Name: Seryjna tomografia dwufotonowa całego mózgu marmozety do analiz neuroanatomicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 2 s
Description: Poznaj seryjną tomografię dwufotonową do wysokorozdzielczej obrazowania całego mózgu marmozety. Ta metoda umożliwia precyzyjną rekonstrukcję 3D połączeń neuronowych i analizę organizacji strukturalnej mózgu naczelnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy personelowi technicznemu w laboratorium i obiektach dla zwierząt Yamamori (RRD) za pomoc. Dziękujemy Centrum Współpracy RIKEN CBS-Olympus za pomoc techniczną w zakresie akwizycji obrazu konfokalnego. Praca ta była wspierana przez program badań naukowych w obszarach innowacyjnych (grant numer 22123009) z MEXT w Japonii, przez Brain/MINDS i Brain/MINDS2.0 z AMED w Japonii (JP15dm0207001, JP23wm0625001 i JP24wm0625218) oraz przez grant JSPS KAKENHI o numerze 24K09678 dla A.W.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Publikacje NIH nr 80-23) poprawionym w 1996 roku oraz "Wytycznymi Zasad Opieki i Użytkowania Zwierząt w Dziedzinie Nauk Fizjologicznych" Japońskiego Towarzystwa Fizjologicznego i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Zwierząt Doświadczalnych RIKEN (W2020-2-009(2)).
1. Wstrzyknięcie znacznika
<ol>
	<li>Wykonaj wstrzyknięcia fluorescencyjnych i niefluorescencyjnych znaczników do mózgu marmozety zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami14.
	<ol>
		<li>W odniesieniu do połączenia z metodą STPT, należy upewnić się, że fluorescencja znaczników jest wystarczająco silna, aby można ją było wykryć bez wzmacniania. Zastosuj dwuwektorowy system TET-Off10 w celu zwiększenia wyrażenia. 
		UWAGA: Znaczniki niefluorescencyjne mogą być również wstrzykiwane i wykrywane po zakończeniu STPT przy użyciu wytworzonych plasterków. Przykłady znaczników niefluorescencyjnych obejmują biotynylowaną aminę dekstranu (BDA), AAV z ekspresją cre w retro AAV2 do wstecznego wykrywania jąder komórek wejściowych10, a także AAV oparte na GFP ze znacznikiem smFP (patrz poniżej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwal perfuzję i uzyskaj mózg marmozety po 4 tygodniach.
	<ol>
		<li>Aby znieczulić marmozetę, należy podać medetomidynę (0,04 mg/kg), midazolam (0,4 mg/kg) i butorfanol (0,4 mg/kg), zwany MMB, domięśniowo, a następnie dootrzewnowe wstrzyknięcie tiopentalu sodu (100 mg/kg).</li>
		<li>Po potwierdzeniu, że odruch bólowy został utracony, rozetnij jamę klatki piersiowej, aby odsłonić serce i przeciąć prawe przedsionek, aby umożliwić wydostanie się krwi i utrwalacza.</li>
		<li>Następnie przeciąć lewą komorę, aby wprowadzić igłę perfuzyjną do pierwszego przepłukania krwi roztworem prefiksowym (250 mM sacharozy, 5 mM MgCl2 w 0,02 M buforze fosforanowym [PB, pH 7,4]) przez kilka minut (~ 50-100 ml), a następnie utrwalanie 4% paraformaldehydem / 0,1 M buforem fosforanowym (PB; 2-3 razy więcej niż waga zwierzęcia w ciągu ~20 min).</li>
		<li>Dobra perfuzja ma kluczowe znaczenie dla dobrego wyniku. Podczas wprowadzania igły perfuzyjnej należy przesunąć ją wzdłuż przegrody w kierunku aorty, aby zapewnić dobry przepływ utrwalacza. Końcówka igły staje się widoczna, gdy dotrze do aorty. Cofnij się, aż końcówka będzie ledwo widoczna, aby nie ominęła tętnicy szyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymuj mózg w 4% paraformaldehydzie/0,1 M PB przez 48 godzin w temperaturze 4 °C i przenieś do 50 mM PB. Jeśli nie zostanie natychmiast użyty, przechowuj mózg w 0,75% glicyny/0,1 M PB, aby zapobiec autofluorescencji z powodu nadmiernej fiksacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Inkubować utrwalony mózg z kolagenazą (1 mg / ml w 3 mM CaCl2 w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej tris [TBS]) w temperaturze 37 °C przez 1 h. 
	UWAGA: Przed inkubacją rozgrzej mózg w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie przetrzyj powierzchnię mózgu bawełnianym wacikiem, aby odkleić materię pia i inne opony mózgowe (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A, dodatkowe wideo). Użyj cienkich kleszczyków, aby obrać oderwane opony mózgowe. 
	UWAGA: Ważne jest, aby usunąć opony mózgowe otaczające śródmózgowie, w tym wzgórek górny lub te w górnej części wzgórza. Trudno jest wyeksponować te konstrukcje, które są ukryte głęboko w środku. Jednak usuń opony mózgowe tak bardzo, jak to możliwe. W przeciwnym razie często pozostają niepocięte, unoszą się w górę i przeszkadzają w obrazowaniu i krojeniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Zachowaj szczególną ostrożność, gdy mózg jest poddawany rezonansowi magnetycznemu ex vivo przed osadzaniem, podczas którego mózg jest zanurzany w roztworze fluoru15. Resztki fluoru, jeśli zostaną osadzone razem, mogą tworzyć maleńkie pęcherzyki powietrza pod obiektywem podczas obrazowania. Aby tego uniknąć, utrzymuj mózg w PB przez 1 tydzień przed osadzeniem. 
	UWAGA: Ten etap oczekiwania zwykle nie jest konieczny, ale ma kluczowe znaczenie w połączeniu z rezonansem magnetycznym ex vivo.</li>
	<li>Przygotować bufor NaBH4, rozpuszczając 0,2 g NaBH4 w 100 ml 50 mM buforu boranowego (pH 9,2) ogrzanego do 40°C. Pozostawić nakrętkę luźną, aby wypuścić gaz CO2 . Roztwór należy przechowywać przez noc z poluzowaną nakrętką. Zawiń butelkę w folię aluminiową, aby chronić ją przed światłem do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotować utlenioną agarozę, mieszając 2,25 g agarozy i 0,21 g NaIO4 w 100 ml PB przez 2-3 godziny. Przefiltrować roztwór przez odsysanie próżniowe i przemyć go trzema zmianami PB. Zawiesić agarozę w 50 ml PB.</li>
	<li>Całkowicie rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej i ostudź do 60-65 °C.</li>
	<li>Umieść mózg w specjalnie przygotowanej komorze i osadź mózg w agarozie. Uważaj, aby wprowadzić agarozę do jamy poniżej ciała modzelowatego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
	UWAGA: Najpierw ogrzej mózg w temperaturze pokojowej, a następnie w 65 °C przez 5 minut, aby agaroza mogła osiąść na powierzchni mózgu bez krzepnięcia.</li>
	<li>Zdemontować komorę i zanurzyć blok agarozy w buforze NaBH4 na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Kilkakrotnie w ciągu 1-2 tygodni w temperaturze 4 °C należy kilkakrotnie zmienić bufor na PB w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Autofluorescencja tkanek staje się bardzo słaba, jeśli wymiana buforu jest niepełna.</li>
	<li>Stwórz szklaną scenę przesuwną, mocując cztery magnesy neodymowe z natychmiastową mieszanką epoksydową.</li>
	<li>Zamontuj blok agarozy na stoliku za pomocą mocnego kleju (np. super kleju) (Rysunek 1C).</li>
</ol>
3. Przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Cały system obrazowania tkanek należy obsługiwać zgodnie z instrukcjami producenta. Opublikowano również szczegółowy protokół16. Obecna procedura jest stosowana głównie w przypadku TissueCyte1000, ale może być stosowana do innych modeli, takich jak TissueCyte 1600FC.</li>
	<li>Operacja różni się nieco w zależności od modelu, ale postępuj zgodnie z poniższymi punktami, które są zwykle ważne.
	<ol>
		<li>Cały mózg marmozety może być przetwarzany koronalnie od przedniego do tylnego końca bez żadnych zmian w sprzęcie. Upewnij się, że limity ruchu etapu nie zostały przekroczone podczas umieszczania mózgu.</li>
		<li>Dostosuj kąt ostrzy, aby upewnić się, że głębokość powierzchni na obu końcach ostrza mieści się w granicach 10 μm. Ze względu na gęstą mielinizację, nawet różnica głębokości 10 μm może prowadzić do różnych penetracji laserowych przez dorosłą istotę białą marmozety. Z tego samego powodu ustaw płaszczyznę obrazowania na około 25-35 μm od powierzchni.</li>
		<li>Użyj ostrza ceramicznego (zalecane), aby przeciąć cały mózg w odstępach 50 μm (~ponad 650 plastrów).</li>
		<li>Opony mózgowe pozostają nieobcięte i przeszkadzają w krojeniu, jeśli nie zostaną odpowiednio usunięte (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Niektóre opony mózgowe (np. te otaczające hipokamp lub pulvinar) są trudne do usunięcia. Ręcznie usuń te opony za pomocą cienkich kleszczy, gdy zostanie zauważony.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomocnicze techniki histologiczne
<ol>
	<li>Wyszukiwanie sekcji
	<ol>
		<li>Odzyskaj wycinki tkanki, aby wykonać różne barwienia histologiczne. Dokładnie wyrównaj te sekcje w kolejności krojenia. Prześledź naczynia krwionośne w warstwach kory mózgowej w celu wyrównania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odetnij nadmiar agarozy z każdej sekcji, aby zapewnić lepszą obsługę. 
	UWAGA: Ten proces nie musi być nadmierny. Agaroza służy do utrzymywania segmentów tkanek na miejscu bez zakłócania przetwarzania histologicznego.</li>
	<li>Obrazowanie pod światło
	<ol>
		<li>Zamontuj sekcje na szklanej szkle i wysusz.</li>
		<li>Ponownie nawodnij wycinek za pomocą PBS i umieść szkiełko nakrywkowe do obrazowania.</li>
		<li>Obserwuj wzór mielinizacji bez barwienia, gdy przekrój jest obrazowany przez mikroskop fluorescencyjny (<silna klasa="xfig">Rysunek 4) w trybie jasnego pola. Dostosuj czas naświetlania tak, aby odbicie światła było widoczne. 
		UWAGA: Można użyć dowolnego mikroskopu, jeśli można w nim korzystać z oświetlenia ciemnego pola.</li>
		<li>Usuń szkiełko nakrywkowe i przystąp do barwienia Nissl lub innego barwienia. Wystarczy każda standardowa procedura barwienia.</li>
		<li>Użyj tej metody, aby bezpośrednio porównać różne wzorce barwienia ze wzorcami mielinizacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie BDA
	<ol>
		<li>Szczegółowa procedura znajduje się w tabeli 1.</li>
		<li>Najpierw potraktuj skrawki roztworem Denta (20% DMSO, 80% metanolu). Metanol zawarty w roztworze Denta radykalnie wzmacnia sygnały BDA w aksonach.</li>
		<li>Użyj metody wzmocnienia sygnału tyramidu (TSA), aby wzmocnić sygnał BDA, który ma być wykrywany fluorescencyjnie17. 
		UWAGA: Roztwór TSA-biotyny można kupić u sprzedawcy, ale odczynnik In-House jest znacznie tańszy i skuteczniejszy.</li>
		<li>Aby zarejestrować się na obrazie STPT, należy wykonać zdjęcie podświetlone po zamontowaniu sekcji do szkła przesuwnego za pomocą nośnika montażowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie białkiem fluorescencyjnym Spaghetti Monster (smFP) 
	UWAGA: Białka fluorescencyjne "spaghetti monster" (smFPs) to rodzina niefluorescencyjnych wariantów GFP z wieloma znacznikami epitopów18. Zapewniają doskonałe sygnały fluorescencyjne po wykryciu przez immuno i nadają się jako znaczniki towarzyszące znacznikom fluorescencyjnym. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z konstruktami AAV dostępnymi w firmie Addgene.
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie ze szczegółową procedurą przedstawioną w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przetwarzanie danych po obrazowaniu
<ol>
	<li>Test integralności danych 
	UWAGA: STPT generuje ogromną liczbę plików graficznych. Kiedy mózg dorosłego marmozety jest podzielony na sekcje koronalne w odstępach 50 μm, zwykle potrzeba ponad 650 sekcji, aby pokryć cały mózg. Dane każdej sekcji składają się z serii kafelkujących obrazów przechwyconych w trzech kanałach. Te pliki obrazów są przechowywane w jednym folderze wraz z plikiem metadanych, który rejestruje położenie każdego kafelka. Aby zminimalizować całkowitą ilość danych i czas przetwarzania, obrazowanie przeprowadza się w blokach przebiegów, podczas których liczba kroków X i Y dla kafelkowania stopniowo się zmienia. Zazwyczaj 20-30 bloków przebiegów, z których każdy składa się z obrazowania 30-50 sekcji, stanowi kompletny zestaw danych dla pojedynczego mózgu. Aby wykorzystać te dane, wymaganych jest kilka etapów przetwarzania obrazu, w tym między innymi zszywanie obrazów kafelkowych, segmentacja sygnałów fluorescencyjnych i rejestracja danych wolumetrycznych do standardowego szablonu.
	<ol>
		<li>Etapy przetwarzania obrazu można wykonywać indywidualnie przy użyciu różnych narzędzi programowych lub za pośrednictwem dedykowanych potoków dostosowanych do konkretnych potrzeb badaczy. Szczegóły dotyczące przetwarzania obrazu wykraczają poza zakres tego artykułu i można je znaleźć w innych publikacjach11,19.</li>
		<li>Niezależnie od zastosowanej procedury upewnij się, że dane są spójnie zorganizowane. 
		UWAGA: Ponieważ cały proces obrazowania obejmuje wiele bloków przebiegów i obejmuje kilka dni, nierzadko zdarza się, że przebieg jest anulowany w połowie i ponownie rozpoczęty. W takich przypadkach struktura danych może zostać zakłócona, co utrudni prawidłowe wykonanie potoku przetwarzania obrazu.</li>
		<li>Aby zminimalizować ryzyko zakłócenia struktury danych, uruchom skrypt języka Python w celu sprawdzenia integralności struktury danych (kn_pipeline_check_mosaic.py) dostępnej w usłudze GitHub (github.com/watkarbey/STPT_depo).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestracja zabarwionego obrazu do STPT image 
	UWAGA: Nieliniową transformację zabarwionego obrazu na obraz STPT można wykonać za pomocą wtyczki bUnwarpJ ImageJ.
	<ol>
		<li>Dostosuj rozmiar obrazów obrazu docelowego (STPT) i obrazu źródłowego (poplamionego) tak, aby były w przybliżeniu równe.</li>
		<li>Podziel każdy obraz na binaryzację, aby zwizualizować kształty sekcji.</li>
		<li>Uruchom bUnwarpJ. Pamiętaj, aby zaznaczyć opcję Zapisz transformacje.</li>
		<li>Uruchom ponownie bUnwarpJ. Wybierz oryginalny obraz przed binaryzacją jako obraz źródłowy. Następnie kliknij Załaduj transformację elastyczną i wybierz zapisaną transformację.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Volumetric Imaging and Axonal Projection Mapping in the Marmoset Brain

<ol><li>Oh, S. W., Harris, J. A., Ng, L., Winslow, B., Cain, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat Methods. 9 (3), 255-258 (2012).</li>
<li>Liang, Z., Arefin, T. M., Lee, C. H., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mesoscopic+tract-tracing+data+to+guide+the+estimation+of+fiber+orientation+distributions+in+the+mouse+brain+from+diffusion+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Using mesoscopic tract-tracing data to guide the estimation of fiber orientation distributions in the mouse brain from diffusion MRI.</a> Neuroimage. 270, 119999(2023).</li>
<li>Watakabe, A., Hirokawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+networks+of+the+mouse+brain+elaborate+within+the+gray+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Cortical networks of the mouse brain elaborate within the gray matter.</a> Brain Struct Funct. 223 (8), 3633-3652 (2018).</li>
<li>Ypma, R. J. F., Bullmore, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+of+tract-tracing+experiments+demonstrates+a+dense%2C+complex+cortical+network+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis of tract-tracing experiments demonstrates a dense, complex cortical network in the mouse.</a> PLoS Comput Biol. 12 (9), e1005104(2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Allen+mouse+brain+common+coordinate+framework%3A+A+3D+reference+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas.</a> Cell. 181 (4), 936-953.e20 (2020).</li>
<li>Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in neuroanatomical tracing.</a> Prog Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroanatomical+tract-tracing+techniques+that+did+go+viral%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Neuroanatomical tract-tracing techniques that did go viral.</a> Brain Struct Funct. 225 (4), 1193-1224 (2020).</li>
<li>Bakker, R., Wachtler, T., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoCoMac+2.0+and+the+future+of+tract-tracing+databases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">CoCoMac 2.0 and the future of tract-tracing databases.</a> Front Neuroinform. 6, (2012).</li>
<li>Watakabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+long-distance+organization+of+prefrontal+cortex+circuits+in+the+marmoset+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local and long-distance organization of prefrontal cortex circuits in the marmoset brain.</a> Neuron. 111 (14), 2258-2273.e10 (2023).</li>
<li>Skibbe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Brain%2FMINDS+marmoset+connectivity+resource%3A+An+open-access+platform+for+cellular-level+tracing+and+tractography+in+the+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The Brain/MINDS marmoset connectivity resource: An open-access platform for cellular-level tracing and tractography in the primate brain.</a> PLoS Biol. 21 (6), e3002158(2023).</li>
<li>Mitchell, J. F., Leopold, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marmoset+monkey+as+a+model+for+visual+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">The marmoset monkey as a model for visual neuroscience.</a> Neurosci Res. 93, 20-46 (2015).</li>
<li>Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+and+perspectives+on+the+application+of+marmosets+in+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Current status of and perspectives on the application of marmosets in neurobiology.</a> Annu Rev Neurosci. 44, 27-48 (2021).</li>
<li>Watakabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analyses+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+8+and+9+in+marmoset%2C+mouse+and+macaque+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex.</a> Neurosci Res. 93, 144-157 (2015).</li>
<li>Hata, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-modal+brain+magnetic+resonance+imaging+database+covering+marmosets+with+a+wide+age+range%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Multi-modal brain magnetic resonance imaging database covering marmosets with a wide age range.</a> Sci Data. 10, 221(2023).</li>
<li>Liwang, J. K., Bennett, H. C., Pi, H. -J., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+using+serial+two-photon+tomography+to+map+cell+types+and+cerebrovasculature+at+single-cell+resolution+in+the+whole+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for using serial two-photon tomography to map cell types and cerebrovasculature at single-cell resolution in the whole adult mouse brain.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102048(2023).</li>
<li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre%2Flox+system%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100230(2021).</li>
<li>Viswanathan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+probes+for+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance probes for light and electron microscopy.</a> Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).</li>
<li>Kuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinformatics+of+the+Allen+mouse+brain+connectivity+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Neuroinformatics of the Allen mouse brain connectivity atlas.</a> Methods. 73, 4-17 (2015).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C., Petrides, M., Rosa, M., Tokuno, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Marmoset+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Marmoset Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. London, Waltham, MA. (2012).</li>
<li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+brain+section+images+for+creating+axonal+projection+maps+in+marmosets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets.</a> J Neurosci Methods. 286, 102-113 (2017).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluoRender%3A+Joint+freehand+segmentation+and+visualization+for+many-channel+fluorescence+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FluoRender: Joint freehand segmentation and visualization for many-channel fluorescence data analysis.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 280(2017).</li>
<li>Majka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+comprehensive+atlas+of+cortical+connections+in+a+primate+brain%3A+Mapping+tracer+injection+studies+of+the+common+marmoset+into+a+reference+digital+template%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Towards a comprehensive atlas of cortical connections in a primate brain: Mapping tracer injection studies of the common marmoset into a reference digital template.</a> J Comp Neurol. 524 (11), 2161-2181 (2016).</li>
<li>Liu, C., Yen, C. C. -C., Szczupak, D., Tian, X., Glen, D., Silva, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marmoset+brain+mapping+V3%3A+Population+multi-modal+standard+volumetric+and+surface-based+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Marmoset brain mapping V3: Population multi-modal standard volumetric and surface-based templates.</a> Neuroimage. 226, 117620(2021).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+3D+atlas+of+the+marmoset+brain+based+on+multi-modal+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">A digital 3D atlas of the marmoset brain based on multi-modal MRI.</a> Neuroimage. 169, 106-116 (2018).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+for+the+detailed+3D+mapping+of+white+matter+pathways+in+the+marmoset+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A resource for the detailed 3D mapping of white matter pathways in the marmoset brain.</a> Nat Neurosci. 23 (2), 271-280 (2020).</li>
<li>Woodward, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Brain%2FMINDS+3D+digital+marmoset+brain+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">The Brain/MINDS 3D digital marmoset brain atlas.</a> Sci Data. 5, 180009(2018).</li>
<li>Saleem, K. S., Avram, A. V., Glen, D., Schram, V., Basser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcortical+atlas+of+the+marmoset+%28%26%2334%3BSAM%26%2334%3B%29+monkey+based+on+high-resolution+MRI+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">The subcortical atlas of the marmoset (&#34;SAM&#34;) monkey based on high-resolution MRI and histology.</a> Cereb Cortex. 34 (4), bhae120(2024).</li>
<li>Watakabe, A., Hirokawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+networks+of+the+mouse+brain+elaborate+within+the+gray+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Cortical networks of the mouse brain elaborate within the gray matter.</a> Brain Struct Funct. 223 (8), 3633-3652 (2018).</li>
<li>Lin, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+neurohistological+pipeline+for+brain-wide+mesoscale+connectivity+mapping+of+the+common+marmoset%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A high-throughput neurohistological pipeline for brain-wide mesoscale connectivity mapping of the common marmoset.</a> eLife. 8, e40042(2019).</li>
<li>Skibbe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAT-probabilistic+axon+tracking+for+densely+labeled+neurons+in+large+3-D+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Med+Imaging%22%5BJournal%5D)">PAT-probabilistic axon tracking for densely labeled neurons in large 3-D micrographs.</a> IEEE Trans Med Imaging. 38 (1), 69-78 (2019).</li>
<li>Economo, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+brain-wide+imaging+and+reconstruction+of+individual+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A platform for brain-wide imaging and reconstruction of individual neurons.</a> eLife. 5, e10566(2016).</li>
<li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+1%2C000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281.e13 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule wyjaśniono praktyczne rozwiązania w zakresie przetwarzania mózgów marmozet w całym mózgu, a także pomocnicze techniki histologiczne, które zwiększają użyteczność techniki STPT. Mocną stroną "neuroanatomii całego mózgu" za pomocą STPT jest to, że można uzyskać współrzędne 3D dowolnego obszaru zainteresowania, niezależnie od tego, czy jest on anatomicznie opisany, czy nie. Dzięki precyzyjnej rejestracji 3D do 3D możliwe jest przekształcenie tych współrzędnych w standardowy szablon do nakładania wielu zestawów danych. W ten sposób standardowy szablon służy jako medium do integracji danych. Był to istotny aspekt naszego projektu mapowania kory przedczołowej (PFC)10, w ramach którego analizowano dane uzyskane od wielu osób. Ponadto informacje odwzorowane do standardowego szablonu można porównać z różnymi danymi, które zostały już zmapowane, niezależnie od tego, czy są to Nissl, wzorce mielinowe, dane znacznikowe, dane MRI (w tym dyfuzyjne MRI) czy adnotacje anatomiczne11. Co ważne, można je również porównać z przyszłymi danymi, które zostaną pozyskane przez technologię, która jeszcze się nie pojawiła. Obecnie istnieje wiele szablonów dla mózgu marmozety, które są oparte na barwieniu Nissl23, MRI 23,24,25,26,27,28 i STPT 11. Ale mogą być przekształcane do swoich współrzędnych na podstawie kontrastów obrazu i wstępnie obliczonych parametrów11. Integracja danych w całej skali mózgu we wszystkich badaniach przyczynia się do lepszego zrozumienia mózgu jako systemu. Warunkiem wstępnym działania tej strategii jest niezawodne gromadzenie danych w mózgu. Poniżej omówiono krytyczne kroki i potencjalne problemy związane z obecnym protokołem.
Jednym z najbardziej wrażliwych procesów obrazowania STPT jest krojenie tkanek. Jak wspomniano powyżej, opony mózgowe często pozostają nieobcięte i mogą przeszkadzać w krojeniu. W szczególności jądro płucne i wzgórek górny to dwa najbardziej dotknięte obszary mózgu: w zależności od dokładności usuwania opon mózgowych i osadzania w agarozie, mogą one zostać usunięte z bloku tkankowego podczas krojenia. Te głębokie obszary są trudne do zdobycia z zewnątrz i mogą łatwo pęknąć podczas usuwania opon mózgowych. Staranne, ale dokładne usunięcie opon mózgowych ma kluczowe znaczenie dla udanego obrazowania. Innym problemem jest odwrócenie pokrojonych odcinków na blok tkanki, co czasami występuje, gdy sekcje pozostają połączone nawet po pokrojeniu. Można go zminimalizować poprzez ukształtowanie bloku tak, aby ostrze na samym końcu cięło ukośnie.
Dzięki obrazowaniu w głąb bloku tkankowego, STPT pozwala uniknąć nierówności jego powierzchni. Podczas gdy sygnały fluorescencyjne mogą dość łatwo przechodzić przez obszar korowy, są one znacznie zmniejszone w obszarach mielinizowanych. W związku z tym głębokość obrazowania musi być dokładnie określona, aby zrównoważyć spójne obrazowanie na całej powierzchni bloku a jasnością sygnałów w obszarze bogatym w mielinę, takim jak istota biała. W zastosowanym tutaj ustawieniu zwykle celujemy w 25-35 μm od powierzchni. Należy również zwrócić uwagę, że powierzchnia cięcia może ulec nierównomiernemu skurczeniu po długich godzinach przechowywania. Aby zminimalizować obszar obrazowania, podzieliliśmy sesję obrazowania na 20-30 przebiegów z różnymi ustawieniami etapu przez 5-6 dni. Albo robimy odstęp między biegami krótszy niż 2 godziny, albo potwierdzamy głębokość nawierzchni i dostosowujemy wysokość etapu przed każdym biegiem.
W tym protokole sygnał BDA został wzmocniony metodą TSA. Metoda ta jest bardzo skuteczna i może wykrywać sygnały BDA transportowane w kierunku następczym nawet w stosunkowo niskiej rozdzielczości (np. Rysunek 6B). Biotyna TSA jest dostępna na rynku w Akoya Biosciences, ale domowe rozwiązanie wykazuje znacznie lepsze ulepszenie. Z drugiej strony rozcieńczenie przeciwciała i roztworu wymaga starannego dostosowania w celu uzyskania optymalnego wyniku. Wstępna obróbka przekroju roztworem metanolu ma kluczowe znaczenie. Bez wstępnej obróbki sygnały BDA są ledwo wykrywalne w mielinizowanych aksonach.
W przypadku stosowania znacznika następczego często trudno jest zidentyfikować dokładne miejsce wstrzyknięcia ze względu na nasycenie sygnałów fluorescencyjnych. W całej konfiguracji systemu obrazowania tkanek zastosowanego w tym badaniu używamy niebieskiego kanału do identyfikacji zakażonych komórek (Figura 5I). Nawet gdy kanały czerwony i zielony są nasycone, każdy pojedynczy zainfekowany neuron jest zwykle wykrywalny w kanale niebieskim. Dotyczy to również atlasu łączności mózgu myszy Allen Mouse Atlas1. Badanie komórek pochodzenia jest ważne, ponieważ infekcja czasami obejmuje tylko określone warstwy. Z takimi częściowymi infekcjami spotykaliśmy się dość często w przypadku Atlasu Połączeń Mózgu Myszy, być może z powodu zastosowania metody jonoforezy29. Boczne rozprzestrzenianie się znaczników wirusa może być mniej lub bardziej zmienne w zależności od wstrzyknięć. Ta zmienność może potencjalnie wpływać na wynik śledzenia i wymaga starannej normalizacji.
Pomyślna rejestracja uzyskanego obrazu 3D do standardowego szablonu jest kluczowym procesem całej neuroanatomii mózgu. Rejestracja obrazu STPT do szablonu STPT może być dość dokładna i zaobserwowaliśmy tylko odchylenia kilku wokseli (50 μm izosześciennych) dla granic o wysokim kontraścieobrazu 10. Mimo to istnieje ograniczenie tego, co może zrobić rejestracja. Ze względu na proces usuwania opon mózgowych, próbki STPT na ogół mają przerwy między półkulami i między korą a śródmózgowiem / tyłomózgowiem, podczas gdy tkanki mózgowe są ciasno upakowane na obrazach MRI in vivo . Takie różnice są trudne do skorygowania przez rejestrację. Kora marmozety jest w większości pozbawiona bruzd, ale bruzda śródciemieniowa jest bardzo głęboka u niektórych osób. Takie bruzdy zostaną utracone (następuje fuzja od góry do góry) po rejestracji. Chociaż rejestracja jest potężną techniką, konieczne jest powrót do surowych danych w celu potwierdzenia uzyskanego wyniku.
Generowanie ogromnych ilości danych obrazowych jest zarówno mocną stroną, jak i ograniczeniem tej techniki. Chociaż zwiększa to kompletność zbioru danych, wymaga starannego zarządzania pozyskanymi danymi i opracowania zautomatyzowanego potoku przetwarzania obrazów w celu efektywnej interpretacji danych. W przyszłości zastosowanie generatywnej sztucznej inteligencji (AI) w budowie potoków przetwarzania obrazu może znacznie uprościć ten proces. Systematyczne obrazowanie całego mózgu przeprowadzono również przy użyciu metod opartych na skanerze slajdów21,30. W porównaniu z takimi metodami, STPT nie wymaga dodatkowych obliczeń do rekonstrukcji 3D. W połączeniu z sekcją optyczną wykazaliśmy, że STPT ma potencjał do rekonstrukcji równych segmentów aksonów w sekcjach31. Dzięki dalszemu połączeniu technik usuwania tkanek, Economo i wsp. opracowali metodę obrazowania całości słabo znakowanych neuronów32,33. Najnowsze wersje TissueCyte oferują teraz opcje dodatkowego lasera w celu zwiększenia wzbudzenia białek czerwonej fluorescencji lub jednostki wychwytywania sekcji do automatycznego odzyskiwania skrawków. Dzięki tym postępom podejście obejmujące cały mózg stanie się bardziej wydajne, zapewniając podstawę do kompleksowego zrozumienia mózgu naczelnych, w tym człowieka.

W badaniach neuroanatomicznych badacze muszą obserwować struktury rzędu mikrometrowego (np. aksony i butony) w kontekście całego mózgu. Do tego trudnego zadania zwykle podchodzi się poprzez wizualne oględziny sekcji seryjnych i szukanie obszaru zainteresowania do szczegółowego obrazowania, analiz i rejestrowania zdjęć. Jednak wraz z postępem technologicznym możliwe staje się obrazowanie całego mózgu w wysokiej rozdzielczości w celu analizy całego mózgu. W przełomowym badaniu przeprowadzonym przez Oh et al.1, setki mózgów myszy otrzymało zastrzyki znacznikowe do analizy konektommicznej, które zostały przetworzone za pomocą techniki obrazowania seryjnej tomografii dwufotonowej (STPT)2. Cechą charakterystyczną tego badania było to, że wybrano znaczniki następcze do ilościowego określenia "łączności". Podczas gdy znaczniki następcze dostarczają bardzo szczegółowych informacji przestrzennych na temat rozmieszczenia aksonów, neuroanatomowie polegali na pracochłonnej ręcznej segmentacji do jej analizy. Dzięki automatyzacji różnych procedur analitycznych, w tym tego etapu segmentacji, udało im się "wyprodukować masowo" gotowe do użycia dane znacznikowe o wysokiej rozdzielczości do wielofunkcyjnych zastosowań. Skuteczność ich podejścia jest oczywista, biorąc pod uwagę różnorodność badań, w których wykorzystano ich dane śledzące3,4,5 i ich standardowy brain6.
Historycznie rzecz biorąc, połączenia neuronalne mózgów naczelnych innych niż ludzkie przyciągały uwagę wielu neuroanatomów od czasu opracowania metody degeneracji w latach 50., przez metody transportu substancji następczych/wstecznych w latach 70., aż po obecną strategię wirusową7,8. W związku z tym istnieje ogromna literatura, która bada połączenia neuronalne naczelnych. W szczególności wielu badaczy badało złożone połączenia korowo-korowe mózgu makaków, a ich wyniki zostały wyselekcjonowane do tabelaryzacji (np. CoCoMac9). Chociaż te klasyczne badania były przydatne, miały kilka ograniczeń. Po pierwsze, ponieważ każde badanie skupia się tylko na ograniczonych obszarach mózgu, uzyskane informacje nieuchronnie stają się fragmentaryczne. Po drugie, każde badanie wykorzystuje inne metody i warunki. W związku z tym ocena ilościowa w różnych badaniach staje się skomplikowana. Po trzecie, łączność jest zwykle pokazywana albo jako camera lucida reprezentatywnych sekcji, albo jako półilościowa tabela/wykres dla zdefiniowanych przez autora regionów mózgu. Innymi słowy, tylko bardzo ograniczone informacje ze złożonej struktury mózgu są wyodrębniane do prezentacji w opublikowanej literaturze. Wraz z rozwojem technik obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) badania całego mózgu w niskiej rozdzielczości stały się popularne. Istnieje jednak duża rozbieżność między poziomami szczegółowości między tym, co wiemy o połączeniach nerwowych u myszy i naczelnych.
Mając na uwadze takie tło, postanowiliśmy przeprowadzić kompleksowe śledzenie następcze mózgów marmozet pospolitych10,11. Chociaż znacznie mniejszy i gładszy niż mózg makaka, jego odpowiednik marmozety wykazuje wyraźne oznaki naczelnych, takie jak obecność obszaru MT i ziarnistych obszarów przedczołowych, z których żaden nie jest wyraźnie zdefiniowany u gryzoni12,13. Tutaj mały rozmiar był dużą zaletą, ponieważ nawet mózg marmozety waży dziesięć razy więcej niż mózg myszy. Na szczęście udało nam się zobrazować cały mózg marmozety przy minimalnych aktualizacjach oryginalnej wersji oprogramowania operacyjnego TissueCyte1000 (odtąd nazywanego systemem obrazowania całych tkanek), dostępnego na rynku mikroskopu do obrazowania STPT 2. Ta aktualizacja miała na celu umożliwienie dodatkowego ruchu sceny przed krojeniem. Obecna wersja jest teraz wystarczająca do przetworzenia mózgu marmozety. W tym artykule przedstawiono protokół obsługi mózgu marmozety do obrazowania STPT. Dostępny jest również protokół po obrazowaniu, który dodatkowo zwiększa użyteczność tej metody.

<table><tbody><tr><td>Agaroza typu I</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Wielofunkcyjny mikroskop fluorescencyjny</td><td>serii Keyence</td><td>BZ-X</td><td>W badaniu wykorzystano BZ-X710</td></tr><tr><td>anty-mysi Cy3</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-myc</td><td>MBL</td><td>M192</td><td>mysi monoklonalny</td></tr><tr><td>butorfanol&nbsp;</td><td>Meiji Animal Health</td><td>Vetorphale</td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczne ostrze</td><td>TissueVision&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Wako Chemical</td><td>#031-17601</td><td>Podwielokrotność na 100 i mikro; L x 10 ze 100 mg/ml w PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>Wacik bawełniany (HUBY-340)</td><td>HUBY</td><td>BB-013SP</td><td>mikrowaciki bawełniane</td></tr><tr><td>Komora na zamówienie</td><td>NIE DOTYCZY</td><td></td><td>NIE DOTYCZY Komora składa się z czterech płyt bocznych i jednej płyty dolnej, wszystkie wykonane z płyt akrylowych o grubości 1 cm, które można bezpiecznie przymocować ze sobą za pomocą śrubowych. Wewnątrz komory umieszczono dodatkową płytę akrylową, na której znajdują się trzy metalowe słupki&nbsp; Wkłada się przez niego, aby utrzymać mózg marmozety w odwróconej pozycji.</td></tr><tr><td>Cy3-Streptawidyna&nbsp;</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5, Inox</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Epoksydowa mieszanka instant</td><td>Locktite</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr> https://imagej.net/software/fiji/downloads <tr><td>kn_pipeline_check_mosaic.py</td><td>N/A</td><td>N/A</td> github.com/watkarbey/STPT_depo<td>; Jest to skrypt sprawdzający dane TissueCyte.</td></tr><tr><td>Medetomidyna&nbsp;</td><td>Zenoaq</td><td>Domitor</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Sandoz</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>#452882</td><td></td></tr><tr><td>NaIO4</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>S1878</td><td></td></tr><tr><td>Igła perfuzyjna&nbsp;</td><td>Natsume Seisakusho Co., Sp. z o.o</td><td>.&nbsp; KN-348, 20G-50</td><td></td></tr><tr><td>Szkło przesuwne (76 mm x 52 mm)</td><td>Matsunami</td><td>S9111</td><td></td></tr><tr><td>StAvHRP&nbsp;</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.</td><td>016-030-084</td><td>HRP-streptawidyna (miareczkowanie należy dokładnie określić)</td></tr><tr><td>TissueCyte1000</td><td>TissueVision&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.tissuevision.com/tissuecyte</tr><tr><td>Odczynnik blokujący TSA</td><td>Kiko Tech</td><td>FP1012</td><td>Patrz zestaw TSA-biotyna (Akoya Biosciences)</td></tr><tr><td>TSA-biotyna</td><td>Domowe</td><td>N/A</td><td>Patrz Okamoto i inni (ref. 16)</td></tr><tr><td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium</td><td>Vector laboratories Inc</td><td>N/A</td><td>Medium montażowe zapobiegające blaknięciu</td></tr></tbody></table>

seryjna tomografia dwufotonowa całego mózgu marmozety do analiz neuroanatomicznych

Serial Two-Photon Tomography of the Whole Marmoset Brain for Neuroanatomical Analyses

Seryjna tomografia dwufotonowa (STPT) to technika obrazowania masy tkanki w jej trójwymiarowym kształcie poprzez połączenie obrazowania dwufotonowego z automatyczną kontrolą etapu i krojeniem mikrotomów. Z powodzeniem wdrożyliśmy tę technikę do śledzenia projekcji aksonalnych w mózgu marmozety. W tym miejscu opisano szczegółowe procedury eksperymentalne, które doprowadziły do wiarygodnego obrazowania wolumetrycznego całego mózgu marmozety. Kluczowym procesem dla udanego obrazowania było usunięcie opon mózgowych otaczających mózg, które zakłócają krojenie. Dużą zaletą tej metodologii jest to, że pokrojone odcinki można wykorzystać do dodatkowego barwienia. W pierwotnej konfiguracji pokrojone sekcje są mieszane w kąpieli wodnej. Sekcje te mogą być prawidłowo wyrównane w ich pierwotnej kolejności zgodnie z wzorcami naczyń krwionośnych w korze. Przykładem skutecznej histologii jest wizualizacja struktury mieliny za pomocą prostego odbicia światła, które można połączyć z barwieniem Nissl w celu zdefiniowania granic anatomicznych. Sekcje te mogą być również wykorzystywane do immunologicznego wykrywania niefluorescencyjnych znaczników następczych i wstecznych, które można zarejestrować w danych STPT w celu nakładania warstw wielu danych.

Seryjna tomografia dwufotonowa (STPT) to technika obrazowania masy tkanki w jej trójwymiarowym kształcie poprzez połączenie obrazowania dwufotonowego z automatyczną kontrolą etapu i krojeniem mikrotomów. Tutaj opisujemy protokół jego implementacji dla mózgów marmozet, aby lepiej zrozumieć ich cechy strukturalne.

Seryjna tomografia dwufotonowa całego mózgu marmozety do analiz neuroanatomicznych

Serial Two-photon tomography (STPT) is a technique to image a mass of tissue in its three-dimensional shape by combining two-photon imaging with automatic ...

Nasze badania dotyczą strukturalnych podstaw funkcji mózgu, w tym u ludzi. Wykorzystując marmozetę pospolitą jako model, staramy się lepiej zrozumieć mózg naczelnych, identyfikując połączenia neuronowe, które są wspólne dla wszystkich gatunków i te, które są wyjątkowo poza rodzajem naczelnych. Przeprowadziliśmy kompleksowe mapowanie projekcji przedczołowych mózgu marmozety.Korzystając z techniki seryjnej tomografii dwufotonowej, udało nam się uzyskać bardzo dokładną rekonstrukcję 3D całego mózgu, która ujawniła solidne projekcje kolumnowe między obszarami asocjacyjnymi. Seryjna tomografia dwufotonowa dostarcza zestawu danych do zrozumienia połączeń neuronalnych w całej skali mózgu. Nasz protokół nie tylko pomaga usprawnić przetwarzanie mózgów marmozet, ale także oferuje wgląd w obchodzenie się z innymi osobnikami.Na początek weź wyizolowany, unieruchomiony mózg marmozety i inkubuj go z kolagenazą w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Za pomocą bawełnianego wacika ostrożnie przetrzyj powierzchnię mózgu, aby odkleić pia mater i inne opony mózgowe. Użyj cienkich kleszczy, aby usunąć wszelkie pozostałe oderwane opony mózgowe.Aby przygotować bufor borowodorku sodu, rozpuść 0,2 grama borowodorku sodu w 100 mililitrach 50-milimolowego buforu boranowego, podgrzanego do 40 stopni Celsjusza. Przygotuj utlenioną agarozę, mieszając 2,25 grama agarozy i 0,21 grama periodynianu sodu w 100 mililitrach buforu fosforanowego przez dwie do trzech godzin. Przefiltrować roztwór za pomocą odsysania próżniowego i przemyć go trzema zmianami buforu fosforanowego.Następnie ponownie zawieś agarozę w 50 mililitrach buforu fosforanowego. Następnie całkowicie rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej i pozwól jej ostygnąć do 60 do 65 stopni Celsjusza. Umieść mózg w specjalnie przygotowanej komorze i osadź mózg w agarozie, upewniając się, że agaroza wypełni jamę poniżej ciała modzelowatego.Po zestaleniu żelu agarozowego należy zdemontować komorę i zanurzyć blok agarozy w buforze borowodorku sodu na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Teraz, używając natychmiastowej mieszanki epoksydowej, zbuduj szklany stolik ślizgowy, mocując cztery magnesy neodymowe. Zamontuj blok agarozy na scenie za pomocą mocnego kleju.Cały system obrazowania tkanek należy obsługiwać zgodnie z instrukcjami producenta. Przetwarzaj cały mózg marmozety koronalnie od przedniego do tylnego końca. Następnie wyreguluj kąty ostrza, aby upewnić się, że głębokość powierzchni na obu końcach mieści się w granicach 10 mikrometrów.Aby to zrobić, wyszukaj górną powierzchnię, zmieniając położenie celu za pomocą kontrolera piezoelektrycznego. Ustaw płaszczyznę obrazowania na około 25 do 35 mikrometrów od powierzchni, aby skompensować gęstą mielinizację i zapewnić równomierną penetrację lasera. Za pomocą ceramicznego ostrza pokrój cały mózg w odstępach 50 mikrometrów, uzyskując około 650 plasterków.

serial-two-photon-tomography-whole-marmoset-brain-for-neuroanatomical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Ten artykuł opisuje metodę, za pomocą której architektura naczyniowa w mózgu może być określona ilościowo za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo i ex vivo.

Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego przez HIV

Ogólnym celem tego protokołu jest dokładne dopasowanie objętości obrazów rezonansu magnetycznego (MRI) do przekrojów histologicznych poprzez tworzenie dostosowanych drukowanych w 3D uchwytów na mózg i slicerów.

Wykorzystanie technologii druku 3D do połączenia rezonansu magnetycznego z histologią: protokół sekcji mózgu

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Opracowaliśmy całokorową matrycę elektrokortykograficzną dla marmozety pospolitej, która nieprzerwanie pokrywa prawie całą boczną powierzchnię kory, od bieguna potylicznego do bieguna skroniowego i czołowego. Protokół ten opisuje przewlekłą procedurę implantacji matrycy w przestrzeni zewnątrzoponowej mózgu marmozety.

Przewlekła implantacja całej korowej matrycy elektrokortykograficznej u marmozety zwyczajnej

Ta praca przedstawia protokół do przeprowadzenia stereotaktycznego, neurochirurgicznego wszczepienia matryc mikroelektrod u marmozety pospolitej. Metoda ta umożliwia zapisy elektrofizjologiczne u swobodnie zachowujących się zwierząt, ale może być łatwo dostosowana do każdej innej podobnej interwencji neurochirurgicznej u tego gatunku (np. kaniula do podawania leków lub elektrody do stymulacji mózgu).

Chirurgia stereotaktyczna do implantacji układów mikroelektrod w marmozecie zwyczajnej (Callithrix jacchus)

Opisana poniżej metoda ma na celu dostarczenie kompleksowego protokołu do przygotowania neurochirurgii na naczelnych (NHP) przy użyciu nowatorskiego połączenia metod drukowania trójwymiarowego (3D) i ekstrakcji danych MRI.

Zestaw narzędzi oparty na rezonansie magnetycznym do planowania neurochirurgicznego u naczelnych

Ten protokół opisuje metody przeprowadzania rezonansu magnetycznego, oczyszczania i znakowania immunologicznego nienaruszonych mózgów myszy za pomocą iDISCO+, a następnie szczegółowy opis obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej i dalszych analiz za pomocą NuMorph.

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

Poznaj seryjną tomografię dwufotonową do wysokorozdzielczej obrazowania całego mózgu marmozety. Ta metoda umożliwia precyzyjną rekonstrukcję 3D połączeń neuronowych i analizę organizacji strukturalnej mózgu naczelnych.

Seryjna tomografia dwufotonowa całego mózgu marmozety do analiz neuroanatomicznych

Przeglądaj więcej filmów