Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych
February 28th, 2025
Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe służą jako biomarkery choroby, odzwierciedlając stany fizjologiczne. Nasze podejście umożliwia ekstrakcję bogatych danych z niewielkich objętości rozdarć, posuwając naprzód badania nad pojazdami elektrycznymi w płynach biologicznych. Kluczowe wyzwania eksperymentalne obejmują uzyskanie wystarczających stężeń pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z małych próbek, zminimalizowanie strat próbki podczas izolacji oraz optymalizację analizy w celu zapobieżenia przesyceniu chipów lub wykrywaniu słabego sygnału.
Protokół ten omija etapy izolacji, skracając czas przetwarzania i umożliwia analizę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z niewielkich objętości próbek, dzięki czemu idealnie nadaje się do ograniczonych próbek biologicznych, takich jak łzy. Nieinwazyjne biomarkery mają kluczowe znaczenie dla wczesnego wykrywania i leczenia zaburzeń rogówki. Biomarkery pęcherzyków zewnątrzkomórkowych umożliwiają monitorowanie choroby, spersonalizowane leczenie, lepsze przestrzeganie zaleceń przez pacjentów i poprawę jakości życia.
Nasze laboratorium było pionierem w analizie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w próbkach łez od osób z KC, identyfikując unikalne sygnatury tEV. Otwiera to drogę dla przyszłej diagnostyki i celów terapeutycznych skoncentrowanych na pojazdach elektrycznych. Na początek umieść próbki biologiczne i chip tetraspaniny na przestrzeni roboczej.
Odpipetować 70 mikrolitrów ludzkich próbek biologicznych, które zostały wstępnie zmieszane z roztworem B ludzkiego zestawu tetraspaniny na chipie. Umieść folię na płycie do mycia wiórów, aby zapobiec parowaniu próbki. Po 16 godzinach umieść płytkę w myjce wiórów.
Zablokuj go na miejscu i zamknij pokrywę. Naciśnij opcję CW-TETRA v0 na podkładce wiórów. Podczas mycia wiórów przygotuj 300 mikrolitrów roztworu blokującego na wiór
.Dodaj 0,6 mikrolitra każdego przeciwciała na chip do roztworu blokującego. Zmieszaj roztwór blokujący z koktajlem przeciwciał, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Po zakończeniu mycia chipów dodaj 250 mikrolitrów roztworu blokującego z koktajlem przeciwciał na wierzchu każdego chipsa.
Następnie zamknij pokrywę i naciśnij Kontynuuj. Gdy myjka do wiórów zacznie ćwierkać, zdejmij płytkę do mycia wiórów. Przesuń wióry w górę rampy.
Umieść płytkę z powrotem w podkładce wiórów, upewniając się, że jest bezpiecznie zablokowana na swoim miejscu. Zamknij pokrywę i naciśnij Kontynuuj. Aby rozpocząć, włącz analizator nanocząstek.
Uruchom oprogramowanie skanujące na pulpicie podłączonym do analizatora nanocząstek. Wybierz folder na wióry, aby wybrać każdy chip tetraspanin i zlokalizować go w pozycji chipa na uchwycie. Kliknij trzy kwadraty poniżej pozycji chipa, aby włączyć fluorescencję.
Kwadraty zmienią kolor na żółty, niebieski i czerwony. Naciśnij pokrywę uchwytu i pociągnij ją, aby ją zdjąć. Następnie mocno przymocuj chipy tetraspaniny załadowane próbką do uchwytu.
Dopasuj kołki pokrywy uchwytu do otworów i dociśnij. Przesuń pokrywę, aby zablokować ją na miejscu. Następnie umieść uchwyt na stoliku i zablokuj go na miejscu.
Następnie kliknij Skanuj chipy w interfejsie oprogramowania, a następnie kliknij OK. Gdy stolik całkowicie przesunie się do maszyny, zamknij drzwi. Po zakończeniu skanowania otwórz drzwiczki, aby wysunąć stolik i sprawdzić wyniki. Jeśli skanowanie zakończyło się pomyślnie, wyrzuć chipy.
Umieść następny zestaw wiórów na uchwycie. Alternatywnie, włóż pusty uchwyt z powrotem na scenę. Wyjdź z oprogramowania i wyłącz urządzenie po zakończeniu.
Optymalne poziomy fluorescencji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zaobserwowano w kanałach CD63, CD81 i CD9, podczas gdy kanał kontrolny MIgG pozostał, co potwierdza swoistość kontrolną. CD81 został zredukowany dla płynów biologicznych. Brak fluorescencji w kanałach CD63, CD81 i CD9 wskazuje na brak pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.
Widoczne było przesycenie fluorescencji, co utrudniało dostrzeżenie istotnych danych z powodu nadmiernego znakowania, szczególnie w kanałach CD63, CD81 i CD9.
Przegląd
Niniejsza praca prezentuje nową metodę charakteryzacji pozakomórkowych pęcherzyków (EVs) pobranych z ludzkich płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina. Wykorzystując chip tetraspaninowy, podejście to ułatwia analizę EVs z minimalnych objętości próbek, co poszerza badania nad nieinwazyjnymi biomarkerami do monitorowania chorób.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Pozakomórkowe pęcherzyki
- Nieinwazyjne biomarkery
- Choroby oczu
Wprowadzenie
- EVs stanowią wskaźniki stanów fizjologicznych i chorób
- Wyzwania obejmują niskie stężenia w małych próbkach i czas przetwarzania próbek
- Znaczenie wczesnego wykrywania zaburzeń rogówki
Wykorzystane metody
- Wykorzystanie chipu tetraspaninowego do analizy EV
- Ludzkie próbki biologiczne (łzy)
- Wykrywanie oparte na fluorescencji markerów EV CD63, CD81 i CD9
Główne wyniki
- Integracja etapów przygotowania próbki i analizy skraca czas przetwarzania
- Poziomy fluorescencji markerów EV potwierdziły specyficzność i obecność
- Identyfikacja sygnatur tEV w próbkach łz od pacjentów z keratokonusem
Wnioski
- Ta metoda zapewnia usprawnione podejście do analizy EV z małych próbek biologicznych
- Wyniki wspierają przyszłą diagnostykę i cele terapeutyczne w obszarze zdrowia oczu
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicles (EVs) from minimal biological fluid volumes addresses a critical bottleneck in non-invasive biomarker discovery and disease monitoring. This workflow enables high-content EV phenotyping from scarce patient samples, supporting translational research and early-stage target validation. The approach enhances predictive confidence for biomarker-driven portfolio decisions in ocular and systemic disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-based biomarkers for disease-relevant pathway analysis.
- Supports functional target validation by quantifying EV phenotypes from patient-derived fluids.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking EV signatures to physiological states.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV detection systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible EV marker measurements from as little as 1 μL of sample.
- Standardizes assay conditions to minimize sample loss and maximize data quality.
Translational & Preclinical Research
- Aligns non-invasive EV biomarker analysis with disease monitoring strategies.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation using patient-derived fluids.
- Supports risk-adjusted advancement of biomarker-driven therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This EV characterization protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early biomarker identification with translational validation in limited-sample contexts.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing for EV biomarker relevance in disease states.
- Screening: Offers reproducible, quantitative EV marker readouts for assay development.
- Analytics: Delivers particle count, size, and phenotype data to compare biological conditions.
- Translational Research: Connects non-invasive sample analysis to preclinical biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for EV analysis across diverse biological fluids.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker discovery and target validation.
- Operational Value: Reduces sample requirements and processing time while enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for biomarker-driven programs and reduces late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of non-invasive biomarker assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EV biology and fluorescence-based detection systems.
- Needs access to nanoparticle analyzers and tetraspanin chip technology.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptable to various biological fluids with protocol optimization.
- Potential limitations include chip oversaturation and signal detection thresholds.
