Name: Skuteczne i bezpieczne dostarczenie genów do nerki myszy poprzez powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wektorów adeno-stowarzyszonych wirusów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Poznaj metodę powolnego wstrzyknięcia wstecznego do miedniczki nerkowej wektorów AAV u myszy. Technika umożliwia skuteczne i bezpieczne dostarczenie genów do kanalików nerkowych bez uszkodzenia tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Guangping Gao i James M. Wilson za dostarczenie nam pomocniczego plazmidu AAV9 oraz Katji Pekrun i Mark A. Kay za pomocniczy plazmid AAV-KP3.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane tutaj zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Wykorzystywania w Oregon Health & Science University (OHSU) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami w OHSU. W niniejszym badaniu zastosowano 8-tygodniowe myszy samce C57BL/6J. Reaktancje i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Produkcja wektora AAV przez transfekcję plazmidem wolnym od adenowirusów
<ol>
	<li>Kultura komórek nerki embrionalnej człowieka (HEK) 293 w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g/L) uzupełnione o 10% łożyskowe surowica wołowa (FBS), 1% Penicillin and Streptomycin Mix oraz 1 mM L-glutamina, w inkubatorze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla (CO2).</li>
	<li>W dniu -2 (48 godzin przed transfekcją) zasiej 4 x 106 komórek HEK 293 na kolbę T225 w 40 mL pożywki opisanej w punkcie 1.1. Osiąga się ~95% konfluencji w dniu 0. 
	UWAGA: Skalę kultury można dostosować w zależności od zastosowania. W przypadku miniprzygotowania AAV (krok 2), przygotuj odpowiednią liczbę kolb w oparciu o docelową tytuł i stężenie wektora, mając na uwadze, że proces oczyszczania zazwyczaj powoduje utratę materiału w wysokości około 50%. Aby osiągnąć >6 x 1012 vg/mL wektorów AAV9 i AAV-KP3 do wstrzyknięcia RP u myszy w dawce 3 x 1011 vg/mysz w 50 µL roztworu wektora, zaleca się co najmniej 2 kolby. W przypadku produkcji wektorów AAV na większą skalę, takich jak AAV wektorów oczyszczonych gradientem gęstości CsCl (AAV CsCl), zazwyczaj stosuje się 25 lub więcej kolb.</li>
	<li>Dzień 0: Transfekcja DNA plazmidowego
	<ol>
		<li>Przygotowanie do transfekcji
		<ol>
			<li>Upewnij się, że komórki osiągnęły ~95% konfluencji.</li>
			<li>Podgrzej DMEM uzupełnione o 1% Penicillin and Streptomycin Mix i 1 mM L-glutamina, ale bez FBS (czyli pożywka wolna od surowicy) w kąpieli wodnej 37 °C.</li>
			<li>Pozwól roztworowi liniowego polietyleniminu (PEI) osiągnąć temperaturę pokojową.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie mieszaniny DNA plazmidowego
		<ol>
			<li>Wymieszaj plazmidy (15 µg każdy z pAAV-CAG-tdTomato, pRepCap i pHelper) w 1 mL buforu fosforanowego bez CaCl2 lub MgCl2 w sterylnych mikroprobówkach 1,5 mL. Łączna ilość DNA wynosi 45 µg/kolba. 
			UWAGA: Można zignorować objętości roztworów DNA plazmidowego, jeśli są minimalne. Jednak zaleca się dostosowanie objętości, jeśli łączna objętość roztworu wynosi ≥225 µL. Sekwencje plazmidów użytych w tym badaniu są dostępne w Pliku uzupełniającym 1.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Transfekcja PEI
		<ol>
			<li>Dodaj 90 µL roztworu PEI (1 mg/mL) do 1 mL PBS i wymieszaj z mieszanką PBS-DNA plazmidowego (przygotowaną jak wyżej) w 50 mL polipropylenowej probówce. Końcowa objętość wynosi około 2 mL (5% objętości pożywki kulturalnej).</li>
			<li>Vorteksuj probówki przez 5 s i krótko przekręć je w wirówce, aby zebrać płyn na dnie probówek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pozostaw w temperaturze pokojowej na 15 min, aby utworzyć kompleksy DNA plazmidowego-PEI.</li>
		<li>Po zakończeniu 15-minutowej inkubacji dodaj 40 mL przegrzanego pożywka wolna od surowicy przygotowanej w punkcie 1.3.1.2 do kompleksów DNA plazmidowego-PEI. Objętość wynosi około 42 mL.</li>
		<li>Zamień pożywkę kulturalną w kolbie T225 na kompleksy DNA plazmidowego-PEI zawierające pożywkę wolną od surowicy opisane w punkcie 1.3.4.</li>
		<li>Utrzymuj komórki w tym medium transfekcyjnym do momentu zbioru w dniu 5 (nie jest wymagana zmiana pożywki).</li>
		<li>W dniu 2 obserwuj komórki transfekowane plazmidem wyrażającym białka fluorescencyjne (np. pAAV-CAG-tdTomato) pod mikroskopem fluorescencyjnym odwróconym, aby ocenić skuteczność transfekcji plazmidowej. 
		UWAGA: Warunki opisane powyżej zwykle dają skuteczność transfekcji przekraczającą 70%. Możliwe są pewne zmiany morfologiczne (np. wydłużenie komórek), prawdopodobnie z powodu środowiska wolnego od surowicy.</li>
		<li>W dniach 3 do 5 kontynuuj hodowlę transfekowanych komórek w inkubatorze 37 °C z 5% CO2.</li>
		<li>W dniu 5 zebraj zarówno komórki, jak i zawierające wirusa medium do 50 mL polipropylenowej probówki.</li>
		<li>Przechowuj próbki w -80 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie wektorów AAV przez wirowania ultrafiltracją wirową (AAV miniprzygotowanie)
<ol>
	<li>Roztwież zamrożoną próbkę z kr

H.N. otrzymuje tantiemy z technologii związanych z AAV na licencji Takara Bio Inc. i Capsigen Inc., pełni rolę konsultanta dla firm biotechnologicznych, jest współzałożycielem Capsigen Inc. i posiada udziały w Capsigen Inc. oraz Sphere Gene Therapeutics.

To raport zawiera szczegółową instrukcję powolnej wstrząśnięcia wstecznego do wstrzyknięć do miedniczki nerkowej wektorów AAV jako metody podanej lokalnie do dostarczenia genów do nerki myszy. Jednym z kluczowych kroków dla bezpiecznego przeprowadzenia wstrzyknięcia do miedniczki nerkowej jest ustawienie szybkości wstrzyknięcia wektorów AAV, aby uniknąć uszkodzenia parenchymy wstrzykniętej nerki. W poprzednim raporcie na temat hydrodynamicznego wstrzyknięcia do miedniczki nerkowej, 100 µL roztworu DNA plasmidowego został...

Skuteczne i bezpieczne metody dostarczania genów do nerki u małych i dużych zwierząt eksperymentalnych stanowią kluczowe możliwości dla rozwoju podstawowych badań nad nerkami i rozpoznawania innowacyjnych podejść terapeutycznych. Ustanowienie takich metod jest szczególnie istotne dla terapii genowej różnych chorób nerek. Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie klinicznych badań genetycznych ujawniły wyższą częstość występowania zespołów nerek monogenicznych niż wcześniej szacowano, co dotyczy około 30% pacjentów z przewlekłymi chorobami nerek (CKD)1. CKD charakteryzuje się progresywnym uszkodzeniem nerek, prowadzącym ostatecznie do niewydolności nerek, bez naprawdę skutecznych terapii modyfikujących przebieg choroby. Dializa i przeszczepianie nerek są obecnie dostępnymi leczeniami; jednak mają ograniczenia, które znacząco pogarszają jakość życia pacjentów z CKD2. Dlatego terapia genowa, klinicznie sprawdzone potężne podejście do leczenia chorób genetycznych, zwróciła na siebie znaczną uwagę w ostatnich latach jako nowa droga do skutecznego leczenia genetycznych chorób nerek prowadzących do CKD3,4,5,6. Takie podejście może bezpośrednio zwrócić się przeciwko pierwotnym przyczynom chorób i potencjalnie zaoferować leczenie.
Mimo stałych postępów w tej dziedzinie, dostarczanie genów do nerek pozostaje znaczącym wyzwaniem zarówno w badaniach jak i w ustawieniach terapeutycznych. Skuteczne ukierunkowanie komórek nerkowych z terapeutycznymi genami jest trudne z powodu złożonej struktury narządu i unikalnych barier fizjologicznych, w tym bariery filtracji kłębuszkowej, która składa się z komórek śródbłonka kłębuszkowego, błony podstawnej kłębuszka i wypustek stopy kłębuszkowych. Różne strategie zostały zbadane dla dostarczania genów ukierunkowanych na nerki, w tym bezpośrednie wstrzyknięcie do kory nerkowej (RC)7,8, wstrzyknięcie do tętnicy nerkowej (RA)9,10,11, wstrzyknięcie do żyły nerkowej (RV)12,13,14, wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej (RP)15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 i wstrzyknięcie dożylne (IV)19,26,27,28,29,30 wirusowych lub niewirusowych wektorów dostarczania genów, a także dostarczania kwasów nukleinowych przy użyciu ultradźwięków i mikrobąbelek31,32. Te podejścia wykazały różne poziomy efektywności transdukcji lub wyników funkcjonalnych, często dając niekonsekwentne wyniki, które są trudne do pogodzenia (przejrzane w odniesieniach3,33,34,35). Dostarczanie genów do nerek jest nadal nierozwinięte, co sprawia, że porównywanie wektorów systemów i metodologii jest trudne. Jednak metody dostarczania zlokalizowanych, które ułatwiają podawanie wysoce skoncentrowanych środków bezpośrednio do nerki, ogólnie osiągnęły lepsze wyniki niż układowe wstrzyknięcia dożylne. Ponadto, wektory adeno-skojarzonego wirusa (AAV), z ich solidnymi profilami bezpieczeństwa i udowodnionym doświadczeniem klinicznym36,37, były najczęściej badane i są uważane za wiodącą opcję dla przeniesienia genów do nerek.
Typowe serotypy AAV i inżynieryjne kapsydy wykazały efektywną transdukcję komórek mezangialnych i mezenchymalnych w nerkach po wstrzyknięciu dożylnym u myszy28,30,38. Warto zauważyć, że ostatnie badania wykazały, że dożylne podawanie AAV9 może skutecznie transdukować stopy kłębuszkowe w mysich modelach zespołu nerczycowego i zespołu Alporta, choć ten efekt nie jest obserwowany w zdrowym narządzie38,39, oraz że dożylne podawanie inżynieryjnego kapsydu AAV2 może wyłącznie ukierunkować komórki śródbłonka kłębuszkowego zarówno w zdrowych jak i zapalnych nerkach u myszy40. Historycznie, przewody nerkowe były trudne do transdukcji drogą dożylną. Jednak niedawno odkryto, że wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej wybranych kapsyd

<table><tbody><tr><td>0.45 &mu;m PVDF syringe filter</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tube&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL polypropylene tube</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>250 mL centrifuge bottle</td><td>Fisher Scientific</td><td>055641S24</td><td></td></tr><tr><td>2F Silicone tubing</td><td>Sai Infusion Technologies</td><td>SIL-2-50&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>25G butterfly needle</td><td>Medex Supply</td><td>26708</td><td></td></tr><tr><td>2-methylbutane</td><td>MilliporeSigma</td><td>MX0760</td><td></td></tr><tr><td>2x qPCR reaction buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>43-676-59</td><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td></tr><tr><td>30G needle</td><td>Becton-Dickinson &amp; Co</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>50 mL polypropylene tube</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>5-0 monofilament suture</td><td>Ethicon</td><td>Y463G</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Lonza</td><td>51202</td><td></td></tr><tr><td>6-0 absorbable suture</td><td>Ethicon</td><td>J489G</td><td></td></tr><tr><td>7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &micro;L</td><td>Bio-Rad</td><td>4561023</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ImageQuant 800 Western Blot Imaging System (Cytiva)</td><td>Cytiva</td><td>29459405</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL tube</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody</td><td>Abcam</td><td>ab199975</td><td>A marker for collecting duct cells</td></tr><tr><td>Anti-Na-K-2Cl cotransporter 2 (NKCC2) antibody</td><td>StressMarq Biosciences</td><td>SPC-401</td><td>A marker for thick ascending limb cells</td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-605-144</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Wilms Tumor 1 (WT1) antibody</td><td>Abcam</td><td>ab89901</td><td>A marker for podocytes</td></tr><tr><td>Beckman Coulter OptiSeal Tube, Polypropylene, 29.9 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9691210</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter OPTISEAL TUBES</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9611575</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1016970001</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal ultrafiltration tube</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC9100</td><td>Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL</td></tr><tr><td>Ceramic bead tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-154</td><td></td></tr><tr><td>Cesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3032-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Clamp applying forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>00071-14</td><td></td></tr><tr><td>Closed-loop heat pad</td><td>Stryker Medical</td><td>8002-062-012</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped applicator</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat microtome</td><td>Tanner Scientific</td><td>TN50</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved-type micro vessel clip</td><td>Kleinert-Kutz</td><td>65145</td><td>Clamp for the renal artery and renal vein</td></tr><tr><td>Dialysis cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>PIA52976</td><td></td></tr><tr><td>DNA extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium- high glucose</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td>DMEM-high glucose (4.5 g/L)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-575-020</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716GEA</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>VWR</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>Gas-tight glass syringe</td><td>Hamilton</td><td>1710 TLL</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Heat therapy pump</td><td>Kent Scientific</td><td>HTP-1500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-163</td><td></td></tr><tr><td>Human embryonic kidney (HEK) 293 cells</td><td>Agilent</td><td>240073</td><td></td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-104</td><td></td></tr><tr><td>Infusion syringe pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4507</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Liquid blocker pen</td><td>Ted Pella</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>Lotus tetragonolobus lectin (LTL)- Fluorescein</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1321-2</td><td>A marker for proximal tubules</td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl2)</td><td>MilliporeSigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>VetOne</td><td>NDC 86136-012-10</td><td>Analgesic</td></tr><tr><td>Microscope glass slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12501-13</td><td></td></tr><tr><td>OCT compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment</td><td>Bausch &amp; Lomb</td><td>NDC 24208-313-34</td><td></td></tr><tr><td>PE-10 polyethylene tube</td><td>BD</td><td>427401</td><td>Inner diameter: 0.28 mm</td></tr><tr><td>Penicillin &amp; Streptomycin Mix</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Plastic cryomold</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188 Non-ionic Surfactant (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>24-040-032</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 800

skuteczne i bezpieczne dostarczenie genów do nerki myszy poprzez powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wektorów adeno-stowarzyszonych wirusów

Effective and Safe Gene Delivery to the Mouse Kidney via Slow Retrograde Renal Pelvis Injection of Adeno-Associated Virus Vectors

Rozwój skutecznych narzędzi i metod in vivo do dostarczania genów do nerki jest kluczowy dla postępów w podstawowych badaniach nerek i terapii genowej chorób nerek. Ponadto, rosnąca świadomość monogenicznych chorób nerek, napędzana zaawansowanymi testami genetycznymi, podkreśla potencjał terapii genowej w leczeniu, a nawet wyleczania trudnych do wyleczenia genetycznych chorób nerek. Pod tym względem, wektory adeno-stowarzyszonych wirusów (AAV) zyskują coraz większą uwagę jako solidna platforma dla dostarczania genów in vivo; jednak najskuteczniejsza i najbezpieczniejsza metoda dostarczania genów za pomocą wektorów AAV do każdego terapeutycznie istotnego typu komórek w nerce nie została jeszcze w pełni ustalone. W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano metodę powolnego wstrzyknięcia wstecznego wektorów AAV do miedniczki nerkowej (RP), a także zademonstrowano jej wysoki potencjał do transdukcji mysich nerek, gdy używa się odpowiednio dobranych kapsyd AAV. Co więcej, pokazano, że ta metoda jest skuteczna nie tylko dla standardowych wektorów AAV oczyszczanych ultrawirówką w chlorku cezu (CsCl AAV), ale również dla ultrafiltrowanych wirówkowo wektorów AAV (CU AAV) w minipreps, które mogą być przygotowane szybko i prosto za pomocą technik, które nie wymagają specjalistycznej znajomości wektorów AAV. Jako przykład, niniejsze badanie pokazuje, że powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wektorów CsCl i CU AAV-KP3 prowadzi do solidnej transdukcji cewek bliższych w nerce myszy bez widocznej szkody dla tkanki, w przeciwieństwie do wcześniej zgłaszanych podejść hydrodynamicznych, które nieuchronnie prowadzą do uszkodzenia tkanki. Zatem niniejsze badanie podkreśla, że powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wybranych wektorów pochodnych kapsyd AAV jest skuteczną i bezpieczną metodą dostarczania genów do nerki. Ta metoda będzie miała zastosowanie w szerokim spektrum badań nerek, włączając badania terapii genowej. Zastosowanie minipreps wektorów CU AAV znacznie zwiększy wydajność i poprawi efektywność czasu i kosztów potrzebnych do generowania danych wstępnych i uzyskiwania kluczowych wniosków.

Niedawny badanie zidentyfikowało małą podzbiór kapsydów AAV, który wykazuje znaczące zwiększenie transdukcji nerek w porównaniu z AAV9 po wstrzyknięciu RP38. Zidentyfikowany podzbiór obejmuje AAV-KP3, chimeryczny kapsyd AAV wygenerowany przez DNA shuffling41. Dlatego AAV-KP3 został wybrany do wstrzyknięcia RP w tym badaniu, obok AAV9 jako punktu odniesienia. Wektor AAV9-CAG-tdTomato (AAV9) i wektor AAV-KP3-CAG-tdTomato (KP3) zostały wyprodukowane w komórkach HEK293 metodą t...

Ten raport szczegółowo opisuje zlokalizowany sposób wstrzyknięcia wektorów AAV za pośrednictwem miednicy nerkowej w celu skutecznego i bezpiecznego przeniesienia genu do nerki myszy.

Skuteczne i bezpieczne dostarczenie genów do nerki myszy poprzez powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wektorów adeno-stowarzyszonych wirusów

The development of effective in vivo tools and methods for gene delivery to the kidney is crucial for advancing basic kidney research and gene therapy for ...

Naszym celem jest opracowanie skutecznych metod dostarczania genów do komórek nerek za pomocą wirusowych wektorów związanych z adenowirusem. To pozwoli na postęp w badaniach podstawowych nad nerkami i pomoże w opracowaniu nowych terapii genowych dla chorób nerek. Głównym wyzwaniem jest brak skutecznych metod dostarczania genów do kluczowych typów komórek nerek, takich jak cewki nerkowe i podocyty, z powodu złożoności strukturalnej narządu, co ogranicza postęp w terapii genowej za pomocą wirusów związanych z adenowirusem ukierunkowanych na nerki.Pokazałyśmy, że skuteczna dostawa genów do komórek nerek, w tym cewek nerkowych i podocytów, może być osiągnięta poprzez wybór odpowiednich kapsyd wirusów związanych z adenowirusem i dróg podawania na podstawie kontekstu choroby. Rozcieńczyć roztwór wektora wirusowego związanego z adenowirusem za pomocą 5% sorbitu w PBS. Umieścić rozcieńczony roztwór na lodzie.Za pomocą uchwytu do igieł, zgiąć i odciąć końcówkę igły od igły 30-gauge. Pod stereomikroskopem połączyć końcówkę igły 30-gauge, cztery centymetry przewodu PE10 wstępnie przymocowanego do 15 centymetrów przewodu silikonowego, kolejną igłę 30-gauge i gazoochroneczną szpricówkę szklaną w kolejności od końcówki. Ustawić połączoną gazoochroneczną szpricówkę szklanę na pompie do szpricówek infuzyjnych.Za pomocą pompy do szpricówek infuzyjnych, wstrzyknąć 90 mikrolitrów roztworu wektora do gazoochronecznej szpricówki szklanej. Ustawić tryb infuzji na pompie do szpricówek na docelową objętość 50 mikrolitrów i szybkość przepływu 50 mikrolitrów na minutę. Następnie umieścić znieczulonego mysza w pozycji bocznej na zamkniętej pętli grzewczej podłączonej do pompy terapii cieplnej utrzymywanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pokrzyj mysz sterylną zasłoną operacyjną. Za pomocą sterylnego skalpela, wykonać jednocentimowe nacięcie skóry na poziomie kąta żebrowo-kręgowego w pobliżu lewej nerki. Przeciąć warstwę mięśniową wzdłuż tej samej długości jak nacięcie skóry.Następnie delikatnie dociskaj brzuch palcami, unikając bezpośredniego kontaktu z nerką, aby eksponować nerkę przez miejsce nacięcia. Ostrożnie usuń minimalną otaczającą tkankę tłuszczową, aż ujrzysz miedniczkę nerkową jako małą białą plamę. Użyj prostego kleszczyka naczyniowego do zaciśnięcia początkowo moczowodu.Następnie zaciśnij tętnicę i żyłę nerkową za pomocą zakrzywionego kleszczyka naczyniowego. Za pomocą zakrzywionych kleszczyków wstaw igłę 30-gauge około trzech milimetrów do jamy miedniczkowej. Rozpocznij wstrzyknięcie 50 mikrolitrów roztworu wektora za pomocą pompy do szpricówek infuzyjnych przez jedną minutę z szybkością przepływu 50 mikrolitrów na minutę.Pozostaw igłę i zaciski na miejscu przez pięć minut, aby zwiększyć ekspozycję nerki na wektor. Następnie usuń zaciski moczowodu i naczyń. Powoli wycofaj igłę, naciskając na aplikator z bawełną na miejscu wstrzyknięcia, aby wywierać ciśnienie.Delikatnie przesuń nerkę z powrotem do jamy otrzewnej. Następnie zeszyj warstwę mięśniową szwem absorbowalnym sześć zero i następnie skórę szwem jednowłókwowym pięć zero. Na koniec wstrzyknij jeden mililitr soli fizjologicznej podskórnie na plecy myszy w celu wsparcia płynów.Stężenia genomów wektora w surowych lizatkach były stosunkowo niskie, na poziomie 10 do potęgi 10 genomów wektora na mililitr zarówno dla preparatów AAV9 jak i KP3, podczas gdy ostateczne ultrafiltrowane środkowo-ultrafiltrowane i oczyszczone preparaty AAV9 i KP3 wykazywały wysokie tytuły genomów wektora odpowiednio 3,2 do 10 potęgi 13 i 8,8 do 10 potęgi 12 genomów wektora na mililitr. Analiza SDS-PAGE z barwieniem srebrowym oczyszczonych cesowo-chlorkiem AAV9 i KP3 wykazała trzy odrębne pasma dla VP1, VP2 i VP3 z minimalnym tłem, wskazując na wysoką czystość. Podczas gdy ultrafiltrowane próbki oczyszczone środkowo-ultrafiltrowane, załadowane w dużych ilościach, wykazywały rozmazanie białka, ale przy niższych obciążeniach pasma VP stały się wyraźne.Dwa tygodnie po wstrzyknięciu do miedniczki nerkowej, ultrafiltrowane środkowo-ultrafiltrowane wektory KP3 skutecznie transdukowali proksymalne cewki nerkowe, podczas gdy ultrafiltrowane środkowo-ultrafiltrowane wektory AAV9 wykazywały ograniczoną transdukcję cewek i były głównie ograniczone do komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych. Ilościowa PCR wykazała 73-krotnie wyższą liczbę kopii genomu wektora w nerkach wstrzykniętych ultrafiltrowanymi środkowo-ultrafiltrowanym wektorem KP3. Wektor KP3 również transdukował komórki przewodzące jak pokazało spolokowanie z barwieniem Aquaporin-2, podczas gdy AAV9 głównie ukierunkował komórki grubych wychodzących kończyn cewek nerkowych współbarwione z NKCC2.Transdukcja wątroby poza docelowym celem była zauważalnie zmniejszona w przypadku KP3 w porównaniu z AAV9. Nie zaobserwowano żad

effective-safe-gene-delivery-to-mouse-kidney-via-slow-retrograde

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokazujemy dostarczanie rekombinowanego genu związanego z adeno na bazie wirusa u szczeniaka myszy. Metoda ta pomaga w badaniu ekspresji genów w docelowych komórkach.

Dostarczanie genów na podstawie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem: technika dostarczania transgenu i ekspresji specyficznej dla serca w modelu gryzoni

Źródło:Pourshafie, N., et al. Ogólnoustrojowe dostarczanie mikroRNA przy użyciu rekombinowanego serotypu 9 wirusa związanego z adenowirusem w leczeniu chorób nerwowo-mięśniowych u gryzoni. J. Vis. Exp. (2018).W tym filmie mysz z rdzeniowym i opuszkowym zanikiem mięśni lub dotknięta SBMA przechodzi wstrzyknięcie do żyły ogonowej rekombinowanych wektorów AAV (wektorów związanych z adeno) przenoszących plazmid kodujący terapeutyczne mikroRNA. Wektor wytwarza mikroRNA, które wiąże się ze zmutowanym...

Wstrzykiwanie rekombinowanych wektorów związanych z adenowirusem w mysim modelu rdzeniowego i opuszkowego zaniku mięśni

Implantacja komórek nowotworowych do narządu pochodzenia może służyć jako użyteczny model przedkliniczny do oceny nowych terapii. Komórki raka pęcherza moczowego MB49 mogą być hodowane w pęcherzu moczowym po wkropleniu dopęcherzowym. Protokół ten demonstruje cewnikowanie pęcherza myszy w celu implantacji guza i dostarczenia adenowirusa.

Ortotopowy model raka pęcherza moczowego do badań nad dostarczaniem genów

Opisane podejście chirurgiczne po usznym pozwala na szybkie i bezpośrednie dostarczenie do błony bębenkowej ślimaka myszy, jednocześnie minimalizując utratę krwi i śmiertelność zwierząt. Metoda ta może być stosowana w terapii ślimakowej z wykorzystaniem podawania molekularnego, farmakologicznego i wirusowego myszom po urodzeniu przez błonę okienną okrągłą.

Metoda chirurgiczna dostarczania genów za pośrednictwem wirusa do ucha wewnętrznego myszy przez błonę okrągłego okienka

W tym manuskrypcie opisana jest metoda przygotowania rekombinowanych wektorów wirusa 9 (rAAV9) do manipulowania ekspresją genów w sercu myszy.

Przygotowanie rAAV9 do nadekspresji lub knockdown genów w sercach myszy

Tutaj opisujemy dostarczanie mikroRNA za pomocą rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem serotypu 9 w mysim modelu choroby nerwowo-mięśniowej. Pojedyncze podanie obwodowe myszom spowodowało trwałą nadekspresję miRNA w neuronach mięśniowych i ruchowych, co dało możliwość zbadania funkcji miRNA i potencjału terapeutycznego in vivo.

Ogólnoustrojowe dostarczanie mikroRNA przy użyciu rekombinowanego serotypu 9 wirusa związanego z adenowirusem w leczeniu chorób nerwowo-mięśniowych u gryzoni

Celem obecnego badania było opracowanie i potwierdzenie siły działania oraz bezpieczeństwa dostarczania genów za pośrednictwem wirusa AAV9 (ang. spinal adeno-associated virus 9) za pośrednictwem metody u dorosłych myszy.

Dostarczanie wektorów subpialnego wirusa Adeno-associated 9 (AAV9) u dorosłych myszy

Ten protokół opisuje metodę wstrzykiwania plazmidowego DNA do nerki myszy przez miedniczkę nerkową w celu wytworzenia ekspresji transgenu specyficznie w nerce.

Hydrodynamiczne wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej w celu niewirusowej ekspresji białek w nerce

Opisujemy nowatorską metodę dostarczania plazmidu DNA do komórek urotelialnych pęcherza myszy in vivo poprzez cewnikowanie cewki moczowej i elektroporację. Oferuje szybki i wygodny sposób generowania autochtonicznych mysich modeli chorób pęcherza moczowego.

Nowa metoda dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka moczowego myszy za pomocą elektroporacji

Tutaj szczegółowo opisujemy zoptymalizowany protokół wstrzykiwania bocznych żył ogonowych myszy w celu systemowego podawania wirusa związanego z adenowirusem (AAV) dorosłym myszom. Dodatkowo opisujemy protokoły powszechnie stosowanych testów do oceny transdukcji AAV.

Konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy

Ten protokół opisuje, w jaki sposób dośledzionowa iniekcja małego RNA spinki do włosów dostarczanego przez AAV8 osiąga taką samą skuteczność knockdownu genu w wątrobie jak iniekcja do żyły wrotnej, co stanowi prostszą procedurę ze znacznie niższą śmiertelnością i powikłaniami okołooperacyjnymi i pooperacyjnymi.

Skuteczny knockdown genu w wątrobie poprzez wstrzyknięcie do śledziony małego RNA dostarczonego przez serotyp 8 (AAV8) wirusa związanego z adenowirusem

Poznaj metodę powolnego wstrzyknięcia wstecznego do miedniczki nerkowej wektorów AAV u myszy. Technika umożliwia skuteczne i bezpieczne dostarczenie genów do kanalików nerkowych bez uszkodzenia tkanek.

Skuteczne i bezpieczne dostarczenie genów do nerki myszy poprzez powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wektorów adeno-stowarzyszonych wirusów (Wideo) | JoVE Journal

Skuteczne i bezpieczne dostarczenie genów do nerki myszy poprzez powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wektorów adeno-stowarzyszonych wirusów

Przeglądaj więcej filmów