Wizualizacja dynamiki mikroorganizmów obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych

Badanie to wizualnie dopasowało przestrzenny i czasowy rozkład kluczowych genów mikrobiologicznych obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych południowego Teksasu, bada, w jaki sposób czynniki środowiskowe regulują dynamikę metanu. Nasze odkrycia pokazują, że obfitość genów obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych południowego Teksasu jest wrażliwa na warunki środowiskowe, w tym zasolenie i porę roku. W szczególności mmoX, rodzaj genu monooksygenazy metanu, występujący najliczniej w chłodniejszych porach roku.

Protokół ten odnosi się do badań nad wykrywaniem genów mikrobiologicznych powodujących obieg metanu, oferując nowatorskie narzędzia do wizualizacji przestrzennej i sezonowej dynamiki drobnoustrojów, na którą wpływają czynniki środowiskowe. Dzięki integracji zoptymalizowanych metod PCR z wizualizacją GIS, protokół ten zapewnia ulepszone wykrywanie i mapowanie przestrzenne genów obiegu metanu, jednocześnie rejestrując dynamiczne, przestrzenne i sezonowe wzorce mikrobiologiczne pod wpływem czynników środowiskowych.

[Narrator] Na początek przygotuj 25-mikrolitrową mieszaninę reakcyjną cPCR z eDNA i innymi składnikami. Umieścić probówki w maszynie do PCR i uruchomić reakcję cPCR z odpowiednimi parametrami. Po cPCR należy przygotować mieszaninę reakcyjną qPCR zawierającą cyber green, z wyłączeniem matrycowego DNA. Dozować 57 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny reakcyjnej do każdej probówki PCR. Dodaj 3 mikrolitry matrycowego DNA, wody wzorcowej lub bez nukleazy do każdej probówki i delikatnie postukaj w probówkę, aby wymieszać. Podwielokrotność 20 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny reakcyjnej z każdej probówki do wyznaczonych dołków 96-dołkowej płytki qPCR. Uszczelnij płytkę PCR samoprzylepną folią uszczelniającą do PCR za pomocą aplikatora. I odwiruj go przy 1,000 x g przez jedną minutę, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie i wyeliminować wszelkie pęcherzyki w studzienkach. Umieść płytkę PCR w termocyklerze. Włącz maszynę qPCR i otwórz odpowiednie oprogramowanie, aby skonfigurować protokół. Zainstaluj program qPCR i zainicjuj przebieg. Otwórz oprogramowanie systemu informacji geograficznej ArcGIS Pro i zapisz plik projektu o nazwie Analizowany obszar w określonym folderze na komputerze. Kliknij Mapa, a następnie wybierz opcję Mapa bazowa i wybierz teren z etykietami jako mapę podstawową. Kliknij Zlokalizuj, a następnie kliknij Szukaj. Gdy otworzy się pasek wyszukiwania, wpisz nazwę analizowanego obszaru, aby zlokalizować go na mapie. Aby narysować określony obszar za pomocą odniesień geograficznych, kliknij Widok, a następnie Okienko katalogu z górnej warstwy. Kliknij dwukrotnie folder z katalogu i wybierz żądaną nazwę pliku. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik .gdb geobazy danych. Kliknij przycisk Nowy i wybierz opcję Klasa elementów. Następnie pojawi się okno Utwórz klasę elementów. Wpisz pole Nazwa i alias, a następnie kliknij przycisk Zakończ u dołu. Teraz kliknij Widok, a następnie Spis treści. Nazwa aliasu zostanie wyświetlona w okienku Zawartość. Kliknij Edytuj z górnej warstwy, a następnie Utwórz. Otworzy się okienko Utwórz obiekty. Kliknij dwukrotnie alias w okienku Utwórz obiekty, a pojawią się opcje Konfiguruj informacje zwrotne o narzędziu. Wybierz linie, a następnie naszkicuj linie na mapie, aby utworzyć granicę analizowanego obszaru. Kliknij dwukrotnie mapę, aby zakończyć. Zminimalizuj oprogramowanie GIS i otwórz arkusz kalkulacyjny. Wpisz przykładową nazwę w pierwszej kolumnie, szerokość geograficzną w drugiej kolumnie i długość geograficzną w trzeciej kolumnie. Następne cztery kolumny zawierają dane qPCR pmoA1, pmoA2, mmoX i mcrA. Zapisz plik w formacie CSV w określonym folderze na komputerze. Następnie otwórz oprogramowanie GIS i kliknij Dodaj dane, a następnie Dane punktu XY. Wybierz zapisany plik CSV z folderu w polu Tabela wejściowa. Zmień nazwę pliku w polu Wynikowa klasa elementów i kliknij przycisk Uruchom, aby wyświetlić punkty próbkowania na mapie. Teraz kliknij pasek wyszukiwania u góry i wyszukaj Kriging. Wybrać plik stacji pobierania próbek i wybrać pmoA1. Następnie kliknij środowisko, wybierz stację próbkowania w warstwie i masce, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Aby utworzyć układ mapy, kliknij pozycję Wstaw, Nowy układ i wybierz opcję ANSI-Landscape. Kliknij Ramkę mapy, wybierz mapę z krigingiem i umieść wszystkie mapy w układzie, rysując prostokąty. Wybierz opcję Strzałka północy i umieść ją w układzie, aby wskazać kierunek północny. Następnie wybierz opcję Podziałka liniowa, aby wyświetlić skalę obszaru na mapie. Kliknij Legenda, a następnie umieść ją w układzie, aby wyświetlić legendy mapy. Kliknij Siatka, a następnie wybierz dowolną czarną siatkę, aby utworzyć siatkę z szerokością i długością geograficzną. Siatka pojawi się w okienku Zawartość z etykietą pozioma siatka etykiety. Kliknij dwukrotnie czarną poziomą siatkę etykiet, wybierz Komponenty i usuń znaczniki 1 i siatkę, klikając znak krzyżyka po ich prawej stronie. Na koniec kliknij Udostępnij z górnej warstwy, a następnie kliknij Eksportuj układ. Wybierz typ pliku jako PDF, zapisz plik na komputerze za pomocą pola Nazwa, ustaw rozdzielczość pionową na 500 DPI, a następnie kliknij przycisk Eksportuj, aby utworzyć plik PDF mapy. Analiza cPCR ujawniła przestrzenną zmienność w wykrywaniu genów związanych z obiegiem metanu, przy czym geny mcrA wykryto we wszystkich próbkach LB i RV, ale nie wykryto ich w próbkach BC, co łączy zasolenie z dystrybucją metanogenu. cPCR wykazał jaśniejsze prążki dla pmoA1 z parami starterów A189-mb661, potwierdzając niską, ale wykrywalną obfitość w próbkach RV, podczas gdy nie było jej w LB i BC. Analiza qPCR wykazała dużą zmienność sezonową, przy czym geny mmoX są najliczniejsze w chłodnym sezonie, a pmoA1 najliczniej w ciepłym sezonie.