In Situ Izolacja i hodowla opornych bakterii glebowych za pomocą chipa izolacyjnego (iChip)

Bogate repozytoria drobnoustrojów istnieją w różnych środowiskach naturalnych, takich jak gleba, zbiorniki wodne i środowiska ekstremalne. Jednak wykorzystanie tej ogromnej różnorodności biologicznej jest w dużej mierze ograniczone przez metody laboratoryjne i media. Pokonanie tej bariery kulturowej i wykorzystanie tej różnorodności biologicznej ma potencjał, aby zaspokoić różne potrzeby biotechnologiczne, a także rozwiązać globalne wyzwania.

Na przykład rozwój oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe stał się elementem globalnego zdrowia publicznego. Bakterie glebowe, które są trudne do wyhodowania w laboratorium, mogą wytwarzać nowe związki bioaktywne o silnym działaniu przeciwdrobnoustrojowym, które mogą być cenne w rozwiązywaniu globalnych problemów związanych z systemami przeciwdrobnoustrojowymi. Ogromna różnorodność mikroorganizmów środowiskowych i ich produktów nie została zbadana, ponieważ tradycyjne technologie oparte na kulturach laboratoryjnych często prowadzą do izolacji podobnych znanych mikroorganizmów. Celem tego eksperymentu jest zademonstrowanie wysokoprzepustowej hodowli opornych bakterii glebowych in situ przy użyciu technologii IChip. W tym protokole zademonstrujemy konstrukcję i zastosowanie tej technologii IChip, która może być wykorzystywana do wysokowydajnej hodowli in-situ trudnych do wyhodowania bakterii i odzyskiwania bakterii wytwarzających środki przeciwdrobnoustrojowe w ramach zastosowania tej technologii.

[Prezenter] Aby rozpocząć, utwórz wstępny projekt górnej, dolnej i środkowej płyty chipa izolacyjnego w oprogramowaniu do prezentacji. Użyj opcji wstaw kształt w oprogramowaniu do prezentacji, aby wstawić okręgi o niezbędnych wymiarach, które będą służyć jako IChip. Wstaw mniejsze okręgi w środku, aby reprezentować kanały IChip. Ułóż mniejsze kółka w żądany wzór, aby przygotować wstępny projekt górnej, dolnej i środkowej płyty IChip. Wybierz projekt i użyj menu prawego przycisku myszy, aby zapisać wstępny projekt jako obraz. Korzystając ze wstępnego projektu jako szablonu, rozpocznij tworzenie dwuwymiarowego projektu za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo. Z menu szkicu wstaw predefiniowane kształty, głównie okręgi, aby utworzyć podstawowy projekt płyt IChip i obszaru kanałów. Użyj opcji wymiarowania, aby ustawić rzeczywiste wymiary blach i ceowników. Kliknij OK, aby sfinalizować projekt, a następnie użyj funkcji wyciągnięcia, aby przekonwertować projekt 2D na model 3D o żądanej grubości. Na koniec użyj menu pliku, aby zapisać kopię modelu 3D w formacie pliku litografii zgodnego z drukiem 3D.

[Prezenter] Zbierz wszystkie niezbędne przedmioty, które będą potrzebne do pobrania próbki gleby i dotrzyj do miejsca, z którego próbka ma zostać pobrana. Otwórz aplikację mobilną geokodowania i znajdź unikalny trzywyrazowy adres miejsca pobierania próbek i zapisz go. Następnie zapisz odpowiednie metadane próbki, takie jak temperatura, data, godzina, głębokość pobierania próbek, pogoda i narażenie miejsca na działanie żywiołów. Spryskaj łopatę i styropianowe pudełko, w którym ma być posadzony IChip, 70% etanolem. Wytrzyj je do czysta bibułką i pozostaw etanol do całkowitego wyschnięcia na powietrzu. Następnie użyj odkażonej łopaty, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia powierzchniowe, takie jak ściółka z liści lub kamienie, aby odsłonić wierzchnią warstwę gleby. Ponownie odkaż łopatę, tak jak poprzednio. Za pomocą łopaty uzyskaj dostęp do gleby na głębokości od trzech do sześciu spożyć pod powierzchnią i przenieś około czterech do pięciu kg gleby z jednolitej głębokości do styropianu. Pudełko powinno być wypełnione w około 75%. Pobraną glebę należy natychmiast przetransportować z powrotem do laboratorium. Z pobranej próbki gleby odważ jeden gram gleby wolnej od gruzu, skał i ściółki z liści do sterylnej probówki wirówkowej o grubości 50 mil zawierającej 10 ml sterylnego soli fizjologicznej. Wymieszaj glebę z solą fizjologiczną, wirując przez około 10 sekund, aby uzyskać zawiesinę glebową. Pozostaw probówkę wirówkową w spokoju przez pięć minut, aby duże cząstki gleby w probówce mogły się uspokoić. Następnie ostrożnie przenieść zawiesinę glebową sklarowanej nad osadem do świeżej probówki oznaczonej jako S. Używając zawiesiny glebowej jako nierozcieńczonej próbki, wykonaj rozcieńczenie zerowe, przenosząc jeden ml próbki do dziewięciu ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej w świeżej probówce. Przygotuj rozcieńczenie od 10 do mocy minus jeden do 10 to do mocy minus pięć. Wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego powierzchnię odkaż górną płytę, dolną i środkową płytę IChip poprzez moczenie w 70% etanolu przez 10 minut. Spłucz nadmiar etanolu, myjąc elementy IChip sterylną wodą dejonizowaną i pozwól im wyschnąć na sterylnej szalce Petriego. Umieść środkową płytkę IChip na sterylnej szalce Petriego, gotową do wysiewu. Rozpuść podłoże agarowe SMS w kuchence mikrofalowej. Pozostaw do ostygnięcia, a następnie przenieś 22,5 ml agaru SMS w temperaturze 45 stopni do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Do tego dodać 2,5 ml odpowiedniej próbki gleby i dobrze wymieszać przez delikatną inwersję, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza. Powoli wlej około trzech do czterech ml pożywki agarowej SMS z nasionami na środkową płytkę IChip, pokrywając całą powierzchnię. Następnie pozwól pożywce agarowej SMS zastygnąć przez około pięć do 10 minut. Sprawdź, czy podłoże agarowe SMS jest ustawione. Następnie za pomocą sterylnej żyletki zeskrob nadmiar agaru SMS z powierzchni metalowej płytki IChip, pozostawiając zatyczki agarowe w poszczególnych komorach dyfuzyjnych. Po wyjęciu arkusza ochronnego z jednego z filtrów z membraną poliwęglanową o grubości 0,03 mikrometra, umieść go ostrożnie po wewnętrznej stronie górnego ostrza IChip za pomocą sterylnych kleszczyków. Następnie umieść kolejny filtr z membraną poliwęglanową o grubości 0,03 mikrometra po odsłoniętej stronie metalowej płytki z nasionami za pomocą sterylnych kleszczy. Umieść górną i dolną płytę IChip, umieszczając środkową płytę i membrany poliwęglanowe, uważając, aby wyrównać te otwory na we wszystkich płytach, aby zakończyć montaż IChip. Mocno dokręć nakrętki i, aby zabezpieczyć zespół IChip. Za pomocą sterylnej łopaty stwórz wgłębienie większe niż rozmiar IChip w kolektorze gleby w pudełku styropianowym. Posadź zespół IChip pionowo w zagłębieniu i mocno ubij ziemią, upewniając się, że wszystkie powierzchnie IChip są całkowicie pokryte. Następnie pozostaw na in-situ w hodowli przez pożądany czas od dwóch do czterech tygodni. Podczas inkubacji należy okresowo używać sterylnej wody destylowanej do nawilżania otoczenia gleby, posadzonego IChip, aby zapobiec wysychaniu zatorów agarowych SMS z nasionami w komorze dyfuzyjnej. Po pożądanej inkubacji delikatnie usuń glebę wokół posadzonego IChip, aby ją odzyskać. Następnie umyj IChip sterylną solą fizjologiczną, aby usunąć przylegające cząstki gleby i przenieś go do komory bezpieczeństwa biologicznego w celu dalszego przetwarzania. Odkręć nakrętki i z zespołu IChip i ostrożnie zdemontuj IChip. Za pomocą sterylnego kleszcza usuń membrany poliwęglanowe i przenieś środkową płytkę IChip na przygotowaną szalkę Petriego. Użyj sterylnego drewnianego aplikatora, aby odzyskać poszczególne korki agarowe w każdej komorze dyfuzyjnej. Zaszczep zatyczki agarowe w odpowiednich podłożach, takich jak agar SMS lub agar 0,1X Tryptic Soy Bulth Agar, aby spróbować uprawy laboratoryjnej. Hodowane izolaty mogą być następnie badane pod kątem produkcji przeciwdrobnoustrojowej za pomocą rutynowych metod, takich jak nakładanie agaru przy użyciu szczepów testowych. Tutaj pokazujemy reprezentatywne wyniki badań przesiewowych dla 12 kultur, IC-1 do 12 uzyskanych z zatyczek agarowych IChip przeciwko Staphylococcus aureus ATCC 29213 i Acinetobacter baumannii B8342. Należy zauważyć, że kultury IC-6 i IC-8 wykazują aktywność odpowiednio przeciwko szczepom testowym Gram-dodatnim i Gram-ujemnym. Alternatywnie, wybarwić i zobrazować odzyskane korki agarowe zawierające oporne bakterie glebowe hodowane in situ, aby potwierdzić wzrost mikrokolonii w warunkach in-situ. Dzięki takiemu podejściu możliwe jest odzyskanie opornych bakterii glebowych na miejscu w sposób wysokoprzepustowy. Wydrukowany w 3D IChip może pomieścić 156 zatyczek agarowych. Konieczne jest jednak wybranie odpowiedniego rozcieńczenia podczas wysiewu, aby zapewnić wysiew jednej komórki bakteryjnej do każdego kanału IChip. Wymagane bakterie można następnie przebadać pod kątem pożądanej aktywności biologicznej, takiej jak produkcja metabolitów, produkcja enzymów, produkcja biopolimerów i tak dalej, jeśli można je hodować w warunkach laboratoryjnych. Jednak jest również prawdopodobne, że niektóre bakterie mogą nie rosnąć w warunkach laboratoryjnych i w takich przypadkach możemy być zmuszeni do przyjęcia podejść metagenomicznych, aby zdać sobie sprawę z obecności drobnoustrojów i uzyskać dostęp do ich potencjału biosyntetycznego. Opisana metoda jest bardzo prosta i może być z łatwością stosowana do bioprospekcji drobnoustrojów w różnych warunkach środowiskowych z niewielkimi modyfikacjami.