Name: Oznaczanie czterech składników w systemie dostarczania nanocząstek lipidowych RNA za pomocą chromatografii cieczowej połączonej z detektorem rozpraszania światła wyparnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj metodę HPLC z detektorem ELSD do analizy nanocząstek lipidowych w systemach dostarczania RNA. Technika zapewnia doskonałą separację, szeroki zakres liniowy i wysoką czułość przy niskich kosztach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękuję firmom biofarmaceutycznym za dostarczenie próbek LNP do eksperymentu i dziękujemy firmie Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd za dostarczenie kolumny chromatograficznej.

1. Przygotowanie instrumentu
<ol>
	<li>Konfiguracja instrumentu
	<ol>
		<li>Skonfiguruj system HPLC sprzężony z ELSD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalacja kolumny
	<ol>
		<li>Zamontuj kolumnę chromatograficzną (C4-300; 150 mm × 4,6 mm średnicy wewnętrznej, 5 μm), zgodnie z kierunkiem strzałki na kolumnie, z jednym końcem podłączonym do wylotu automatycznego podajnika próbek, a drugim z wlotem ELSD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie fazy ruchomej
	<ol>
		<li>Przygotować fazy ruchome: fazę A, 10 mM wodnego roztworu TEAA (pH = 7,0) i fazę B, 10 mM roztworu metanolu TEAA (pH = 7,0).</li>
		<li>Aby przygotować fazę A, dokładnie odważ 1,01 g trietyloaminy, rozpuść ją w 1000 ml wody, dobrze wymieszaj i dostosuj pH do 7,0 kwasem octowym.</li>
		<li>Aby przygotować fazę B, rozpuść 1,01 g trietyloaminy w 1000 ml metanolu, wymieszaj i dostosuj pH do 7,0 kwasem octowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Edycja metody
	<ol>
		<li>Włącz przełączniki zasilania dla każdego modułu LC-ELSD i uruchom oprogramowanie LabSolutions. Następnie otwórz okno Analiza w czasie rzeczywistym.</li>
		<li>Kliknij Plik i wybierz Nowy, aby utworzyć nowy plik metody. Zmodyfikuj czas zatrzymania LC w metodzie na 15 i kliknij przycisk Zastosuj do wszystkich czasów akwizycji.</li>
		<li>Następnie kliknij Pompa, aby zmodyfikować parametry pompy. Wybierz tryb analizy jako binarny gradient wysokiego ciśnienia (B.GE) i ustaw natężenie przepływu na 1,0 ml/min.</li>
		<li>Następnie ustaw początkowe stężenie pompy B (%B) na 80% i zmodyfikuj gradient fazy ruchomej: po 3 minutach %B wynosi 80%, po 4 minutach %B wynosi 85% od 5,5 min do 12 min, %B wynosi 100%, po 12,1 min, %B wraca do 80%.</li>
		<li>Następnie kliknij Piekarnik kolumnowy i ustaw temperaturę piekarnika na 55 °C. Na koniec kliknij ELSD, aby zmienić temperaturę rurki dryfującej na 40 °C. Zapisz metodę. 
		UWAGA: Podsumowanie parametrów przedstawiono w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom i zrównoważ instrument.
	<ol>
		<li>Kliknij Pobierz i uruchom, aby uruchomić i zrównoważyć instrument.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów wzorcowych i próbek
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów wzorcowych
	<ol>
		<li>Dokładnie odważyć 10,0 mg czterech substancji wzorcowych składnika LNP oddzielnie, rozpuścić w 1 ml metanolu i wirować aż do całkowitego rozpuszczenia, aby uzyskać roztwory podstawowe o stężeniu 10 mg/ml dla każdego składnika.</li>
		<li>Za pomocą pipety dokładnie przenieść 100 μl każdego z czterech roztworów podstawowych do fiolki z próbką, a następnie dodać 600 μl metanolu. Dokładnie wymieszać, aby przygotować zmieszany roztwór pośredni 1 o stężeniu 1000 μg/ml.</li>
		<li>Dokładnie przenieść 20 μl każdego z czterech roztworów podstawowych do fiolki z próbką, a następnie dodać 920 μl metanolu. Dokładnie wymieszać, aby przygotować zmieszany roztwór pośredni 2 o stężeniu 200 μg/ml.</li>
		<li>Następnie należy przygotować serię roztworów wzorcowych o stężeniach 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/mL, 200 μg/ml i 250 μg/ml przez seryjne rozcieńczanie zgodnie z tabelą 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety dokładnie przenieść 100 μl próbki do fiolki z próbką, a następnie dodać 900 μl metanolu i dobrze wymieszać. W tym momencie należy upewnić się, że stężenie LNP w próbce jest rozcieńczone 10-krotnie, a LNP jest dysocjowany od leku kwasu nukleinowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Akwizycja danych
<ol>
	<li>Umieścić roztwory wzorcowe i roztwory próbek w automatycznym podajniku próbek chromatografu cieczowego.</li>
	<li>Kliknij Realtime Batch na pasku narzędzi asystenta w oknie Analiza w czasie rzeczywistym. Następnie kliknij przycisk Nowy w menu Plik, aby utworzyć nową tabelę wsadową.</li>
	<li>W tabeli partii wprowadź fiolkę#, nazwę tacy, plik danych oraz objętość iniekcji roztworu wzorcowego i próbki, a następnie wybierz plik metody zapisany w kroku 1.4. Kliknij Zapisz plik wsadowy w menu Plik, aby zapisać plik wsadowy.</li>
	<li>Poczekaj, aż ciśnienie chromatografu cieczowego i linia bazowa chromatogramu ustabilizują się. Następnie kliknij Rozpocznij partię w czasie rzeczywistym na pasku narzędzi asystenta, aby rozpocząć pobieranie danych.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Ustalanie krzywych kalibracyjnych
	<ol>
		<li>Otwórz okno przeglądarki oprogramowania LabSolutions i przeciągnij dane roztworu wzorcowego do widoku wyników ilościowych, aby ustalić krzywą kalibracyjną. Następnie zmodyfikuj parametry przetwarzania danych. Kliknij Edytuj w widoku metody.</li>
		<li>W oknie Parametry integracji zmień wartość nachylenia na 10000. Następnie w Parametrach identyfikacji zmień metodę identyfikacji na Band i ustaw Domyślną przepustowość na 0,1 min.</li>
		<li>Następnie zmodyfikuj parametry ilościowe. Zmień metodę ilościową na Wzorzec zewnętrzny i ustaw # poziomu kalibracji na 7. Wybierz typ krzywej kalibracyjnej jako Wykładniczo. Następnie zmodyfikuj złożenie.</li>
		<li>Wprowadzić nazwy i stężenia roztworu wzorcowego czterech składników LNP. Kliknij dwukrotnie wierzchołek szczytu, aby zaktualizować czasy przechowywania. Na koniec kliknij Widok, aby zakończyć modyfikację parametrów przetwarzania danych.</li>
		<li>Zmodyfikuj typ próbki w widoku Wyniki ilościowe na Standardowy (punkt obliczeniowy). W zależności od stężeń ustaw poziomy roztworu wzorcowego od 1-7. Po ustaleniu krzywych kalibracyjnych kliknij Plik na pasku menu i zapisz plik metody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza ilościowa próbek
	<ol>
		<li>Przeciągnij dane próbek do widoku wyników ilościowych w oknie przeglądarki, w którym zostaną wyświetlone wyniki stężeń czterech składników LNP w próbkach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle+%28LNP%29+enables+mRNA+delivery+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy.</a> Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).</li>
<li>Vlatko, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-immunotherapy+application+of+LNP-mRNA%3A+Maximizing+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety.</a> Biomedicines. 9 (5), 530(2021).</li>
<li>Eygeris, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+lipid+nanoparticles+for+RNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery.</a> Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2021).</li>
<li>Sun, D., Lu, Z. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+cationic+and+ionizable+lipids+for+nucleic+acid+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery.</a> Pharm Res. 40 (1), 27-46 (2023).</li>
<li>Rebecca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle+formulations+for+enhanced+co-delivery+of+siRNA+and+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA.</a> Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).</li>
<li>Maugeri, M., Nawaz, M., Papadimitriou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+between+endosomal+escape+of+LNP-mRNA+and+loading+into+EVs+for+transport+to+other+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells.</a> Nat Commun. 10, 4333(2019).</li>
<li>Renee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+PEGylation+on+LNP+based+mRNA+delivery+to+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effects of PEGylation on LNP based mRNA delivery to the eye.</a> PLoS One. 15 (10), e0241006(2020).</li>
<li>Benedicto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+phospholipid+chemistry+for+improved+lipid+nanoparticle+%28LNP%29+delivery+of+messenger+RNA+%28mRNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA).</a> Biomater Sci. 10 (2), 549-559 (2022).</li>
<li>Kamanzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+visualization+of+lipid+nanoparticle+fusion+as+a+function+of+formulation+and+process+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Quantitative visualization of lipid nanoparticle fusion as a function of formulation and process parameters.</a> ACS Nano. 18 (28), 18191-18201 (2024).</li>
<li>Melissa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+lipid+nanoparticles+for+the+delivery+of+nebulized+therapeutic+mRNA+to+the+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs.</a> Nat Biomed Eng. 5 (9), 1059-1068 (2021).</li>
<li>Packer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+for+the+loss+of+mRNA+activity+in+lipid+nanoparticle+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems.</a> Nat Commun. 12 (1), 6777(2021).</li>
<li>Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSnyder%2C+LR+%22Introduction+to+Modern+Liquid+Chromatography%22">Introduction to Modern Liquid Chromatography</a>. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).</li>
<li>Zhang, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mRNA-LNP+components+of+two+globally+marketed+COVID-19+vaccines+on+efficacy+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Effect of mRNA-LNP components of two globally marketed COVID-19 vaccines on efficacy and stability.</a> NPJ Vaccines. 8 (1), 156(2023).</li>
<li>Zhang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+comparison+of+different+ELSD+detectors+in+pharmaceutical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Methods%22%5BJournal%5D)">Performance comparison of different ELSD detectors in pharmaceutical analysis.</a> Anal Methods. 7 (12), 4800-4807 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wszystkie cztery składniki LNP wykazują stosunkowo słabą polaryzację. Podczas analizy przy użyciu kolumny C18 związki docelowe wykazują silną retencję w kolumnie, co prowadzi do poszerzenia piku fosfolipidów dla silnie zatrzymanych składników. Ponadto, po przeanalizowaniu roztworów o wysokim stężeniu, na szczycie kolumny C18 gromadzą się pozostałości, co może zagrozić dokładności oznaczania ilościowego. Chromatogram przedstawiono na rysunku 5.
Aby zoptymalizować m...

Nanocząstka lipidowa (LNP) jest jednym z najbardziej zaawansowanych systemów dostarczania genów niewirusowych, głównie używanym do dostarczania leków kwasów nukleinowych, takich jak oligonukleotydy antysensowne, małe nukleotydy zakłócające, mRNA itp1,2,3. LNP składa się zazwyczaj z czterech składników: lipidów jonizowalnych, lipidów modyfikowanych glikolem polietylenowym (PEG), fosfolipidów i cholesterolu. Kluczowym składnikiem są jonizowalne lipidy, które są decydującym czynnikiem wpływającym na skuteczność dostarczania leków z kwasami nukleinowymi. Pozostałe trzy składniki mogą zwiększać stabilność LNP i zmniejszać rozpoznawanie układu odpornościowego4,5,6.
Różne proporcje czterech składników w LNP mogą znacząco wpłynąć na proces samoorganizacji nanocząstek, wpływając na właściwości takie jak skuteczność kapsułkowania aktywnego składnika farmaceutycznego (API), jego skuteczność dostarczania i szybkość uwalniania in vivo7,8,9. Dlatego konieczne jest ustalenie metody analizy ilościowej dla komponentów LNP, ułatwiając w ten sposób syntezę optymalnego systemu dostarczania LNP10,11.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest współczesną techniką analityczną szeroko stosowaną w analizie farmaceutycznej i jest ceniona ze względu na wysoką wydajność, czułość i możliwości automatyzacji. HPLC obejmuje między innymi różne detektory, w tym konwencjonalne detektory ultrafioletu (UV), a także detektory ogólnego przeznaczenia, takie jak detektory indeksu refrakcji (RID), detektory rozpraszania światła parnego (ELSD), detektory naładowanego aerozolu (CAD) i wysoce selektywne detektory częstotliwości radiowej (RF), między innymi12.
W przypadku analizy czterech składników LNP, które nie mają odrębnych grup absorbujących promieniowanie UV, a tym samym nie dają odpowiedzi w detektorach UV, rozważano użycie detektorów ogólnego przeznaczenia. Chociaż RID jest jedną z takich opcji, nie nadaje się do analizy gradientowej i oferuje stosunkowo niższą czułość w porównaniu z pozostałymi dwoma detektorami ogólnego przeznaczenia; W związku z tym nie został wybrany12. Co więcej, chociaż detektory CAD mogą pochwalić się wysoką czułością, ich zaporowy koszt sprawia, że są mniej atrakcyjne12.
W związku z tym, detektor ELSD został wybrany. Detektor ten posiada charakterystyczną opcję trybu wzmocnienia - tryb "szeroki" - który umożliwia jednoczesną analizę zarówno składników o wysokim stężeniu, jak i śladowych, zwiększając czułość i rozszerzając zakres liniowy.
Ten artykuł wykorzystuje system HPLC sprzężony z ELSD, osiągając efektywną separację i analizę ilościową czterech składników LNP poprzez optymalizację kolumn chromatograficznych, gradientową elucję faz ruchomych i inne warunki13.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.</td><td>CAEQ-4-000319-0050</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Shimadzu (Szanghaj) Global Laboratory Consumables Co., Ltd</td><td>AP135W</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna</td><td>Shimadzu (Szanghaj) Global Laboratory Consumables Co., Ltd</td><td>ShimNex WP C4(380-01235-74)</td><td></td></tr><tr><td>ELSD</td><td>Shimadzu (China) CO., LTD</td><td>ELSD-LT III(228-65900-46)</td><td></td></tr><tr><td>LabSolutions Software</td><td>Shimadzu (Chiny) CO., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC</td><td>Shimadzu (Chiny) CO., LTD</td><td>LC40D XR</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ANPEL Laboratory Technologies (Szanghaj) Inc.</td><td>CAEQ-4-003302-4000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta-100 i mikro; L</td><td>Shimadzu (Szanghaj) Globalne laboratoryjne materiały eksploatacyjne Co., Ltd</td><td>00-NAR-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta-1000 i mikro; L</td><td>Shimadzu (Szanghaj) Globalne Laboratoryjne materiały eksploatacyjne Co., Ltd</td><td>00-NAR-1000</td><td></td></tr><tr><td>TEA</td><td>ANPEL Laboratory Technologies (Szanghaj) Inc.</td><td>CAEQ-4-012190-0250</td><td></td></tr><tr><td>System wody ultraczystej</td><td></td> Mieszalnik wirowy <td>Millipore</td> ZIQ7000T0C <td></td></tr><tr><td>ANPEL</td><td>Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.</td><td>Maszyna VM-B</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie czterech składników w systemie dostarczania nanocząstek lipidowych rna za pomocą chromatografii cieczowej połączonej z detektorem rozpraszania światła wyparnego

Determining Four Components in a Lipid Nanoparticle RNA Delivery System by Liquid Chromatography Combined with Evaporative Light Scattering Detector

Ten artykuł przedstawia metodę analizy składników nanocząstek lipidowych (LNP). LNP, służący jako kluczowy wektor dla leków opartych na RNA, składa się głównie z cholesterolu, PEG z modyfikacjami, lipidów jonizowalnych i lipidów pomocniczych. Składniki te wykazują słabą polarność, co prowadzi do silnej retencji i trudności w separacji przy użyciu chromatografii z odwróconymi fazami, a także brak wyraźnych właściwości absorpcji ultrafioletu. Aby sprostać temu wyzwaniu, system chromatografii cieczowej został sprzężony z detektorem rozpraszania światła wyparnego (ELSD). Dzięki systematycznemu dostosowywaniu typu kolumny chromatograficznej i optymalizacji programu elucji gradientowej fazy ruchomej, uzyskano szybką i całkowitą separację czterech krytycznych składników od linii podstawowej. Wykorzystanie najnowszej technologii ELSD znacznie zwiększyło czułość wykrywania i rozszerzyło zakres liniowy metody. Wyniki eksperymentalne wykazały, że w zakresie stężeń od 5 μg/ml do 250 μg/ml cztery składniki LNP wykazywały doskonałą liniowość ze współczynnikami korelacji większymi niż 0,999, a dokładność wahała się od 94,2% do 108,0%. W eksperymentach precyzyjnych względne odchylenia standardowe zarówno czasu retencji, jak i powierzchni piku dla roztworu wzorcowego 10 μg/ml wynosiły odpowiednio poniżej 0,1% i 2%. W przypadku stosowania tej metody do analizy różnych próbek LNP wszystkie składniki są z powodzeniem rozdzielane, a ich odpowiednia zawartość jest dokładnie określana ilościowo, co podkreśla solidną zdolność adaptacyjną tego podejścia analitycznego.

Analiza roztworu wzorcowego LNP z zastosowaniem tej metody pozwoliła na uzyskanie stopnia rozdzielczości większego niż 1,5 dla czterech składników, co zapewniło rozdzielenie do linii bazowej. Ponadto, w roztworach wzorcowych o wysokim stężeniu nie zaobserwowano pozostałości, co przedstawiono na Rysunku 1. Krzywa kalibracyjna została wyznaczona w zakresie stężeń od 5 do 250 µg/mL, a współczynniki korelacji we wszystkich przypadkach przekroczyły 0,999, co wskazuje na szeroki zakres liniowy i d...

Tutaj ustalamy metodę analizy ilościowej dla czterech składników systemu dostarczania RNA nanocząsteczek lipidowych (LNP) za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej połączonej z detektorem rozpraszania światła wyparnego (ELSD). Metoda charakteryzuje się dobrą separacją, wysoką czułością i wysoką wydajnością.

Oznaczanie czterech składników w systemie dostarczania nanocząstek lipidowych RNA za pomocą chromatografii cieczowej połączonej z detektorem rozpraszania światła wyparnego

This article presents a method for the analysis of lipid nanoparticle (LNP) components. LNP, serving as a pivotal vector for RNA-based drugs, primarily ...

Nasze badania koncentrują się na zastosowaniu chromatograficznej spektrometrii mas w dziedzinie kwasów nukleinowych, białek peptydowych i CDT. Wyzwanie tego eksperymentu polega na oddzieleniu wielu składników LNP i określeniu składników o znacznych różnych stężeniach i problemach resztkowych. Zaletą tego protokołu jest to, że osiąga dobrą separację, szeroki zakres liniowy i bieżące oznaczanie LNP przy niskich kosztach.Na początek skonfiguruj wysokowydajną chromatografię cieczową lub system HPLC w połączeniu z detektorem rozpraszania światła wyparnego. Zamontować kolumnę chromatograficzną zgodnie z kierunkiem strzałki na kolumnie. Podłącz jeden koniec do wylotu automatycznego podajnika światła, a drugi do wlotu detektora rozpraszania światła wyparnego.Aby przygotować fazę A, dokładnie odmierz i przenieś 1 387 mikrolitrów trietyloaminy i rozpuść ją w 1000 mililitrach wody. Dobrze wymieszaj i dostosuj pH do siedmiu za pomocą kwasu octowego. Aby przygotować fazę B, rozpuść 1 387 mikrolitrów trietyloaminy w 1000 mililitrach metanolu.Dokładnie wymieszaj i dostosuj pH do siedmiu kwasem octowym. Umieść fazę A i fazę B na tacy. Uruchom oprogramowanie LabSolutions i otwórz okno analizy w czasie rzeczywistym.Kliknij Plik i wybierz Nowy, aby utworzyć nowy plik metody, zmodyfikuj czas zatrzymania chromatografii cieczowej na 15 minut, a następnie kliknij Zastosuj do całego czasu akwizycji. Następnie kliknij Pompa i zmodyfikuj parametry pompy. Wybierz tryb analizy jako binarny gradient wysokiego ciśnienia lub BGE i ustaw natężenie przepływu na jeden mililitr na minutę.Ustaw początkowe stężenie pompy B na 80%Zmodyfikuj ruchomy gradient fazy na trzy minuty do 80%na cztery minuty do 85%od 5.5 do 12 minut na 100%a po 12.1 minutach pozwól, aby pompa wróciła do 80%Teraz kliknij Piec kolumnowy i ustaw temperaturę piekarnika na 55 stopni Celsjusza. Następnie kliknij ELSD, aby zmodyfikować temperaturę rurki dryfującej do 40 stopni Celsjusza i zapisać metodę. Kliknij Pobierz i uruchom, aby uruchomić i zrównoważyć instrument.Dokładnie zważyć 10 miligramów każdej z czterech standardowych substancji składowych nanocząstek lipidowych oddzielnie. Rozpuść każdy z nich w jednym mililitrze metanolu i wiruj aż do całkowitego rozpuszczenia, aby uzyskać roztwory podstawowe o stężeniu 10 miligramów na mililitr dla każdego składnika. Za pomocą pipety dokładnie przenieść 100 mikrolitrów każdego roztworu podstawowego do fiolki z próbką.Dodaj 600 mikrolitrów metanolu i dokładnie wymieszaj, aby przygotować mieszany roztwór pośredni o stężeniu 1000 mikrogramów na mililitr. Teraz dokładnie przenieś 20 mikrolitrów każdego roztworu podstawowego do fiolki z próbką. Dodaj 920 mikrolitrów metanolu i dokładnie wymieszaj, aby przygotować zmieszany roztwór pośredni dwa o stężeniu 200 mikrogramów na mililitr.Przygotować serię roztworów wzorcowych o różnych stężeniach przez seryjne rozcieńczanie. Następnie za pomocą pipety dokładnie przenieś 100 mikrolitrów próbki do fiolki z próbką. Następnie dodaj 900 mikrolitrów metanolu i dobrze wymieszaj, aby zapewnić dziesięciokrotne rozcieńczenie nanocząstek lipidowych i ich dysocjację od leku kwasu nukleinowego.Umieścić roztwory wzorcowe i roztwory próbek w automatycznym podajniku próbek chromatografu cieczowego. Kliknij partię w czasie rzeczywistym na pasku narzędzi asystenta w oknie analizy w czasie rzeczywistym. Następnie kliknij przycisk Nowy w menu Plik, aby utworzyć nową tabelę wsadową.W tabeli partii wprowadzić numer fiolki, nazwę tacki, plik danych oraz objętość iniekcji roztworu wzorcowego i roztworu próbki. Wybierz zapisany plik metody i kliknij zapisz plik wsadowy w menu Plik. Poczekaj, aż ciśnienie chromatografu cieczowego i linia bazowa chromatogramu ustabilizują się.Następnie kliknij rozpocznij partię w czasie rzeczywistym na pasku narzędzi asystenta, aby rozpocząć pobieranie danych. W celu analizy danych otwórz okno przeglądarki oprogramowania LabSolutions. Przeciągnij dane roztworu wzorcowego do widoku wyników ilościowych, aby wyznaczyć krzywą kalibracyjną.Zmodyfikuj parametry przetwarzania danych, klikając Edytuj w widoku metody. W oknie parametrów integracji zmień algorytm integracji na I-PeakFinder i ustaw typ linii bazowej na Base na Base. Następnie w parametrach identyfikacji zmień metodę identyfikacji na band i ustaw domyślną przepustowość na 0,1 minuty.Aby zmodyfikować parametry ilościowe, należy zmienić metodę ilościową na standard zewnętrzny. Ustaw liczbę poziomów kalibracji na siedem. Następnie wybierz typ krzywej kalibracyjnej wykładniczo i zmodyfikuj ustawienia związku.Wprowadzić nazwy i stężenia roztworu wzorcowego czterech składników nanocząstek lipidowych. Kliknij dwukrotnie wierzchołek szczytu, aby zaktualizować czasy przechowywania. Kliknij przycisk Widok, aby zakończyć modyfikację parametrów przetwarzania danych.Teraz zmodyfikuj typ próbki w widoku wyników ilościowych na standardowy punkt obliczeń. Ustaw poziomy roztworu wzorcowego od jednego do siedmiu w zależności od stężeń. Po ustaleniu krzywych kalibracyjnych kliknij Plik na pasku menu i Zapisz plik metody.Przeciągnij przykładowe dane do widoku wyników ilościowych w oknie przeglądarki. Obserwuj wyświetlane wyniki stężeń czterech składników nanocząstek lipidowych w próbkach. W analizie roztworu wzorcowego LNP osiągnięto separację wyjściową ze stopniem separacji większym niż 1,5 dla czterech składników, a w roztworach wzorcowych o wysokim stężeniu nie zaobserwowano żadnych pozostałości.Krzywa kalibracyjna dla czterech składników wykazywała współczynniki korelacji przekraczające 0,999 w zakresie stężeń od pięciu do 250 mikrogramów na mililitr, co wskazuje na doskonałą liniowość. Metoda wykazała wysoką odtwarzalność, ze względnym odchyleniem standardowym dla czasu retencji mniejszym niż 0,1% i względnym odchyleniem standardowym dla powierzchni piku mniejszym niż 2% w oparciu o sześć powtórzonych wstrzyknięć po 10 mikrogramów na mililitr roztworu wzorcowego. Analiza rzeczywistych próbek LNP rozcieńczonych 10-krotnie metanolem wykazała stężenia składników w zakresie od 150 mikrogramów na mililitr do 1 500 mikrogramów na mililitr, osiągając niezmiennie wysoką separację i czułość u wielu producentów.

determining-four-components-lipid-nanoparticle-rna-delivery-system

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje metodę ekstruzji służącą do przygotowania pęcherzyków lipidowych o rozmiarach submikronowych i wysokim stopniu jednorodności. Metoda ta wykorzystuje system z kontrolą ciśnienia i regulowanym przepływem azotu do przygotowania liposomów. W opracowaniu przedstawiono przygotowanie lipidów1,2, ekstruzję liposomów oraz charakterystykę ich rozmiaru.

Metoda ekstruzji z kontrolowanym stałym ciśnieniem do przygotowania nano-rozmiarowych pęcherzyków lipidowych

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

W tym badaniu opisano metodę syntezy ultra-małych populacji biokompatybilnych nanocząstek, a także kilka metod in vitro, za pomocą których można ocenić ich interakcje komórkowe.

Stałe nanocząstki lipidowe (SLN) do zastosowań wewnątrzkomórkowych

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Ten artykuł opisuje enkapsulację falkarindiolu w pokrytych lipidami nanocząstkach o długości fali 74 nm. Komórkowy wychwyt nanocząstek przez ludzkie komórki macierzyste do kropelek lipidów jest monitorowany za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i konfokalnego. Nanocząstki są wytwarzane metodą szybkiego wstrzykiwania rozpuszczalnika, a ich rozmiar mierzy się za pomocą techniki dynamicznego rozpraszania światła.

Wychwyt nowych nanocząstek pokrytych lipidami zawierających falkarindiol przez ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste

Ten protokół opisuje wytwarzanie liposomów oraz sposób, w jaki można je unieruchomić na powierzchni i zobrazować indywidualnie w masowy równoległy sposób za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala to na ilościowe określenie wielkości i niejednorodności składu między pojedynczymi liposomami populacji.

Ilościowy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Pokazujemy, jak używać nowatorskiego instrumentu do analizy śledzenia nanocząstek, aby oszacować rozkład wielkości i całkowite stężenie cząstek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyizolowanych z mysiej tkanki tłuszczowej okołokomórkowej i ludzkiego osocza.

Analiza śledzenia nanocząstek w celu ilościowego określenia i określenia wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia nanocząsteczek lipidowych (LNP), które zawierają mRNA kodujące lucyferazy świetlika. Te LNP zostały przetestowane pod kątem ich siły działania in vitro w komórkach HepG2 i in vivo u myszy C57BL / 6.

Testowanie skuteczności in vitro i in vivo nanocząstek mRNA-lipidów powstałych metodą mieszania mikroprzepływowego

Szczegółowy protokół syntezy nanocząsteczek lipidowych (LNP) przy użyciu technologii mieszalnika CIJ (Limited Impinging Jet), w tym dwustrumieniowego CIJ i czterostrumieniowego mieszalnika wirowego z wieloma wlotami (μMIVM), jest zademonstrowany. Mieszalniki CIJ generują powtarzalne, turbulentne środowiska mikromieszania, co skutkuje produkcją monodyspersyjnych LNP.

Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem

Poznaj metodę HPLC z detektorem ELSD do analizy nanocząstek lipidowych w systemach dostarczania RNA. Technika zapewnia doskonałą separację, szeroki zakres liniowy i wysoką czułość przy niskich kosztach.

Oznaczanie czterech składników w systemie dostarczania nanocząstek lipidowych RNA za pomocą chromatografii cieczowej połączonej z detektorem rozpraszania światła wyparnego (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczanie czterech składników w systemie dostarczania nanocząstek lipidowych RNA za pomocą chromatografii cieczowej połączonej z detektorem rozpraszania światła wyparnego

Przeglądaj więcej filmów