Name: Separacja i frakcjonowanie białek ściany komórkowej i błony komórkowej z Mycobacterium tuberculosis do dalszej analizy białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Poznaj metodę separacji białek ściany i błony komórkowej Mycobacterium tuberculosis za pomocą izoelektrycznego fokusowania. Uzyskane frakcje nadają się bezpośrednio do analiz proteomicznych i immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta jest w pełni wspierana przez grant DST SERB dr K. R. Uma Devi. Dr B. Ramalingam był finansowany przez stypendium DBT-Ramalingaswamy.

Badanie to było zgodne z odpowiednimi wytycznymi rządowymi i zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Naukowy Komitet Doradczy i Komitet Etyczny. Świadomą zgodę uzyskano od badanej populacji przed pobraniem próbek.
1. Hodowla M. tuberculosis
<ol>
	<li>Przenieś około 10 M. kolonii gruźlicy ze skosów Lowensteina-Jensena do 2 ml pożywki bulionowej 7H9 (zawiesić 2,35 g Middlebrook 7H9 Bulion Base w 400 ml wody destylowanej, 50 ml suplementu katalazy albuminy kwasu oleinowego i dekstrozy [OADC], 0,5 g Tween 80 i uzupełnić do 500 ml) UWAGA: M. tuberculosis jest patogenem grupy ryzyka 3; należy obchodzić się z nim w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) w obiekcie BSL3. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).</li>
	<li>Rozprowadzić komórki za pomocą szklanych kulek w sterylnych warunkach w wytrząsarce do butelek z prędkością 15 obr./min przez 1 min.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę bakteryjną do 10 ml pożywki bulionowej 7H9 w butelce McCartneya i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 tygodnie w inkubatorze z wytrząsarką przy 30 obr./min.</li>
	<li>Zwiększ hodowlę w fazie logarytmicznej do 200 ml pożywki bulionowej 7H9 i hoduj w kulturze wytrząsającej przez 4 tygodnie przy 30 obr./min.</li>
	<li>Następnie zwiększyć skalę kultury w 1-litrowej kolbie zawierającej 500 ml pożywki bulionowej 7H9 i hodować jako kulturę wytrząsającą przy 30 obr./min przez 4 tygodnie w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zebrać prątki przez odwirowanie z prędkością 1741 g przez 30 minut.</li>
</ol>
2. Przygotowanie białek lizatu całych komórek
<ol>
	<li>Poddać wyizolowany osad bakteryjny sonikacji zgodnie ze standardowym protokołem.</li>
	<li>Przygotować bufor rozbijający o następującym składzie: 20 mM Tris z 8,5% (8,5 g na 100 ml) NaCl.</li>
	<li>Dostosuj końcowe pH do 7,4 za pomocą stężonego HCl.</li>
	<li>Dodać świeżo przygotowane inhibitory proteazy do buforu niszczącego o następujących stężeniach (szczegółowe informacje na temat inhibitorów proteazy, które należy dodać, są wymienione w tabeli uzupełniającej 1)</li>
	<li>Traktować pałeczki M. tuberculosis (100 ml objętości po upakowaniu i zważyć) na każde 2 g osadu komórek bakteryjnych, dodać 1 ml buforu łamiącego lizozymem (1 mg/5 ml zawiesiny komórkowej) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie mieszając.</li>
	<li>Zawiesić pałeczki w podwójnej objętości buforu łamającego.</li>
	<li>Do buforu dodać 0,04% (wag./obj.) azydek sodu i 0,05% Tween 80.</li>
	<li>Rozbić komórki bakteryjne w buforze rozbijającym za pomocą sonikatora z cyklem 9 s włączonym i 9 s wyłączonym przez 30 minut przy 40% amplitudzie, utrzymując zawiesinę na lodzie, aby zapobiec denaturacji białek.</li>
	<li>Odwirować przygotowany lizat przy 3438 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia nieuszkodzonych komórek.</li>
	<li>Zagęścić supernatant za pomocą koncentratorów odśrodkowych (odcięcie 3 kDa – 5 ml).</li>
	<li>Oznaczyć stężenie białka w supernatancie za pomocą testu ilościowego białka kwasu bicinchoninowego (BCA) przy użyciu białka BSA jako standardu. UWAGA: W analizie SDS-PAGE załaduj 50 μg białka do analizy.</li>
</ol>
3. Izolacja białek ściany komórkowej i błony komórkowej przez ultrawirowanie
<ol>
	<li>Wyizoluj ścianę komórkową, błonę komórkową i białka cytozolowe z lizatu całej komórki zgodnie z protokołem Raja i wsp.9. zgodnie z poniższym opisem.</li>
	<li>Odwirować lizat całego układu komórkowego w temperaturze 13751 × g w temperaturze 4 °C przez 30 minut, rozdzielając białka ściany komórkowej w postaci osadu.</li>
	<li>Poddać supernatant ultrawirowaniu w temperaturze 100 000 × g w temperaturze 4 °C przez 4 godziny za pomocą ultrawirówki, oddzielając białka błony komórkowej w postaci osadu i pozostawiając białka cytozolowe w supernatancie.</li>
	<li>Oszacuj stężenia białek w ścianie komórkowej i frakcjach błony komórkowej za pomocą testu białka BCA. UWAGA: W analizie SDS-PAGE załaduj 50 μg białka do analizy. Oddzielona ściana komórkowa i błona komórkowa są przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.</li>
</ol>
4. Preparatywne ogniskowanie izoelektryczne w fazie ciekłej (Rotofor [aparatura IEF])
<ol>
	<li>Rozpuścić solubilizację ścian komórkowych i białek błony komórkowej wyizolowanych przez ultrawirowanie w buforze IEF zawierającym 8 M mocznika, 1 mM DTT, 5% glicerolu, 2% digitoniny.</li>
	<li>Dodać 2% amfolitów (pH 3,0 do 10,0 i pH 4,0 do 6,0 w stosunku 1:4)</li>
	<li>Frakcjonować rozpuszczone białka za pomocą ciekłego systemu IEF utrzymywanego w temperaturze 4 °C z chłodzącą łaźnią wodną.</li>
	<li>Przeprowadzić separację IEF zgodnie z instrukcjami producenta, stosując stałą moc 12 W, aż do ustabilizowania się napięcia (między 1300 V a 1600 V).</li>
	<li>Kontynuuj przebieg IEF przez dodatkowe 30 minut po ustabilizowaniu napięcia, z całkowitym czasem pracy około 5-6 godzin.</li>
	<li>Zebrać poszczególne frakcje IEF za pomocą pompy próżniowej i określić ich wartości pH.</li>
	<li>Poddaj oddzielone frakcje (50 μg) SDS-PAGE i zwizualizuj białka za pomocą barwienia Coomassie Brilliant Blue (CBB) lub srebra. Oddzielone frakcje IEF należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.</li>
</ol>
5. Preparatywna SDS-PAGE i cała elucja żelu
<ol>
	<li>Wymieszać oddzielone IEF frakcje ściany komórkowej i błony komórkowej z 6-krotnym buforem próbki SDS-PAGE i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut przed analizą SDS-PAGE.</li>
	<li>Oddziel frakcje białkowe w drugim wymiarze za pomocą żeli poliakrylamidowych o długości 16 cm i długości 20 cm, składających się z 12,5% żelu rozdzielczego i 4% żelu do układania w stosy.</li>
	<li>Do załadowania próbki należy użyć pojedynczego dołka na próbkę o długości 13 cm.</li>
	<li>Przeprowadzaj elektroforezę przy stałym prądzie 50 mA/żel, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu.</li>
	<li>Równoważyć żel w buforze elucyjnym (60 mM Tris, pH 9,4; 40 mM kwas 3-(cykloheksyloamino)-1-propanosulfonowy [CAPS]) przez 10 minut po zakończeniu elektroforezy.</li>
	<li>Przenieść żel do całego aparatu do eluteracji żelu zgodnie z opisem producenta urządzenia.</li>
	<li>Eluować białka z żelu, uruchamiając eluter przy stałym prądzie 250 mA przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zebrać około 30 frakcji białkowych, każda o objętości 3 ml, z każdego żelu za pomocą pompy próżniowej.</li>
	<li>Określić ilościowo stężenie białka w eluowanych frakcjach za pomocą testu białka BCA.</li>
	<li>Poddaj 10 μg eluowanych frakcji analizie SDS-PAGE i uwidocznij za pomocą barwienia błękitem brylantowym Coomassie (CBB). UWAGA: Oddzielone całe eluowane frakcje żelowe przechowywano w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Seshadri, C., Turner, M. T., Lewinsohn, D. M., Moody, D. B., Van Rhijn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+are+major+targets+of+the+polyclonal+human+T+cell+response+to+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins are major targets of the polyclonal human T cell response to Mycobacterium tuberculosis.</a> J Immunol. 190 (1), 278-284 (2013).</li>
<li>Kunnath-Velayudhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+antibody+responses+to+the+Mycobacterium+tuberculosis+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14703-14708 (2010).</li>
<li>Drage, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR2+and+its+co-receptors+determine+responses+of+macrophages+and+dendritic+cells+to+lipoproteins+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR2 and its co-receptors determine responses of macrophages and dendritic cells to lipoproteins of Mycobacterium tuberculosis.</a> Cell Immunol. 258 (1), 29-37 (2009).</li>
<li>Wallin, E., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+integral+membrane+proteins+from+eubacterial%2C+archaean%2C+and+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms.</a> Protein Sci. 7, 1029-1038 (1998).</li>
<li>Almeida, J. G., Preto, A. J., Koukos, P. I., Bonvin, A. M. J. J., Moreira, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins+structures%3A+A+review+on+computational+modeling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins structures: A review on computational modeling tools.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1859 (10), 2021-2039 (2017).</li>
<li>Finkelstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of membrane proteins.</a> Nature. 511 ((Suppl 7509)), 21(2014).</li>
<li>Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+purification+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strategies for the purification of membrane proteins.</a> Methods Mol Biol. 1485, 389-400 (2017).</li>
<li>Von Jagow, G., Link, T., Schager, H. Purification Strategies for Membrane Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVon+Jagow%2C+G+%22A+Practical+Guide+to+Membrane+Protein+Purification%22">A Practical Guide to Membrane Protein Purification</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1994).</li>
<li>Raja, A., Uma Devi, K. R., Ramalingam, B., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G%2C+A%2C+and+M+responses+in+serum+and+circulating+immune+complexes+elicited+by+the+16-kilodalton+antigen+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G, A, and M responses in serum and circulating immune complexes elicited by the 16-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 308-312 (2002).</li>
<li>Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+proteomics+in+defining+the+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 1 (4), 574-586 (2001).</li>
<li>Deenadayalan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoproteomic+identification+of+human+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis+that+differentiate+healthy+contacts+from+tuberculosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).</li>
<li>Sinha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenic+membrane-associated+proteins+of+Mycobacterium+tuberculosis+revealed+by+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Immunogenic membrane-associated proteins of Mycobacterium tuberculosis revealed by proteomics.</a> Microbiology. 151 (7), 2411-2419 (2005).</li>
<li>Deenadayalan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+approach+for+proteomic+and+immunological+analysis+of+cell+wall+and+cell+membrane+proteins+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Arch%22%5BJournal%5D)">An Integrated approach for proteomic and immunological analysis of cell wall and cell membrane proteins of Mycobacterium tuberculosis.</a> Med Res Arch. 11 (11), (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hydrofobowy charakter białek ściany komórkowej i błony stanowi poważne wyzwanie eksperymentalne w zakresie ich rozpuszczania i separacji. We wspomnianym protokole opisaliśmy nowatorską dwuwymiarową metodę separacji opartą na elektroforezie, aby skutecznie wyizolować te hydrofobowe białka. W tym protokole początkowo oddzieliliśmy białka błony i ściany komórkowej na podstawie ich punktów izoelektrycznych za pomocą ciekłego systemu IEF. Aby rozwiązać problem solubilizacji, zastosowaliśmy wysokie stężenie środka chaotropoweg...

Badania immunologiczne wykazały, że oprócz rozpuszczalnych białek, które są łatwe do oczyszczenia, ludzka odpowiedź immunologiczna na patogeny, takie jak M. tuberculosis, jest również ukierunkowana hydrofobowa białko obecne w ścianie komórkowej1 i białkach błony komórkowej2 Mycobacterium tuberculosis. Te białka ściany komórkowej i błony odgrywają kluczową rolę w kontroli immunologicznej przeciwko wielu patogenom, w tym gruźlicy. Niektóre z tych białek są zgłaszane jako antygeny immunodominujące, które wywołują odpowiedź komórek T i B. W przeciwieństwie do tego, inne białka są identyfikowane jako sygnatury molekularne patogenów, które są rozpoznawane jako inicjujące wrodzoną odpowiedź immunologiczną, takie jak wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP) przez komórki odpornościowe, inicjując w ten sposób odpowiedź immunologiczną. Na przykład lipoproteiny prątków, takie jak LprG, LpqH, LprA i PhoS1, są rozpoznawane przez receptor Toll-podobny 23. 
Hydrofobowy charakter białek ściany komórkowej i błony stanowi poważne wyzwanie techniczne w zakresie ich rozpuszczania i separacji. Badania wykazały, że białka błonowe stanowią około 20% do 30% regionów kodujących wszystkie organizmy, w tym prątki 4,5. Ze względu na ich wewnętrzną naturę i wyzwania techniczne, białka ściany komórkowej i błony są trudniejsze do rozpuszczenia i wyizolowania w porównaniu z białkami rozpuszczalnymi. W rezultacie opisano tylko 2% struktur białek błonowych6. Do trudności w wyizolowaniu tych białek przyczynia się kilka czynników. Podstawowym wyzwaniem jest ich niska liczebność w komórce, co komplikuje izolację poszczególnych białek w celu dalszej charakterystyki7. Dodatkowo białka te mają tendencję do agregacji, co dodatkowo komplikuje ich rozpuszczalność. Ten problem można rozwiązać, dodając detergenty, które wspomagają rozpuszczanie. Jednak niektóre białka mogą nadal tworzyć agregaty nawet w obecności detergentów, w którym to przypadku można zastosować środki chaotropowe i redukujące w celu poprawy rozpuszczalności.
Stosowanie detergentów do solubilizacji może zakłócać późniejsze metody separacji. Na przykład naładowane detergenty nie mogą być używane z chromatografią jonowymienną, a wszystkie detergenty mogą zakłócać chromatografię oddziaływań hydrofobowych8. Dlatego wybór detergentu kompatybilnego z wybraną metodą separacji ma kluczowe znaczenie. Kolejnym ważnym krokiem w izolacji białek ściany komórkowej i błony jest usunięcie detergentów używanych do solubilizacji, ponieważ mogą one zakłócać późniejsze analizy funkcjonalne białek.
Opracowaliśmy solidną metodologię, która pozwala przezwyciężyć wiele wyzwań związanych z analizą białek błonowych, w szczególności białek hydrofobowych ze ściany komórkowej i błony komórkowej. Kluczowym wyzwaniem w badaniu tych białek jest ich rozpuszczalność, ponieważ ich hydrofobowy charakter sprawia, że są trudne do ekstrakcji i analizy. Opisana tutaj metodologia wykorzystuje specjalnie opracowany bufor ogniskowania izoelektrycznego (IEF), który skutecznie rozpuszcza białka ściany komórkowej i błony komórkowej. Ten etap rozpuszczania ma kluczowe znaczenie, ponieważ umożliwia późniejszą analizę tych hydrofobowych białek.
Dodatkową zaletą tej metody jest jej zdolność do zmniejszania złożoności mieszanki białkowej. Dzięki zastosowaniu dwóch uzupełniających się technik separacji - opartych na punkcie izoelektrycznym (pI) i masie cząsteczkowej białek - metodologia ta skutecznie rozdziela białka ściany komórkowej i błony komórkowej na uproszczone frakcje. Każda frakcja zazwyczaj zawiera tylko jedno do trzech białek, co znacznie zwiększa rozdzielczość i ułatwia dalszą charakterystykę.
Metodologia ta, opracowana przy użyciu białek ściany komórkowej i błony komórkowej Mycobacterium tuberculosis jako systemu modelowego, skutecznie rozwiązuje problemy związane z izolacją i analizą białek hydrofobowych. Zapewnia niezawodne podejście do izolacji, separacji i charakterystyki tych złożonych frakcji białkowych, zwiększając możliwości ich szczegółowego badania.

<table><tbody><tr><td>Rosół 7H9&nbsp;</td><td>Himedia&nbsp;</td><td>Zobacz materiał M198</td><td></td></tr><tr><td>40% Bio-Lyte 3/10 Amfolite&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1631113</td><td></td></tr><tr><td>Test białka BCA&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>Zobacz materiał BCA1</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Lyte 5/7 Amfolite&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1631152</td><td></td></tr><tr><td>koncentratory odśrodkowe 3 kDa</td><td>MERCK</td><td>Z629456</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina.</td><td>MERCK</td><td>Zobacz materiał D141</td><td></td></tr><tr><td>Dnase (Wirus Dnase)</td><td>MERCK</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Naziemna telewizja cyfrowa</td><td>MERCK</td><td>Zobacz materiał D9779</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MERCK</td><td>Numer katalogowy E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (EGTA)</td><td>MERCK</td><td>E3889 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>MERCK</td><td>Zobacz materiał G5516</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptyna</td><td>MERCK</td><td>E18</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna A</td><td>MERCK</td><td>Zobacz materiał P5318</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Kanał PMSF)</td><td>MERCK</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Rnaza</td><td>MERCK</td><td>10109134001</td><td></td></tr><tr><td>Rotofor&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-2986</td><td>&nbsp; aparatura do ogniskowania izoelektrycznego (IEF)</td></tr><tr><td>Sonifikacji</td><td>Vibra-Cell, Dźwięki</td><td>VC 750</td><td></td></tr><tr><td>TLCK (Troska)</td><td>MERCK</td><td>Zobacz materiał T7254 TGL</td><td></td></tr><tr><td>TPCK (Protokół TPCK)</td><td>MERCK</td><td>4376</td><td></td></tr><tr><td>mocznik</td><td>MERCK</td><td>U5378 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Cała aparatura Gel Eluter&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651250</td><td></td></tr></tbody></table>

separacja i frakcjonowanie białek ściany komórkowej i błony komórkowej z mycobacterium tuberculosis do dalszej analizy białek

Separation and Fractionation of Cell Wall and Cell Membrane Proteins from Mycobacterium tuberculosis for Downstream Protein Analysis

Ściany komórkowej i białka błonowe prątków, które odgrywają kluczową rolę w patogenezie gruźlicy, udało się oddzielić za pomocą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF) i preparatywnej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE). Następnie następuje elucja żelu, pokonując ograniczenia w konwencjonalnych metodach separacji białek hydrofobowych. W tej procedurze kolonie M. tuberculosis przeniesiono ze skosów Lowensteina-Jensena do 2 ml bulionu 7H9, zdyspergowano szklanymi kulkami i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 2 tygodnie. Następnie kulturę przeskalowano do 200 ml i hodowano w shakerze przez 4 tygodnie. Został on następnie przeskalowany do 1 litra z 500 ml bulionu 7H9 i uprawiany przez dodatkowe 4 tygodnie. Wyhodowane prątki granulowano przez odwirowanie w ilości 1741 × g przez 30 minut. Na każde 2 g pastylki dodano 1 ml buforu łamliwego, a próbkę poddano sonikacji. Lizat odwirowywano przy 3436 × g przez 15 minut w celu usunięcia nieuszkodzonych komórek, a supernatant zagęszczono. Ten supernatant (lizat całokomórkowy) odwirowywano w stężeniu 13751 × g przez 30 minut w celu osadzenia białek ściany komórkowej. Pozostały supernatant był ultra odwirowywany w stężeniu 100 000 × g przez 4 godziny w celu oddzielenia błony komórkowej i cytozolu. Wyizolowane białka ściany komórkowej i błony zostały załadowane do płynnego preparatywnego układu IEF w temperaturze 4 °C i rozdzielone w temperaturze 12 W, aż napięcie ustabilizowało się na poziomie 1400 V, co oddziela 20 frakcji. Te frakcje IEF zostały następnie oddzielone za pomocą preparatywnego SDS-PAGE, a białka eluowano przy użyciu całego eluteru żelowego o natężeniu 250 mA, w wyniku czego uzyskano 30 frakcji. Dzięki temu protokołowi byliśmy w stanie zidentyfikować nowe ściany komórkowe M. tuberculosis i biomarkery specyficzne dla błony, a także wykazuje potencjał do charakteryzowania podobnych białek w innych patogenach.

Izolacja białek ściany komórkowej i błony komórkowej za pomocą ultrawirowania z dużą prędkością Białka ściany komórkowej i błony wyizolowano z całych lizatów komórkowych za pomocą ultrawirowania, jak opisano w protokole. Analiza SDS-PAGE oddzielonych frakcji subkomórkowych - ściany komórkowej, błony komórkowej i profili białkowych cytozolu M. tuberculosis pokazano na rycinie 1.
Rozdzielanie białek ściany komórkowej za pomocą pr...

Protokół ten rozdziela nierozpuszczalne białka ściany komórkowej i błony na proste frakcje (1-5 białek) za pomocą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF) opartego na punkcie izoelektrycznym, a następnie rozdzielania według masy cząsteczkowej. Otrzymane frakcje można wykorzystać bezpośrednio do analizy immunologicznej i proteomicznej bez dalszego oczyszczania.

Separacja i frakcjonowanie białek ściany komórkowej i błony komórkowej z Mycobacterium tuberculosis do dalszej analizy białek

Mycobacterium cell wall and membrane proteins, which play a central role in tuberculosis pathogenesis, were successfully separated using preparative ...

Nasze badania koncentrowały się na opracowaniu uproszczonej metody rozdzielania nierozpuszczalnych białek ściany komórkowej i błony komórkowej Mycobacterium tuberculosis na proste frakcje do bezpośrednich testów proteomicznych i immunologicznych. Postępy w technikach elektroforetycznych pozwalają obecnie na rozdzielanie złożonych białek na mniejszą liczbę frakcji białkowych, co ułatwia wydajną izolację opartą na specyfikacji masy do funkcjonalnych zastosowań proteomicznych i immunologicznych. Kluczowe wyzwania obejmują słabą rozpuszczalność białka hydrofobowego wytrącającego się powyżej stu miligramów oraz denaturację wywołaną SDS-PAGE, co utrudnia dalsze stosowanie wymagające natywnego potwierdzenia, takiego jak testy aktywności enzymatycznej.Żaden obecny protokół nie rozdziela systematycznie nierozpuszczalnych hydrofobowych białek ściany komórkowej i błony komórkowej na zdefiniowane frakcje rozpuszczalne w wodzie w celu bezpośredniej analizy proteomicznej i immunologicznej, co jest kluczem do zrozumienia funkcji i kierowania interwencjami. Nasze przyszłe badania będą koncentrować się na rozwoju diagnostyki opartej na antygenach T oraz ocenie ich czułości, swoistości i wydajności w całej populacji gruźlicy w celu wczesnego i dokładnego wykrywania gruźlicy w celu wsparcia lepszej kontroli choroby. Na początek uzyskaj próbki ściany komórkowej, błony komórkowej i białka cytozolowego z lizatu całych komórek prątków Mycobacterium tuberculosis.Rozpuszczaj białka ściany komórkowej i błony komórkowej w buforze izoelektrycznym. Dodaj 2% amfolity w zakresach pH od 3 do 10 i od 4 do 6 w stosunku od jednego do czterech. Teraz frakcjonuj rozpuszczone białka w ciekłym układzie ogniskowania izoelektrycznego utrzymywanym w temperaturze czterech stopni Celsjusza z chłodzącą kąpielą wodną.Przeprowadzić separację izoelektryczną zgodnie z instrukcjami producenta, stosując stałą moc 12 watów. Zebrać poszczególne frakcje ogniskujące izoelektrycznie za pomocą pompy próżniowej. Określ wartości pH każdej frakcji.Poddaj 50 mikrogramów oddzielonych frakcji SDS-PAGE i zwizualizuj białka za pomocą barwienia Coomassie Brilliant Blue lub srebra. Zacznij od zmieszania oddzielonych IEF frakcji ściany komórkowej i błony komórkowej z buforem próbki do elektroforezy żelowej SDS. Podgrzej mieszaninę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.Oddziel frakcje białkowe w drugim wymiarze, używając żeli poliakrylamidowych o wymiarach 16 na 20 centymetrów z żelem rozdzielczym 12,5% i żelem do układania w stosy 4%. Następnie użyj pojedynczej studzienki na próbkę o długości 13 centymetrów, aby załadować próbkę do żelu. Wykonaj elektroforezę przy stałym prądzie 50 miliamperów na żel, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu.Po elektroforezie należy równoważyć żel w buforze elucyjnym przez 10 minut. Przenieś żel do całego aparatu do usuwania żelu zgodnie z instrukcjami producenta urządzenia. Uruchom eluter przy stałym prądzie 250 miliamperów przez jedną godzinę, aby wymyć białka z żelu, a następnie użyj pompy próżniowej, aby zebrać z żelu około 30 frakcji białkowych, z których każda mierzy trzy mililitry.Określić ilościowo stężenie białka w eluowanych frakcjach za pomocą testu białkowego kwasu bicinchoninowego. Poddaj 10 mikrogramów eluowanych frakcji białkowych analizie SDS-PAGE i uwidocznij prążki za pomocą barwienia Coomassie Brilliant Blue. W pierwszym supernatantze: ścianie komórkowej, błonie komórkowej i frakcjach cytozolowych Mycobacterium tuberculosis zaobserwowano wyraźne wzorce prążkowania białek, co potwierdza udane frakcjonowanie subkomórkowe.Ogniskowanie izoelektryczne białek ściany komórkowej wykazało najwyższe stężenie białek we frakcjach o pH poniżej 2,5. SDS-PAGE frakcji IEF ściany komórkowej ujawnił wyraźne prążki białkowe, głównie we frakcjach od 1 do 8. Separacja białek błony komórkowej przez IEF ujawniła duże szczyty stężenia białka między pH 4 a pH 10, przy czym najwyższe stężenie występuje w okolicach pH 10.SDS-PAGE frakcji IEF błony komórkowej wykazywały zróżnicowane profile białkowe z wyraźniejszymi prążkami we frakcjach od 1 do 9. Preparatywne oddzielenie SDS-PAGE białek ściany komórkowej o rozdzielczości IEF pozwoliło uzyskać frakcje głównie poniżej 100 mikrogramów na mililitr. SDS-PAGE eluowanych frakcji białkowych ściany komórkowej wykazywał szeroki zakres mas cząsteczkowych białek, z bardziej skoncentrowanymi prążkami we frakcjach od 6 do 10.Preparatywne SDS-PAGE frakcji białek błony komórkowej ujawniły, że ponad połowa frakcji miała stężenie białka między 50 a 199 mikrogramów na mililitr. SDS-PAGE eluowanych frakcji białek błony komórkowej ujawnił skoncentrowane prążki w pasach od 1 do 8 i od 13 do 16.

separation-fractionation-cell-wall-cell-membrane-proteins-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki z ograniczoną ilością żelaza. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje stopniową izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Mycobacterium tuberculosis hodowanych w warunkach ograniczających żelazo, które naśladują środowisko gospodarza. Przedstawiono w nim zastosowanie ultrafiltracji, wirowania różnicowego i separacji gradientu gęstości w celu wzbogacenia i...

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zawierających syderofory z Mycobacterium tuberculosis

Ten film demonstruje rozdzielanie kwasów mykolowych metodą chromatografii cienkowarstwowej. Technika ta oddziela różne kwasy mykolowe - długołańcuchowe lipidy obecne w ścianie komórkowej prątków - na podstawie ich polarności.

Separacja wariantów kwasu mykolowego oparta na chromatografii cienkowarstwowej: metoda rozdzielania lipidów ściany komórkowej prątków na podstawie polarności

Ten film demonstruje technikę chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) do oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu hodowlanego Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Technika ta wykorzystuje porowatą kolumnę wypełnioną żywicą w celu uzyskania oczyszczonych frakcji EV. Porowate cząsteczki selektywnie pozwalają mniejszym białkom wnikać do porów, co skutkuje wolniejszą elucją. Jednocześnie pojazdy elektryczne są wykluczone z wnikania do porów ze względu na ich większy...

Technika chromatografii wykluczającej wielkość do oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Bakteryjna ściana komórkowa składa się z peptydoglikanu, makromolekularnej sieci nici cukrowych połączonych peptydami. Ultrasprawna chromatografia cieczowa zapewnia wysoką rozdzielczość i przepustowość dla nowatorskich odkryć składu peptydoglikanu. Przedstawiamy procedurę izolacji ścian komórkowych (woreczków) i ich późniejszego przygotowania do analizy za pomocą UPLC.

Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej

Bakterie Gram-ujemne wytwarzają dwie przestrzennie oddzielone błony. Błona zewnętrzna jest oddzielona od błony wewnętrznej warstwą peryplazmy i peptydoglikanu. Zdolność do wyizolowania podwójnych warstw tych drobnoustrojów miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii i patogenezy.

Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii

Przedstawiono protokół ekstrakcji całkowitej zawartości lipidów w ścianie komórkowej szerokiej gamy prątków. Ponadto przedstawiono protokoły ekstrakcji i analizy różnych rodzajów kwasów mykolowych. Dostępny jest również protokół chromatografii cienkowarstwowej do monitorowania tych związków prątków.

Analiza składu lipidowego prątków metodą chromatografii cienkowarstwowej

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Ten protokół opisuje chromatografię wykluczania rozmiaru, łatwą i powtarzalną technikę wzbogacania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Mycobacterium tuberculosis z supernatantów hodowli.

Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości

Ten protokół szczegółowo opisuje wzbogacanie natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków (mEV) z aksonicznych kultur Mycobacterium smegmatis (Msm) oraz jak można projektować i wzbogacać rekombinowane MsmEV zawierające mCherry (czerwony fluorescencyjny reporter). Na koniec zweryfikowano nowatorskie podejście polegające na wzbogaceniu MsmEV zawierających białko EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Chociaż prokariota nie mają układu organellarnego, istnieją regiony subkomórkowe ze zlokalizowanymi białkami. Ilościowa i jakościowa analiza enzymów i białek w regionach subkomórkowych jest ważna dla opracowania celów dla leków i szczepionek. Tutaj ilustrujemy subkomórkowe frakcjonowanie białek leptospiralnych za pomocą Triton X-114 i jego analizę.

Wzbogacanie białek subkomórkowych w Leptospira przy użyciu metody frakcjonowania opartej na Triton X-114

Protokół ten opisuje hodowlę, zbiór i koncentrację wydzielanych białek Mycobacterium tuberculosis. Białka filtratu kulturowego (CFP) są oznaczane ilościowo, rozdzielane na 20 frakcji przez ogniskowanie izoelektryczne, a następnie rozdzielane na 30 frakcji za pomocą preparatywnego SDS-PAGE i systemu elektroelucji.

Rozdzielanie i frakcjonowanie białek filtratu kulturowego (CFP) z Mycobacterium tuberculosis

Poznaj metodę separacji białek ściany i błony komórkowej Mycobacterium tuberculosis za pomocą izoelektrycznego fokusowania. Uzyskane frakcje nadają się bezpośrednio do analiz proteomicznych i immunologicznych.

Separacja i frakcjonowanie białek ściany komórkowej i błony komórkowej z Mycobacterium tuberculosis do dalszej analizy białek

Przeglądaj więcej filmów