endotrachealną (z punktu 1.1) oraz światłowód, jeśli jest on wykorzystywany. Przed użyciem oczyść wszystkie te elementy gazikami nasączonymi izopropanolem.</li>
	<li>Odetnij około 20 cm elastycznego wężyka. Zegnij go w kształt litery U, załóż złączkę Luer lock na jednym końcu i zabezpiecz ją wiązaniem skrętnym. Do wężyka wlej 200-300 µL sterylnej wody filtrowanej lub tuszu indyjskiego. Od tego momentu zestaw ten nazywany będzie „rurką z pęcherzykiem”.</li>
	<li>Wykonaj pętlę szewną, wiążąc ok. 13 cm plecionej nici jedwabnej o rozmiarze 0 w okrąg. Umieść pętlę na górze statywu i upewnij się, że obie strony nici są zabezpieczone, a statyw jest czysty. Umieść statyw dla myszy na metalowej podstawie lampy powiększającej. Ustaw uchwyty pomocnicze („helping hands”) wokół miejsca, w którym znajdować się będzie pysk myszy. 
	UWAGA: Wielu dostawców oferuje wymienne statywy (patrz Tabela materiałów), a taki można tanio wykonać w laboratorium4,7,14. Do zawieszenia zwierzęcia użyto plecionej nici jedwabnej o rozmiarze 0. Opisano jednak zastosowanie innych materiałów w tym samym celu4,13.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia. Stosuj stały przepływ O2 z prędkością 0,8 L/min i 2% izofluranu. Znieczul zwierzę w stopniu wystarczającym (patrz uwaga), aby nie obudziło się podczas zakładania lejka nosowego. Nie tłum znacząco częstotliwości oddychania myszy. Regularne oddechy ułatwiają wizualizację fałdów głosowych. 
	UWAGA: Częstotliwość oddychania myszy powinna być normalna. Kryterium to służy do ustalenia odpowiedniej głębokości znieczulenia. Może być ono zmienne między zwierzętami i może przekraczać 200 oddechów/min. W związku z tym liczenie oddechów lub stosowanie testu ucisku palca u stopy nie jest praktyczne ani konieczne. 
	OSTRZEŻENIE: Procedurę tę można przerwać w razie potrzeby. Zwierzęta nie powinny jednak pozostawać w komorze indukcyjnej dłużej, niż jest to ściśle konieczne.</li>
	<li>Podłącz otoskop do telefonu komórkowego i upewnij się, że przekaz wideo jest stabilny. 
	OSTRZEŻENIE: Aby zminimalizować ekspozycję badaczy na izofluran podczas tej procedury, należy używać maski z filtrem chemicznym w przypadku wykonywania wielu intubacji lub szkolenia z tej metody. Alternatywnie procedurę można przeprowadzić w dygestorium.</li>
</ol>
2. Określanie stadium rozwoju zwierząt
<ol>
	<li>Gdy tylko pierwsze zwierzę zaśnie, wyjmij je z komory indukcyjnej, złap za kark i oprzyj jego górne zęby o długość szwy. Delikatnie napnij zwierzę, aby utrzymać pozycję szwów, kładąc mysz plecami na statywie. 
	UWAGA: Średnio zwierzęta pozostają pod narkozą przez łącznie 2 min, wliczając indukcję. Znacznie zmniejsza to ryzyko dla zwierzęcia, eliminuje potrzebę stosowania lubrykacji okulistycznej i zapobiega gromadzeniu się śliny. Należy dążyć do tego, aby zwierzęta pozostawały w stanie sedacji jak najkrócej.</li>
	<li>Niewielko odchyl kąt szyi do tyłu (wprowadzając szyję w lekkie wyprostu, 5°-15°). Delikatnie nasuń stożek nosowy na nozdrza. Nie dociskaj stożka zbyt mocno, ponieważ może to zakłócić ułożenie szwów, zawieszając mysz.</li>
	<li>Mocno chwyć język jak najbliżej dolnej wargi, używając dużych, drobno ząbkowanych pęsety wygiętej. Odciągnij go w dół i na bok od górnych zębów w stronę dolnych zębów. 
	OSTRZEŻENIE: Przedłużona trakcja, nadmierne napięcie lub zmiażdżenie języka mogą pogorszyć stan zdrowotny zwierzęcia. Należy monitorować język pod kątem objawów urazu (siniaków, krwawienia, obrzęku lub wysychania); w przypadku ich wystąpienia należy przerwać procedurę i powiadomić personel weterynaryjny.</li>
	<li>W przypadku korzystania z uchwytów pomocniczych („helping hands”), utrwal pęsetę w tej pozycji. W zależności od doświadczenia i ostrości wzroku badacza, podświetlana lupa może pomóc w prawidłowym ułożeniu zwierzęcia.</li>
	<li>Wprowadź światłowód (jeśli jest używany) przez elastyczny cewnik z zamontowanym klinem zabezpieczającym intubację (kolor zielony na wideo). 
	UWAGA: Nie mocuj kabla światłowodowego zbyt ciasno do źródła światła. Zbyt mocne dociśnięcie utrudnia usunięcie światłowodu przy pozostawieniu rurki endotrachealnej na miejscu.</li>
</ol>
3. Ocena wizualna strun głosowych i intubacja
<ol>
	<li>Trzymając otoskop w niedominującej ręce, lekko dociśnij go do języka. Następnie ustaw kąt kamery i źródła światła tak, aby zwizualizować struny głosowe w pobliżu nasady języka. 
	UWAGA: Niewielkie różnice w anatomii i kolorze tkanek mogą utrudniać orientację. Wykorzystaj ruchy związane z oddychaniem, aby potwierdzić identyfikację struktur.</li>
	<li>Przy włączonym świetle światłowodowym (jeśli jest używane), wprowadź kaniulę wzdłuż górnej części otoskopu, lekko stykając ją z nasadą języka lub krawędzią otoskopu w celu odniesienia. Przesuń ją do jamy ustnej myszy pomiędzy podniebieniem miękkim a krawędzią otoskopu. 
	UWAGA: Jeśli światłowód nie jest używany, „rurkę z pęcherzykiem” (bubble tube) opisaną w kroku 4 można przymocować do cewnika na tym etapie. Jasne, skupione oświetlenie jamy ustnej myszy jest niezbędne przy tej modyfikacji procedury.</li>
	<li>Dostosuj kąt podejścia tak, aby cewnik był wprowadzony bardzo płytko. Natychmiast po wprowadzeniu cewnika (mniej niż 1 mm za strunami głosowymi), podnieś jego końcówkę, tak aby była prawie równoległa do blatu stołu. Zapobiega to wypychaniu cewnika przez nagłośnię w kierunku grzbietowym do przełyku. Szczególnie podczas szkolenia, w przypadku trudności lub na początku zdobywania doświadczenia, podgląd wideo jest nieoceniony przy umieszczaniu rurki endotrachealnej pomiędzy strunami głosowymi. 
	UWAGA: Produkcja śliny nie utrudnia widoczności strun głosowych podczas wykonywania tej procedury. Jednak w poprzednich publikacjach dotyczących intubacji szczurów19 opisano użycie aplikatora bawełnianego z ostrym końcem do usuwania przeszkadzającej śliny. Metoda ta może okazać się przydatna, jeśli ślina stanie się problemem.
	<ol>
		<li>W przypadku napotkania oporu natychmiast wyjmij cewnik i pozwól, aby oddychanie wróciło do normy. W przypadku wystąpienia krwawienia skonsultuj się z personelem weterynaryjnym. 
		UWAGA: Podczas wprowadzania cewnika opór powinien być niemal nieodczuwalny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Potwierdzenie prawidłowego umiejscowienia rurki endotrachealnej
<ol>
	<li>Potwierdź wizualnie prawidłowe położenie rurki endotrachealne za pomocą otoskopu. Ponadto upewnij się co do poprawnego umieszczenia rurki, biorąc pod uwagę, że tchawica stawia mniejszy opór podczas wprowadzania niż przełyk. Zauważ, że w odpowiedniej pozycji rurka endotrachealna znajduje się ok. 5 mm poza fałdami głosowymi. Poszukaj światła z włókna optycznego prześwitującego przez skórę szyi, aby ponownie potwierdzić prawidłowość umiejscowienia. 
	UWAGA: Klin bezpieczeństwa intubacyjnego powinien zapobiegać zbyt głębokiemu wprowadzeniu rurki endotrachealnej. Klin bezpieczeństwa chroni przed urazem kątastki; nie musi on jednak całkowicie blokować posuwania rurki. Należy go traktować jako funkcję zabezpieczającą, a optymalna głębokość jest często mniejsza niż ta dopuszczona przez klin.</li>
	<li>Następnie, trzymając rurkę endotrachealną w miejscu, wyjmij światłowód. Potwierdź odpowiednie umiejscowienie cewnika, stosując „metodę pęcherzykową” (opisana poniżej), zamiast zaparowywania lustra.</li>
	<li>Pobierz rurkę pęcherzykową przygotowaną w kroku 1.3. Przygotuj ją przed procedurą i używaj wielokrotnie dla wszystkich zwierząt. 
	OSTROŻNIE: 200-300 µL wody lub tuszu w rurce pęcherzykowej nigdy nie powinny zostać odessane. Aby tego uniknąć, upewnij się, że ciecz znajduje się daleko od złącza Luer lock.</li>
	<li>Przy wprowadzonej rurce endotrachealnej zamocuj rurkę pęcherzykową za pomocą złącza Luer lock. Objętość oddechowa powinna być natychmiast widoczna. Jeśli tak nie jest, rurka endotrachealna jest źle umiejscowiona. Szybko ją usuń i poczekaj, aż do myszy powróci normalna częstość oddychania. 
	OSTROŻNIE: Błędne umieszczenie cewnika w przełyku spowoduje ucisk tchawicy, uniemożliwiając prawidłowe oddychanie. Błędnemu umiejscowieniu często towarzyszy duszność (w tym wyraźny udział mięśni międzyżebrowych) i/lub gwałtowny spadek częstości oddychania. Ponadto kaniulacja przełyku może doprowadzić do skurczu mięśni, co utrudni kolejną próbę intubacji; z tego powodu zalecamy wykorzystanie wielu zwierząt podczas treningu.</li>
</ol>
5. Podanie dotchawicze
UWAGA: Podobnie jak w metodzie odciągania języka przy podawaniu do gardła, podawanie poprzez intubację wiąże się z ryzykiem utonięcia zwierzęcia. U myszy młodzieńczych i dorosłych 50 µL jest zazwyczaj bezpieczną objętością płynu do podania i jest wystarczająca, aby rozprzestrzenić się w całych płucach.
<ol>
	<li>W przypadku podawania za pomocą strzykawki: odłączyć rurkę z pęcherzykiem i złącze Luer lock od cewnika, podłączyć napełnioną strzykawkę z Luer slip i nacisnąć tłok, aby podać pożądaną objętość (maksymalnie 50 µL).</li>
	<li>W przypadku podawania za pomocą pipety: pobrać pożądaną objętość (maksymalnie 50 µL) i nanieść ją bezpośrednio do cewnika, umożliwiając myszy wdech roztworu. 
	UWAGA: W celach szkoleniowych należy rozważyć użycie wskaźnika, takiego jak rozcieńczony, przefiltrowany tusz indyjski lub błękit metylenowy.</li>
	<li>Aby zapewnić rozproszone dostarczenie do płuc, należy przepłukać podaną ciecz do płuc za pomocą do 500 µL powietrza20. Można to zrobić, używając albo wstępnie napełnionej strzykawki Luer lock o objętości 0,5 mL, albo pipety P1000 z końcówką z filtrem; obie te metody okazały się niezawodne. W razie potrzeby można kilkakrotnie nacisnąć pipetę bez ryzyka zasysania podanej cieczy. 
	OSTRZEŻENIE: Podczas inokulacji zwierzęcia tą metodą należy rozważyć zmniejszenie stężenia inokulum ze względu na zwiększoną wydajność podania w porównaniu z aspiracją orofaringealną lub podaniem donosowym. 
	UWAGA: Podczas przepłukiwania inokulum powietrzem może być konieczne użycie objętości większej niż objętość oddechowa (~200 µL). Jednak zastosowanie 500 µL nie stwarza ryzyka urazu ciśnieniowego (barotraumy), ponieważ stanowi to jedynie około połowę pojemności życiowej21. Dorosłe myszy mają rezerwową pojemność wdechową wynoszącą około ~800 µL, zatem barotrauma nie występuje, nawet jeśli mysz wykonała wdech bezpośrednio przed przepłukiwaniem21. Należy rozważyć, czy mniejsze objętości przepłukiwania powietrzem (sugerowane 100-200 µL) będą bardziej odpowiednie dla potrzeb rozprzestrzeniania inokulum.</li>
</ol>
6. Ocena dostarczania
UWAGA: Czynność tę wykonuje się wyłącznie podczas szkolenia lub ćwiczenia procedury.
<ol>
	<li>Uśmieć zwierzę w sposób humanitarny, zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC. W niniejszej procedurze zastosowano uduszenie CO2 jako podstawową metodę eutanazji oraz zwichnięcie stawów szyjnych jako metodę potwierdzającą.</li>
	<li>Otwórz klatkę piersiową i wyjmij płuca. Zrób to poprzez otwarcie otrzewnej, dostęp do przepony od strony ogonowej i nakłucie jej małymi nożyczkami w miejscu, w którym widoczne jest serce. Spowoduje to zapadnięcie się płuc i stworzy więcej miejsca do otwarcia klatki piersiowej poprzez przecięcie żeber. 
	UWAGA: Jeśli wymagana jest perfuzja w celu zmniejszenia ilości krwi w płucach, przeprowadź tę procedurę przez prawą komorę serca na tym etapie.</li>
	<li>Po wyjęciu płuca krótko opłucz 1 mL sterylnego PBS. Rozłóż je płasko na białej powierzchni (np. na gąbce chirurgicznej), aby odsłonić maksymalną powierzchnię, zachowując jednocześnie względne położenie płatów.</li>
	<li>Wykonaj fotografię płuc ex vivo (użyto telefonu komórkowego), otwórz obrazy w programie ImageJ i zmierz obszary zabarwione oraz niezabarwione, obrysowując linię frontu barwnika. Pomiaru powierzchni zabarwionej powinien dokonać niezależny, oślepiony badacz, aby uniknąć błędów systematycznych. 
	UWAGA: W przypadku zastosowania luminescencji i systemu IVIS, jak pokazano na Rysunku 3, zamiast Kroku 6 należy przeprowadzić obrazowanie żywych tkanek in vivo.</li>
</ol>

<ol><li>The Pneumonia Etiology Research for Child Health (PERCH) Study Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+severe+pneumonia+requiring+hospital+admission+in+children+without+HIV+infection+from+Africa+and+Asia%3A+the+PERCH+multi-country+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Causes of severe pneumonia requiring hospital admission in children without HIV infection from Africa and Asia: the PERCH multi-country case-control study.</a> Lancet. 394 (10200), 757-779 (2019).</li>
<li>Shiels, M. S., Haque, A. T., Berrington de González, A., Freedman, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leading+causes+of+death+in+the+US+During+the+COVID-19+pandemic%2C+March+2020+to+October+2021%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Leading causes of death in the US During the COVID-19 pandemic, March 2020 to October 2021.</a> JAMA Intern Med. 182 (8), 883-886 (2022).</li>
<li>Egger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+bleomycin+via+the+oropharyngeal+aspiration+route+leads+to+sustained+lung+fibrosis+in+mice+and+rats+as+quantified+by+UTE-MRI+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology.</a> PLOS ONE. 8 (5), e63432(2013).</li>
<li>Nielsen, T. B., Yan, J., Luna, B., Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+oropharyngeal+aspiration+model+of+ventilator-associated+and+hospital-acquired+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine oropharyngeal aspiration model of ventilator-associated and hospital-acquired bacterial pneumonia.</a> J Vis Exp. (136), e57672(2018).</li>
<li>Seo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+anesthesia+and+delivery+approaches+for+dosing+into+lungs+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optimizing anesthesia and delivery approaches for dosing into lungs of mice.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 325 (2), L262-L269 (2023).</li>
<li>Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-assisted+orotracheal+intubation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Video-assisted orotracheal intubation in mice.</a> Lab Anim. 37 (3), 204-206 (2003).</li>
<li>Watanabe, A., Hashimoto, Y., Ochiai, E., Sato, A., Kamei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+confirming+correct+endotracheal+intubation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">A simple method for confirming correct endotracheal intubation in mice.</a> Lab Anim. 43 (4), 399-401 (2009).</li>
<li>Samsamshariat, S. A., Movahed, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+0.035-in.+straight-tip+wire+and+a+small+infant+laryngoscope+for+safe+and+easy+endotracheal+intubations+in+rats+for+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Revasc+Med%22%5BJournal%5D)">Using a 0.035-in. straight-tip wire and a small infant laryngoscope for safe and easy endotracheal intubations in rats for cardiovascular research.</a> Cardiovasc Revasc Med. 6 (4), 160-162 (2005).</li>
<li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation%3A+description%2C+evaluation+and+comparison+with+transillumination%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Lab Anim. 42 (2), 222-230 (2008).</li>
<li>Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+endotracheal+intubation+of+mice+and+rats+used+in+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp+Top+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies.</a> Contemp Top Lab Anim Sci. 44 (2), 52-55 (2005).</li>
<li>Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple method of mouse lung intubation.</a> J Vis Exp. (73), e50318(2013).</li>
<li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotracheal+intubation+in+mice+via+direct+laryngoscopy+using+an+otoscope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope.</a> J Vis Exp. (86), e50269(2014).</li>
<li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J Appl Physiol. 87 (6), 2362-2365 (1999).</li>
<li>Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C., Nelson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Orotracheal+Intubation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Repeated Orotracheal Intubation in Mice.</a> J Vis Exp. (157), e60844(2020).</li>
<li>MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">An improved simple method of mouse lung intubation.</a> J Appl Physiol (1985). 106 (3), 984-987 (2009).</li>
<li>Controlled Substance Schedules. , US Department of Justice Diversion Control Division. 
 <a target="_blank" href="https://www.deadiversion.usdoj.gov/schedules/schedules.html">https://www.deadiversion.usdoj.gov/schedules/schedules.html</a> (2025).</li>
<li>Cesarovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+and+sevoflurane+provide+equally+effective+anaesthesia+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice.</a> Lab Anim. 44 (4), 329-336 (2010).</li>
<li>Balloy, V., Huerre, M., Latgé, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+patterns+of+infection+and+inflammation+for+corticosteroid+treatment+and+chemotherapy+in+experimental+invasive+pulmonary+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Differences in patterns of infection and inflammation for corticosteroid treatment and chemotherapy in experimental invasive pulmonary aspergillosis.</a> Infect Immun. 73 (1), 494-503 (2005).</li>
<li>Clary, E. M., O'Halloran, E. K., de la Fuente, S. G., Eubanks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Videoendoscopic+endotracheal+intubation+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Videoendoscopic endotracheal intubation of the rat.</a> Lab Anim. 38 (2), 158-161 (2004).</li>
<li>Silva, P. L., Scharffenberg, M., Rocco, P. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+mechanisms+of+ventilator-induced+lung+injury+using+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med+Exp%22%5BJournal%5D)">Understanding the mechanisms of ventilator-induced lung injury using animal models.</a> Intensive Care Med Exp. 11 (1), 82(2023).</li>
<li>Schulz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+mechanics+in+mice%3A+strain+and+sex+specific+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand%22%5BJournal%5D)">Respiratory mechanics in mice: strain and sex specific differences.</a> Acta Physiol Scand. 174 (4), 367-375 (2002).</li>
<li>Americo, J. L., Cotter, C. A., Earl, P. L., Liu, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+inoculation+of+an+MVA-based+vaccine+induces+IgA+and+protects+the+respiratory+tract+of+hACE2+mice+from+SARS-CoV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Intranasal inoculation of an MVA-based vaccine induces IgA and protects the respiratory tract of hACE2 mice from SARS-CoV-2 infection.</a> PNAS. 119 (24), e2202069119(2022).</li>
<li>Belser, J. A., Gustin, K. M., Katz, J. M., Maines, T. R., Tumpey, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+traditional+intranasal+and+aerosol+inhalation+inoculation+of+mice+with+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of traditional intranasal and aerosol inhalation inoculation of mice with influenza A viruses.</a> Virology. 481, 107-112 (2015).</li>
<li>Pelgrim, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratracheal+administration+of+solutions+in+mice%3B+development+and+validation+of+an+optimized+method+with+improved+efficacy%2C+reproducibility+and+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Intratracheal administration of solutions in mice; development and validation of an optimized method with improved efficacy, reproducibility and accuracy.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 114, 107156(2022).</li>
<li>Kunda, N. K., Price, D. N., Muttil, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+tract+deposition+and+distribution+pattern+of+microparticles+in+mice+using+different+pulmonary+delivery+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Respiratory tract deposition and distribution pattern of microparticles in mice using different pulmonary delivery techniques.</a> Vaccines. 6 (3), 41(2018).</li>
<li>Driscoll, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratracheal+instillation+as+an+exposure+technique+for+the+evaluation+of+respiratory+tract+toxicity%3A+uses+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations.</a> Toxicol Sci. 55 (1), 24-35 (2000).</li>
<li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-surgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J Vis Exp. (51), e2702(2011).</li>
<li>Hattori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+IL-17A-treated+synovial+fibroblasts+from+the+human+temporomandibular+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of IL-17A-treated synovial fibroblasts from the human temporomandibular joint.</a> Mediators Inflamm. 2015, 436067(2015).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych ujawnień.

Intubacja i wkraplanie dotchawicze są najlepszymi metodami dostarczania płynu do płuc, ale liczne wyzwania związane z anatomią myszy uniemożliwiły powszechne zastosowanie w laboratoriach płucnych15. Chociaż zapewnia skuteczne dostarczanie inokulum do płuc, potencjalną wadą dostarczania IT za pomocą tej i innych technik intubacji jest ominięcie górnych dróg oddechowych. Poród donosowy to sprawdzona metoda, która nie omija górnych dróg oddechowych. Chociaż podawanie donosowe jest często stosowane w laboratoriach wirusologii płucnej i może być bardziej skuteczne w niektórych przypadkach22, nie odzwierciedla naturalnej drogi ekspozycji23 dla niektórych zasysanych środków, powoduje bardziej zmienne ilości inokulum w płucach24 i jest mniej skuteczne w przypadku stosowania izofluranu jako środka znieczulającego5. W związku z tym przeprowadzono szeroko zakrojone prace nad aparatami aerozolowymi i porównaniem ich z innymi technikami dostarczania do płuc25, ale metody te stwarzają zagrożenia związane z aerozolami i są zwykle drogie. Wszystkie te trudności doprowadziły do wkraplania jamy ustnej i gardła za pomocą pociągnięcia języka26, co jest preferowaną metodą dostarczania płynu płucnego w wielu laboratoriach. Jak wykazaliśmy, metoda ta jest znacznie bardziej zmienna niż wkraplanie dotchawicze po intubacji. Co więcej, nie można ocenić porodu metodą ciągnięcia języka podczas podawania, a język myszy może spowodować nadmierny uraz z powodu napięcia potrzebnego do zapobieżenia połknięciu. Język jest również utrzymywany w technice intubacji kierowanej i wkraplania IT. Ponieważ jednak obraz wideo pokazuje zapalenie głośni, badacz korzystający z naszej metody nie musi wymuszać ułożenia krtani poprzez wywieranie znacznego nacisku na język. Ta zmniejszona przyczepność powoduje mniej urazów tkanek. Jednak pomimo znacznych korzyści płynących z intubacji i wkraplania informatycznego, na drodze do jej zastosowania w niektórych laboratoriach stanęły wyzwania. Na przykład: ucisk tchawicy z powodu błędnej kaniulacji przełyku może utrudniać oddychanie i zwiększać śmiertelność; Zbyt głębokie wprowadzenie rurki dotchawiczej może prowadzić do uszkodzenia kariny lub oskrzeli głównych; I wreszcie, mysia intubacja tradycyjnymi metodami zajmuje dużo czasu, co czyni ją niepraktyczną dla większości badaczy poszukujących niezawodnego porodu dopłucnego. Nasza metoda rozwiązuje trudności związane z intubacją myszy, pokonując nawet anatomiczne bariery uniemożliwiające intubację myszy.
Zaproponowano kilka metod przezwyciężenia anatomicznych wyzwań związanych z intubacją myszy poprzez wdrożenie pomocy wizualnych. Na przykład zaproponowano zastosowanie tradycyjnego endoskopu6. Jednak długa ogniskowa instrumentu nie nadaje się do stosowania do intubacji u myszy (ryc. S1). Jest to również łatwo widoczne w filmie 1, gdzie fałdy głosowe są widoczne, ale są rozmyte. Otoskopy kliniczne były również stosowane w laryngoskopii bezpośredniej12. Jednak koszt otoskopów klinicznych i brak przekazu wideo sprawiają, że są one niedostępne dla większości laboratoriów i nie nadają się do szkolenia. Zastosowanie powszechnie dostępnego otoskopu konsumenckiego znacznie poprawiło praktyczność intubacji sterowanej. Krótsza ogniskowa, mniejszy korpus i przedłużona warga depresyjna pozwalają na wyraźniejszy przekaz wideo, lepszą manewrowość i pozycjonowanie, a warga otoskopowa może być używana do wywierania nacisku na podstawę języka, co poprawia dostęp do obręczy głośniowej. Poza tymi pomocami wizualnymi, transiluminacja została również wykorzystana do skutecznej wizualizacji głośni i intubacji myszy 7,13,14. Jednak podejścia oparte na transilluminacji mogą wymagać środków do depilacji na obszarze nakładającym się na szyję myszy, bliskiej odległości od gorącego źródła światła, użycia igły w cewniku, wprowadzenia ostrych narzędzi do ust myszy i/lub małego nacięcia, które należy wykonać nad tchawicą w celu potwierdzenia umieszczenia. Opisana tutaj metoda pozwala uniknąć tych zagrożeń i opiera się na najlepszych aspektach tych opublikowanych metod. Oprócz pokonania anatomicznych barier utrudniających intubację, w naszej metodzie wzięto pod uwagę względy kosztowe.
Razem użycie pomocnych dłoni, stojaka na mysz, otoskopu i światła światłowodowego sprawia, że intubacja jest łatwiejsza do nauczenia się i znacznie szybsza do wykonania, przy zmniejszonych kosztach dla laboratoriów. Kosztów dostępnego na rynku stanowiska do intubacji można uniknąć, korzystając z ręcznie robionegostanowiska 27. Koszt montażu światłowodu można pokryć, kupując kabel światłowodowy osobno (po znacznie niższych kosztach, ~ 9 USD vs 218 USD - kent scientific- w momencie pisania tego tekstu). Aby uzupełnić światłowodowe źródło światła, stożkowa pokrywka o pojemności 50 ml z otworkiem w środku i taśmą może być użyta do zbierania światła z latarki telefonu komórkowego (patrz rysunek S3 i tabela materiałów). Das et. Na pewno nie opiszemy podobnego urządzenia11. Dla niektórych laboratoriów obniżony koszt tego rozwiązania może sprawić, że nasza metoda stanie się znacznie bardziej dostępną procedurą. Poza kosztami, trudności z potwierdzeniem umieszczenia rurki dotchawiczej sprawiły, że intubacja myszy była zniechęcająca.
W przeszłości, aby potwierdzić, że rurka dotchawicza jest odpowiednio umieszczona, naukowcy polegali na zamgławianiu lusterek, trzymając lusterko dentystyczne nad rurką dotchawiczą18. Jednak mała objętość oddechowa i wahania temperatury w pomieszczeniu często zapobiegają parowaniu lusterek i prowadzą do błędów w ocenie. W przypadku intubacji u myszy stwarza to poważne ryzyko obrażeń. Inni uciekali się do wywoływania niewydolności oddechowej poprzez zatkanie rurki dotchawiczej10. Powoduje to znaczny stres u zwierzęcia i dostarcza mniej informacji niż "metoda bąbelkowa". Co więcej, wprowadzenie leków płucnych i powietrza do żołądka z powodu nieodpowiedniego potwierdzenia umieszczenia rurki dotchawiczej może powodować niepokój, a także utrudniać skuteczność podawanego środka. Zastosowanie "metody pęcherzykowej" zapewnia szybsze, bardziej wiarygodne wizualne potwierdzenie umieszczenia rurki dotchawiczej i stanowi nieznaczne ulepszenie w stosunku do podobnej metody opisanej wcześniej28. "Metoda pęcherzykowa" umożliwia również badaczowi przybliżone oszacowanie częstości oddechów i objętości oddechowej zwierzęcia.
Ułożenie zwierząt i wizualizacja fałdów głosowych są kluczem do tej techniki. Odkryliśmy, że wzierniki nosowe u dzieci były zbyt duże i nieporęczne, aby utrzymać otwarte usta i policzki poza przeszkodą podczas intubacji, ale były bardzo pomocne podczas treningu, ponieważ pozwoliły badaczowi zademonstrować umieszczenie otoskopu. Nakłonienie uczestnika szkolenia do rozpoznania odpowiedniej anatomii jest trudne, a poprawa widoczności w pysku myszy była kluczowa, w czym znacznie pomogło zastosowanie komercyjnego otoskopu. Ustawianie pozycji przy użyciu oświetlonego szkła powiększającego i pomocnych dłoni jest integralną częścią pomocy niedoświadczonym operatorom w intubacji, chociaż może nie być tak krytyczne dla doświadczonych operatorów.
Podczas szkolenia w tej metodzie może być konieczne rozwiązywanie problemów. Jeśli rurka dotchawicza wielokrotnie wchodzi do przełyku, głośnia mogła mieć skurcze, podniebienie miękkie może być w stanie zapalnym, a prawidłowe umieszczenie może być trudniejsze. W takim przypadku należy pozwolić zwierzęciu dojść do siebie przez kilka minut przed ponowną próbą intubacji. Liczba ponownych prób powinna być określona w protokole IACUC i zawsze przestrzegana. Jeśli masz problemy z widzeniem fałdów głosowych, częstość oddechów może być stłumiona z powodu zbyt dużego znieczulenia lub ułożenie myszy może być nieodpowiednie (najczęściej głowa odchylona do tyłu zbyt daleko). W takim przypadku zmień pozycję zwierzęcia i pozwól mu dojść do siebie po znieczuleniu przed ponowną próbą. Rurka bąbelkowa powinna wyraźnie pokazywać objętość oddechową zwierzęcia. Jeśli pęcherzyk porusza się tylko nieznacznie, przyczyną tego ruchu może być sapanie spowodowane naciskiem wywieranym na tchawicę przez nieprawidłowo umieszczoną rurkę dotchawiczą. W tym przypadku zapoznaj się ze znacznikiem czasu: 8:25 i rysunkiem S3 , aby zobaczyć, jak łatwo widoczna jest objętość oddechowa podczas używania "rurki bąbelkowej" na prawidłowo umieszczonej rurce dotchawiczej. Jeśli rurka dotchawicza jest niewłaściwie umieszczona, wyjmij ją natychmiast i pozwól zwierzęciu dojść do siebie przed ponownym przystąpieniem do zabiegu.
Chociaż intubacja i wkraplanie dotchawicze są znacznie lepsze od innych metod, są zbyt trudne technicznie, aby można je było powszechnie przyjąć. Opisane tutaj metody sprawiają, że wkraplanie dotchawicze i intubacja mysia są dostępne i praktyczne. Chociaż przyszłe zastosowania tej techniki są w dużym stopniu zależne od tego, co jest dostarczane do płuc i w jakim kontekście są one podawane, łatwa i niezawodna metoda toruje drogę do wielu postępów w biologii płuc.

W skali globalnej choroby układu oddechowego są główną przyczyną zgonów dzieci poniżej 5 roku życia oraz stanowią istotny czynnik zachorowalności i śmiertelności u dorosłych1. W 2021 roku zakażenie SARS-CoV2 było trzecią najczęstszą przyczyną zgonów w USA2. Modele mysie są często wykorzystywane do badania chorób płuc, w tym astmy, zapalenia płuc, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc oraz włóknienia płuc. Niemal wszystkie te modele wymagają podania substancji w formie płynnej do płuc. Można to osiągnąć poprzez bezpośrednią kanulację tchawicy (zazwyczaj pod bezpośrednią kontrolą wizualną z zastosowaniem techniki chirurgicznego dojścia), podanie donosowe lub aspirację orofaringealną za pomocą uznanej metody pociągania za język3,4,5. Jednak wszystkie te techniki mają swoje wady. Powstawanie tkanki bliznowatej po chirurgicznym dojściu sprawia, że metoda ta jest nieodpowiednia do badań wymagających wielokrotnego podawania substancji do płuc, natomiast dwie pozostałe techniki mogą prowadzić do zmiennej ilości dostarczonego preparatu do płuc. Ponadto, przy zastosowaniu metody pociągania za język, urazy tkankowe języka mogą być znaczne, a efektywność podania zależy od badacza wykonującego procedurę, patrz Rysunek 1.
<img alt="Rozkład barwnika w płucach; wyniki eksperymentu z tuszem indyjskim; analiza wykresu słupkowego; porównanie technik." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67676/67676fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Intubacja sterowana i instylacja przez tchawicę (IT) skutkują lepszym dostarczeniem preparatu do płuc i mniejszą zmiennością w porównaniu do metody z odciągnięciem języka. (A) Troje różnych badaczy podało 50 µL rozcieńczonego tuszu indyjskiego metodą odciągnięcia języka, będącą standardową metodą podania do gardła (OP). Dwóch badaczy podało również tusz do płuc za pomocą intubacji zgodnie z opisem. (B) Płuca usunięto 1-4 h po podaniu i sfotografowano przy 2-krotnym powiększeniu. Zdjęcia oceniano pod kątem powierzchni zabarwienia przy użyciu programu ImageJ. (n=6 (intubacja) lub 9 (podanie OP), wyniki z 2 lub 3 niezależnych powtórzeń wykonanych przez 2-3 różnych badaczy, p&lt;0.0001 test T Welcha) (C) Zmienność podania do płuc obliczono również jako procentowe odchylenie od średniej. Podanie OP charakteryzowało się znacznie większą zmiennością. (p = 0.0317, test T Welcha, GraphPad Prism 10.2.3 do wszystkich obliczeń statystycznych i wykresów) (Użyto samców i samic myszy C57BL/6J w wieku ok. 10 tygodni.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/67676fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Anatomia myszy sprawia, że intubacja jest trudna i czasochłonna. Jama ustna jest mała, a tkanka policzków może ograniczać badaczowi widoczność rima glottidis6. Ponadto fałdy głosowe są bardzo małe i ich wizualizacja może być utrudniona, ponieważ znajdują się one blisko nasady języka. Wreszcie, potwierdzenie prawidłowego umiejscowienia rurki endotrachealnej jest trudne, ponieważ mała objętość oddechowa często nie powoduje zaparowania lusterka7. Trudności te skłoniły do opracowania szeregu innowacyjnych technik intubacji myszy. Udoskonalone metody obejmują zastosowanie laryngoskopu noworodkowego i drutu do wprowadzenia cewnika do tchawicy8,9, wykorzystanie światłowodowego źródła światła do prowadzenia i usztywniania cewnika10,11 oraz zastosowanie transmisji wideo na żywo6. W ostatnim czasie pomocne w intubacji orotrachealnej okazało się zastosowanie klinicznego otoskopu12. Inni stosowali transiluminację w celu wizualizacji głośni i intubacji myszy7,13,14. Metody te mają jednak wiele wad. Stosowanie środków depilacyjnych na szyi myszy oraz bliskość zwierzęcia względem gorącego źródła światła sprawiają, że transiluminacja nie jest rozwiązaniem idealnym. Wykorzystanie igły wewnątrz cewnika lub wprowadzanie ostrych narzędzi do pyska oznacza, że niektóre metody usztywniania cewnika narażają zwierzęta na nieuzasadnione ryzyko. Wreszcie, wykonanie nacięcia nad tchawicą w celu potwierdzenia położenia rurki wiąże się ze znacznymi wadami, w tym z koniecznością zachowania sterylności i powstawaniem tkanki bliznowatej. Do tej pory instylacja dotchawicza poprzez intubację okazała się zbyt trudna, by mogła zostać powszechnie przyjęta15, a postępy w rozwoju metodologicznym pozostały odizolowane i nie są wykorzystywane przez wiele laboratoriów15. Dalsze badania skupiły się na wyborze środka anestetycznego podczas zabiegu, wykazując, że ketamina może mieć przewagę nad izofluranem5. Jednak izofluran, nie będąc substancją kontrolowaną i szybko przestając działać po zakończeniu procedury, oferował atrakcyjne korzyści, dlatego stosowaliśmy tę formę znieczulenia, optymalizując inne aspekty tej metodologii16,17.
Opisana przez nas metoda pozwala pokonać problemy z wizualizacją, z którymi mierzyli się inni badacze, ogranicza ryzyko dla zwierząt doświadczalnych, skraca czas potrzebny na wlewanie małych objętości w sposób wewnątrzoskrzelny za pomocą rurki endotrachealnej, zwiększa objętość cieczy docierającej do płuc oraz oferuje ulepszoną metodę potwierdzania prawidłowego umieszczenia rurki endotrachealnej. Zastosowanie statywu zawiesowego, magnetycznych „trzecich rączek” (klipsów aligatorowych na elastycznych ramionach przymocowanych do podstawy) oraz jaśniejszego oświetlenia umożliwia pojedynczemu badaczowi sprawne przeprowadzenie podania wewnątrzoskrzelnego. Wizualizację ułatwia domowy otoskop z łącznością WIFI. Urządzenie to jest bardziej przystępne cenowo niż komercyjne instrumenty do intubacji. Ponadto łączność WIFI pozwala na jednoczesne przesyłanie obrazu wideo na urządzenie przenośne (np. telefon komórkowy), co czyni tę metodę przydatną w celach szkoleniowych. Do intubacji można wykorzystać albo światłowodowe źródło światła wprowadzone przez elastyczny cewnik (PTFE) o rozmiarze 20 g x 1" (po usunięciu igły), albo sam cewnik bez źródła światła. Głębokość wprowadzenia jest kontrolowana dwiema metodami – poprzez dodanie klinowego bezpiecznika do intubacji (stożkowej osłony na cewniku) oraz poprzez obserwację głębokości na obrazie wideo. Umieszczenie rurki endotrachealnej potwierdza się za pomocą „metody pęcherzyków”, która pozwala wyraźniej zwizualizować objętość oddechową niż tradycyjna metoda zaparowania lusterka18. Jest to mniej stresujące dla zwierzęcia niż poleganie na obturacji tchawicy w celu wywołania duszności10 dla potwierdzenia prawidłowego umieszczenia rurki. Połączenie zastosowania rurki przedłużającej sprzężonej z cewnikiem w celu potwierdzenia udanej intubacji (dalej nazywanej metodą pęcherzyków), uproszczonej na podstawie pracy Watanabe i wsp.7, oraz konsumenckiego wideootoskopu w ramach jednej procedury sprawia, że intubacja staje się praktyczną metodą terapeutycznego podawania substancji do płuc i stanowi wyraźną poprawę względem metody odciągania języka (patrz Rycina 1). Jeśli poszukiwana jest niezawodna, powtarzalna i niedroga metoda niechirurgicznego podawania cieczy do płuc myszy, zwłaszcza bez użycia substancji kontrolowanych (takich jak ketamina) lub kosztownego sprzętu, poniższa metoda może okazać się idealna.

<table><tbody><tr><td>Światłowód LightiZestaw oświetlenia światłowodowego, Mysz</td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>ETI-12ETI-MSE-02</td><td>Element zespołu światłowodowego, kompatybilny z innymi lampami i zamiennym światłowodowym poniżej</td></tr><tr><td>Alternatywny montaż światłowodu</td><td>Braintree Scientifuc</td><td>RW-A37 47</td><td>alternatywa, nie omówiona (ale nie widzimy powodu, dla którego miałaby nie działać)</td></tr><tr><td>Alternatywny montaż światłowodów</td><td>Aparat Harvard</td><td>72-9075</td><td>alternatywa, nie omówiona (ale nie widzimy powodu, dla którego nie miałaby działać)</td></tr><tr><td>Alternatywny montaż światłowodu</td><td>Ręcznie robiony przez laboratorium</td><td>N/A</td><td>Instrukcje można znaleźć tutaj za pomocą gumowego korka: DOI 10.3791/50318</td></tr><tr><td>Alternatywny montaż światłowodowy</td><td>Ręcznie wykonany przez laboratorium</td><td>N/A (materiały wymienione poniżej)</td><td>Wykonany ze stożkowej pokrywki 50 ml, taśmy i</td></tr><tr><td>światłowodowego stojaka do intubacji</td> 0,75 mm, Mysz <td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>ETI-MSE-01</td><td>Regulowany stojak do intubacji, dostępnych jest wiele wersji do samodzielnego wykonania, używane stojaki na końcówki i drewniane platformy, niektóre alternatywy wymieniają wiele dostępnych odpowiednich alternatyw.</td></tr><tr><td>Alternatywne stanowiska do intubacji</td><td>Braintree Scientifuc</td><td>RIS 100</td><td>alternatywa, nie omówione (ale nie widzimy powodu, dla którego miałyby nie zadziałać)</td></tr><tr><td>Alternatywne stanowiska do intubacji</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-1014</td><td>alternatywa, nie omówione (ale nie widzimy powodu, dla którego miałyby nie zadziałać)</td></tr><tr><td>Alternatywne stanowiska do intubacji</td><td>Vetland</td><td>000A3467</td><td>alternatywa, nie omówione (ale nie widzimy powodu, dla którego miałyby nie zadziałać)</td></tr><tr><td>Alternatywne stanowiska do intubacji</td><td>Ręcznie robione przez laboratorium</td><td>N/A</td><td>Wykonane z 3-pierścieniowego segregatora tutaj: DOI 10.3791/60844 (opublikowano kilka alternatywnych metod)</td></tr><tr><td>Niewchłanialny pleciony jedwabny szew, rozmiar 0</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>18020-00</td><td>każdy dłuższy niż 1 cal uszkodzi Carina&nbsp;</td></tr><tr><td>Cewnik dożylny Safelet 20G x 1"</td><td>Nipro</td><td>NPRCI+2025</td><td>Lub podobne</td></tr><tr><td>mikrokleszcze preparacyjne RS-5358</td><td>Fisher</td><td>RS-5358</td><td>Lub podobne, zawiera pomocne dłonie&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkło powiększające ze światłem i podstawką, elastyczna magnetyczna pomocna dłoń EOOKU, 5X& 10X 12V 108szt Koraliki LED Lampa powiększająca, 3 tryby Regulowane obrotowe ramiona na gęsiej szyi i Wytrzymała płyta podstawy</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.com/Magnifying- EOOKU-Elastyczny-regulowany-Gęsia szyja /dp/B0C5MC6QNW/ref=sr_1_5?crid=F4 PZY6UOCEE9& dib=eyJ2IjoiMSJ9.. gj5cKLw4v3CDSkrQKcs73kXqVtnJl JpBKEp_FcTCIEQSO3EirxEYoH ySohcPg0ZDhmnFwGeLit22nM SJxpz1MPP0 q6-PwbPzzMT0RWB_pXkmSBiAo5xB J4QSf8_BoLZ4u8S8lfIo5WI9-VuXj75X eo0LQfygaSM gW58XO2bbasOfaw cwxZXs5cTqCUmKh5bRn7A19_ cY2a0-x_ly-27RXXPinVbBNW00Ww8jY55x fnWFCaK5lnPb4VxSV6iTCOhMnkm TopFiA3rCLNXcBDGCwfLdw22w 17T0c_rRhh-mrew . TtsVr89Bo5YLvaXvarcbKxJ07GK zMMVSg5op4U5eyvA& dib_tag= se& słowa kluczowe=powiększające+szkło+z +światło+EOOKU+3+w+1& qid=1709661 709& sprefix=powiększające+szkło+z+ światłem+eooku+3+in+1%2Caps%2C98& sr=8-5</td><td>Lub podobnie, wszelkie wygięte drobno ząbkowane kleszcze będą działać&nbsp;</td></tr><tr><td>Usuwanie woskowiny - Narzędzie do usuwania woskowiny z 8-częściowym zestawem do uszu - Środek do czyszczenia uszu z kamerą - Zestaw do usuwania woskowiny ze światłem - Kamera do uszu z 6 łyżkami do uszu - Środek do czyszczenia uszu dla iOS i Android ()</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.com/Ear-Wax- Removal-Remover-Android%EF% BC%88Black%EF%BC%89/dp/B0 9KZ8TS7L/ref=pd_lpo_sccl_1/147 -1203879-4147304?pd_rd_w=Lt8 Ta& identyfikator zawartości=amzn1.sym.1ad20 66f-97D2-4731-9356-36b3edf1ae 04& pf_rd_p=1ad2066f-97d2-4731 -9356-36b3edf1ae04& pf_rd_r= MDQ3AHH4AC8T2KFX1RBE& pd_rd_wg=ja4H2& pd_rd_r=52d9 372c-b34b-4f6a-93f6-974754d96 3d9& pd_rd_i=B09KZ8TS7L& PSC=1</td><td>lub podobne, dostępnych jest kilka marek&nbsp;</td></tr><tr><td>AZIMOM PMMA Plastikowy koniec świecącego światłowodowego 0,75 mm (0,02 cala) 100 m (328 stóp) / rolka do sufitu Star Sky All Kind Led Light Engine Sterownik Źródło</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.com/AZIMOM -Plastikowy sufit do cięcia-1szt0-00 98in328ft / dp / B07WC9JV5N / ref=sr _1_9?dib=eyJ2IjoiMSJ9.K7NmvB hJOux4zdNBKSPo-ac4HYPDPUS F85Qlra7o7G2FQl9MQLj1D7QtPJ cxnAeDiYm_yNWPhwj44nhSfwqM vs1AtulruHGEsfjLEAjRGSFpNLgN H-Ewc190MluERArk91lR9Od6ceB Hkz2AJad11hVUkWEOb0-emUWW b2U4fNN0upQKgyD1vE eU0DtClQ73tDe22z4CXrSLP7vC D9jF2APfz1liHou_zdiAyCSFb1Df bC8Ymce6zXV0qOD3gQFkm6j NV5bN1DG8SH_BaV4vofzj98T JVRnNElEzUzjx0rY.br/ AMHl3h-jIz GTeGjvej0Nq8FTPLEPmfiQ UDPz_U6ctI0& dib_tag=se& słowa kluczowe=światłowód%2Boptyczny%2Blight %2Bstrands& qid=1722619884& sr =8-9& th = 1</td><td>Lub podobnie, włókno jest używane do budowy urządzenia w linii 7</td></tr><tr><td>50 ml stożkowa rurka</td><td>Cell Treat</td><td>229421</td><td>powinna działać dowolna nieprzezroczysta plastikowa stożkowa pokrywka z zakrętką o pojemności 50 ml. Nie wchodzi w kontakt ani nie zbliża się do zwierzęcia, więc nie ma potrzeby stosowania sterylności&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VetOne</td><td>Skonsultuj się z personelem</td><td></td>weterynaryjnym</tr><tr><td>Innoculum&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td>Specyficzne dla Twojego eksperymentu</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (filtr)</td><td>Nie dotyczy</td><td>Sterylny filtr Używane końcówki p100 i p1000</td><td>Marka/dostawca nie dotyczy&nbsp;</td></tr><tr><td>Komora indukcyjna</td><td>N/A</td><td>Dostępne w Twojej instytucji</td><td>Marka/Dostawca nie dotyczy&nbsp;</td></tr><tr><td>Podkładki przygotowawcze z izopropanolem</td><td>Nie dotyczy Marka</td><td></td><td>/Dostawca nie dotyczy&nbsp;</td></tr><tr><td>Przewody&nbsp;</td><td>N / A</td><td>elastyczna rurka o małej średnicy będzie działać&nbsp;</td><td>Do budowy "rurki bąbelkowej"&nbsp; (nasz ma średnicę ~3 mm i został pobrany z linii dożylnej)</td></tr><tr><td>Luer lock</td><td>N/A</td><td>pasujący do rurki powyżej</td><td>Do budowy "rurki bąbelkowej"</td></tr><tr><td>Półmaska oddechowa 3M 3M</td><td></td><td>17-986-9B</td><td>w celu ograniczenia ekspozycji na gaz</td></tr><tr><td>Twist Tie</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>, aby zachować kształt U rurki bąbelkowej</td></tr></tbody></table>

ulepszona metodologia dostarczania płynu do płuc myszy: intubacja przy użyciu otoskopu konsumenckiego

Improved Methodology for Liquid Delivery to the Mouse Lung: Intubation using a Consumer Otoscope

Konsekwentne dostarczanie płynów, w tym potencjalnych terapii, do płuc ma kluczowe znaczenie dla modelowania choroby płuc i przedklinicznego rozwoju terapeutycznego. Jednak obecne metody stosowane u myszy - takie jak aspiracja ustno-gardłowa metodą ciągnięcia języka - mogą powodować zmienny poród. W tym miejscu opisujemy użycie niedrogiego, podłączonego do telefonu komórkowego, oświetlonego otoskopu do wizualizacji głośni i umożliwienia bezpośredniego zaszczepienia do dróg oddechowych. Szczegółowo opisujemy zoptymalizowaną technikę inscenizacji z odpowiednim oświetleniem i pomocami do pozycjonowania. Opisano również, w jaki sposób można niezawodnie przeprowadzić intubację przy użyciu elastycznego cewnika o sile 20 G ze światłem światłowodowym lub bez niego. Technika ta znacznie zmniejsza zmienność dostarczania do płuc i zwiększa objętość dostarczanego płynu, który dociera do płuc. Ze względu na zmniejszoną wariancję, przy stosowaniu tej metody można stosować mniejsze kohorty zwierząt zamiast wkraplania ustno-gardłowego metodą ciągnięcia języka. Poniżej przedstawiono metodę skutecznej, szybkiej i konsekwentnej intubacji myszy i dostarczania jej do płuc, w tym solidne potwierdzenie umieszczenia rurki dotchawiczej. Dzięki tej ulepszonej metodologii konsekwentna, bezpieczna intubacja oraz powtarzalne, skuteczne dostarczanie do płuc są w zasięgu ręki.

Jak pokazano na Rysunku 1 i Rysunku 3, inokulacja wewnątrzopłucnowa z wykorzystaniem tradycyjnej metody wyciągania języka (podanie przez gardło) spowodowała niejednorodne, plamiste rozmieszczenie tuszu oraz większą zmienność wyników między badaczami. W przeciwieństwie do tego, instylacja dotchawicza (IT) po intubacji doprowadziła do bardziej spójnego dostarczenia substancji do obu płuc (prawego i lewego) i charakteryzowała się mniejszą zmiennością (Rysunek 1C i Rysunek 3D). W płucach zwierząt, którym tusz podano poprzez aspirację przez gardło z wyciąganiem języka, barwienie jest subtelne i występuje jedynie w pobliżu dużych dróg oddechowych (Rysunek 1A). Natomiast w przypadku zastosowania intubacji prowadzonej w celu podania tuszu, rozprzestrzenił się on znacznie głębiej w tkankę, obejmując znacznie większy obszar płuc. Po porównaniu powierzchni płuc zabarwionej tuszem pomiędzy obiema metodami, metoda intubacji okazała się znacznie skuteczniejsza od metody wyciągania języka (Rysunek 1B). Zmienność ilości dostarczonego tuszu była również drastycznie niższa w warunkach intubacji (Rysunek 1C). Zwiększony obszar zabarwienia płuc oraz mniejsza zmienność ilości cieczy docierającej do płuc silnie sugerują, że podanie IT jest lepszą metodą niż wyciąganie języka.
Jak pokazano w Filmie 1, tradycyjne endoskopy (opisywane w poprzednich publikacjach) mają zbyt długą ogniskową, aby umożliwić dokładną ocenę fałdów głosowych i poprowadzić rurkę endotrachealną6,19. W przeciwieństwie do nich, obrazy wideo uzyskane za pomocą konsumenckiego otoskopu (Rycina S1 oraz znaczniki czasu: 6:34 i 7:05 w filmie) charakteryzowały się znacznie lepszą rozdzielczością, co pozwoliło na lepszą wizualizację głośni.
Ta metoda intubacji obejmuje wielokrotną weryfikację umieszczenia rurki w tchawicy. Objętość oddechowa myszy była wyraźnie widoczna przy zastosowaniu metody pęcherzykowej (Rycina S2 oraz znacznik czasu: 8:25) i służy jako końcowe potwierdzenie, że każda podana ciecz trafi do płuc.
Aby dalej ocenić zmienność dwóch metod dostarczania, zbadano ekspresję transgenu w tkance płuc po inokulacji myszy 1 x 1011 vg AAV6.2-Luciferase za pomocą dwóch różnych metod (instylacji orofaringealnej metodą wyciągania języka lub podania wewnątrzoskrzelnego po intubacji z prowadzeniem). Siedem dni po podaniu wektora dokonano pomiarów luminescencji przy użyciu systemu obrazowania in vivo (IVIS) (Rysunek 3A). Następnie obliczono średnią radiancję dla obu płuc. Na 10 min przed obrazowaniem (ekspozycja 30 s) zwierzęta otrzymały w zastrzyku (podskórnie) 200 µL lucyferyny (15 mg/mL). Jak pokazano na Rysunku 3B, zwierzęta, którym podano wektor poprzez instylację orofaringealną, wykazywały sygnał luminescencyjny szeroko rozproszony zarówno w klatce piersiowej, jak i w obszarze nosa. W przeciwieństwie do nich, zwierzęta, którym wektor podano wewnątrzoskrzelnie za pomocą intubacji z prowadzeniem, wykazały skoncentrowaną luminescencję w płucach. Średnia radiancja u zwierząt intubowanych była znacznie większa w porównaniu z podaniem orofaringealnym, co wskazuje na poprawę wydajności dostarczania wektora do płuc oraz zmniejszoną zmienność dostarczania, obliczoną na podstawie odchylenia od średniej (Rysunek 3C i Rysunek 3D).
Pozytywne rezultaty metody intubacji obejmowały powtarzalne podanie do 50µL substancji do płuc myszy (przeprowadzone w Rysunku 1 i Rysunku 3), z rozproszonym rozmieszczeniem w całym płucu (co wykazano w Rysunku 1) i brakiem obecności w innych obszarach (takich jak górne drogi oddechowe/nos, co widać w Rysunku 3).
Negatywnym wynikiem byłaby jakakolwiek szkoda wyrządzona zwierzęciu, nadmierny stres, zmniejszona objętość płynu docierającego do płuc, niewłaściwa dystrybucja inokulum w płucach lub potrzeba przedłużonego szkolenia, jednak żadna z tych sytuacji nie wystąpiła.
Film 1: Tradycyjny widok endoskopowy gardła i fałdów głosowych myszy jest nieostry i trudny do efektywnego wykorzystania. Ogniskowa wynosząca 3 cm w tym endoskopie sprawia, że fałdy głosowe i orientacja przestrzenna są trudne do oceny. Język znajduje się w lewym dolnym rogu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/Video1%20T.%20Parks%20Remcho%20(1).mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
<img alt="Podawanie AAV6.2 Luc u myszy: obrazowanie IVIS; dostarczanie OP vs. IT; dane o radiancji, analiza zmienności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67676/67676fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Intubacja zapewnia większe dostarczanie do płuc przy mniejszej zmienności w porównaniu z aspiracją O.P. (A) Samice myszy BALB/c w wieku 6-10 tyg. otrzymały dawkę 1x1011 vg AAV6.2-Luciferase (Penn Vector Core), a następnie poddano je ocenie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo (IVIS) 7 dni później. Na 10 min przed obrazowaniem (czas ekspozycji 30 s) wstrzyknięto im (podskórnie) 200 µL lucyferyny (GoldBio, 15mg/mL). (Stworzone w biorender.com) (B) Reprezentatywne obrazy IVIS myszy, którym AAV6.2-Luciferase podano poprzez aspirację OP (wyciągnięcie języka, lewo) lub dostarczanie IT (intubacja, prawo). Obszary zainteresowania (ROI) mają taką samą wielkość, a na obrazie przedstawiono średnią radiancję w obrębie obszaru. (C) Ilościowe oznaczenie sygnału lucyferazy u myszy po aspiracji OP (n=7) w porównaniu z intubacją (n=5). p&lt;0.0001 w nieparzystym teście t Welcha po transformacji logarytmicznej surowych danych lucyferazy. (D) Odchylenie od średniej jako procent średniej radiancji. (p=0.0381, test t Welcha) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/67676fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rycina S1: Przedstawiono przykładowe obrazy z konsumenckiego otoskopu użytego w opisanym protokole do intubacji prowadzonej (lewo) oraz z endoskopu o podobnym koszcie i dostępności (prawo). Zwróć uwagę na wyraźne różnice w ostrości między obrazami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/FigureS1.jpeg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina S2: Przykładowy obraz przedstawiający rurkę pęcherzykową w użyciu. Objętość oddechowa szybko przesuwa kropelkę w rurce pęcherzykowej o kilka centymetrów. Kropelka przesuwa się w niewielkim stopniu, jeśli rurka znajduje się w przełyku. Częstość oddechów oraz objętość oddechowa mogą być szacowane za pomocą tej metody. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/FigureS2.jpeg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek S3: Podstawowy zestaw oświetleniowy, który eliminuje konieczność zakupu kosztownego zestawu do oświetlenia światłowodowego. Igła 20 G została przeprowadzona przez stożkową probówkę 50 mL, tanio (i w ilościach hurtowych) zakupiono kabel światłowodowy o średnicy 0,75 mm, który przycięto żyletką do odpowiedniej długości (~1m) i przymocowano taśmą. Unieruchomienie cewnika nie było konieczne ze względu na ciasne dopasowanie do kabla światłowodowego. Zamocowanie pokrywy stożkowej nad latarką telefonu komórkowego zapewnia wystarczającą transmisję światła do przeprowadzenia intubacji w zaciemnionym pomieszczeniu. Taka konstrukcja dodatkowo obniża koszty ponoszone przez laboratorium wdrażające tę technikę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67676/FigureS3.jpeg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół pokazuje, jak optymalne ustawienie myszy i transoralne wprowadzenie otoskopu opartego na kamerze umożliwia wizualizację głośni, szybką intubację przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i stałe dostarczanie płynu do płuc.

Ulepszona metodologia dostarczania płynu do płuc myszy: intubacja przy użyciu otoskopu konsumenckiego

Consistent delivery of liquids, including potential therapies, to the lungs is critical for modeling pulmonary disease and pre-clinical therapeutic ...

[Spiker] Ulepszona metodologia dostarczania płynu do płuc myszy. Intubacja za pomocą otoskopu konsumenckiego. Wszystkie procedury na zwierzętach i ta treść zostały sprawdzone przez Wydział Medycyny Porównawczej Uniwersytetu Tulane i zostały zatwierdzone na podstawie Protokołu 1810. Przed kontynuowaniem należy uzyskać zgodę IACUC i skonsultować się z personelem weterynaryjnym w swojej placówce. Rozwój nowych leków płucnych zależy od niezawodnego, powtarzalnego dostarczania do płuc myszy, ale tradycyjnie opiera się na podawaniu donosowym, aspiracji ustno-gardłowej przez pełne użycie języka lub chirurgicznym cięciu. Poniższa metoda ma zmniejszoną zmienność w porównaniu z pełnym językiem, co pozwala na uzyskanie mniejszych kohort zwierząt. Jest to również znacznie mniej inwazyjne niż ścinanie. Procedura, krok pierwszy, konfiguracja. Zestaw do intubacji gryzoni początkowo wykorzystywał statki z klinami zabezpieczającymi do intubacji. Są to małe stożkowe rękawy, które mieszczą się na elastycznym cewniku o rozmiarze 20 rozmiarów i jednym calu. Zapobiegają one uszkodzeniu cariny przez cewnik. Przed użyciem wyczyść klin zabezpieczający za pomocą podkładki do przygotowania izopropanolu. Wsuń czysty klin bezpieczeństwa, tutaj zielony, na elastyczną kaniulę o rozmiarze 20. Zbierz inne potrzebne narzędzia, w tym komercyjny otoskop, telefon komórkowy, stojak na mysz ze stożkiem nosowym, zgięte, drobno ząbkowane kleszcze, rurkę dotchawiczą i światło światłowodowe, jeśli używasz. Przed użyciem wyczyść to wszystko za pomocą podkładki do przygotowania izopropanolu. Weź elastyczną rurkę o długości około 20 centymetrów. Zegnij go w kształcie litery U i dodaj połączenie blokady przynęty na jednym końcu. Zabezpiecz kształt litery U za pomocą opaski zaciskowej. Dodaj do probówki od dwóch do 300 mikrolitrów sterylnej przefiltrowanej wody lub atramentu indyjskiego. W dalszej części tego zespołu zespół jest określany jako rurka bąbelkowa. Weź pętlę do szwów, wiążąc 13 centymetrów jedwabnego szwu o rozmiarze zero w kółko. Umieść tę pętlę w górnej części podstawki pod mysz i upewnij się, że obie strony szwu są dobrze zabezpieczone. Umieść podstawkę pod mysz na metalowej podstawie światła powiększającego. Umieść pomocne dłonie wokół miejsca, w którym będzie znajdować się usta myszy. Umieść mysz w komorze indukcyjnej. Używaj tlenu o stałym natężeniu przepływu na poziomie 0,8 litra na minutę i 2% izofluranu. Znieczulij mysz na tyle, aby nie obudziła się podczas umieszczania stożka nosowego. Nie należy znacząco hamować częstości oddechów myszy. Regularne oddechy pomagają docenić fałdy głosowe. Połącz otoskop z telefonem komórkowym i upewnij się, że obraz wideo jest stabilny. Uwaga, aby zminimalizować narażenie badacza na izofluoran podczas tej procedury, należy użyć respiratora chemicznego w przypadku przeprowadzania wielokrotnych intubacji lub szkolenia w tej metodzie. Alternatywnie, przeprowadź procedurę w kilku drewnie. Krok drugi, inscenizacja zwierząt. Wyjmij pierwsze zwierzę z komory indukcyjnej, gdy tylko zaśnie. Szoruj je i umieść ich górne zęby na długości szwu. Lekko napnij zwierzę, aby utrzymać pozycję szwu podczas odkładania myszy z powrotem na stojak. Dostosuj kąt szyi lekko do tyłu, umieszczając szyję w niewielkim wyprostu od pięciu do 15 stopni. Delikatnie popchnij stożek nosowy nad nozdrzy. Nie dociskaj mocno stożka nosowego w dół, ponieważ może to kolidować ze szwem zawieszającym mysz. Używając dużych, drobno ząbkowanych, zgiętych kleszczy, mocno chwyć język jak najbliżej dolnej wargi. Mocno pociągnij go w dół i odsuń od górnych zębów i przesuń na bok dolnych zębów. Ostrożność, przedłużona przyczepność, nadmierne napięcie lub zgniatanie języka mogą zagrozić zdrowiu zwierząt. Należy obserwować, czy nie ma oznak urazu, w tym siniaków, krwawienia, obrzęku lub wysuszenia języka. W przypadku zaobserwowania jakichkolwiek objawów należy przerwać zabieg i powiadomić personel weterynaryjny. Jeśli używasz pomocnych rąk, podeprzyj kleszcze w tej pozycji. Wprowadź światło światłowodowe, jeśli używasz przez elastyczny cewnik z założonym klinem zabezpieczającym do intubacji. Krok trzeci, wizualna ocena strun głosowych i intubacja. Trzymając otoskop w niedominującej ręce, delikatnie naciśnij język. Następnie ustaw kamerę i jej źródło światła pod odpowiednim kątem, aby uwidocznić struny głosowe w pobliżu podstawy języka. Ze względu na niewielkie różnice w anatomii i kolorze tkanki, użyj ruchu związanego z oddychaniem, aby potwierdzić identyfikację strukturalną. Na początku zorientowanie się w obrazie wideo może okazać się trudne. To są fałszywe fałdy głosowe. To są prawdziwe struny głosowe. Jest to odbicie od tkanki policzkowej. To jest sonda i światło światłowodowe. To jest nagłośnia. To jest podniebienie miękkie. To jest rima glottidis, twój cel do intubacji. To jest warga otoskopowa, wciskająca język. To jest region zakazany. Przy włączonym świetle światłowodowym, jeśli używasz, poprowadź kaniulę wzdłuż otoskopu, nawiązując lekki kontakt z podstawą języka lub wargową częścią otoskopu. Dla porównania, dostosuj kąt podejścia do cewnika, aby był bardzo płytki. Natychmiast po wprowadzeniu cewnika, mniej niż jeden milimetr poza fałdy głosowe, podnieś końcówkę cewnika tak, aby była prawie równoległa do blatu stołu. Zapobiega to wpychaniu się cewnika przez nagłośnię grzbietowo do przełyku. Należy pamiętać, że podczas przesuwania cewnika nie powinno być prawie żadnego oporu. W przypadku napotkania oporu należy natychmiast usunąć cewnik i pozwolić, aby oddechy powróciły do normy. W przypadku zaobserwowania krwawienia skonsultuj się z personelem weterynaryjnym. Krok czwarty, potwierdzenie założenia rurki dotchawiczej. Oprócz wizualnego potwierdzenia, że rurka znajduje się we właściwym miejscu za pomocą otoskopu, tchawica zapewnia mniejszy opór podczas umieszczania niż przełyk. Głębokość wprowadzenia optycznego wynosi około pięciu milimetrów poza fałdy głosowe. Światło można zobaczyć przez szyjkę jako drugorzędną metodę potwierdzenia, że głębokość wsunięcia jest odpowiednia. Należy pamiętać, że klin zabezpieczający do intubacji powinien zapobiegać nadmiernej głębokości w umieszczeniu rurki dotchawiczej. Klin bezpieczeństwa zapobiegnie urazowi coriny, jednak nie musi zapobiegać postępowi. Następnie, trzymając rurkę dotchawiczą na miejscu, usuń światło światłowodowe. Potwierdź prawidłowe umieszczenie cewnika metodą rurki bąbelkowej. Zamocuj rurkę bąbelkową na miejscu za pomocą dolnego zamka. Objętość oddechowa powinna być natychmiast widoczna. Jeśli nie, rurka dotchawicza jest niewłaściwie umieszczona. Usuń go szybko i pozwól, aby mysz powróciła do normalnego tempa oddychania. Krok piąty, podanie dotchawicze. Podobnie jak w przypadku metody ciągnięcia języka w przypadku porodu ustno-gardłowego, poród przez intubację grozi utopieniem zwierzęcia. U dorastających i dorosłych myszy 50 mikrolitrów to ogólnie bezpieczna objętość płynu do dostarczenia i wystarczająca do rozprowadzenia po płucach. Jeśli do podawania używasz pipety, odpipetuj żądaną objętość bezpośrednio do cewnika i pozwól myszy wdychać roztwór. Aby zapewnić rozproszone dostarczanie do płuc oraz dostarczany płyn do płuc z maksymalnie 500 mikrolitrami powietrza. W razie potrzeby można przeprowadzić wielokrotne wgłębienia pipety bez ryzyka negatywnego zasysania dostarczonej cieczy. Uwaga, użycie więcej niż objętość oddechowa, około 200 mikrolitrów, może być konieczne podczas przepłukiwania inokulum powietrzem. Jednak użycie 500 mikrolitrów nie grozi traumą, ponieważ jest to tylko około połowa pojemności życiowej. Krok szósty, ocena dostawy. Ręczna lampa światłowodowa może być wykonana z tanich i łatwo dostępnych komponentów. Można użyć komercyjnego zespołu światłowodowego, jak pokazano tutaj. Wystarczy jednak stożkowa pokrywka tubki o pojemności 50 ml z otworem wybitym za pomocą igły o średnicy 20 mm, przez którą wprowadzany jest plastikowy światłowodowy o średnicy 75 milimetra. W tym filmie wykorzystano zarówno komercyjne, jak i ręcznie wykonane urządzenia. Reprezentatywne wyniki, poród dotchawiczy z wykorzystaniem intubacji skutkuje poprawą porodu i zmniejszoną zmiennością w porównaniu z aspiracją ustno-gardłową przez pociągnięcie języka. Bezpośrednie porównanie ciągnięcia języka i intubacji sterowanej. Trzech różnych badaczy z ukrytym poziomem doświadczenia lub poproszonych o niezależne dostarczenie 50 mikrolitrów rozcieńczonego atramentu indyjskiego ustnie i gardłowo przez pociągnięcie języka 10 do 12 tygodniowym myszom C57 BL / 6J obu płci. Dwóch badaczy dostarczyło również ten sam zapas i objętość atramentu do płuc poprzez intubację, jak opisano. Płuca zostały usunięte wkrótce po porodzie i sfotografowane w 2-krotnym powiększeniu. Fotografie zostały ocenione pod kątem obszaru zabarwionego przez niezależnego, zaślepionego badacza za pomocą Obrazu J. Odkryła, że większy obszar płuc był zabarwiony, jeśli zastosowano intubację. Co więcej, zmienność, wyrażona jako procentowe odchylenie od średniej, była zmniejszona, jeśli zastosowano podanie dotchawicze po intubacji, a nie ciągnięcie języka. Ta stacja używana do intubacji sterowanej jest przygotowana tak, jak pokazano. Od lewej pipety do podawania, rurka bąbelkowa do potwierdzenia prawidłowego umieszczenia rurki dotchawiczej, kleszcze, szpatułka, wziernik nosowy dla dzieci, pomocne dłonie, światło powiększające, podstawka pod mysz ze stożkiem nosowym, sonda światłowodowa i komora indukcyjna znieczulenia. Intubacja zapewnia większe dostarczanie do płuc przy mniejszej zmienności w stosunku do aspiracji OP. 10-tygodniowym samicom myszy z zastawką C podano jedną dawkę lucyferazy od 10 do 11. VG lucyferazy AIV 6.2 i oceniono za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo siedem dni później. 10 minut przed obrazowaniem wstrzyknięto im podskórnie lucyferynę. Pokazano reprezentatywne obrazy a-vis myszy otrzymujących lucyferazy AV 6.2 przez aspirację OP po pociągnięciu języka lub instalację dotchawiczą przez intubację. Zasysanie jamy ustnej i gardła poprzez pociągnięcie języka prowadziło do rozprowadzania sygnału w różnych częściach górnych dróg oddechowych, podczas gdy intubacja prowadziła do skoncentrowanego sygnału w płucach. Obszary zainteresowania są tym samym obszarem, a średnie promieniowanie w tym obszarze jest pokazane na obrazie. Kwantyfikacja sygnałów lucyferazy ujawniła poprawę wydajności dostarczania do płuc przez intubację i dodatkowo podkreśliła zmniejszoną zmienność dostarczania przy użyciu tej metody. Wniosek, jak widać na poprzednich rysunkach, inokulacja międzypłucna przy użyciu tradycyjnej metody ciągnięcia języka wykazuje niejednolitą, niespójną dystrybucję inokulum i większą zmienność w tym, ile dociera do płuc. Natomiast metoda intubacji prowadziła do bardziej spójnego dostarczania zarówno do prawego, jak i lewego płuca i była mniej zmienna. Solidnie wykazane pozytywne wyniki tej metody intubacji to, po pierwsze, powtarzalna instalacja do 50 mikrolitrów do płuc myszy, po drugie, rozproszona dystrybucja wkroplonego płynu w płucach, a po trzecie, zmniejszone rozprzestrzenianie się inokulum poza płuca. Metoda ta jest szybka, bezpieczna i może być włączona do procedur laboratoryjnych bez kosztownego sprzętu lub czasochłonnego szkolenia.

improved-methodology-for-liquid-delivery-to-mouse-lung-intubation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wielokrotne pomiary fizjologii układu oddechowego gryzoni oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych są pożądane, lecz zazwyczaj niewykonalne. W niniejszym materiale opisujemy powtarzalną metodę intubacji doustnej myszy, która umożliwia wielokrotne pomiary nadreaktywności dróg oddechowych oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych.

Odwracalna, nieinwazyjna metoda pomiaru oporu dróg oddechowych i pobierania płynu z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego u myszy

Ten film opisuje prostą i niezawodną metodę wprowadzania płynu do tchawicy w celu wkroplenia płuc, utrwalenia i pomiaru objętości płuc.

Wkraplanie i utrwalanie płuc: wprowadzanie płynu do tchawicy i mocowanie płuc w celu zmierzenia ustalonej objętości płuc

Opracowaliśmy prostą, niezawodną i stosunkowo tanią metodę intubacji dotchawiczej u myszy za pomocą bezpośredniej laryngoskopii przy użyciu otoskopu z wziernikiem 2,0 mm. Technika ta jest atraumatyczna i może być stosowana do powtarzania pomiarów w przewlekłych eksperymentach. Uważamy, że jest lepsza od tracheostomii lub wcześniej opisanych technik niechirurgicznych.

Intubacja dotchawicza u myszy za pomocą laryngoskopii bezpośredniej przy użyciu otoskopu

Ten artykuł opisuje szybką i efektywną metodę intubacji myszy do pomiarów funkcji płuc lub wkraplania płuc, która pozwala myszom na regenerację i badanie w późniejszym czasie.  Zabieg polega na niedrogim światłowodowym źródle światła, które bezpośrednio oświetla tchawicę.

Prosta metoda intubacji płuc myszy

Użycie modelu, który naśladuje stan chorób płuc u ludzi, jest kluczowe dla badania patofizjologii i/lub etiologii danej choroby oraz dla opracowania interwencji terapeutycznej. W artykule przedstawiono nieinwazyjną metodę intubacji dotchawiczej, która może bezpośrednio dostarczać materiały egzogenne do płuc myszy.

Nieinwazyjna intubacja dotchawicza w celu zbadania patologii i fizjologii płuc myszy

Intubacja-intubacja dotchawicza (IMIT) jest doskonałą, nieinwazyjną metodą badania chorób układu oddechowego, jak również metodą wkraplania odczynników terapeutycznych bezpośrednio do płuc. Jest to szybka i wysoce powtarzalna metoda, która nadaje się do badań przedklinicznych.

Wkraplanie dotchawicze za pośrednictwem intubacji (IMIT): nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania

Ten artykuł przedstawia szybką i prostą metodę podawania bleomycyny bezpośrednio do tchawicy myszy poprzez intubację. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest wysoce powtarzalna, łatwa do opanowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani długiego czasu rekonwalescencji.

Ulepszona metoda szybkiej intubacji tchawicy u myszy

Dotchawicze (IT) podawanie eksperymentalnych środków myszom często powoduje asymetryczne dostarczanie do dystalnych płuc. W tym raporcie opisujemy bezpośrednie podejście dooskrzelowe (IB) do kanniulacji każdego płuca u żywych myszy bez operacji. To podejście może być stosowane do selektywnego podawania środków do jednego płuca lub może być dostosowane do poprawy symetrycznego dostarczania środka do obu płuc.

Bezpośrednie podanie dooskrzelowe w celu poprawy selektywnego odkładania się czynnika w płucach myszy

Celem tego artykułu jest opisanie wyrafinowanej metody intubacji myszy laboratoryjnej. Metoda jest nieinwazyjna i dlatego idealnie nadaje się do badań, które wymagają seryjnego monitorowania funkcji oddechowych i/lub wkraplania leków do płuc.

Wielokrotna intubacja jamy ustnej i tchawicy u myszy

Tutaj proponujemy protokół dostarczania lipopolisacharydów dotchawiczych (LPS) poprzez nieinwazyjną intubację dotchawiczą ustno-gardłową. Metoda ta minimalizuje uraz związany z zabiegiem chirurgicznym u zwierzęcia i dokładnie dostarcza LPS do tchawicy, a następnie do płuc.

Nieinwazyjne wkraplanie lipopolisacharydu dotchawiczego u myszy

Ten protokół opisuje prostą, niedrogą metodę intubacji doustnej wspomaganą wideo, umożliwiającą szybką i wizualizacyjnie sterowaną intubację u dorosłych szczurów pod znieczuleniem izofluranem.

Intubacja orotrachealna wspomaganą wideo u szczurów z wykorzystaniem taniego otoskopu połączonego ze smartfonem

Poznaj metodę intubacji myszy przy użyciu otoskopu konsumenckiego do precyzyjnego dostarczania płynów do płuc. Ta technika zapewnia niezawodne podawanie terapeutyków z minimalnym urazem tkanek.

Ulepszona metodologia dostarczania płynu do płuc myszy: intubacja przy użyciu otoskopu konsumenckiego

Przeglądaj więcej filmów