Separacja i frakcjonowanie białek ściany komórkowej i błony komórkowej z Mycobacterium tuberculosis do dalszej analizy białek

Nasze badania koncentrowały się na opracowaniu uproszczonej metody rozdzielania nierozpuszczalnych białek ściany komórkowej i błony komórkowej Mycobacterium tuberculosis na proste frakcje do bezpośrednich testów proteomicznych i immunologicznych. Postępy w technikach elektroforetycznych pozwalają obecnie na rozdzielanie złożonych białek na mniejszą liczbę frakcji białkowych, co ułatwia wydajną izolację opartą na specyfikacji masy do funkcjonalnych zastosowań proteomicznych i immunologicznych. Kluczowe wyzwania obejmują słabą rozpuszczalność białka hydrofobowego wytrącającego się powyżej stu miligramów oraz denaturację wywołaną SDS-PAGE, co utrudnia dalsze stosowanie wymagające natywnego potwierdzenia, takiego jak testy aktywności enzymatycznej.

Żaden obecny protokół nie rozdziela systematycznie nierozpuszczalnych hydrofobowych białek ściany komórkowej i błony komórkowej na zdefiniowane frakcje rozpuszczalne w wodzie w celu bezpośredniej analizy proteomicznej i immunologicznej, co jest kluczem do zrozumienia funkcji i kierowania interwencjami. Nasze przyszłe badania będą koncentrować się na rozwoju diagnostyki opartej na antygenach T oraz ocenie ich czułości, swoistości i wydajności w całej populacji gruźlicy w celu wczesnego i dokładnego wykrywania gruźlicy w celu wsparcia lepszej kontroli choroby. Na początek uzyskaj próbki ściany komórkowej, błony komórkowej i białka cytozolowego z lizatu całych komórek prątków Mycobacterium tuberculosis.

Rozpuszczaj białka ściany komórkowej i błony komórkowej w buforze izoelektrycznym. Dodaj 2% amfolity w zakresach pH od 3 do 10 i od 4 do 6 w stosunku od jednego do czterech. Teraz frakcjonuj rozpuszczone białka w ciekłym układzie ogniskowania izoelektrycznego utrzymywanym w temperaturze czterech stopni Celsjusza z chłodzącą kąpielą wodną.

Przeprowadzić separację izoelektryczną zgodnie z instrukcjami producenta, stosując stałą moc 12 watów. Zebrać poszczególne frakcje ogniskujące izoelektrycznie za pomocą pompy próżniowej. Określ wartości pH każdej frakcji.

Poddaj 50 mikrogramów oddzielonych frakcji SDS-PAGE i zwizualizuj białka za pomocą barwienia Coomassie Brilliant Blue lub srebra. Zacznij od zmieszania oddzielonych IEF frakcji ściany komórkowej i błony komórkowej z buforem próbki do elektroforezy żelowej SDS. Podgrzej mieszaninę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Oddziel frakcje białkowe w drugim wymiarze, używając żeli poliakrylamidowych o wymiarach 16 na 20 centymetrów z żelem rozdzielczym 12,5% i żelem do układania w stosy 4%. Następnie użyj pojedynczej studzienki na próbkę o długości 13 centymetrów, aby załadować próbkę do żelu. Wykonaj elektroforezę przy stałym prądzie 50 miliamperów na żel, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu.

Po elektroforezie należy równoważyć żel w buforze elucyjnym przez 10 minut. Przenieś żel do całego aparatu do usuwania żelu zgodnie z instrukcjami producenta urządzenia. Uruchom eluter przy stałym prądzie 250 miliamperów przez jedną godzinę, aby wymyć białka z żelu, a następnie użyj pompy próżniowej, aby zebrać z żelu około 30 frakcji białkowych, z których każda mierzy trzy mililitry.

Określić ilościowo stężenie białka w eluowanych frakcjach za pomocą testu białkowego kwasu bicinchoninowego. Poddaj 10 mikrogramów eluowanych frakcji białkowych analizie SDS-PAGE i uwidocznij prążki za pomocą barwienia Coomassie Brilliant Blue. W pierwszym supernatantze: ścianie komórkowej, błonie komórkowej i frakcjach cytozolowych Mycobacterium tuberculosis zaobserwowano wyraźne wzorce prążkowania białek, co potwierdza udane frakcjonowanie subkomórkowe.

Ogniskowanie izoelektryczne białek ściany komórkowej wykazało najwyższe stężenie białek we frakcjach o pH poniżej 2,5. SDS-PAGE frakcji IEF ściany komórkowej ujawnił wyraźne prążki białkowe, głównie we frakcjach od 1 do 8. Separacja białek błony komórkowej przez IEF ujawniła duże szczyty stężenia białka między pH 4 a pH 10, przy czym najwyższe stężenie występuje w okolicach pH 10.

SDS-PAGE frakcji IEF błony komórkowej wykazywały zróżnicowane profile białkowe z wyraźniejszymi prążkami we frakcjach od 1 do 9. Preparatywne oddzielenie SDS-PAGE białek ściany komórkowej o rozdzielczości IEF pozwoliło uzyskać frakcje głównie poniżej 100 mikrogramów na mililitr. SDS-PAGE eluowanych frakcji białkowych ściany komórkowej wykazywał szeroki zakres mas cząsteczkowych białek, z bardziej skoncentrowanymi prążkami we frakcjach od 6 do 10.

Preparatywne SDS-PAGE frakcji białek błony komórkowej ujawniły, że ponad połowa frakcji miała stężenie białka między 50 a 199 mikrogramów na mililitr. SDS-PAGE eluowanych frakcji białek błony komórkowej ujawnił skoncentrowane prążki w pasach od 1 do 8 i od 13 do 16.