Name: Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Poznaj metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z łez i śliny przy użyciu chipa tetraspaninowego. Technika ta umożliwia analizę biomarkerów nieinwazyjnych z minimalnych objętości próbek, wspierając diagnostykę chorób rogówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować NIH za finansowanie (EY031316 i EY034714). Chcielibyśmy również podziękować UNTHSC i NTERI za przestrzeń laboratoryjną.

Wszystkie opisane badania były zgodne z Deklaracją Helsińską. Pisemna zgoda została uzyskana od każdego uczestnika przed włączeniem go do badania. Otrzymano zgodę Institutional Review Board (IRB) od Szpitala Uniwersyteckiego w Aarhus (1-10-72-77-14) i Dean McGee Institute (1576837-2) zgodnie z wytycznymi federalnymi i instytucjonalnymi. Przed przetworzeniem wszystkie próbki łez i śliny zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację. Wszystkie badania zostały zrecenzowane i zatwierdzone przez Regionalną Komisję Rewizyjną Regionalnego Instytucjonalnego Teksasu (#2020-030). Poniższy protokół jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi i został zatwierdzony, jak wspomniano powyżej.
1. Dzień 1: Przygotowanie próbki i inkubacja
<ol>
	<li>Zbierz próbkę (próbki) płynu biologicznego, tj. łzy i ślinę od osoby (osób) lub rozmroź próbkę (próbki) z zamrażarki.
	<ol>
		<li>Łzy: Zbieraj łzy biernie z łąkotki bocznej za pomocą szklanej rurki kapilarnej.
		<ol>
			<li>Umieść szklaną rurkę kapilarną na dolnej powiece, uważając, aby nie dotknąć rogówki.</li>
			<li>Zbierz objętość 10 μl łez w ciągu 10 minut.</li>
			<li>Łzy należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ślina: Zbierz ślinę z biernej śliny w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml
		<ol>
			<li>Pozwól dawcy zgromadzić ślinę w ustach.</li>
			<li>Poproś dawcę, aby ślinił się do probówki z lejkiem.</li>
			<li>Ślinę należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20 °C. </li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić chip(y) tetraspaniny na płycie do mycia wiórów na 15 minut przed dodaniem próbek, aby mogły osiągnąć temperaturę pokojową. Umieszczając wióry w studzience, upewnij się, że cyfry znajdują się na spodzie skierowanym do góry i że wióry nie dotykają bocznych ścianek studni (studzienek).</li>
	<li>Zapisz numer identyfikacyjny i numer chipa w notebooku, aby śledzić chip(y).</li>
	<li>Podłącz uniwersalną magistralę szeregową (USB) dołączoną do zestawu, a następnie rozpakuj i zapisz folder z powiązanym numerem zestawu w wyznaczonym przez siebie obszarze.</li>
	<li>Odpipetować 99 μl roztworu B w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 1 μl płynu biologicznego do probówki o pojemności 1,5 ml przygotowanej w poprzednim kroku.</li>
	<li>Zakręć rurkami.</li>
	<li>Pobrać 70 μl roztworu z kroku 1.6 i odpipetować na chipie tetraspaniny.</li>
	<li>Umieść folię na płycie do mycia wiórów, aby zapobiec parowaniu próbki.</li>
	<li>Inkubować przez 16 godzin w temperaturze pokojowej (RT) na stole bez wibracji.</li>
</ol>
2. Dzień 2: Mycie wiórów
<ol>
	<li>Włącz pralkę do frytek.</li>
	<li>Usuń folię z kroku 1.9 z płyty.</li>
	<li>Umieść płytkę w myjce wiórów, upewniając się, że zatrzasnęła się na swoim miejscu, i zamknij pokrywę. 
	UWAGA: Płyta nie będzie się łatwo przesuwać, jeśli zostanie prawidłowo zablokowana na swoim miejscu.</li>
	<li>Naciśnij opcję CW-TETRA v0 na podkładce wiórów.</li>
	<li>Wybierz rząd początkowy i liczbę rzędów do umycia.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Kontynuuj na pralce do wiórów.</li>
	<li>Podczas mycia chipa(ów) należy przygotować roztwór blokujący zawierający przeciwciała w probówce w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Przygotuj 300 μl roztworu blokującego na chip.</li>
		<li>Dodać 0,6 μl lub każde przeciwciało na chip (odwirować i odwirować przeciwciała przed dodaniem do roztworu blokującego)</li>
		<li>Vortex roztwór blokujący + koktajl przeciwciał. 
		UWAGA: Przykryj roztwór blokujący + koktajl przeciwciał ze światła, aby zapewnić stabilność przeciwciał. Należy tego dokonać w dniu użytkowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy myjka do chipsów zaćwierka, dodaj 250 μl roztworu blokującego + koktajlu przeciwciał na wierzch chipsów.</li>
	<li>Zamknij pokrywę i naciśnij Kontynuuj. 
	UWAGA: Myjka do wiórów wykona teraz 1-godzinną inkubację wraz z kilkoma dodatkowymi rundami mycia i płukania.</li>
	<li>Gdy myjka do wiórów zacznie ćwierkać, zdejmij płytkę do mycia wiórów i przesuń wiór(y) w górę rampy.</li>
	<li>Umieść płytkę z powrotem w myjce wiórów, upewniając się, że zatrzasnęła się na swoim miejscu. Zamknij pokrywę i naciśnij Kontynuuj.</li>
	<li>Gdy myjka do wiórów zakończy program, wyjmij płytkę i umieść wiór(y) na ręczniku papierowym. Zakryj wiór(y) przed światłem.</li>
</ol>
3. Dzień 2: Skanowanie chipa (chipów)
<ol>
	<li>Włącz skaner i otwórz oprogramowanie do skanowania. 
	UWAGA: Skaner zostanie poddany samokontroli, aby wskazać, czy występują błędy lub czy skanowanie można kontynuować.</li>
	<li>Wybierz opcję Zapisz folder i wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać pliki.</li>
	<li>Wybierz ChipFile Folder i wybierz folder zapisany w kroku 1.4.</li>
	<li>Wybierz opcję rozwijaną, aby wybrać każdy chip i zlokalizować go w pozycji chipa na uchwycie. Powtórz ten krok dla wszystkich chipów, które muszą zostać zeskanowane.</li>
	<li>Włącz fluorescencję, klikając trzy kwadraty poniżej pozycji chipa. Kwadraty zmienią kolor odpowiednio na żółty, niebieski i czerwony.</li>
	<li>Zdejmij pokrywę uchwytu, naciskając pokrywę w dół i pociągnij ją.</li>
	<li>Umieść wiór(y) na uchwycie, upewniając się, że są mocno zamocowane.</li>
	<li>Załóż z powrotem pokrywę uchwytu, umieszczając kołki w otworach, dociśnij i przesuń pokrywę, aby zablokować ją na miejscu.</li>
	<li>Umieść uchwyt na scenie, upewniając się, że zatrzasnął się na swoim miejscu.</li>
	<li>Wybierz opcję Scan Chips (Skanuj elementy).</li>
	<li>Wybierz przycisk OK.</li>
	<li>Gdy stage całkowicie przesunie się do maszyny, zamknij drzwi. 
	UWAGA: Skanowanie pojedynczego chipa zajmuje około 12 minut.</li>
	<li>Gdy program zakończy skanowanie chipów, otwórz drzwi, aby wysunąć stage sprawdź, czy skanowanie się powiodło.
	<ol>
		<li>Jeśli skanowanie zakończyło się pomyślnie, wyrzuć chip(y) i umieść następny zestaw chipów na uchwycie lub włóż pusty uchwyt na scenę. Następnie wyjdź z oprogramowania i wyłącz urządzenie po zakończeniu.</li>
		<li>Jeśli skanowanie się nie powiodło, spójrz na kod błędu i popraw błąd.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy.</li>
	<li>Wybierz opcję Wstępne skanowanie danych i wybierz folder, w którym znajduje się skan z kroku 3.2 dnia 2.</li>
	<li>Wybierz pozycję Dalej.</li>
	<li>Oznacz chip(y) w kolumnie Sample Name (Nazwa próbki) nazwą próbki, klikając komórkę i wpisując identyfikator próbki.</li>
	<li>Następnie oznacz tetraspaniny w kolumnie Nazwa kanału. Czerwony = CD63, zielony = CD81 i niebieski = CD9.</li>
	<li>Wybierz pozycję Dalej.</li>
	<li>Wybierz opcję Wysokie CV z grupy Select Spot, aby sprawdzić listę rozwijaną i wyłączyć wysokie CV dla każdego żetonu, wyłączając jedno lub dwa miejsca.</li>
	<li>Następnie wybierz pozycję Duża liczba i spróbuj wyłączyć ostrzeżenia o dużej liczbie. 
	UWAGA: Niektóre próbki mogą mieć zbyt dużą liczbę, ale nadal można je analizować.</li>
	<li>Wybierz Wszystkie miejsca z menu rozwijanego, wybierz Montaż punktowy i wizualnie sprawdź każdy chip pod kątem deformacji lub zadrapań, które mogą być obecne.</li>
	<li>Wybierz pozycję Dalej.</li>
	<li>W kanale CD63 ustaw minimum na 300, aby pozbyć się czerwonych krwinek w wierszu Średnio % uwzględnione; żółte komórki są w porządku i przejdź do kanału CD81. Jeśli ustawienie wartości minimalnej na 300 nie zmieni czerwonej komórki na żółtą lub białą, przejdź do kroku 4.14 w celu rozwiązania problemu.</li>
	<li>W kanale CD81 ustaw minimum na 300, aby pozbyć się czerwonych krwinek w wierszu Średnio % uwzględnione; żółte komórki są w porządku i przejdź do kanału CD9. Jeśli ustawienie wartości minimalnej na 300 nie zmieni czerwonej komórki na żółtą lub białą, przejdź do kroku 4.14 w celu rozwiązania problemu.</li>
	<li>W kanale CD9 ustaw wartość minimalną na 400, aby pozbyć się czerwonych krwinek w wierszu Średnia % uwzględniona; żółte komórki są w porządku i przejdź do kroku 4.15. Jeśli ustawienie wartości minimalnej na 400 nie zmieni czerwonej komórki na żółtą lub białą, przejdź do kroku 4.14 w celu rozwiązania problemu.</li>
	<li>Rozwiązywanie problemów
	<ol>
		<li>Zwiększa minimalną wartość o 100 jednostek.</li>
		<li>Jeśli krok 4.14.1 nie zadziałał, wybierz żeton w sekcji Wybierz żetony do pracy i wybierz żeton. Wybierz opcję Particle Count (Liczba cząstek) i wyłącz miejsca, które mają dużą liczbę cząstek. Wybierz opcję Intensywność/Rozmiar, wybierz opcję Wszystkie żetony i sprawdź, czy to rozwiąże problem.</li>
		<li>Jeśli krok 4.14.2 nie zadziałał, wybierz żeton w sekcji Wybierz żetony do pracy i wybierz żeton. Wybierz opcję Single-Chip Cutoffs (Odcięcia pojedynczego układu) i zwiększ wartość minimalną o 100 jednostek. Następnie wybierz opcję Wszystkie żetony, aby sprawdzić, czy czerwona komórka jest teraz żółta. Jeśli to nie zadziała, powtarzaj ten krok, aż komórka Średnia % uwzględniona zmieni kolor na żółty lub biały.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz pozycję Dalej.</li>
	<li>Usuń zaznaczenie kanału wiadomości błyskawicznych.</li>
	<li>Ustaw wartość mapy cieplnej w prawym dolnym rogu, aby uwzględnić wszystkie cząstki, a następnie wybierz opcję Dodaj wykres do raportu.
	<ol>
		<li>Dostosuj maksymalną liczbę w polu rozwijanym i ręcznie wprowadź wartość.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie wybierz menu rozwijane w górnej środkowej części w obszarze Sondy przechwytywania i wybierz CD63.</li>
	<li>Wybierz opcję Dodaj wykres do raportu, aby dodać całkowitą liczbę cząstek do raportu.</li>
	<li>Wybierz menu rozwijane w obszarze Tryb analizy, wybierz opcję Kolokalizacja i Dodaj wykres do raportu.</li>
	<li>Następnie wybierz pozycję Rozmiar, wybierz pozycję Zmień widok na Wykres, a następnie wybierz pozycję Dodaj wykres do raportu.</li>
	<li>Na koniec wybierz pozycję Obrazy i wybierz pozycję Dodaj wykres do raportu.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.18–4.22 dla CD81 i CD9, upewniając się, że za każdym razem odznaczono kanał wiadomości błyskawicznych.</li>
	<li>Po dodaniu wszystkich elementów do raportu wybierz pozycję Eksportuj raport, upewnij się, że jest on zapisywany w odpowiednim pliku, a następnie wybierz pozycję Folder. 
	UWAGA: Pliki i obrazy Excela zostały wygenerowane i mogą być teraz używane do dalszej analizy.</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Najważniejszym krokiem w tym protokole jest upewnienie się, że osiągnięte zostanie optymalne stężenie pojazdów elektrycznych. Musi być wystarczająca liczba pojazdów elektrycznych, aby uzyskać odczyt, ale nie za dużo pojazdów elektrycznych, które przesycą chip. Najlepszym sposobem na określenie optymalnego stężenia EV jest wykonanie serii optymalizacyjnej z 1 μl próbki i sprawdzenie, czy stężenie wymaga korekty. Kolejnym krytycznym krokiem jest sprawdzenie, czy w próbce znajduje się duża ilość resztek komórkowych, które można określić, przeglądając duże kawałki na chipach w oprogramowaniu analizującym. Jeśli próbka zawiera resztki komórek, proste odwirowanie lub przefiltrowanie próbki powinno rozwiązać ten problem.
Dodatkowym, kluczowym krokiem jest upewnienie się, że wióry nie dotykają ścian studni i unikanie kontaktu ze środkową częścią wióra (wiórów) podczas umieszczania ich na rampie. Skaner będzie odczytywał z kwadratu na środku chipa, dlatego ważne jest, aby unikać dotykania tego obszaru kleszczami, aby zapobiec zakłóceniu pracy pojazdów elektrycznych.
Metoda ta ma pewne ograniczenia, takie jak niewystarczające stężenie EV do wykrycia przez instrument. Stężenie można poprawić, susząc próbkę lub używając rurki koncentratora. Innym ograniczeniem jest to, że oprogramowanie analityczne mierzy tylko EV w zakresie 50-200 nm, wykluczając niektóre mikropęcherzyki i wszystkie ciała apoptotyczne z pomiarów wielkości75.
 Istnieje wiele sposobów izolacji (Tabela 1 42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55,56,57,58, 59,60, 61,62,63,64,65,66,67) i analizować EV (Tabela 2 78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90), a obecnym złotym standardem izolacji EV jest ultrawirowanie 36,37,38 w celu granulowania komórek do testów takich jak Western Blots 68,69,70 i PCR 71,72,73,74,75,76. Chociaż protokół ten działa dobrze w przypadku dużych próbek 42,44,46, uzyskanie płynów biologicznych może być trudne, a często można pobrać tylko niewielką objętość próbek na raz, co nie jest idealne do ultrawirowania. W przeciwieństwie do tego, korzystanie z tego analizatora nanocząstek pozwala użytkownikowi generować cenne dane, takie jak rozmiar, całkowita liczba cząstek i fenotyp EV, w zaledwie 1 μl próbki, co czyni go idealnym dla płynów biologicznych. Będziemy mogli poszerzyć wiedzę na temat EV z niewielkich objętości próbek, które są trudne do pobrania, co może zwiększyć komfort pacjenta i być może znaleźć potencjalne cele terapeutyczne dla różnych chorób i zaburzeń.

Komórki komunikują się z sąsiednimi komórkami poprzez różne mechanizmy sygnalizacyjne, w tym uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), które odgrywają kluczową rolę w komunikacji międzykomórkowej. EV uczestniczą w komunikacji międzykomórkowej, przekazując ładunek genetyczny, taki jak DNA, RNA i białka, z jednej komórki do drugiej1,2,3,4,5. Obecnie istnieją trzy kategorie EV: egzosomy, mikropęcherzyki i ciała apoptotyczne, które charakteryzują się wielkością. Egzosomy są najmniejsze, o średnicy 30-150 nm6,7,8, i są utworzone z systemu błon endosomalnych 9,10,11 (Rysunek 1). Mikropęcherzyki są większe niż egzosomy, ponieważ mieszczą się w zakresie od 100 do 1000 nm12,13,14 i wystają z błony komórkowej11,12,13 (Rysunek 1). Ciała apoptotyczne są największymi EV i mieszczą się w zakresie od 1000 do 5000 nm12,14,15, a także wypuszczają z błony plazmatycznej12,16,17 (Rysunek 1). Oprócz rozmiaru, EV można klasyfikować na podstawie innych cech biofizycznych, które obejmują gęstość, markery molekularne, takie jak CD63, CD81, CD9, a także mechanizm biogenezy18. EV mogą pokonywać krótkie odległości między sąsiednimi komórkami i duże odległości w całym ciele19,20,21,22,23. EV można znaleźć w płynach biologicznych, takich jak krew24,25,26, mózgowy płyn rdzeniowy27,28,29, tears30,31,32, and saliva33,34,35, żeby wymienić tylko kilka.
Do tej pory ultrawirowanie jest jedną z najbardziej znanych metod izolowania EV od próbek36,37,38. Ta metoda wymaga wielu rund wirowania i ultrawirowania, które można przeprowadzić, zwiększając prędkość w celu odizolowania EV od komórek i szczątków komórek. Metodę tę można rozpocząć od niskiej prędkości z komórkami peletowymi, po których nastąpi średnia prędkość w celu wyeliminowania większych pęcherzyków, a na koniec etap ultrawirowania do granulowania EVs18. Chociaż ultrawirowanie jest uważane za najlepszą metodę izolacji, nadal istnieją pewne ograniczenia, ponieważ zmienia morfologię klasy EVs<sup="xref">39,40,41. Inną techniką stosowaną do izolowania EV jest cytometria przepływowa, która podkreśla zalety oceny wielu punktów czasowych i końcowych oraz wysokoprzepustowej analizy pojedynczej EV. Jednak ograniczenia cytometrii przepływowej obejmują między innymi zatykanie porów i słabe sygnały. Innym stosowanym podejściem jest wirowanie gradientowe, w którym wykorzystuje się materiały o różnej gęstości do odwirowania za pomocą pojazdów elektrycznych i umożliwia lepszą separację pojazdów elektrycznych w porównaniu z ultrawirowaniem. Chociaż technika ta poprawia separację, jest pracochłonna, czasochłonna i może prowadzić do znacznych strat próbki. Dodatkowo wytrącanie i filtracja mogą być również stosowane do izolowania pojazdów elektrycznych. Obie te techniki są proste i szybkie, ale obie mogą prowadzić do zanieczyszczenia próbki. Chociaż istnieje kilka technik izolowania EV, każda z nich ma swoje zalety i ograniczenia, które są wymienione poniżej (Tabela 1) 42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55, 56,57,58,59,60,61, 62,63,64,65,66,67.
Po wyizolowaniu EV, można przeprowadzić testy molekularne w celu scharakteryzowania EV. Western blot jest powszechnym testem do poszukiwania ekspresji białek powierzchniowych i ładunkowych68,69,70 a reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest używana do ekspresji miRNA71,72,73 dla EVs74,75,76. Testy te są sprawdzone i mogą przynieść intrygujące wyniki. Ograniczeniem tych metod jest to, że wymagają one dużej ilości białek lub RNA z EV, aby uzyskać odczyt77, co jest problemem w przypadku próbek o małej objętości lub stężeniu EV.
Analizator nanocząstek omawiany w tym artykule pozwala użytkownikowi przezwyciężyć wiele ograniczeń określonych w Tabeli 1 i Tabeli 2 78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90. Metoda ta nie wymaga stosowania technik izolacji, co pomoże przezwyciężyć zmniejszoną wydajność pojazdów elektrycznych. Metoda ta pozwala również użytkownikowi na analizę białek powierzchniowych i ładunkowych, całkowitej liczby EV i wielkości EV z objętości próbki wynoszącej zaledwie 1 μl. Odbywa się to za pomocą chipów tetraspaniny dostarczonych przez firmę, która wykorzystuje mikromacierz przeciwciał z przeciwciałami tetraspaninowymi, CD63, CD81 i CD9, do identyfikacji EV w roztworze, jak pokazano na rysunku 2. Przeciwciała fluorescencyjne potwierdzają obecność EV, a także zapobiegają zniekształceniu wyników przez cząstki zanieczyszczające.
Ogólnym celem tej techniki jest zapewnienie mniej czasochłonnej metody analizy EVs, jak również analizy EVs z małej objętości próbki. Korzystanie z tego analizatora nanocząstek pozwala użytkownikom analizować wielkość, całkowitą liczbę cząstek i białka powierzchniowe już od 1 μl próbki, co jest idealne dla płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina.

<table><tbody><tr><td>ChipWasher 100</td><td>NanoView</td><td>EV-CW100 ChipWasher 100</td><td>Wkłada, myje, płucze i suszy chipsy tetraspaninowe. Ten obecny model nie jest już dostępny. Cena w momencie zakupu: $9,995.00&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ExoView Analyzer</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>Analizuje informacje o chipie i tworzy pliki Excela do dalszej analizy. Nie jest już dostępny.</td></tr><tr><td>ExoView R100</td><td>NanoView</td><td>EV-R100</td><td>Służy do skanowania chipów tetraspaniny na 3 długościach fal. Ten obecny model nie jest już dostępny. Cena w momencie zakupu:&nbsp; $110,000.00</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ExoView Scanner</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>Skanuje chipy na 3 różnych długościach fal. Nie jest już dostępny.</td></tr><tr><td>Zestawy ludzkiej tetraspaniny</td><td>Unchained</td><td>Labs EV-TETRA-C</td><td>Zawiera 8 chipów tetraspaniny, roztwór do inkubacji, roztwór blokujący, przeciwciało CD63, przeciwciało CD81, przeciwciało CD9, roztwór A, roztwór B, USB i pokrywę płytki.</td></tr></tbody></table>

charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to struktury, które są wytwarzane z komórek i uczestniczą w komunikacji międzykomórkowej poprzez transport biomolekuł z jednej komórki do drugiej. Wykazano, że pojazdy elektryczne pokonują krótkie i dalekie odległości w organizmie i są specyficzne dla tkanki. EV znajdują się nie tylko w tkankach, ale można je również znaleźć w praktycznie wszystkich płynach ustrojowych, takich jak łzy, ślina, płyn mózgowo-rdzeniowy, krew itp. Mimo że EV można pobrać nieinwazyjnie ze łez i śliny, jednorazowo można zebrać tylko małe objętości, co może powodować problemy z uzyskaniem wystarczającej ilości EV do analizy białek. Skaner omawiany w tym artykule jest analizatorem nanocząstek, który zapewnia rozwiązanie tego problemu, pozwalając nam scharakteryzować i zbadać fenotyp, rozmiar i całkowitą liczbę cząstek EV już od 1 μl płynu biologicznego. Protokół ten poszerzy wiedzę na temat EV z małych objętości próbek, które są trudne do pobrania od pacjentów. Może to zwiększyć komfort pacjentów i potencjalnie zidentyfikować nowe cele terapeutyczne dla szeregu chorób i zaburzeń.

Podczas analizy plamek na chipach należy dążyć do uzyskania optymalnego stężenia EV, obserwując fluorescencyjnie znakowane EV w kanałach CD63, CD81 i CD9, natomiast kanał MIgG30,91 powinien pozostać czarny, ponieważ jest to kanał kontrolny, jak pokazano na Rysunku 3A. W przypadku płynów biologicznych sygnał CD81 będzie zredukowany. Brak fluorescencji w kanałach CD63, CD81 i CD9 oznacza brak EV (Rysunek 3B). Należy uważać, aby nie doprowadzić do przesycenia chipa (Rysunek 3C). Utrudni to oprogramowaniu analitycznemu obliczenie dokładnej wielkości, całkowitej liczby cząsteczek oraz fenotypów EV. Na podstawie plamek o optymalnym stężeniu oprogramowanie analityczne będzie w stanie zmierzyć wielkość (50-200 nm), całkowitą liczbę cząsteczek oraz ekspresję tetraspanyn EV (Rysunek 4), a dane zostaną wyeksportowane do oddzielnych arkuszy kalkulacyjnych w celu dalszej analizy. Analiza tetraspanyn obejmie kolokalizację białek powierzchniowych na EV. Kolokalizacja będzie reprezentowana przez znak "/", na przykład "CD63/CD81". Nie oznacza to, że CD63 i CD81 są połączone, lecz że zarówno CD63, jak i CD81 znajdują się na powierzchni EV.
Wyniki te dostarczą cennych informacji na temat różnic między próbkami zdrowymi a chorobowo zmienionymi. Będziemy w stanie określić, czy próbki zdrowe czy chorobowe produkują więcej EV, czy EV są większe bądź mniejsze, a także jaki jest ich fenotyp. Każda z tych cech lub wszystkie one razem mogą odgrywać rolę w biogenezie i/lub progresji choroby. Dzięki tym wynikom będziemy mogli stwierdzić, czy występuje brak lub wzrost poziomu tetraspanin, co może dostarczyć informacji o procesach komórkowych i formowaniu się EV.
<img alt="Schemat sekrecji komórkowej; rozmiary egzosomów, mikropęcherzyków i ciał apoptotycznych, skala nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Typy i rozmiary różnych EV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat wiązania przeciwciał z cząsteczkami wirusa; odpowiedź immunologiczna; wizualizacja oddziaływań molekularnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat obrazujący sposób, w jaki chipy z tetraspanynami wychwytują i wykrywają EV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza fluorescencji markerów egzosomów; optymalna, negatywna, przesycenie; wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Optymalizacja stężeń EV. (A) Optymalne stężenie EV. (B) Wynik negatywny: brak obecności EV. (C) Przesycenie EV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych; wielkość cząstek, stężenie, ekspresja tetraspanin; wykres porównawczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Dane wygenerowane przez analizator nanocząstek. (A) Średnica pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) mierzona w nanometrach. (B) Całkowita liczba cząstek EV. (C) Kolokalizowany fenotyp EV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Technika</td>
			<td >Zalety</td>
			<td >Ograniczenia</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Ultrawirowanie</td>
			<td >Wysoka czystość42,43</td>
			<td >Zmienia morfologię EV42,44</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Homogenność42,45</td>
			<td >Wymaga dużych objętości42,44,46</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Funkcjonalność42,43</td>
			<td >Wysoki koszt42,43</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Cytometria przepływowa</td>
			<td >Ocena próbek w wielu punktach czasowych47</td>
			<td >Słaby sygnał48,49</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Wiele punktów końcowych47,50</td>
			<td >Zapychanie porów51</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Wysokoprzepustowa analiza pojedynczych EV52,53</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Wirowanie w gradiencie gęstości</td>
			<td >Uzyskiwanie próbek o wysokiej czystości54</td>
			<td >Pracochłonność55,56</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Różnorodność próbek55,57</td>
			<td >Czasochłonność55,58 </td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Znaczna utrata wydajności54</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Wytrącanie</td>
			<td >Prostota59,60</td>
			<td >Zanieczyszczenie36,44,61</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Szybkość61,62</td>
			<td >Niespecyficzność63</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Wysoka wydajność44,59,62</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Neutralne pH36</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Filtracja</td>
			<td >Prostota64 </td>
			<td >Zatrzymywanie egzosomów65</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Szybkość64</td>
			<td >Uszkadzanie dużych pęcherzyków36</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Niski koszt64</td>
			<td >Powstawanie osadu na filtrze66,67</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >Zapychanie egzosomami65</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Zalety i ograniczenia technik izolacji EV. Lista różnych metod izolacji EV, zawierająca ich zalety i ograniczenia.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Technika</td>
			<td>Zalety</td>
			<td>Ograniczenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamiczne rozpraszanie światła</td>
			<td>Pomiar cząstek o rozmiarach od 1 nm do 6 µM78 </td>
			<td>Nieodpowiednie do pomiaru złożonych próbek egzosomów o szerokim zakresie rozmiarów79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Dolna granica wynosi 10 nm, co jest odpowiednie dla układów monodyspersyjnych79 </td>
			<td>Brak możliwości odróżnienia białek zanieczyszczających od egzosomów79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)</td>
			<td>Obserwacja morfologii egzosomów79,80 </td>
			<td>Złożone przygotowania próbek79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Obserwacja struktury wewnętrznej81 </td>
			<td>Brak możliwości rozróżnienia egzosomów na podstawie rozmiaru i kształtu ze względu na zbyt silne sygnały fluorescencyjne82 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analiza śledzenia nanocząstek</td>
			<td>Pomiar stężenia, wielkości i rozkładu wielkości egzosomów w zakresie od 10 nm do 2 µM zakres78 </td>
			<td>Brak możliwości odróżnienia pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) od agregatów białkowych i innych zanieczyszczeń83 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>Szybkie przygotowanie i pomiar próbek78,84</td>
			<td>Kosztowny instrument NTA85 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbki można odzyskać w formie natywnej84 </td>
			<td>Wrażliwy na wibracje85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot (WBs)</td>
			<td>umożliwia jakościową i ilościową analizę białek markerowych79,86 </td>
			<td>Skomplikowane i czasochłonne79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Analiza egzosomów z pożywek hodowlanych79 </td>
			<td>Izolaty pęcherzyków zewątkórkowiczych (EV) mogą zawierać lipoproteiny i inne zanieczyszczenia86 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Cytometria przepływowa</td>
			<td>Wyższa czułość i obrazowanie o wysokiej rozdzielczości w celu</td>
			<td rowspan="2">Czasochłonne i pracochłonne, z granicą detekcji wynoszącą 400 nm79,88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>odróżnienie barwionych egzosomów od zanieczyszczeń87 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Wymagane niskie stężenie próbki79 </td>
			<td>Sygnały optyczne utrudniają osiągnięcie dokładności i rozdzielczości88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exoview</td>
			<td>Pomiar tetraspanyn (CD9, CD63 i CD81) w egzosomach89 </td>
			<td>Nie mierzy większych rozmiarów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Pomiar białek cargo pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Zalety i ograniczenia technik charakteryzacji EV.

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Extracellular vesicles (EVs) are structures that are produced from cells and participate in intercellular communication by transporting biomolecules from ...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe służą jako biomarkery choroby, odzwierciedlając stany fizjologiczne. Nasze podejście umożliwia ekstrakcję bogatych danych z niewielkich objętości rozdarć, posuwając naprzód badania nad pojazdami elektrycznymi w płynach biologicznych. Kluczowe wyzwania eksperymentalne obejmują uzyskanie wystarczających stężeń pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z małych próbek, zminimalizowanie strat próbki podczas izolacji oraz optymalizację analizy w celu zapobieżenia przesyceniu chipów lub wykrywaniu słabego sygnału.Protokół ten omija etapy izolacji, skracając czas przetwarzania i umożliwia analizę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z niewielkich objętości próbek, dzięki czemu idealnie nadaje się do ograniczonych próbek biologicznych, takich jak łzy. Nieinwazyjne biomarkery mają kluczowe znaczenie dla wczesnego wykrywania i leczenia zaburzeń rogówki. Biomarkery pęcherzyków zewnątrzkomórkowych umożliwiają monitorowanie choroby, spersonalizowane leczenie, lepsze przestrzeganie zaleceń przez pacjentów i poprawę jakości życia.Nasze laboratorium było pionierem w analizie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w próbkach łez od osób z KC, identyfikując unikalne sygnatury tEV. Otwiera to drogę dla przyszłej diagnostyki i celów terapeutycznych skoncentrowanych na pojazdach elektrycznych. Na początek umieść próbki biologiczne i chip tetraspaniny na przestrzeni roboczej.Odpipetować 70 mikrolitrów ludzkich próbek biologicznych, które zostały wstępnie zmieszane z roztworem B ludzkiego zestawu tetraspaniny na chipie. Umieść folię na płycie do mycia wiórów, aby zapobiec parowaniu próbki. Po 16 godzinach umieść płytkę w myjce wiórów.Zablokuj go na miejscu i zamknij pokrywę. Naciśnij opcję CW-TETRA v0 na podkładce wiórów. Podczas mycia wiórów przygotuj 300 mikrolitrów roztworu blokującego na wiór.Dodaj 0,6 mikrolitra każdego przeciwciała na chip do roztworu blokującego. Zmieszaj roztwór blokujący z koktajlem przeciwciał, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Po zakończeniu mycia chipów dodaj 250 mikrolitrów roztworu blokującego z koktajlem przeciwciał na wierzchu każdego chipsa.Następnie zamknij pokrywę i naciśnij Kontynuuj. Gdy myjka do wiórów zacznie ćwierkać, zdejmij płytkę do mycia wiórów. Przesuń wióry w górę rampy.Umieść płytkę z powrotem w podkładce wiórów, upewniając się, że jest bezpiecznie zablokowana na swoim miejscu. Zamknij pokrywę i naciśnij Kontynuuj. Aby rozpocząć, włącz analizator nanocząstek.Uruchom oprogramowanie skanujące na pulpicie podłączonym do analizatora nanocząstek. Wybierz folder na wióry, aby wybrać każdy chip tetraspanin i zlokalizować go w pozycji chipa na uchwycie. Kliknij trzy kwadraty poniżej pozycji chipa, aby włączyć fluorescencję.Kwadraty zmienią kolor na żółty, niebieski i czerwony. Naciśnij pokrywę uchwytu i pociągnij ją, aby ją zdjąć. Następnie mocno przymocuj chipy tetraspaniny załadowane próbką do uchwytu.Dopasuj kołki pokrywy uchwytu do otworów i dociśnij. Przesuń pokrywę, aby zablokować ją na miejscu. Następnie umieść uchwyt na stoliku i zablokuj go na miejscu.Następnie kliknij Skanuj chipy w interfejsie oprogramowania, a następnie kliknij OK. Gdy stolik całkowicie przesunie się do maszyny, zamknij drzwi. Po zakończeniu skanowania otwórz drzwiczki, aby wysunąć stolik i sprawdzić wyniki. Jeśli skanowanie zakończyło się pomyślnie, wyrzuć chipy.Umieść następny zestaw wiórów na uchwycie. Alternatywnie, włóż pusty uchwyt z powrotem na scenę. Wyjdź z oprogramowania i wyłącz urządzenie po zakończeniu.Optymalne poziomy fluorescencji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zaobserwowano w kanałach CD63, CD81 i CD9, podczas gdy kanał kontrolny MIgG pozostał, co potwierdza swoistość kontrolną. CD81 został zredukowany dla płynów biologicznych. Brak fluorescencji w kanałach CD63, CD81 i CD9 wskazuje na brak pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.Widoczne było przesycenie fluorescencji, co utrudniało dostrzeżenie istotnych danych z powodu nadmiernego znakowania, szczególnie w kanałach CD63, CD81 i CD9.

characterizing-extracellular-vesicles-from-biological-fluids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe obecne we krwi zostały zasugerowane jako nowe biomarkery różnych chorób. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji dużych mikropęcherzyków pochodzących z błony plazmatycznej z próbek krwi obwodowej i ich późniejszej analizy za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej i Western Blotting.

Izolacja i charakterystyka mikropęcherzyków z krwi obwodowej

W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.

Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek

Protokół opisuje powtarzalną metodę przeznaczoną do użycia z supernatantami do hodowli komórkowych do wykrywania epitopów powierzchniowych na małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV). Wykorzystuje specyficzną immunoprecypitację EV za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami, które rozpoznają antygen powierzchniowy CD9, CD63 i CD81. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z całych tkanek, w tym próbek mózgu i nowotworów. Metoda ta oferuje powtarzalną technikę ekstrakcji EV z tkanki stałej w celu dalszych analiz.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki

Niniejszy raport podkreśla chronologiczne wymagania dotyczące izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mikrogleju lub makrofagów krwi. EV pochodzące z mikrogleju oceniano jako regulatory wzrostu neurytów, podczas gdy EV pochodzące z makrofagów krwi badano w kontroli inwazji komórek glejaka C6 w testach in vitro. Celem jest lepsze zrozumienie tych funkcji EV jako mediatorów immunologicznych w określonych mikrośrodowiskach.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek odpornościowych i badanie funkcjonalnego wpływu na środowisko komórkowe

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Najnowsza generacja narzędzi do charakteryzacji EV jest w stanie przeprowadzić pojedynczą analizę EV dla wielu parametrów jednocześnie. Cytometria nanoprzepływowa mierzy wszystkie cząstki biologiczne większe niż 45 nm bez znakowania i identyfikuje specyficzne cechy subpopulacji za pomocą różnych technik znakowania fluorescencyjnego.

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Poznaj metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z łez i śliny przy użyciu chipa tetraspaninowego. Technika ta umożliwia analizę biomarkerów nieinwazyjnych z minimalnych objętości próbek, wspierając diagnostykę chorób rogówki.

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

Przeglądaj więcej filmów