Oznaczanie czterech składników w systemie dostarczania nanocząstek lipidowych RNA za pomocą chromatografii cieczowej połączonej z detektorem rozpraszania światła wyparnego

Nasze badania koncentrują się na zastosowaniu chromatograficznej spektrometrii mas w dziedzinie kwasów nukleinowych, białek peptydowych i CDT. Wyzwanie tego eksperymentu polega na oddzieleniu wielu składników LNP i określeniu składników o znacznych różnych stężeniach i problemach resztkowych. Zaletą tego protokołu jest to, że osiąga dobrą separację, szeroki zakres liniowy i bieżące oznaczanie LNP przy niskich kosztach.

Na początek skonfiguruj wysokowydajną chromatografię cieczową lub system HPLC w połączeniu z detektorem rozpraszania światła wyparnego. Zamontować kolumnę chromatograficzną zgodnie z kierunkiem strzałki na kolumnie. Podłącz jeden koniec do wylotu automatycznego podajnika światła, a drugi do wlotu detektora rozpraszania światła wyparnego.

Aby przygotować fazę A, dokładnie odmierz i przenieś 1 387 mikrolitrów trietyloaminy i rozpuść ją w 1000 mililitrach wody. Dobrze wymieszaj i dostosuj pH do siedmiu za pomocą kwasu octowego. Aby przygotować fazę B, rozpuść 1 387 mikrolitrów trietyloaminy w 1000 mililitrach metanolu.

Dokładnie wymieszaj i dostosuj pH do siedmiu kwasem octowym. Umieść fazę A i fazę B na tacy. Uruchom oprogramowanie LabSolutions i otwórz okno analizy w czasie rzeczywistym.

Kliknij Plik i wybierz Nowy, aby utworzyć nowy plik metody, zmodyfikuj czas zatrzymania chromatografii cieczowej na 15 minut, a następnie kliknij Zastosuj do całego czasu akwizycji. Następnie kliknij Pompa i zmodyfikuj parametry pompy. Wybierz tryb analizy jako binarny gradient wysokiego ciśnienia lub BGE i ustaw natężenie przepływu na jeden mililitr na minutę.

Ustaw początkowe stężenie pompy B na 80%Zmodyfikuj ruchomy gradient fazy na trzy minuty do 80%na cztery minuty do 85%od 5.5 do 12 minut na 100%a po 12.1 minutach pozwól, aby pompa wróciła do 80%Teraz kliknij Piec kolumnowy i ustaw temperaturę piekarnika na 55 stopni Celsjusza. Następnie kliknij ELSD, aby zmodyfikować temperaturę rurki dryfującej do 40 stopni Celsjusza i zapisać metodę. Kliknij Pobierz i uruchom, aby uruchomić i zrównoważyć instrument.

Dokładnie zważyć 10 miligramów każdej z czterech standardowych substancji składowych nanocząstek lipidowych oddzielnie. Rozpuść każdy z nich w jednym mililitrze metanolu i wiruj aż do całkowitego rozpuszczenia, aby uzyskać roztwory podstawowe o stężeniu 10 miligramów na mililitr dla każdego składnika. Za pomocą pipety dokładnie przenieść 100 mikrolitrów każdego roztworu podstawowego do fiolki z próbką.

Dodaj 600 mikrolitrów metanolu i dokładnie wymieszaj, aby przygotować mieszany roztwór pośredni o stężeniu 1000 mikrogramów na mililitr. Teraz dokładnie przenieś 20 mikrolitrów każdego roztworu podstawowego do fiolki z próbką. Dodaj 920 mikrolitrów metanolu i dokładnie wymieszaj, aby przygotować zmieszany roztwór pośredni dwa o stężeniu 200 mikrogramów na mililitr.

Przygotować serię roztworów wzorcowych o różnych stężeniach przez seryjne rozcieńczanie. Następnie za pomocą pipety dokładnie przenieś 100 mikrolitrów próbki do fiolki z próbką. Następnie dodaj 900 mikrolitrów metanolu i dobrze wymieszaj, aby zapewnić dziesięciokrotne rozcieńczenie nanocząstek lipidowych i ich dysocjację od leku kwasu nukleinowego.

Umieścić roztwory wzorcowe i roztwory próbek w automatycznym podajniku próbek chromatografu cieczowego. Kliknij partię w czasie rzeczywistym na pasku narzędzi asystenta w oknie analizy w czasie rzeczywistym. Następnie kliknij przycisk Nowy w menu Plik, aby utworzyć nową tabelę wsadową.

W tabeli partii wprowadzić numer fiolki, nazwę tacki, plik danych oraz objętość iniekcji roztworu wzorcowego i roztworu próbki. Wybierz zapisany plik metody i kliknij zapisz plik wsadowy w menu Plik. Poczekaj, aż ciśnienie chromatografu cieczowego i linia bazowa chromatogramu ustabilizują się.

Następnie kliknij rozpocznij partię w czasie rzeczywistym na pasku narzędzi asystenta, aby rozpocząć pobieranie danych. W celu analizy danych otwórz okno przeglądarki oprogramowania LabSolutions. Przeciągnij dane roztworu wzorcowego do widoku wyników ilościowych, aby wyznaczyć krzywą kalibracyjną.

Zmodyfikuj parametry przetwarzania danych, klikając Edytuj w widoku metody. W oknie parametrów integracji zmień algorytm integracji na I-PeakFinder i ustaw typ linii bazowej na Base na Base. Następnie w parametrach identyfikacji zmień metodę identyfikacji na band i ustaw domyślną przepustowość na 0,1 minuty.

Aby zmodyfikować parametry ilościowe, należy zmienić metodę ilościową na standard zewnętrzny. Ustaw liczbę poziomów kalibracji na siedem. Następnie wybierz typ krzywej kalibracyjnej wykładniczo i zmodyfikuj ustawienia związku.

Wprowadzić nazwy i stężenia roztworu wzorcowego czterech składników nanocząstek lipidowych. Kliknij dwukrotnie wierzchołek szczytu, aby zaktualizować czasy przechowywania. Kliknij przycisk Widok, aby zakończyć modyfikację parametrów przetwarzania danych.

Teraz zmodyfikuj typ próbki w widoku wyników ilościowych na standardowy punkt obliczeń. Ustaw poziomy roztworu wzorcowego od jednego do siedmiu w zależności od stężeń. Po ustaleniu krzywych kalibracyjnych kliknij Plik na pasku menu i Zapisz plik metody.

Przeciągnij przykładowe dane do widoku wyników ilościowych w oknie przeglądarki. Obserwuj wyświetlane wyniki stężeń czterech składników nanocząstek lipidowych w próbkach. W analizie roztworu wzorcowego LNP osiągnięto separację wyjściową ze stopniem separacji większym niż 1,5 dla czterech składników, a w roztworach wzorcowych o wysokim stężeniu nie zaobserwowano żadnych pozostałości.

Krzywa kalibracyjna dla czterech składników wykazywała współczynniki korelacji przekraczające 0,999 w zakresie stężeń od pięciu do 250 mikrogramów na mililitr, co wskazuje na doskonałą liniowość. Metoda wykazała wysoką odtwarzalność, ze względnym odchyleniem standardowym dla czasu retencji mniejszym niż 0,1% i względnym odchyleniem standardowym dla powierzchni piku mniejszym niż 2% w oparciu o sześć powtórzonych wstrzyknięć po 10 mikrogramów na mililitr roztworu wzorcowego. Analiza rzeczywistych próbek LNP rozcieńczonych 10-krotnie metanolem wykazała stężenia składników w zakresie od 150 mikrogramów na mililitr do 1 500 mikrogramów na mililitr, osiągając niezmiennie wysoką separację i czułość u wielu producentów.