Ulepszona metodologia dostarczania płynu do płuc myszy: intubacja przy użyciu otoskopu konsumenckiego

[Spiker] Ulepszona metodologia dostarczania płynu do płuc myszy. Intubacja za pomocą otoskopu konsumenckiego. Wszystkie procedury na zwierzętach i ta treść zostały sprawdzone przez Wydział Medycyny Porównawczej Uniwersytetu Tulane i zostały zatwierdzone na podstawie Protokołu 1810. Przed kontynuowaniem należy uzyskać zgodę IACUC i skonsultować się z personelem weterynaryjnym w swojej placówce. Rozwój nowych leków płucnych zależy od niezawodnego, powtarzalnego dostarczania do płuc myszy, ale tradycyjnie opiera się na podawaniu donosowym, aspiracji ustno-gardłowej przez pełne użycie języka lub chirurgicznym cięciu. Poniższa metoda ma zmniejszoną zmienność w porównaniu z pełnym językiem, co pozwala na uzyskanie mniejszych kohort zwierząt. Jest to również znacznie mniej inwazyjne niż ścinanie. Procedura, krok pierwszy, konfiguracja. Zestaw do intubacji gryzoni początkowo wykorzystywał statki z klinami zabezpieczającymi do intubacji. Są to małe stożkowe rękawy, które mieszczą się na elastycznym cewniku o rozmiarze 20 rozmiarów i jednym calu. Zapobiegają one uszkodzeniu cariny przez cewnik. Przed użyciem wyczyść klin zabezpieczający za pomocą podkładki do przygotowania izopropanolu. Wsuń czysty klin bezpieczeństwa, tutaj zielony, na elastyczną kaniulę o rozmiarze 20. Zbierz inne potrzebne narzędzia, w tym komercyjny otoskop, telefon komórkowy, stojak na mysz ze stożkiem nosowym, zgięte, drobno ząbkowane kleszcze, rurkę dotchawiczą i światło światłowodowe, jeśli używasz. Przed użyciem wyczyść to wszystko za pomocą podkładki do przygotowania izopropanolu. Weź elastyczną rurkę o długości około 20 centymetrów. Zegnij go w kształcie litery U i dodaj połączenie blokady przynęty na jednym końcu. Zabezpiecz kształt litery U za pomocą opaski zaciskowej. Dodaj do probówki od dwóch do 300 mikrolitrów sterylnej przefiltrowanej wody lub atramentu indyjskiego. W dalszej części tego zespołu zespół jest określany jako rurka bąbelkowa. Weź pętlę do szwów, wiążąc 13 centymetrów jedwabnego szwu o rozmiarze zero w kółko. Umieść tę pętlę w górnej części podstawki pod mysz i upewnij się, że obie strony szwu są dobrze zabezpieczone. Umieść podstawkę pod mysz na metalowej podstawie światła powiększającego. Umieść pomocne dłonie wokół miejsca, w którym będzie znajdować się usta myszy. Umieść mysz w komorze indukcyjnej. Używaj tlenu o stałym natężeniu przepływu na poziomie 0,8 litra na minutę i 2% izofluranu. Znieczulij mysz na tyle, aby nie obudziła się podczas umieszczania stożka nosowego. Nie należy znacząco hamować częstości oddechów myszy. Regularne oddechy pomagają docenić fałdy głosowe. Połącz otoskop z telefonem komórkowym i upewnij się, że obraz wideo jest stabilny. Uwaga, aby zminimalizować narażenie badacza na izofluoran podczas tej procedury, należy użyć respiratora chemicznego w przypadku przeprowadzania wielokrotnych intubacji lub szkolenia w tej metodzie. Alternatywnie, przeprowadź procedurę w kilku drewnie. Krok drugi, inscenizacja zwierząt. Wyjmij pierwsze zwierzę z komory indukcyjnej, gdy tylko zaśnie. Szoruj je i umieść ich górne zęby na długości szwu. Lekko napnij zwierzę, aby utrzymać pozycję szwu podczas odkładania myszy z powrotem na stojak. Dostosuj kąt szyi lekko do tyłu, umieszczając szyję w niewielkim wyprostu od pięciu do 15 stopni. Delikatnie popchnij stożek nosowy nad nozdrzy. Nie dociskaj mocno stożka nosowego w dół, ponieważ może to kolidować ze szwem zawieszającym mysz. Używając dużych, drobno ząbkowanych, zgiętych kleszczy, mocno chwyć język jak najbliżej dolnej wargi. Mocno pociągnij go w dół i odsuń od górnych zębów i przesuń na bok dolnych zębów. Ostrożność, przedłużona przyczepność, nadmierne napięcie lub zgniatanie języka mogą zagrozić zdrowiu zwierząt. Należy obserwować, czy nie ma oznak urazu, w tym siniaków, krwawienia, obrzęku lub wysuszenia języka. W przypadku zaobserwowania jakichkolwiek objawów należy przerwać zabieg i powiadomić personel weterynaryjny. Jeśli używasz pomocnych rąk, podeprzyj kleszcze w tej pozycji. Wprowadź światło światłowodowe, jeśli używasz przez elastyczny cewnik z założonym klinem zabezpieczającym do intubacji. Krok trzeci, wizualna ocena strun głosowych i intubacja. Trzymając otoskop w niedominującej ręce, delikatnie naciśnij język. Następnie ustaw kamerę i jej źródło światła pod odpowiednim kątem, aby uwidocznić struny głosowe w pobliżu podstawy języka. Ze względu na niewielkie różnice w anatomii i kolorze tkanki, użyj ruchu związanego z oddychaniem, aby potwierdzić identyfikację strukturalną. Na początku zorientowanie się w obrazie wideo może okazać się trudne. To są fałszywe fałdy głosowe. To są prawdziwe struny głosowe. Jest to odbicie od tkanki policzkowej. To jest sonda i światło światłowodowe. To jest nagłośnia. To jest podniebienie miękkie. To jest rima glottidis, twój cel do intubacji. To jest warga otoskopowa, wciskająca język. To jest region zakazany. Przy włączonym świetle światłowodowym, jeśli używasz, poprowadź kaniulę wzdłuż otoskopu, nawiązując lekki kontakt z podstawą języka lub wargową częścią otoskopu. Dla porównania, dostosuj kąt podejścia do cewnika, aby był bardzo płytki. Natychmiast po wprowadzeniu cewnika, mniej niż jeden milimetr poza fałdy głosowe, podnieś końcówkę cewnika tak, aby była prawie równoległa do blatu stołu. Zapobiega to wpychaniu się cewnika przez nagłośnię grzbietowo do przełyku. Należy pamiętać, że podczas przesuwania cewnika nie powinno być prawie żadnego oporu. W przypadku napotkania oporu należy natychmiast usunąć cewnik i pozwolić, aby oddechy powróciły do normy. W przypadku zaobserwowania krwawienia skonsultuj się z personelem weterynaryjnym. Krok czwarty, potwierdzenie założenia rurki dotchawiczej. Oprócz wizualnego potwierdzenia, że rurka znajduje się we właściwym miejscu za pomocą otoskopu, tchawica zapewnia mniejszy opór podczas umieszczania niż przełyk. Głębokość wprowadzenia optycznego wynosi około pięciu milimetrów poza fałdy głosowe. Światło można zobaczyć przez szyjkę jako drugorzędną metodę potwierdzenia, że głębokość wsunięcia jest odpowiednia. Należy pamiętać, że klin zabezpieczający do intubacji powinien zapobiegać nadmiernej głębokości w umieszczeniu rurki dotchawiczej. Klin bezpieczeństwa zapobiegnie urazowi coriny, jednak nie musi zapobiegać postępowi. Następnie, trzymając rurkę dotchawiczą na miejscu, usuń światło światłowodowe. Potwierdź prawidłowe umieszczenie cewnika metodą rurki bąbelkowej. Zamocuj rurkę bąbelkową na miejscu za pomocą dolnego zamka. Objętość oddechowa powinna być natychmiast widoczna. Jeśli nie, rurka dotchawicza jest niewłaściwie umieszczona. Usuń go szybko i pozwól, aby mysz powróciła do normalnego tempa oddychania. Krok piąty, podanie dotchawicze. Podobnie jak w przypadku metody ciągnięcia języka w przypadku porodu ustno-gardłowego, poród przez intubację grozi utopieniem zwierzęcia. U dorastających i dorosłych myszy 50 mikrolitrów to ogólnie bezpieczna objętość płynu do dostarczenia i wystarczająca do rozprowadzenia po płucach. Jeśli do podawania używasz pipety, odpipetuj żądaną objętość bezpośrednio do cewnika i pozwól myszy wdychać roztwór. Aby zapewnić rozproszone dostarczanie do płuc oraz dostarczany płyn do płuc z maksymalnie 500 mikrolitrami powietrza. W razie potrzeby można przeprowadzić wielokrotne wgłębienia pipety bez ryzyka negatywnego zasysania dostarczonej cieczy. Uwaga, użycie więcej niż objętość oddechowa, około 200 mikrolitrów, może być konieczne podczas przepłukiwania inokulum powietrzem. Jednak użycie 500 mikrolitrów nie grozi traumą, ponieważ jest to tylko około połowa pojemności życiowej. Krok szósty, ocena dostawy. Ręczna lampa światłowodowa może być wykonana z tanich i łatwo dostępnych komponentów. Można użyć komercyjnego zespołu światłowodowego, jak pokazano tutaj. Wystarczy jednak stożkowa pokrywka tubki o pojemności 50 ml z otworem wybitym za pomocą igły o średnicy 20 mm, przez którą wprowadzany jest plastikowy światłowodowy o średnicy 75 milimetra. W tym filmie wykorzystano zarówno komercyjne, jak i ręcznie wykonane urządzenia. Reprezentatywne wyniki, poród dotchawiczy z wykorzystaniem intubacji skutkuje poprawą porodu i zmniejszoną zmiennością w porównaniu z aspiracją ustno-gardłową przez pociągnięcie języka. Bezpośrednie porównanie ciągnięcia języka i intubacji sterowanej. Trzech różnych badaczy z ukrytym poziomem doświadczenia lub poproszonych o niezależne dostarczenie 50 mikrolitrów rozcieńczonego atramentu indyjskiego ustnie i gardłowo przez pociągnięcie języka 10 do 12 tygodniowym myszom C57 BL / 6J obu płci. Dwóch badaczy dostarczyło również ten sam zapas i objętość atramentu do płuc poprzez intubację, jak opisano. Płuca zostały usunięte wkrótce po porodzie i sfotografowane w 2-krotnym powiększeniu. Fotografie zostały ocenione pod kątem obszaru zabarwionego przez niezależnego, zaślepionego badacza za pomocą Obrazu J. Odkryła, że większy obszar płuc był zabarwiony, jeśli zastosowano intubację. Co więcej, zmienność, wyrażona jako procentowe odchylenie od średniej, była zmniejszona, jeśli zastosowano podanie dotchawicze po intubacji, a nie ciągnięcie języka. Ta stacja używana do intubacji sterowanej jest przygotowana tak, jak pokazano. Od lewej pipety do podawania, rurka bąbelkowa do potwierdzenia prawidłowego umieszczenia rurki dotchawiczej, kleszcze, szpatułka, wziernik nosowy dla dzieci, pomocne dłonie, światło powiększające, podstawka pod mysz ze stożkiem nosowym, sonda światłowodowa i komora indukcyjna znieczulenia. Intubacja zapewnia większe dostarczanie do płuc przy mniejszej zmienności w stosunku do aspiracji OP. 10-tygodniowym samicom myszy z zastawką C podano jedną dawkę lucyferazy od 10 do 11. VG lucyferazy AIV 6.2 i oceniono za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo siedem dni później. 10 minut przed obrazowaniem wstrzyknięto im podskórnie lucyferynę. Pokazano reprezentatywne obrazy a-vis myszy otrzymujących lucyferazy AV 6.2 przez aspirację OP po pociągnięciu języka lub instalację dotchawiczą przez intubację. Zasysanie jamy ustnej i gardła poprzez pociągnięcie języka prowadziło do rozprowadzania sygnału w różnych częściach górnych dróg oddechowych, podczas gdy intubacja prowadziła do skoncentrowanego sygnału w płucach. Obszary zainteresowania są tym samym obszarem, a średnie promieniowanie w tym obszarze jest pokazane na obrazie. Kwantyfikacja sygnałów lucyferazy ujawniła poprawę wydajności dostarczania do płuc przez intubację i dodatkowo podkreśliła zmniejszoną zmienność dostarczania przy użyciu tej metody. Wniosek, jak widać na poprzednich rysunkach, inokulacja międzypłucna przy użyciu tradycyjnej metody ciągnięcia języka wykazuje niejednolitą, niespójną dystrybucję inokulum i większą zmienność w tym, ile dociera do płuc. Natomiast metoda intubacji prowadziła do bardziej spójnego dostarczania zarówno do prawego, jak i lewego płuca i była mniej zmienna. Solidnie wykazane pozytywne wyniki tej metody intubacji to, po pierwsze, powtarzalna instalacja do 50 mikrolitrów do płuc myszy, po drugie, rozproszona dystrybucja wkroplonego płynu w płucach, a po trzecie, zmniejszone rozprzestrzenianie się inokulum poza płuca. Metoda ta jest szybka, bezpieczna i może być włączona do procedur laboratoryjnych bez kosztownego sprzętu lub czasochłonnego szkolenia.