Name: Wizualizacja dynamiki mikroorganizmów obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Odkryj metody wizualizacji genów mikroorganizmów obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych. Protokół łączy zoptymalizowane PCR z GIS, umożliwiając mapowanie przestrzenne i sezonowe zmiany związane z czynnikami środowiskowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni członkom C-REAL za ich pomoc w obserwacji terenowej i analizach laboratoryjnych.

1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Próbki osadów należy pobierać za pomocą próbnika lub łopaty. 
	UWAGA: Próbki pobrano z dwóch stacji trzech odrębnych przybrzeżnych terenów podmokłych w chłodnych (październik-luty, średnia temperatura wynosi 20 °C) i ciepłych (kwiecień-czerwiec, średnia temperatura wynosi 27 °C) sezonach 2023 i 2024. Próbnik do chwytania osadów został użyty, gdy próbki zostały pobrane z przybrzeżnych słodkowodnych terenów podmokłych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), a łopata została użyta do przybrzeżnych mokradeł morskich pod wpływem pływów.</li>
	<li>Najpierw opuść próbnik do płytkiego zbiornika wodnego i pozwól mu opaść na powierzchnię osadu (w górnych 50 cm) pod własnym ciężarem, minimalizując zakłócenia struktury osadu, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
	<li>Wyciągnij go ze słupa wody, gdzie głębokość wynosiła zwykle od 60 cm do 215 cm30, przenieś próbki osadu do woreczków strunowych i natychmiast przechowuj je w pojemniku na lód. 
	UWAGA: Oczyść i umyj próbnik chwytakowy wodą dejonizowaną (DI) przed przejściem do kolejnych stacji.</li>
	<li>Wszystkie próbki należy natychmiast przechowywać w temperaturze -20 °C w laboratorium.</li>
	<li>W każdym miejscu pobierania próbek należy zmierzyć parametry jakości wód powierzchniowych, takie jak zasolenie i temperatura in situ, za pomocą wieloparametrowego miernika jakości wody. 
	UWAGA: Sondy zostały przepłukane wodą dejonizowaną (woda DI) po użyciu w każdej stacji.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja genomowego DNA
<ol>
	<li>Rozmrozić próbki w temperaturze pokojowej przed rozpoczęciem procedury ekstrakcji genomowego DNA.</li>
	<li>Przenieść około 500 mg próbek osadu do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 4 250 × g przez 3 minuty w celu usunięcia całej wody.</li>
	<li>Wyodrębnij genomowe DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA do gleby zgodnie z protokołem producenta31 z niewielką modyfikacją i natychmiast przechowuj w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Zmiany zostały wprowadzone w celu zmniejszenia nadmiarowości i wydajnego przepływu pracy.
	<ol>
		<li>Dodać do 500 mg próbki gleby do probówki zawierającej szklaną kulkę/ceramiczną kulę.</li>
		<li>Dodać 978 μl buforu fosforanowo-sodowego do próbki w probówce zawierającej kulkę/kulkę.</li>
		<li>Dodać 122 μl roztworu do lizy buforowej do próbki w probówce zawierającej kulkę/kulkę, aby rozpuścić zanieczyszczenia zewnętrzne.</li>
		<li>Homogenizować za pomocą homogenizatora z młynkiem perełkowym przy 5-krotności prędkości przez 20 s i powtórzyć 2x, 
		UWAGA: W tym badaniu użyto homogenizatora młynka perełkowego, dlatego dostosowano prędkość obrotową.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 14 000 × g.</li>
		<li>Przenieść supernatant do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml.</li>
		<li>Dodaj 250 μl roztworu do wytrącania białek (PPS), aby oddzielić rozpuszczone kwasy nukleinowe od szczątków komórkowych i matrycy lizy. Wymieszaj, odwracając rurkę 10x.</li>
		<li>Wirować przy 14 000 × g przez 5 minut, aby wytrącić osad, usuwając resztki komórkowe i matrycę lizy.</li>
		<li>Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Dodać 1,0 ml zawiesiny matrycy wiążącej do supernatantu w probówce o pojemności 15 ml. 
		UWAGA: Wstrząśnij zawiesiną Binding Matrix w celu ponownego zawieszenia przed jej dodaniem.</li>
		<li>Pozwól na związanie DNA z matrycą wiążącą, umieszczając probówki na rotatorze na 2 minuty.</li>
		<li>Umieść wszystkie probówki na stojaku i inkubuj przez 3 minuty, aby umożliwić osiadanie matrycy wiążącej.</li>
		<li>Po 3 minutach wyrzucić 750 μl i delikatnie wymieszać pozostały supernatant z osadem za pomocą pipety.</li>
		<li>Przenieść 750 μl mieszaniny do filtra wirującego i odwirować przy 14 000 × g przez 1 minutę. Opróżnij rurkę wychwytującą i użyj jej ponownie. Powtórz z pozostałą mieszanką.</li>
		<li>Dodać 500 μl przygotowanego roztworu myjącego (z dodatkiem odpowiedniej ilości etanolu) w celu dalszego rozpuszczenia zanieczyszczeń. Delikatnie zawiesić osad ponownie, wykorzystując siłę płynu z końcówki pipety.</li>
		<li>Wirować przy 14 000 × g przez 1 minutę w celu usunięcia zanieczyszczeń. Opróżnij rurkę wychwytującą i użyj jej ponownie.</li>
		<li>Odwirować ponownie w temperaturze 14 000 × g przez 2 minuty, nie dodając niczego.</li>
		<li>Wymień rurkę wychwytującą na nową, czystą rurkę wychwytującą i wysusz filtr wirowania na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 50 μl wody wolnej od DNAzy (DES) i odwirować w stężeniu 14 000 × g przez 1 min. 
		UWAGA: W tym protokole do elucji DNA użyto 50 μl DES, aby zapewnić optymalne odzyskiwanie i stabilność wyekstrahowanego środowiskowego DNA (eDNA).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja DNA
<ol>
	<li>Dodać 1 μl wyekstrahowanego DNA z 200 μl barwnika fluorescencyjnego do probówki o pojemności 0,5 ml i dokładnie wymieszać pipetując.</li>
	<li>Natychmiast owinąć probówkę folią aluminiową, aby światło nie mogło przeniknąć i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Zmierz stężenie DNA za pomocą fluorometru w trybie JEDNEGO stężenia DNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
4. Wykrywanie 16S rRNA, pmoA1 , pmoA2 , mmoX i mcrA metodą konwencjonalnego PCR
<ol>
	<li>Przed uruchomieniem konwencjonalnego PCR (cPCR) rozmrozić wszystkie próbki i odczynniki w wiaderku na lód.</li>
	<li>Rozcieńczyć wszystkie wyekstrahowane próbki eDNA do 10 ng/μL. 
	UWAGA: Wykaz starterów znajduje się w Tabeli 1.</li>
	<li>Przygotować 25 μl mieszaniny reakcyjnej cPCR dla każdej próbki, w tym 12,5 μl 2x PCR Master mix, 0,5 μl starterów do przodu i do tyłu (10 μM) (patrz tabela 1 dla listy starterów), 1 μl 10 ng/μL eDNA i 10,5 μl wody wolnej od nukleaz. 
	UWAGA: Przygotuj mieszankę wzorcową o objętości wystarczającej na jedną dodatkową próbkę, aby zminimalizować błędy pipetowania.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję cPCR zgodnie z protokołem składającym się z początkowej denaturacji w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 45 s, przedłużenia w temperaturze 72 °C przez 30 s i końcowego przedłużenia w temperaturze 72 °C przez 5 m, przy różnej temperaturze wyżarzania dla różnych starterów (patrz tabela 1 dla temperatur wyżarzania różnych starterów stosowanych dla różnych genów). 
	UWAGA: Dla genu mcrA, startery ML wykazały pożądane pasmo przy użyciu powolnej szybkości narastania 0,1 °C/s między etapami wyżarzania i wydłużania przez pierwsze pięć cykli32.</li>
	<li>Wizualizacja produktów cPCR w żelu agarozowym wstępnie wybarwionym bromkiem etydyny (EtBr). 
	UWAGA: Użyj 2,5% żelu agarozowego do drabiny 50 pz i 0,9% żelu do drabiny 1 kb. Użyj 1x buforu TAE dla 2,5% żelu agarozowego i 0,5x buforu TAE dla żelu 0,9% agarozowego.</li>
</ol>
5. Wykrywanie pmoA1 , pmoA2 , mmoX i mcrA za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym
UWAGA: Geny ukierunkowane na metanogeny i metanotrofy, takie jak obfitość pmoA1, pmoA2, mmoX i mcrA, zostały zaobserwowane przez qPCR przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym.
<ol>
	<li>Przygotuj wzorce dla każdego genu osobno, aby uzyskać krzywą wzorcową dla każdego genu.
	<ol>
		<li>Amplifikuj docelowy gen za pomocą cPCR, używając próbek, które wytworzyły najjaśniejsze pasmo podczas elektroforezy żelowej każdego genu. Postępuj zgodnie z metodą i podstawami opisanymi w punkcie 4.</li>
		<li>Oczyścić amplifikowane produkty za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu i zmierzyć stężenie DNA zgodnie z metodą opisaną w sekcji 3 i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Podwielokrotność oczyszczonych wzorców przelać do oddzielnych probówek do dalszego wykorzystania.</li>
		<li>Oblicz kopie genów na podstawie zmierzonego stężenia DNA, korzystając ze strony internetowej do obliczania liczby kopii dla qPCR.</li>
		<li>Rozcieńczyć obliczoną liczbę kopii wzorca wodą wolną od nukleaz, aby przygotować każdy wzorzec, w zakresie od 108 do 102 kopii/μl, przed uruchomieniem qPCR.</li>
		<li>Przygotować krzywą wzorcową, używając trzech powtórzeń każdej liczby kopii, w tym kontroli ujemnej (NTC, brak matrycy DNA). 
		UWAGA: Wartość R2 każdej krzywej standardowej była większa niż 0,99.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną qPCR o pojemności 20 μl dla wszystkich próbek, wzorców i NTC. Przeprowadzić analizę qPCR w trzech powtórzeniach dla wszystkich próbek.
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem umieść wszystkie składniki reakcji, w tym główną mieszankę qPCR, startery, wodę wolną od nukleaz, wzorce i próbki, na stojaku na lód.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną qPCR o objętości 20 μl dla każdej próbki, wzorca i NTC, zawierającą 10 μl mieszanki wzorcowej SYBR Green, 0,5 μl każdego z 10 μM starterów do przodu i do tyłu, 8 μl wody wolnej od nukleaz i 1 μl odpowiednio 10 ng/μl matrycy DNA lub wody wzorcowej lub DI. 
		UWAGA: Użyj pokazanych zestawów starterów, aby uzyskać optymalne wyniki dla genów pmoA1 i mcrA w konwencjonalnym PCR dla qPCR (patrz Tabela 1). Aby zwiększyć dokładność, należy przeprowadzić każdą próbkę w trzech egzemplarzach. Poniższe kroki zapewniają skuteczną metodę przygotowania potrójnych próbek o łącznej objętości 60 μl na próbkę.
		<ol>
			<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną w celu połączenia mieszanki wzorcowej, starterów do przodu i do tyłu dla określonego genu oraz wody wolnej od nukleaz w probówce o pojemności 2 ml, z wyjątkiem matrycy DNA. 
			UWAGA: Przygotować objętość mieszaniny reakcyjnej z uwzględnieniem błędu pipetowania. Na przykład, jeśli istnieją 24 próbki i 8 wzorców, oblicz całkowitą objętość dla 33 reakcji zamiast 32 reakcji, aby zminimalizować błędy pipetowania. W takim przypadku całkowita objętość wymagana do przeprowadzenia reakcji potrójnych byłaby następująca: 990 μl mieszaniny wzorcowej (33 próbki x 3 kontrpróby x 10 μl), 49,5 μl starterów wstępnych (33 próbki x 3 kontrpróby x 0,5 μl), 49,5 μl starterów odwróconych (33 próbki x 3 kontrpróby x 0,5 μl), i 792 μl wody wolnej od nukleaz (33 próbki x 3 kontrpróby x 8 μl).</li>
			<li>Przygotuj probówki PCR zgodnie z liczbą próbek i wzorcami.</li>
			<li>Dozować 57 μl przygotowanej mieszaniny reakcyjnej do każdej probówki PCR. 
			UWAGA: Aby przeprowadzić qPCR dla każdej próbki w trzech egzemplarzach, należy przygotować całkowitą objętość mieszaniny reakcyjnej wynoszącą 57 μl na próbkę (z wyłączeniem matrycy DNA, wzorca lub wody). Objętość ta zostanie równo podzielona na trzy studzienki na jedną próbkę, przy czym 19 μl zostanie przydzielonych do każdej studzienki.</li>
			<li>Do każdej probówki dodać 3 μl matrycy DNA, wody wzorcowej lub wolnej od nukleaz i wymieszać, delikatnie stukając w dno probówki. 
			UWAGA: Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej przygotowanej dla jednej próbki wynosiłaby teraz 60 μl w każdej probówce.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podwielokrotność 20 μl przygotowanej mieszaniny reakcyjnej z każdej probówki do wyznaczonych dołków 96-dołkowej płytki qPCR. Uszczelnij płytkę PCR samoprzylepną folią uszczelniającą do PCR za pomocą aplikatora.</li>
		<li>Odwirować szczelnie zamkniętą płytkę o masie 1 000 × g przez 1 minutę, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie i wyeliminować wszelkie pęcherzyki w studzienkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść płytkę PCR w termocyklerze. Włącz maszynę qPCR, a następnie otwórz odpowiednie oprogramowanie, aby skonfigurować protokół.
	<ol>
		<li>Ustaw protokół zgodnie z wytycznymi qPCR master mix. Stosować następujący protokół: 95 °C przez 10 minut, następnie 95 °C przez 15 s i stopień przedłużający w temperaturze 72 °C przez 30 s. Etap wyżarzania należy wykonać w temperaturze wyżarzania określonej dla odpowiednich podkładów w tabeli 1 przez 45 sekund. Przeprowadzić wszystkie serie qPCR przez 35 cykli.</li>
		<li>Ustawić 96-dołkową płytkę qPCR z wzorcami i NTC w tej samej konfiguracji, co płytka zawierająca próbkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj metody bezwzględnej krzywej standardowej kwantyfikacji, aby określić ilościowo amplifikowany produkt i liczbę kopii genu w każdej próbce33.</li>
</ol>
6. Wizualizacja genów obiegu metanu na mapie mokradeł południowego Teksasu
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie systemu informacji geograficznej (GIS) ArcGIS Pro i zapisz plik projektu o nazwie Analizowany obszar w określonym folderze na komputerze.</li>
	<li>Kliknij Mapa w lewym górnym rogu | Mapa bazowa i wybierz opcję Teren z etykietami jako mapę bazową.</li>
	<li>Kliknij Zlokalizuj | Wyszukaj, a gdy otworzy się pasek wyszukiwania, zlokalizuj badany obszar, wpisując jego nazwę; Obszar się pojawi.</li>
	<li>Narysuj określony obszar za pomocą georeferencji.
	<ol>
		<li>Kliknij Widok | Okienko katalogu z górnej warstwy.</li>
		<li>Kliknij dwukrotnie Folder w katalogu | Nazwa pliku.</li>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy plik geobazy (.gdb), a następnie kliknij Nowy | Zostaną wyświetlone opcje Klasa elementów i Utwórz klasę elementów.</li>
		<li>Wpisz pole Nazwa i alias i kliknij przycisk Zakończ u dołu.</li>
		<li>Kliknij Widok | Spis treści. Nazwa aliasu pojawi się w okienku Zawartość.</li>
		<li>Kliknij Edytuj z górnej warstwy | Utwórz. Otworzy się okienko Utwórz obiekty. Kliknij dwukrotnie alias w okienku Utwórz obiekty, a pojawi się opcja Konfiguruj informacje zwrotne o narzędziu.</li>
		<li>Wybierz Linie, a następnie naszkicuj linie na mapie, aby utworzyć zewnętrzną granicę analizowanego obszaru. Po zakończeniu kliknij dwukrotnie mapę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zminimalizuj oprogramowanie GIS, a następnie otwórz arkusz kalkulacyjny. Wpisz nazwę próbki w pierwszej kolumnie, wprowadź szerokość geograficzną w drugiej kolumnie i długość geograficzną w trzeciej kolumnie. Następne cztery kolumny służą do przechowywania danych qPCR pmoA1, pmoA2, mmoX i mcrA.</li>
	<li>Zapisz plik w formacie CSV w dowolnym folderze na komputerze.</li>
	<li>Otwórz ponownie oprogramowanie GIS i kliknij opcję Dodaj dane | Dane punktu XY.</li>
	<li>Wybierz plik CSV z folderu na komputerze w polu Tabela wejściowa. Zmień nazwę pliku w wynikowej klasie elementów, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby wyświetlić punkty próbkowania na mapie.</li>
	<li>Kliknij navpasek wyszukiwania u góry i wyszukaj Kriging.</li>
	<li>Wybrać plik stacji pobierania próbek, a następnie wybrać pmoA1.</li>
	<li>Kliknij przycisk Środowisko | wybierz pikietę próbkowania w obszarze Warstwa i maska | kliknij przycisk Uruchom.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołami wymienionymi w krokach 6.9, 6.10 i 6.11, aby utworzyć Kriging dla pmoA2, mmoX i mcrA dla całego badanego obszaru.</li>
	<li>Utwórz układ mapy.
	<ol>
		<li>Kliknij Wstaw z górnej warstwy | Nowy układ i wybierz ANSI - Poziomo.</li>
		<li>Kliknij Ramkę mapy, wybierz mapę z Krigingiem i umieść wszystkie mapy w układzie, rysując prostokąt. Spowoduje to, że mapa będzie widoczna w układzie.</li>
		<li>Wybierz strzałkę północy i umieść ją w układzie, aby wskazać kierunek północny.</li>
		<li>Wybierz opcję Podziałka liniowa, aby wyświetlić skalę obszaru na mapie.</li>
		<li>Kliknij Legenda, aby wyświetlić legendy, a następnie umieść ją w układzie.</li>
		<li>Kliknij opcję Siatka i wybierz dowolną opcję czarnej siatki. Spowoduje to utworzenie siatki z szerokością i długością geograficzną i wyświetlenie jej w okienku zawartości z etykietą pozioma siatka etykietowa.</li>
		<li>Kliknij dwukrotnie czarną poziomą siatkę etykiet, a następnie wybierz Komponenty. Kliknij Znaczniki 1 i Siatka, a następnie usuń te komponenty, klikając znak krzyżyka po ich prawej stronie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij Udostępnij z górnej warstwy, a następnie kliknij Eksportuj układ. Wybierz typ pliku jako PDF, zapisz plik na komputerze za pomocą pola nazwy, ustaw rozdzielczość pionową na 500 DPI, a następnie kliknij przycisk Eksportuj, aby utworzyć plik PDF mapy.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Przybrzeżne tereny podmokłe są uznawane za znaczące czynniki przyczyniające się do powstawania metanu w atmosferze, ważnego gazu cieplarnianego40 . Chociaż przeprowadzono badania nad strumieniem metanu i metanogenami na terenach podmokłych41,42,43, niewiele wiadomo na temat tego, jak metanotrofy działają w różnych środowiskach lub przy różnych praktykach zarządzania, zwłaszcza na terenach podmokłych o zmi...

Przybrzeżne tereny podmokłe są kluczowymi ekosystemami, które przyczyniają się do regulacji klimatu, ochrony różnorodności biologicznej i gospodarki wodnej poprzez procesy takie jak sekwestracja węgla, ewapotranspiracja i emisje metanu (CH4)1. Ekosystemy te, w tym zarówno słodkowodne, jak i słonowodne tereny podmokłe2, są wysoce produktywne i działają jako krytyczne strefy dla pochłaniania dwutlenku węgla (CO2) i wychwytywania materii organicznej ze środowisk lądowych i morskich3,4. Dynamiczne interakcje na tych terenach podmokłych stymulują produkcję i konsumpcję mikroorganizmów CH45, pozycjonując je jako jedno z największych naturalnych źródeł CH46. Jako drugi najważniejszy gaz cieplarniany, CH4 ma potencjał globalnego ocieplenia około 27-30 razy większy niż CO24,7,8,9, co sprawia, że badanie emisji CH4 z przybrzeżnych terenów podmokłych jest niezbędne w erze zmian klimatycznych. Na emisjęCH4 wpływają różne czynniki środowiskowe, w szczególności zasolenie, odgrywające kluczową rolę w procesach mikrobiologicznych10. Słodkowodne tereny podmokłe w znacznym stopniu przyczyniają się do emisji metanu w atmosferze ze względu na niższy poziom siarczanów, co ułatwia większą produkcję mikrobiologicznąCH4, podczas gdy słonowodne tereny podmokłe na ogół emitują mniejCH4 ze względu na wyższe stężenia siarczanów11,12,13.
Emisje CH4 z przybrzeżnych terenów podmokłych są zazwyczaj kontrolowane przez dwie grupy mikroorganizmów, znane jako metanogeny i metanotrofy14. Metanogeny wytwarzająCH4 w osadach beztlenowych poprzez rozkład substratów, takich jak mrówczan, octan, wodór lub związki metylowe, w procesie znanym jako metanogeneza15. Ważnym enzymem w tym szlaku jest metylokoenzym M reduktaza (MCR), ponieważ katalizuje ostatni i ograniczający szybkość etap metanogenezy15,16,17. Gen mcrA, który koduje podjednostkę alfa MCR, jest funkcjonalnym markerem, który można znaleźć we wszystkich archeonach metanogennych 18. Ponadto na przybrzeżnych terenach podmokłych strefa przejściowa siarczanowo-metanowa (SMTZ) tworzy się powyżej strefy metanogennej, gdzie metan dyfundujący w górę i siarczan poruszający się w dół zbiegają się i są zubożone19. W tej strefie beztlenowe archeony metanotroficzne (ANME) utleniają metan do dwutlenku węgla za pomocą enzymu MCR, podczas gdy bakterie redukujące siarczany (SRB) redukują siarczan do siarczku. SRB konkuruje z metanogenami pod względem wodoru i octanu, ograniczając produkcję metanu do wyczerpania siarczanu16,17.
Natomiast tlenowe bakterie metanotroficzne utleniają CH4 w środowisku tlenowym20, wykorzystując różne formy monooksygenazy metanu (MMO). Należą do nich monooksygenaza metanu w cząstkach stałych (pMMO), enzym zawierający miedź osadzony w błonie wewnątrzcytoplazmatycznej, oraz rozpuszczalna monooksygenaza metanu (sMMO), enzym zawierający żelazo znajdujący się w cytoplazmie. Jednak dla pMMO istnieją trzy operony genowe pmoCAB21; wśród nich gen pmoA jest najbardziej konserwatywny dla wszystkich metanotrofów. Istnieją dwa różne geny biomarkerów dla pmoA: pmoA1 i pmoA222. Ponadto, dla pełnego zrozumienia metanotrofów, gen mmoX jest używany jako narzędzie w biologii molekularnej do identyfikacji metanotrofów zawierających sMMO23. To rozróżnienie w szlakach metabolicznych i wymaganiach środowiskowych metanogenów i tlenowych metanotrofów podkreśla złożone interakcje mikrobiologiczne regulujące obieg metanu w przybrzeżnych ekosystemach podmokłych.
Mokradła Boca Chica (BC), produktywne środowisko słonowodne w południowym Teksasie, doświadczają wpływów pływowych z Zatoki Meksykańskiej (GOM), co prowadzi do zmiennych poziomów zasolenia powierzchni, szczególnie ze względu na bliskość hipersoli Laguna Madre24. To działanie pływowe, naprzemiennie przypływy i odpływy, powoduje wahania poziomu tlenu25, co może zmienić aktywność metanogenu i metanotrofu w osadach26. Natomiast przybrzeżne słodkowodne tereny podmokłe są uważane za znaczący punkt zapalny dla strumieni CH4 27. Przybrzeżne słodkowodne tereny podmokłe w południowym Teksasie, w tym Resaca Del Rancho Viejo (RV) i Lozano Banco (LB), oddalone od skutków pływów GOM, mają wyraźne zarządzanie hydrologiczne. RV doświadcza przepływów pulsacyjnych uzupełnianych przez wodę rzeczną podczas niskich poziomów wody, podczas gdy LB działa jako system przepływu offline bez takiej suplementacji. Ponadto RV i LB utrzymują niższy poziom zasolenia ze względu na wysoki zrzut sztucznie pompowanej słodkiej wody i bycie odpowiednio starorzeczem. Różne czynniki środowiskowe mogą znacząco wpływać na obieg metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych południowego Teksasu. Jednak obieg metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych południowego Teksasu pozostaje obszarem, który nie został jeszcze dokładnie zbadany.
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) i PCR w czasie rzeczywistym (zwana również ilościowym PCR [qPCR]) reprezentują podstawowe i szeroko stosowane techniki wykrywania i ilościowego określania względnej obfitości określonych genów w próbkach środowiskowych. Techniki te w szczególności amplifikują docelowe regiony DNA, aby wskazać obecność i względną ilość genów związanych z cyklamiCH4, dostarczając wskaźników potencjalnego obiegu metanu. Niemniej jednak dostępność i skuteczność zestawów starterów PCR może być ograniczona przez różne czynniki hamujące w wyekstrahowanym DNA środowiskowym, na które wpływ mają typy środowisk28,29. W związku z tym badanie to głównie ustaliło optymalną metodę PCR do wykrywania obecności genów związanych z jazdą na rowerze CH4 na przybrzeżnych terenach podmokłych południowego Teksasu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1), a następnie zwizualizowano ich ilościowo określoną względną liczebność w tych ekosystemach. Wyniki tego badania można zastosować w innych regionach przybrzeżnych w celu lepszego zrozumienia cykli CH4 i dynamiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach przybrzeżnych.

<table><tbody><tr><td>Probówki do PCR 0,2 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0620</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AB0620?SID=srch-srp-AB0620</td></tr><tr><td>0,5 ml probówki do PCR</td><td>Promega</td><td>E4941</td><td>https://www.promega.com/products/biochemicals-and-labware/tips-and-accessories/0_5ml-pcr-tubes/?catNum=E4941</td></tr><tr><td>10 &mu; Końcówki L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-187</td><td>Fisherbrand SureGrip Końcówki do pipet z systemem racked lub Reload Naturalny; 10&mu; L; | </td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa Fisher Scientific 15 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/p-193301</td></tr><tr><td>200 &mu; L końcówki</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-190</td><td>Fisherbrand SureGrip Końcówka do pipet z systemem racked lub Reload Naturalny; 200&mu; L; | Fisher Scientific</td></tr><tr><td>1000 &mu; L końcówki</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-707-402</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sureone-micropoint-pipette-tips-specific-standard-fit/02707402?gclid=Cj0KCQiAp NW6BhD5ARIsACmEb kUsQ9Lu0YIq5i4vWege 17qPdtxIYZyvmJH1cDo ARuwereO1V4GLz9UaA lDREALw_wcB& ef_id=C j0KCQiApNW6BhD5ARI sACmEbkUsQ9Lu0YIq5i 4vWege17qPdtxIYZyvmJ H1cDoARuwereO1V4GLz 9UaAlDREALw_wcB:G:s & ppc_id=PLA_goog_2175 7693617_171052169911_02 707402__715434303113_1555 377385658230343& ev_chn=sh op& s_kwcid=AL!4428!3!71543430 3113!! g!2366517300713!& _source=1</td></tr><tr><td>Applied Biosystem Power SYBR Green Master Mix&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368577</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4368577</td></tr><tr><td>ArcGIS Pro&nbsp;</td><td>Esri</td><td></td><td>https://www.esri.com/en-us/arcgis/products/arcgis-pro/overview?srsltid=AfmBOopatJ4 JvHJfscHRcAaDx0Jz5_Jrl8l5 vYkkBvfOqE-uNSsMghN1</td></tr><tr><td>System CFX Duet do PCR w czasie rzeczywistym&nbsp;</td><td>Pipetor jednokanałowy Bio-Rad</td><td></td><td>12016265 https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx-duet-real-time-pcr-system?ID=97722926-9ed9-16a4-1d83-c92f587e427a</td></tr><tr><td>Corning Lambda plus o objętości 0,5-10 μm; L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4071-1EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4071</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Lambda&nbsp; plus pojemność pipety jednokanałowej 100-1000&nbsp; &mu; L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4075-1EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4075</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Lambda&nbsp; plus pojemność pipety jednokanałowej 20-200&nbsp; &mu; L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4074-1EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4074</td></tr><tr><td>Zestaw spinowy FastDNA do gleby</td><td>MP Biomedical</td><td>116560200-CF</td><td>https://www.mpbio.com/us/116560000-fastdna-spin-kit-for-soil-samp-cf?srsltid=AfmBOoqOxxGilzY3IHNIZR ajegGTr9MoX1oMZUh 3dcbJqe0UvvukY128</td></tr><tr><td>Kopiowanie genów&nbsp; kalkulator</td><td>Elementarz</td><td></td> <td>naukowyhttps://scienceprimer.com/copy-number-calculator-for-realtime-pcr&nbsp;.</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa szybkoobrotowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004241</td><td>https://newlifescientific.com/products/thermo-scientific-sorvall-st16-high-speed-benchtop-centrifuge-75004241?_source=1&gclid=Cj0KCQiApN W6BhD5ARIsACmEbkVC_-cCIN9j 20TvYq8iDsBlUR5cPK_1_wN OBEcjMdv-CYVoGCfeOLYaAv enEALw_wcB</td></tr><tr><td>Mikrowirówka szybkoobrotowa</td><td>VWR</td><td>75838-336</td><td>https://us.vwr.com/store/product/20546590/null</td></tr><tr><td>Rurka E z matrycą do lizy&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Rurka z kulką szklaną/ceramiczną Probówka</td></tr><tr><td>do mikrowirówek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/02681320?gclid=Cj0KCQiAp NW6BhD5ARIsACm EbkWbG4_o3oUiGk HJPU-_31-CuexDwQ fmWPnfyhBOf2BHXsy K3fFW1toaAgJbEALw_ wcB& ef_id=Cj0KCQiAp NW6BhD5ARIsACmEb kWbG4_o3oUiGkHJPU- _31-CuexDwQfmWPnfy hBOf2BHXsyK3fFW1toa AgJbEALw_wcB:G:s& PPC _id=PLA_goog_21757693 617_171052169911_0268 1320__715434303113_10 349826094968484711& EV _chn=Sklep& s_kwcid=AL!4 428!3!715434303113!!! g!23 66517300713!& _source=1</td></tr><tr><td>PCR Master mix&nbsp;</td>System dsDNA <td>Promega</td><td>M7502</td><td>https://www.promega.com/products/pcr/taq-polymerase/master-mix-pcr/?catNum=M7502</td></tr><tr><td>Quantiflour ONE&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E4871</td><td>https://www.promega.com/products/rna-analysis/dna-and-rna-quantitation/quantifluor-one-dsdna-system/?_source=1&gbraid=0AAAAAD _rg189yJTY3cxeVqMdu8RPx10 Ma& gclid=CjwKCAjwxNW2BhAk EiwA24Cm9FUgViPNyWq7UfZL VeeoroLAZ5JIP6w07RGK_4D0w oZgAqf-G1XTmxoCxm8QAvD_B wE& catNum=E4871</td></tr><tr><td>Fluorometr kwantowy&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E6150</td><td>https://www.promega.com/products/microplate-readers-fluorometers-luminometers/fluorometers/quantus-fluorometer/?catNum=E6150</td></tr><tr><td>YSI Pro 2030</td><td>YSI to marka ksylemu</td><td>603174</td><td>https://www.ysi.com/product/id-p2030/pro2030-kits</td></tr></tbody></table>

wizualizacja dynamiki mikroorganizmów obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych

Visualizing Methane-Cycling Microbial Dynamics in Coastal Wetlands

Przybrzeżne mokradła są największym źródłem biotycznym metanu, gdzie metanogeny przekształcają materię organiczną w metan, a metanotrofy utleniają metan, odgrywając tym samym kluczową rolę w regulacji cyklu metanowego. Tereny podmokłe w południowym Teksasie, które są narażone na częste zjawiska pogodowe, wahania poziomu zasolenia i działalność antropogeniczną spowodowaną zmianami klimatu, wpływają na obieg metanu. Pomimo ekologicznego znaczenia tych procesów, obieg metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych południowego Teksasu pozostaje niewystarczająco zbadany. Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy metodę wykrywania genów związanych z metanogenami i metanotrofami, w tym mcrA jako biomarker metanogenów oraz pmoA1, pmoA2 i mmoX jako biomarkery metanotrofów. Ponadto badanie to miało na celu wizualizację przestrzennych i czasowych wzorców rozmieszczenia obfitości metanogenu i metanotrofu przy użyciu oprogramowania systemu informacji geograficznej (GIS) ArcGIS Pro. Integracja tych technik molekularnych z zaawansowaną wizualizacją geoprzestrzenną dostarczyła krytycznych informacji na temat przestrzennego i czasowego rozmieszczenia zbiorowisk metanogenu i metanotrofów na terenach podmokłych południowego Teksasu. W związku z tym metodologia ustanowiona w tym badaniu oferuje solidne ramy do mapowania dynamiki mikrobiologicznej na terenach podmokłych, pogłębiając naszą wiedzę na temat obiegu metanu w różnych warunkach środowiskowych i wspierając szersze badania nad zmianami ekologicznymi i środowiskowymi.

Aby zrozumieć rozmieszczenie i liczebność genów związanych z cyklem CH4 (mcrA, pmoA1, pmoA2 oraz mmoX) w mokradłach wybrzeża Południowego Teksasu, wyekstrahowane eDNA z każdej próbki przeanalizowano za pomocą cPCR i qPCR. Uniwersalne startery dla każdego biomarkera do cPCR zostały wybrane na podstawie wcześniejszych badań (Tabela 1)22,34,35,<sup class="xr...

Protokół wykrywa kluczowe geny obiegu metanu na mokradłach przybrzeżnych południowego Teksasu i wizualizuje ich rozmieszczenie przestrzenne, aby lepiej zrozumieć regulację metanu i jego wpływ na środowisko w tych dynamicznych ekosystemach.

Wizualizacja dynamiki mikroorganizmów obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych

Coastal wetlands are the largest biotic source of methane, where methanogens convert organic matter into methane and methanotrophs oxidize methane, thus ...

Badanie to wizualnie dopasowało przestrzenny i czasowy rozkład kluczowych genów mikrobiologicznych obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych południowego Teksasu, bada, w jaki sposób czynniki środowiskowe regulują dynamikę metanu. Nasze odkrycia pokazują, że obfitość genów obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych południowego Teksasu jest wrażliwa na warunki środowiskowe, w tym zasolenie i porę roku. W szczególności mmoX, rodzaj genu monooksygenazy metanu, występujący najliczniej w chłodniejszych porach roku.Protokół ten odnosi się do badań nad wykrywaniem genów mikrobiologicznych powodujących obieg metanu, oferując nowatorskie narzędzia do wizualizacji przestrzennej i sezonowej dynamiki drobnoustrojów, na którą wpływają czynniki środowiskowe. Dzięki integracji zoptymalizowanych metod PCR z wizualizacją GIS, protokół ten zapewnia ulepszone wykrywanie i mapowanie przestrzenne genów obiegu metanu, jednocześnie rejestrując dynamiczne, przestrzenne i sezonowe wzorce mikrobiologiczne pod wpływem czynników środowiskowych.[Narrator] Na początek przygotuj 25-mikrolitrową mieszaninę reakcyjną cPCR z eDNA i innymi składnikami. Umieścić probówki w maszynie do PCR i uruchomić reakcję cPCR z odpowiednimi parametrami. Po cPCR należy przygotować mieszaninę reakcyjną qPCR zawierającą cyber green, z wyłączeniem matrycowego DNA. Dozować 57 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny reakcyjnej do każdej probówki PCR. Dodaj 3 mikrolitry matrycowego DNA, wody wzorcowej lub bez nukleazy do każdej probówki i delikatnie postukaj w probówkę, aby wymieszać. Podwielokrotność 20 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny reakcyjnej z każdej probówki do wyznaczonych dołków 96-dołkowej płytki qPCR. Uszczelnij płytkę PCR samoprzylepną folią uszczelniającą do PCR za pomocą aplikatora. I odwiruj go przy 1,000 x g przez jedną minutę, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie i wyeliminować wszelkie pęcherzyki w studzienkach. Umieść płytkę PCR w termocyklerze. Włącz maszynę qPCR i otwórz odpowiednie oprogramowanie, aby skonfigurować protokół. Zainstaluj program qPCR i zainicjuj przebieg. Otwórz oprogramowanie systemu informacji geograficznej ArcGIS Pro i zapisz plik projektu o nazwie Analizowany obszar w określonym folderze na komputerze. Kliknij Mapa, a następnie wybierz opcję Mapa bazowa i wybierz teren z etykietami jako mapę podstawową. Kliknij Zlokalizuj, a następnie kliknij Szukaj. Gdy otworzy się pasek wyszukiwania, wpisz nazwę analizowanego obszaru, aby zlokalizować go na mapie. Aby narysować określony obszar za pomocą odniesień geograficznych, kliknij Widok, a następnie Okienko katalogu z górnej warstwy. Kliknij dwukrotnie folder z katalogu i wybierz żądaną nazwę pliku. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik .gdb geobazy danych. Kliknij przycisk Nowy i wybierz opcję Klasa elementów. Następnie pojawi się okno Utwórz klasę elementów. Wpisz pole Nazwa i alias, a następnie kliknij przycisk Zakończ u dołu. Teraz kliknij Widok, a następnie Spis treści. Nazwa aliasu zostanie wyświetlona w okienku Zawartość. Kliknij Edytuj z górnej warstwy, a następnie Utwórz. Otworzy się okienko Utwórz obiekty. Kliknij dwukrotnie alias w okienku Utwórz obiekty, a pojawią się opcje Konfiguruj informacje zwrotne o narzędziu. Wybierz linie, a następnie naszkicuj linie na mapie, aby utworzyć granicę analizowanego obszaru. Kliknij dwukrotnie mapę, aby zakończyć. Zminimalizuj oprogramowanie GIS i otwórz arkusz kalkulacyjny. Wpisz przykładową nazwę w pierwszej kolumnie, szerokość geograficzną w drugiej kolumnie i długość geograficzną w trzeciej kolumnie. Następne cztery kolumny zawierają dane qPCR pmoA1, pmoA2, mmoX i mcrA. Zapisz plik w formacie CSV w określonym folderze na komputerze. Następnie otwórz oprogramowanie GIS i kliknij Dodaj dane, a następnie Dane punktu XY. Wybierz zapisany plik CSV z folderu w polu Tabela wejściowa. Zmień nazwę pliku w polu Wynikowa klasa elementów i kliknij przycisk Uruchom, aby wyświetlić punkty próbkowania na mapie. Teraz kliknij pasek wyszukiwania u góry i wyszukaj Kriging. Wybrać plik stacji pobierania próbek i wybrać pmoA1. Następnie kliknij środowisko, wybierz stację próbkowania w warstwie i masce, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Aby utworzyć układ mapy, kliknij pozycję Wstaw, Nowy układ i wybierz opcję ANSI-Landscape. Kliknij Ramkę mapy, wybierz mapę z krigingiem i umieść wszystkie mapy w układzie, rysując prostokąty. Wybierz opcję Strzałka północy i umieść ją w układzie, aby wskazać kierunek północny. Następnie wybierz opcję Podziałka liniowa, aby wyświetlić skalę obszaru na mapie. Kliknij Legenda, a następnie umieść ją w układzie, aby wyświetlić legendy mapy. Kliknij Siatka, a następnie wybierz dowolną czarną siatkę, aby utworzyć siatkę z szerokością i długością geograficzną. Siatka pojawi się w okienku Zawartość z etykietą pozioma siatka etykiety. Kliknij dwukrotnie czarną poziomą siatkę etykiet, wybierz Komponenty i usuń znaczniki 1 i siatkę, klikając znak krzyżyka po ich prawej stronie. Na koniec kliknij Udostępnij z górnej warstwy, a następnie kliknij Eksportuj układ. Wybierz typ pliku jako PDF, zapisz plik na komputerze za pomocą pola Nazwa, ustaw rozdzielczość pionową na 500 DPI, a następnie kliknij przycisk Eksportuj, aby utworzyć plik PDF mapy. Analiza cPCR ujawniła przestrzenną zmienność w wykrywaniu genów związanych z obiegiem metanu, przy czym geny mcrA wykryto we wszystkich próbkach LB i RV, ale nie wykryto ich w próbkach BC, co łączy zasolenie z dystrybucją metanogenu. cPCR wykazał jaśniejsze prążki dla pmoA1 z parami starterów A189-mb661, potwierdzając niską, ale wykrywalną obfitość w próbkach RV, podczas gdy nie było jej w LB i BC. Analiza qPCR wykazała dużą zmienność sezonową, przy czym geny mmoX są najliczniejsze w chłodnym sezonie, a pmoA1 najliczniej w ciepłym sezonie.

visualizing-methane-cycling-microbial-dynamics-in-coastal-wetlands

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Analiza cytometryczna przepływu okazała się przydatna do badania czystych kultur i monitorowania dynamiki społeczności mikroorganizmów. Przedstawiamy trzy kompleksowe przepływy pracy, od próbkowania po analizę danych, dla czystych kultur i złożonych społeczności, odpowiednio w przezroczystym podłożu, jak i w trudnych matrycach.

Charakterystyka dynamiki mikrobiomu – przepływy pracy oparte na cytometrii przepływowej od czystych kultur do naturalnych społeczności

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Przedstawiono protokół do generowania dynamicznych krajobrazów chemicznych przez fotolizę w układach mikroprzepływowych i milifluidowych. Metodologia ta jest odpowiednia do badania różnych procesów biologicznych, w tym zachowania ruchliwego, pobierania składników odżywczych lub adaptacji mikroorganizmów do substancji chemicznych, zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji.

Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów

Tutaj staramy się zobrazować strefowanie produktywności biologicznej w Zatoce Narragansett, Rhode Island, w oparciu o model bilansu masy azotu. Wyniki zostaną wykorzystane w gospodarce składnikami odżywczymi w regionach przybrzeżnych w celu ograniczenia niedotlenienia i eutrofizacji.

Wizualizacja stref produktywności w oparciu o model bilansu masy azotu w zatoce Narragansett, Rhode Island

To badanie demonstruje podejście do pomiaru stężeń metanu w próbkach wodnych za pomocą przenośnych analizatorów optycznych połączonych z komorą wtryskową w zamkniętej pętli. Wyniki są podobne do wyników konwencjonalnej chromatografii gazowej, co stanowi praktyczną i tanią alternatywę, szczególnie przydatną do zdalnych badań terenowych.

Pomiar rozpuszczonego metanu w ekosystemach wodnych za pomocą analizatora gazów ze spektroskopią optyczną

Opisano protokół przygotowania prostego modelu ekosystemu, który odtwarza gradient przeciwstawny metanowo-tlenowy występujący w naturalnym środowisku tlenowych bakterii utleniających metan, umożliwiając badanie ich fizjologii w przestrzennie rozwiązanym kontekście. Opisano również modyfikacje popularnych testów biochemicznych do stosowania z ekosystemem modelowym opartym na agarozie.

Modelowy ekosystem oparty na agarozie do hodowli metanotrofów w przeciwgradieniu metanowo-tlenowym

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak pobierać próbki z drewnianych próbek w celu ogólnej oceny ich struktur wzrostu. Opisano makro- i mikroskopowe techniki preparacji i wizualizacji niezbędne do wygenerowania dobrze odwzorowanych i wysoce rozdzielczych zbiorów danych anatomicznych i dendroekologicznych drewna.

Perspektywa techniczna we współczesnych badaniach słojów drzew - jak pokonać wyzwania dendroekologiczne i anatomiczne drewna

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Dostępny jest protokół do ilościowego oznaczania genów bakteryjnych 16S rRNA i transkryptów z osadów przybrzeżnych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Metodologia obejmuje jednoczesną ekstrakcję DNA i RNA; przygotowanie RNA wolnego od DNA; oraz kwantyfikacja genu 16S rRNA i transkryptu za pomocą RT-q-PCR, w tym konstrukcja krzywej standardowej.

Jednoczesna ekstrakcja DNA-RNA z osadów przybrzeżnych i kwantyfikacja genów i transkryptów 16S rRNA metodą Real-time PCR

Fosfolipidowe kwasy tłuszczowe dostarczają informacji o strukturze zbiorowisk mikroorganizmów glebowych. Przedstawiono metody ekstrakcji z próbek glebowych za pomocą jednofazowej mieszaniny chloroformu, frakcjonowania wyekstrahowanych lipidów za pomocą kolumn ekstrakcyjnych do fazy stałej oraz metalizy do produkcji estrów metylowych kwasów tłuszczowych, które są analizowane za pomocą kapilarnej chromatografii gazowej.

Ekstrakcja i analiza mikrobiologicznych fosfolipidowych kwasów tłuszczowych w glebie

Odkryj metody wizualizacji genów mikroorganizmów obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych. Protokół łączy zoptymalizowane PCR z GIS, umożliwiając mapowanie przestrzenne i sezonowe zmiany związane z czynnikami środowiskowymi.

Wizualizacja dynamiki mikroorganizmów obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych

Przeglądaj więcej filmów