Name: Obrazowanie sygnałówCa2+ w małych żyłach płucnych przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Poznaj nową metodę obrazowania sygnałów wapniowych w małych żyłach płucnych myszy przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym. Protokół wykorzystuje Fluo-4 AM i mikroskopię konfokalną do analizy sygnalizacji Ca²⁺.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane z nagród NHLBI (HL167208, HL157407 i HL146914) dla SKS i NIDDK (DK138271) dla YLC.

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wirginii (protokoły 4100 i 4120). Myszy C57BL6/J w wieku 10-12 tygodni są poddawane eutanazji za pomocą pentobarbitalu (90 mg/kg; dootrzewnowo), a następnie zwichnięciu szyjki macicy w celu pobrania tkanki płucnej3,4,19,20.
1. Izolacja małych paneli fotowoltaicznych
<ol>
	<li>Wyczyść narzędzia i naczynia do preparowania 100% etanolem, a następnie umyj wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby otworzyć klatkę piersiową. Użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć serce i płuca z jamy klatki piersiowej przy minimalnym dotykaniu płuc.</li>
	<li>Umieścić tkankę na płytce pokrytej preparatem Sylgard zawierającej zimny (4-10 °C) roztwór soli fizjologicznej buforowany przez HEPS (HEPES-PSS, w mM, 10 HEPES, 134 NaCl, 6 KCl, 1 MgCl2 heksahydrat, 2 CaCl2 dwuwodny i 7 dekstroza, pH dostosowane do 7,4 przy użyciu 1 M NaOH)3,4,19. Użyj szpilek do rozwarstwienia, aby przygwoździć serce i płuca tak, aby duże PV i PA były wyraźnie widoczne, a lewy płat płuca był lekko rozciągnięty, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
	<li>Używając dużych żył płucnych (PV) jako punktów odniesienia, ostrożnie usuń tkankę otaczającą małe żyły wewnątrzpłucne (małe PV o średnicy około 50-100 μm, oznaczone przerywanym prostokątem w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) za pomocą cienkich nożyczek. Upewnij się, że unikasz bezpośredniego kontaktu z małymi PV. Delikatnie odizoluj małe PV od otaczającej tkanki.</li>
	<li>Odizoluj segmenty małych paneli fotowoltaicznych o długości około 1-2 mm. Umieść małe ogniwa fotowoltaiczne w temperaturze 4-10 °C HEPES-PSS.</li>
</ol>
2. Ładowanie małych paneli fotowoltaicznych za pomocą wskaźnika Ca2+
UWAGA: Z małymi PV należy obchodzić się ostrożnie, upewniając się, że kleszcze dotykają tylko końcówek PVs. Ta metoda jest modyfikacją techniki opisanej wcześniej3,7,20,21.
<ol>
	<li>Przygotuj stężenie zapasowe 2,5 mM Fluo-4 AM z DMSO3,4. Korzystając z powyższego roztworu podstawowego, przygotować 10 μM fluo-4 AM i 0,04% kwasu pluronowego z HEPES-PSS.</li>
	<li>Umieść małe ogniwa fotowoltaiczne w probówce o pojemności 1,5 ml z roztworem ładującym (10 μM fluo-4 AM i 0,04% kwasu pluronowego w HEPES-PSS)3,4. Przykryć probówkę folią aluminiową i umieścić w łaźni wodnej do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po inkubacji ostrożnie zastąpić roztwór nasycający roztworem o temperaturze 4-10 °C HEPES-PSS i trzymać na lodzie przez 30 minut jako etap mycia.</li>
</ol>
3. Kaniulacja małych PV
UWAGA: Ta metoda jest modyfikacją techniki opisanej wcześniej3,20,21.
<ol>
	<li>Przygotuj komorę miografii ciśnieniowej z dwiema szklanymi kaniulami, po jednej z każdej strony. Napełnij kaniule PSS (119 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgCl2 160 sześciowodzian, 2,5 mM CaCl2 dwuwodny3,4,21,22, 7 mM dekstrozy i 24 mM NaHCO3, utrzymywane w pH 7,4 przez bulgotanie roztworu z 21% O2 i 5% CO2) za pomocą strzykawki 10 ml.</li>
	<li>Usuń niewielką cząstkę PV z roztworu myjącego i umieść ją w komorze miografii ciśnieniowej. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką ostrożnie nałóż jeden koniec małego PV na jedną z kaniul. Następnie, za pomocą mikrofilamentu wykonanego z nylonowej nici, zawiąż węzeł wokół kaniulowanego końca małej PV i końcówki kaniuli, aby ją zabezpieczyć.</li>
	<li>Delikatnie przepchnij PSS przez kaniulę, aby usunąć krew z PV. Użyj nylonowej nici, aby związać drugi koniec szklaną kaniulą za pomocą mikrowłókien, jak pokazano na Rysunek 1.</li>
</ol>
4. Zwiększanie ciśnienia iobrazowanie Ca2+ małych PV
UWAGA: Ta metoda jest modyfikacją techniki opisanej wcześniej3,21.
<ol>
	<li>Za pomocą regulatora ciśnienia serwomechanizmu podłączonego do rurki zawierającej PSS, zwiększ ciśnienie w małym ogniwie fotowoltaicznym z jednego końca na poziomie 5 mm Hg. Użyj pompy perystaltycznej podłączonej zarówno do wlotu, jak i wylotu, aby przelać PSS. Utrzymać temperaturę superfusatu na poziomie 37 °C.</li>
	<li>Po okresie równoważenia uzyskaj obrazy Ca2+ przez 1000 klatek (liczba klatek na sekundę: 30 klatek na sekundę) za pomocą 40-krotnego obiektywu zanurzającego w wodzie (NA 0,8) i systemu obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem. Wzbudzić Fluo-4 za pomocą lasera na ciele stałym o długości fali 488 nm i wychwycić emitowaną fluorescencję za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 525/36 nm.</li>
	<li>Zastosuj antagonistę receptora ryanodine (RyR) ryanodine (5 μM)21,23 do superfuzatu. Poczekaj 5 minut. Zrób ponownie zdjęcia Ca2+ zgodnie z powyższym opisem, przechwytując kolejne 1000 klatek z szybkością 30 klatek/s.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu Ca2+
UWAGA: Ta metoda jest modyfikacją techniki opisanej wcześniej21,22,24. Zmiany w aktywności sygnałów Ca2 + w miocytach PV mogą dostarczyć ważnych informacji na temat hamowania lub wzmacniania sprzężenia wzbudzenie-skurcz w PV.
<ol>
	<li>Użyj specjalnie zaprojektowanego oprogramowania (opracowanego przez dr Adriana Boneva, https://github.com/vesselman/SparkAn) do analizy obrazów Ca2+.</li>
	<li>Płynne obrazy dzięki filtrowi boxcar 5 x 5 i filtrowi mediany 5 x 5. Użyj ramki wyznaczającej płaski obszar PV z wieloma komórkami do automatycznego wykrywania zdarzeń.</li>
	<li>Kliknij Widok i automatyczne wykrywanie zdarzeń. Użyj następujących ustawień: próg zdarzenia przy amplitudzie 1,3 F/F0, tolerancja 20%, pole skanowania 7 x 7 pikseli i średnia bieżąca 7 obrazów. Generuj średnie obrazy automatycznie co 10 obrazów, zaczynając od pierwszego obrazu.</li>
	<li>Kliknij Rozpocznij wyszukiwanie (ikona oka). Znajdź tabelę zdarzeń zapisaną jako Zaznacz plik w menu Plik. Aby obliczyć zdarzenia na μm², podziel liczbę wykrytych sygnałów Ca2+ przez obszar wybranej ramki.</li>
</ol>

<ol><li>Suresh, K., Shimoda, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lung circulation.</a> Compr Physiol. 6 (2), 897-943 (2016).</li>
<li>Sundjaja, J. H., Bordoni, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSundjaja%2C+JH+%22Thorax%2C+heart+pulmonic+valve%22">Thorax, heart pulmonic valve</a>. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2024).</li>
<li>Daneva, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+peroxynitrite+formation+impairs+endothelial+TRPV4+channels+and+elevates+pulmonary+arterial+pressure+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Caveolar peroxynitrite formation impairs endothelial TRPV4 channels and elevates pulmonary arterial pressure in pulmonary hypertension.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (17), e2023130118(2021).</li>
<li>Daneva, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+pannexin+1-TRPV4+channel+signaling+lowers+pulmonary+arterial+pressure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Endothelial pannexin 1-TRPV4 channel signaling lowers pulmonary arterial pressure in mice.</a> Elife. 10, e67777(2021).</li>
<li>Kuhr, F. K., Smith, K. A., Song, M. Y., Levitan, I., Yuan, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mechanisms+of+pulmonary+arterial+hypertension%3A+role+of+Ca2%2B+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">New mechanisms of pulmonary arterial hypertension: role of Ca2+ signaling.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (8), H1546-H1562 (2012).</li>
<li>Sonkusare, S. K., Laubach, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TRPV4+channels+in+lung+edema+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Endothelial TRPV4 channels in lung edema and injury.</a> Curr Top Membr. 89, 43-62 (2022).</li>
<li>Kuppusamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+P2Y2+receptor-induced+activation+of+endothelial+TRPV4+channels+mediates+lung+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Purinergic P2Y2 receptor-induced activation of endothelial TRPV4 channels mediates lung ischemia-reperfusion injury.</a> Sci Signal. 16 (808), eadg1553(2023).</li>
<li>Alvarez, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+receptor+potential+vanilloid+4-mediated+disruption+of+the+alveolar+septal+barrier%3A+a+novel+mechanism+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transient receptor potential vanilloid 4-mediated disruption of the alveolar septal barrier: a novel mechanism of acute lung injury.</a> Circ Res. 99 (9), 988-995 (2006).</li>
<li>Balakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV4+inhibition+counteracts+edema+and+inflammation+and+improves+pulmonary+function+and+oxygen+saturation+in+chemically+induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">TRPV4 inhibition counteracts edema and inflammation and improves pulmonary function and oxygen saturation in chemically induced acute lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307 (2), L158-L172 (2014).</li>
<li>Suresh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+induced+Ca2%2B+influx+via+TRPV4+and+microvascular+endothelial+dysfunction+in+the+SU5416%2Fhypoxia+model+of+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species induced Ca2+ influx via TRPV4 and microvascular endothelial dysfunction in the SU5416/hypoxia model of pulmonary arterial hypertension.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 314 (5), L893-L907 (2018).</li>
<li>Haissaguerre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+initiation+of+atrial+fibrillation+by+ectopic+beats+originating+in+the+pulmonary+veins%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins.</a> N Engl J Med. 339 (10), 659-666 (1998).</li>
<li>Heijman, J., Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+electrophysiology+of+atrial+fibrillation+initiation%2C+maintenance%2C+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression.</a> Circ Res. 114 (9), 1483-1499 (2014).</li>
<li>Brunton, T. L., Fayrer, J. XXII <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Note+on+independent+pulsation+of+the+pulmonary+veins+and+vena+cava%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond%22%5BJournal%5D)">Note on independent pulsation of the pulmonary veins and vena cava.</a> Proc R Soc Lond. 25, 174-176 (1877).</li>
<li>Namekata, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchanger+in+the+automaticity+of+guinea-pig+pulmonary+vein+myocardium+as+revealed+by+SEA0400%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Involvement of the Na(+)/Ca(2+) exchanger in the automaticity of guinea-pig pulmonary vein myocardium as revealed by SEA0400.</a> J Pharmacol Sci. 110 (1), 111-116 (2009).</li>
<li>Cros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+differences+in+Ca2%2B+signaling+and+transverse-tubules+across+left+atrium+from+adult+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Regional differences in Ca2+ signaling and transverse-tubules across left atrium from adult sheep.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 2347(2023).</li>
<li>Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors%2C+calcium+signaling%2C+and+regulation+of+vascular+tone+in+the+cerebral+parenchymal+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation.</a> Microcirculation. 20 (4), 307-316 (2013).</li>
<li>Nair, R., Lamaa, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNair%2C+R+%22Pulmonary+capillary+wedge+pressure%22">Pulmonary capillary wedge pressure</a>. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2024).</li>
<li>Fukuta, H., Little, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+cycle+and+the+physiologic+basis+of+left+ventricular+contraction%2C+ejection%2C+relaxation%2C+and+filling%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Fail+Clin%22%5BJournal%5D)">The cardiac cycle and the physiologic basis of left ventricular contraction, ejection, relaxation, and filling.</a> Heart Fail Clin. 4 (1), 1-11 (2008).</li>
<li>Daneva, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+IK+and+SK+channel+activation+decreases+pulmonary+arterial+pressure+and+vascular+remodeling+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Circ%22%5BJournal%5D)">Endothelial IK and SK channel activation decreases pulmonary arterial pressure and vascular remodeling in pulmonary hypertension.</a> Pulm Circ. 13 (1), e12186(2023).</li>
<li>Marziano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide-dependent+feedback+loop+regulates+transient+receptor+potential+vanilloid+4+%28TRPV4%29+channel+cooperativity+and+endothelial+function+in+small+pulmonary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide-dependent feedback loop regulates transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) channel cooperativity and endothelial function in small pulmonary arteries.</a> J Am Heart Assoc. 6 (12), e007157(2017).</li>
<li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+smooth+muscle+Ca2%2B-signaling+nanodomains+in+blood+pressure+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Novel smooth muscle Ca2+-signaling nanodomains in blood pressure regulation.</a> Circulation. 146 (7), 548-564 (2022).</li>
<li>Sonkusare, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+Ca2%2B+signals+through+endothelial+TRPV4+channels+regulate+vascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function.</a> Science. 336, 597-601 (2012).</li>
<li>Arias-Cavieres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor-mediated+calcium+release+has+a+key+role+in+hippocampal+LTD+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor-mediated calcium release has a key role in hippocampal LTD induction.</a> Front Cell Neurosci. 12, 403(2018).</li>
<li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signal+profiles+in+vascular+endothelium+from+Cdh5-GCaMP8+and+Cx40-GCaMP2+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice.</a> J Vasc Res. 58 (3), 159-171 (2021).</li>
<li>Ottolini, M., Sonkusare, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium+signaling+mechanisms+in+arterial+smooth+muscle+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">The calcium signaling mechanisms in arterial smooth muscle and endothelial cells.</a> Compr Physiol. 11 (2), 1831-1869 (2021).</li>
<li>Boyette, L. C., Burns, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoyette%2C+LC+%22Physiology%2C+pulmonary+circulation%22">Physiology, pulmonary circulation</a>. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2024).</li>
<li>Ottolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+peroxynitrite+impairs+endothelial+transient+receptor+potential+vanilloid+4+channels+and+elevates+blood+pressure+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Local peroxynitrite impairs endothelial transient receptor potential vanilloid 4 channels and elevates blood pressure in obesity.</a> Circulation. 141 (16), 1318-1333 (2020).</li>
<li>Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+the+ryanodine+receptor+mediates+the+cardiac+fight+or+flight+response+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of the ryanodine receptor mediates the cardiac fight or flight response in mice.</a> J Clin Invest. 120 (12), 4388-4398 (2010).</li>
<li>Knot, H. J., Standen, N. B., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors+regulate+arterial+diameter+and+wall+%5BCa2%2B%5D+in+cerebral+arteries+of+rat+via+Ca2%2B-dependent+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors regulate arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat via Ca2+-dependent K+ channels.</a> J Physiol. 1 (Pt 1), 211-221 (1998).</li>
<li>Tischbirek, C., Birkner, A., Jia, H., Sakmann, B., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+two-photon+brain+imaging+with+a+red-shifted+fluorometric+Ca2%2B+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deep two-photon brain imaging with a red-shifted fluorometric Ca2+ indicator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (36), 11377-11382 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

SygnałyCa2+ w komórkach mięśni gładkich odgrywają kluczową rolę w regulacji funkcji naczyń krwionośnych25. PV są ważnym, ale stosunkowo słabo zbadanym łożyskiem naczyniowym odpowiedzialnym za dostarczanie bogatej w tlen krwi do lewego serca26. Jednak mechanizmy sygnalizacji Ca2+ w małych PV i ich wpływ na funkcje fizjologiczne są nieznane. Celem tego manuskryptu jest opisanie nowej metody izolacji, kaniulacji i zwiększania ciśnienia małych PV w celu rejestrowania sygnałów Ca2+ w warstwie miocytów i analizy tych sygnałów Ca2+ . Możliwość wizualizacji sygnałów Ca2+ w małych ogniwach fotowoltaicznych może pomóc w lepszym zrozumieniu, jak te sygnały działają w normalnych i chorych warunkach. Podczas gdy badanie sygnałów Ca2 + w PV w nienaruszonym płucu dostarczyłoby fizjologicznie bardziej istotnych danych, małe PV nie są wyraźnie widoczne w nienaruszonym płucu, co może stanowić wyzwanie techniczne związane z ładowaniem barwników Ca2+ i obrazowaniem konfokalnym. Izolowanie i zwiększanie ciśnienia w małych ogniwach fotowoltaicznych stanowi alternatywny sposób obserwacji sygnałów Ca2+ pod fizjologicznym ciśnieniem wewnątrzświetlnym, temperaturą i roztworami jonowymi.
Obrazowanie Ca2 + PV opisane w tym manuskrypcie opiera się na naszej dobrze ugruntowanej procedurze obrazowania Ca2 + w tętnicach układowych21,22,27. Dane wskazują, że większość sygnałów Ca2+ w małych miocytach PV jest spowodowana otwarciem kanałów jonowych RyR. W związku z tym protokół opisany w tym manuskrypcie umożliwi przyszłe badania nad regulacją RyR i jej wpływem na funkcję PV w normalnych warunkach i chorobach. Aktywność RyR2 jest niezbędna do skurczów miocytów serca28, podczas gdy w komórkach mięśni gładkich tętnic wiąże się z relaksacją29. Dokładny wpływ aktywności RyR na kurczenie się małych ogniw fotowoltaicznych pozostaje nieznany. Miografia ciśnieniowa jest powszechnie stosowaną techniką monitorowania zmian w skurczu małych naczyń krwionośnych. Dlatego jest prawdopodobne, że przygotowanie fotowoltaiki pod ciśnieniem może być również stosowane do monitorowania małych skurczów PV.
Ryanodyna wykazuje zależny od stężenia wpływ na aktywność RyR, zwiększając ją przy stężeniach submikromolowych i zmniejszając przy stężeniach mikromolowych23. Ryanodyna może również mieć pośredni wpływ hamujący na inne sygnały Ca2+ w małych PV, co nie zostało przetestowane. Przy zastosowanym stężeniu nie zaobserwowaliśmy kompensacyjnego wzrostu sygnałów Ca2+ w PV. Regulacja sygnałów Ca2+ w izolowanych i ciśnieniowych ogniwach fotowoltaicznych może różnić się od regulacji w ogniwach fotowoltaicznych w nienaruszonym płucu, co jest możliwością, która nie została jeszcze zbadana. Jednak rejestrowanie sygnałów Ca2 + w małych PV w nienaruszonym płucu od znieczulonej myszy stanowi poważne wyzwanie, wynikające z lokalizacji płuca w jamie klatki piersiowej i trudności w selektywnym ładowaniu wskaźnika Ca2 + w PV u znieczulonej myszy.
Wiadomo, że naprężenie ścinające przepływ krwi zmienia funkcję naczyń krwionośnych. Chociaż obecna metoda pozwala na odizolowanie wpływu ciśnienia śródświetlnego na sygnały Ca2+ w małych ogniwach fotowoltaicznych, brak naprężeń przepływowych lub ścinających jest potencjalnym ograniczeniem. Jednak naprężenie przepływowe lub ścinające można łatwo włączyć i przeprowadzić w połączeniu z obrazowaniem Ca2+ przy użyciu konfiguracji opisanych wcześniej21. Możliwe, że naprężenie przepływowo-ścinające modyfikuje aktywność sygnałów Ca2+ w małych ogniwach fotowoltaicznych, co byłoby interesującym tematem do przyszłych badań.
Użyliśmy fluo-4-AM jako wskaźnika Ca2+ do rejestracji sygnałów Ca2+ w małych PV. W zależności od potrzeb eksperymentalnych powinno być możliwe użycie innych wskaźników Ca2+ , które mogą być wzbudzone przy 488 nm (Calbryte 520 AM)7 lub 560 nm (Calbryte 590 AM)30. Zastosowanie systemu obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem pozwala na obrazowanie sygnałów Ca2+ , szczególnie w miocytach PV. Chociaż nie badano tego w obecnym badaniu, skupienie się na warstwie komórek śródbłonka pozwoli na rejestrację śródbłonkowych sygnałów Ca2+ w małych PV. PA i PV różnią się funkcjonalnie i są narażone na różne mikrośrodowiska. Dlatego porównanie sygnałów Ca2 + miocytów i śródbłonka między małymi PA i małymi PV może dostarczyć kluczowych informacji na temat ich różnic funkcjonalnych.
Jest prawdopodobne, że sygnały Ca2+ w małych PV regulują przepływ krwi bogatej w tlen przez PV. Ciśnienie wewnątrz lewego przedsionka zmienia się z 4 mmHg do 12 mmHg podczas każdego cyklu pracy serca17,18. Ponieważ PV dostarczają krew do lewego przedsionka, jest prawdopodobne, że ciśnienie wewnątrz PV zmienia się również podczas cyklu pracy serca. Wcześniejsze badania wykazały, że RyR może być aktywowany przez ciśnienie śródświetlne w małych tętnicach16. Dlatego pomiar wpływu ciśnienia śródświetlnego na sygnały PV Ca2+ może dostarczyć nowych informacji na temat dostarczania bogatej w tlen krwi z PV do lewego serca. Stymulacja nerwów i mediatory humoralne w krwiobiegu mogą również aktywować sygnały Ca2 + mięśni gładkich. Obecna metoda ułatwi przyszłe badania nad wpływem mediatorów neurohumoralnych na sygnały PVCa 2+ i funkcję PV.
W protokole jest kilka krytycznych kroków, o które należy zadbać. Dokładna sekcja żył płucnych (PV) jest niezwykle ważna. Bardzo ważne jest, aby unikać dotykania obszaru obrazowania PV narzędziami do preparowania, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na ich zdrowie. Należy dotykać tylko końców paneli fotowoltaicznych. Skrócenie czasu preparacji może zwiększyć wskaźnik sukcesu. Niewystarczające obciążenie barwnikiem może skutkować niższym stosunkiem sygnału do szumu i zwiększyć prawdopodobieństwo wystąpienia fałszywych alarmów podczas automatycznego wykrywania zdarzeń. Przestrzeganie opisanego tutaj protokołu powinno zapewnić odpowiednie obciążenie barwnikiem w miocytach PV.
Podsumowując, przedstawiliśmy metodę rejestracji sygnałów Ca2+ w małych PV, która pozwala na badanie mechanizmów sygnalizacyjnych Ca2+ w tym ważnym, ale często pomijanym łożysku naczyniowym. Co ważne, zdolność do rejestrowania sygnałów Ca2+ w małych PV w normalnych warunkach może dostarczyć cennego zrozumienia patologicznych mechanizmów chorób płuc, w tym nadciśnienia płucnego, uszkodzenia płuc i obrzęku płuc wywołanego niewydolnością serca.

Układ naczyniowy płuc odgrywa ważną rolę w wymianie gazów, dodawaniu tlenu i usuwaniu dwutlenku węgla z krwi1,2. Tętnice płucne (PA) otrzymują krew ubogą w tlen z prawego serca. Wymiana gazowa zachodzi na poziomie naczyń włosowatych (naczyń włosowatych pęcherzyków płucnych), a krew bogata w tlen jest dostarczana do lewego serca przez żyły płucne (PV). W przeciwieństwie do innych żył, które przenoszą krew ubogą w tlen, PV pełnią ważną funkcję dostarczania krwi bogatej w tlen do lewego serca, a w konsekwencji do ważnych narządów w ciele. Jednak mechanizmy sygnalizacyjne, które regulują funkcję PV w warunkach normalnych i chorobowych, są słabo poznane.
Badania nad układem naczyń płucnych koncentrowały się głównie na PA i naczyniach włosowatych płuc. Ostatnie badania pokazują, że sygnały Ca2+ w warstwach komórek śródbłonka i mięśni gładkich mają kluczowe znaczenie w regulacji funkcji PAs3,4,5. Ponadto nieprawidłowe mechanizmy sygnalizacji Ca2 + są odpowiedzialne za upośledzenie funkcji PA i naczyń włosowatych płuc w stanach chorobowych6,7,8,9,10. Jednak badania nad żyłami wewnątrzpłucnymi (małymi PV) pozostają nieliczne. Aktywność ektopowa w dużych PV przylegających do lewego serca (PVs sercowych) została zaproponowana jako źródło migotania przedsionków u ludzi11,12, oraz spontaniczna pulsacja13 i sygnały Ca2+12,14,15 zostały również pokazane w dużych PV. Małe PV dostarczają krew bogatą w tlen do dużych PV. Jednak mechanizmy sygnalizacji Ca2+ w małych PV nie były badane pod fizjologicznym ciśnieniem śródświetlnym.
W tym manuskrypcie wprowadzamy nową metodę izolacji, kaniulacji i zwiększania ciśnienia małych PV oraz obrazowania sygnałów Ca2+ w miocytach PV za pomocą szybkiej mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Ogólnym celem tej metody jest rejestracja spontanicznych i indukowanych sygnałów Ca2+ w małych miocytach PV pod fizjologicznym ciśnieniem śródświetlnym. Ciśnienie śródświetlne odgrywa kluczową rolę w regulacji sygnałów Ca2+ w miocytach16. Zazwyczaj PV są poddawane fizjologicznemu ciśnieniu śródświetlnemu w zakresie od 4 do 10 mm Hg17,18. Zmiany ciśnienia śródświetlnego w całym cyklu pracy serca mogą wpływać na sygnały Ca2+ w miocytach PV. Dlatego ważne jest, aby zastosować technikę, która pozwoli nam badać te sygnały w warunkach fizjologicznych i badać, jak wpływają na nie różne ciśnienia śródświetlne. Ponadto większość wcześniejszych badań nad PV koncentrowała się na większych PV serca. Obecna technika koncentruje się na małych ogniwach fotowoltaicznych znajdujących się głęboko w płucach, co może być bardziej istotne dla zrozumienia regulacji czynności płuc zarówno w zdrowiu, jak i chorobie.

<table><tbody><tr><td>Specjalnie zaprojektowane oprogramowanie SparkAn&nbsp;</td><td>University of Vermont</td><td></td><td>https://github.com/vesselman/SparkAn</td></tr><tr><td>Fluo-4, AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FN1 Mikroskop pionowy&nbsp;</td>Grzejnik/regulator temperatury <td>firmy Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>System obrazowania <td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Andor&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przejęcia iQ 3.x</td><td>Andor&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamery iXon EMCCD Andor</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nić nylonowa do wiązania naczyń krwionośnych</td><td>Żywe systemy Oprzyrządowanie</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>Komora miografii ciśnieniowej&nbsp;</td><td>Zakład Oprzyrządowania i Modelowania, University of Vermont, Burlington, VT, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Revolution WD (z Borealis) Szybki system obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem</td><td>Andor&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ryanodine</td><td>Bio-Techne</td><td>1329</td><td></td></tr><tr><td>Regulator ciśnienia serwomechanizmu&nbsp;</td><td>Oprzyrządowanie</td><td></td><td></td>systemów żywych</tr><tr><td>Kołki rozwarstwiające SS, średnica 0,2 mm</td><td>Oprzyrządowanie systemów żywych</td><td>PIN-0,2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Pompa rurowa REGLO</td><td>ISMATEC</td><td>ISM4212</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie sygnałówca2+ w małych żyłach płucnych przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym

Imaging Ca2+ Signals in Small Pulmonary Veins at Physiological Intraluminal Pressures

Żyły płucne (PV) przenoszą bogatą w tlen krew z płuc z powrotem do lewego serca, pełniąc w ten sposób ważną funkcję w dostarczaniu bogatej w tlen krwi do ważnych organów. Jednak większość badań nad unaczynieniem płuc koncentrowała się na tętnicach płucnych i naczyniach włosowatych w warunkach normalnych i chorobowych. Sygnały Ca2+ są krytycznymi regulatorami funkcji naczyń krwionośnych. Pomimo krytycznych fizjologicznych ról PV, sygnały Ca2+ w małych wewnątrzpłucnych PV nie zostały zarejestrowane w warunkach fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy technikę rejestrowania aktywności sygnału Ca2+ w mysich PV izolowanych, kaniulowanych i pod ciśnieniem 5 mmHg. Włączając wskaźnik Ca2 +, możemy badać sygnały Ca2 + w warstwie miocytów małych PV za pomocą szybkiego, wirującego obrazowania konfokalnego dysku w warunkach fizjologicznych. Nasze reprezentatywne dane wskazują, że sygnały Ca2+ w małych miocytach PV są pośredniczone przez otwory kanałów jonowych receptora ryanodine. Metoda ta będzie cieszyła się dużym zainteresowaniem badaczy zajmujących się fizjologią i zaburzeniami naczyń płucnych.

Rysunek 2A przedstawia pole widzenia małego naczynia żylnego płucnego (PV) przy ciśnieniu wewnątrzwłóknistym 5 mm Hg. Symbole + wskazują automatycznie wykryte sygnały Ca2+ w wybranym kadrze (Wideo 1), zaznaczonym zieloną obwódką. Z każdego PV zarejestrowano jedno pole widzenia, a od każdej myszy wykorzystano jedno PV. Jedno małe PV uznano za n=1. Liczbę sygnałów Ca2+ na μm2 na minutę porównano przed i 5 min po dodaniu inhibitora RyR ryodaniny (5 μM)23 w eksperymentach parowanych. Do porównań statystycznych w celu wykrycia istotnych różnic zastosowano parowany test t. Liczba spontanicznie występujących sygnałów Ca2+ wynosiła 0,73 ± 0,2 zdarzeń na minutę na μm2 (Rysunek 2B,C) w opisanych powyżej warunkach. Leczenie ryodaniną niemal całkowicie zahamowało sygnały Ca2+ w małych PV (Rysunek 2C, Wideo 2), co objawiło się drastycznym spadkiem liczby zdarzeń na minutę na μm2. Dane te wykazują, że spontaniczna aktywność sygnałów Ca2+ w warstwie miocytów w poddanym ciśnieniu małych PV reprezentuje otwarcia RyR. Wyniki te stanowią dowód, że aktywność sygnałów Ca2+ można badać w małych PV przy fizjologicznym ciśnieniu wewnątrzwłóknistym. Metoda ta ułatwi przyszłe badania nad wpływem ciśnienia wewnątrzwłóknistego i mediatorów neurohumoralnych na sygnalizację Ca2+ w miocytach małych PV, potencjalnie oferując cenne informacje na temat regulacji funkcji PV. Chociaż obecne badanie skupia się na liczbie sygnałów Ca2+ pochodzących z RyR, możliwe jest również analizowanie właściwości kinetycznych tych sygnałów, w tym czasu trwania, amplitudy, rozprzestrzeniania przestrzennego i czasu narastania. Zrozumienie, w jaki sposób bodźce fizjologiczne i patologiczne wpływają na właściwości kinetyczne sygnałów Ca2+ z RyR, może dostarczyć ważnych informacji dotyczących regulacji funkcji PV zarówno w stanach zdrowych, jak i chorobowych.
<img alt="Proces obrazowania płata płuca: mikroskopia konfokalna, barwnik Fluo-4AM, wykres analizy danych dla badania ciśnienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67722/67722fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przygotowanie i obrazowanie Ca2+ w żyłach płucnych (PV). Sekwencja obrazów przedstawiająca identyfikację i izolację małych PV, inkubację z Fluo-4AM, kaniulację i nadciśnienie (5 mm Hg), obrazowanie konfokalne wysokiej szybkości z dyskiem rotującym oraz analizę obrazu. Przerywany prostokąt na obrazie po lewej stronie reprezentuje PV wykorzystaną w badaniu. Skróty: PA = tętnica płucna; RA = prawy przedsionek; PV = żyła płucna; LA = lewy przedsionek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67722/67722fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie wapnia, efekt ryonadyny, mikroskopia fluorescencyjna, wykres danych, analiza aktywności komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67722/67277fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Analiza obrazowania Ca2+. (A) Obrazy pola widzenia z poddanego ciśnieniu (5 mm Hg), załadowanego fluo-4, małego naczynia PV w obecności (lewo) lub obecności ryonadyny (5 µM; inhibitor RyR, prawo). Zielony prostokąt oznacza obszar wybrany do autodetekcji sygnałów Ca2+. Znaki + reprezentują automatycznie wykryte zdarzenia w klatce. Czerwone znaki wskazują sygnały o powierzchni mniejszej niż 3000 µm2, natomiast niebieskie znaki wskazują sygnały zajmujące powierzchnię większą niż 3000 µm2. Każdy znak + oznacza jedno zdarzenie lub sygnał Ca2+. (B) Ślady F/F0 wykrytych zdarzeń z wybranego obszaru wskazanego w A, pokazujące aktywność sygnałów Ca2+ w warstwie miocytów z poddanych ciśnieniu małych naczyń PV w warunkach bazalnych (lewo) oraz w obecności ryonadyny (prawo). (C) Ilościowe oznaczenie liczby zdarzeń na minutę na µm2 sygnałów Ca2+ w małych naczyniach PV przed i po dodaniu ryonadyny (1 PV na mysz; n=6 myszy; **p &lt; 0.01 względem warunków bazalnych; test t dla prób zależnych). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67722/67277fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wideo 1: Sygnały Ca2+ w małym PV pod ciśnieniem 5 mm Hg przed traktowaniem rjanodyną. Pole widzenia odpowiada wybranemu klatce, zaznaczonej kolorem zielonym na Ryc. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67722/PV_Baseline_5_mm_Hg.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Wideo 2: Sygnały Ca2+ w małym PV poddanym ciśnieniu 5 mm Hg po traktowaniu ryanodyną (5 μM). Pole widzenia odpowiada wybranemu klatce, zaznaczonej kolorem zielonym na Rysunku 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67722/PV_Baseline_5_mm_Hg_ryanodine.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

W tym protokole prezentujemy nowatorską technikę rejestrowania i analizowania sygnałów Ca2+ w żyłach wewnątrzpłucnych (małe żyły płucne lub PV) przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym. Technika ta obejmuje izolację małych PV, inkubację ich za pomocą wskaźnika Ca2+, kaniulowanie i zwiększanie ciśnienia, obrazowanie konfokalne sygnałów Ca2+ oraz analizę danych.

Obrazowanie sygnałówCa2+ w małych żyłach płucnych przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym

Pulmonary veins (PVs) carry oxygen-rich blood from the lungs back to the left heart, thus serving an important function in the delivery of oxygen-rich ...

Sygnały wapniowe regulują czynność naczyń krwionośnych, różniąc się źródłem i rolą. Naszym celem jest zrozumienie ich specyficznych funkcji w ścianie naczyniowej i zidentyfikowanie nieprawidłowości związanych z chorobą. Większość badań naczyń krwionośnych płuc koncentruje się na tętnicach lub naczyniach włosowatych, a nie na żyłach płucnych.W żadnym z badań nie oceniano sygnałów wapniowych w żyłach płucnych przy normalnym ciśnieniu śródświetlnym, pomimo ich fizjologicznego znaczenia. W żyłach płucnych dochodzi do zmian ciśnienia podczas cykli cardio, ale ich wpływ na sygnały wapniowe nie był badany. Nasz protokół umożliwia akwizycję i automatyczną analizę sygnałów wapniowych w małych żyłach płucnych przy normalnym ciśnieniu.Nasz protokół umożliwia przyszłe badania nad tym, jak ciśnienie śródświetlne wpływa na sygnały wapniowe w małych żyłach płucnych, pogłębiając wiedzę na temat ich regulacji i roli w zdrowiu i chorobie. Na początek wyczyść narzędzia i naczynia do preparowania w 100% etanolu, a następnie umyj je w wodzie dejonizowanej. Z nożyczkami.Otwórz klatkę piersiową myszy poddanej eutanazji. Użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć serce i płuca z jamy klatki piersiowej przy minimalnym dotykaniu płuc. Następnie umieść tkankę na płytce pokrytej powłoką uszczelniającą, zawierającej zimny, buforowany roztwór soli fizjologicznej HEPES.Przypnij serce i płuca za pomocą szpilek rozwarstwiających, tak aby duże żyły płucne i tętnice płucne były wyraźnie widoczne, a lewy płat płuca był lekko rozciągnięty. Używając dużych żył płucnych jako punktów odniesienia, ostrożnie usuń tkankę otaczającą małe żyły międzypłucne za pomocą cienkich nożyczek. Następnie delikatnie odizoluj małe żyły płucne od otaczającej tkanki.Następnie przygotuj stężenie zapasu 2,5 milimolowego Fluo-4 AM z DMSO. Korzystając z roztworu podstawowego, przygotuj roztwór ładujący. Umieść małe żyły płucne w 1,5-mililitrowej probówce z roztworem ładującym.Przykryj probówkę folią aluminiową, inkubowaną w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Aby kaniulować małe żyły płucne, usuń żyłę z roztworu myjącego. Umieść go w przygotowanej komorze miografii ciśnieniowej.Za pomocą kleszczy z cienką końcówką ostrożnie nałóż jeden koniec małej żyły płucnej na jedną z kaniul, a następnie użyj mikrofilamentu z nylonową nicią, aby zawiązać węzeł wokół kaniulowanego końca małej żyły płucnej i końcówki kaniuli, aby ją zabezpieczyć. Delikatnie przeciśnij roztwór soli fizjologicznej przez kaniulę, aby usunąć krew z żyły płucnej. Użyj nylonowej nici, aby związać drugi koniec szklaną kaniulą za pomocą mikrowłókien.W celu obrazowania wapnia należy najpierw podłączyć regulator ciśnienia serwomechanizmu do rurki zawierającej buforowany roztwór soli fizjologicznej HEPES. Użyj kontrolera, aby zwiększyć ciśnienie w małej żyle płucnej z jednego końca. Teraz podłącz pompę perystaltyczną do wlotu i wylotu oraz wylotu i przelej roztwór.Po okresie równowagi użyj 40-krotnego obiektywu do zanurzania w wodzie i systemu obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem, aby uzyskać obrazy wapnia dla 1000 klatek. Aby przeprowadzić analizę obrazu, uruchom specjalnie zaprojektowany program Spark i oprogramowanie. Użyj filtra pięć na pięć i filtra mediany, aby wygładzić obrazy, a następnie umieść ramkę przedstawiającą płaski obszar żyły płucnej z wieloma komórkami do automatycznego wykrywania zdarzeń.Kliknij widok i automatyczne wykrywanie zdarzeń. Ustaw próg zdarzenia na amplitudę 1,3F przez F0, tolerancję na 20%, pole skanowania na siedem na siedem pikseli, a średnią bieżącą na siedem obrazów. Kliknij Rozpocznij wyszukiwanie lub ikonę oka.Znajdź tabelę zdarzeń, klikając tabelę małych zdarzeń w menu widoku, a następnie oblicz zdarzenia na mikrometr kwadratowy, dzieląc liczbę wykrytych sygnałów jonów wapnia przez obszar wybranej ramki. Liczba spontanicznie występujących sygnałów wapniowych w małych żyłach płucnych przy pięciomilimetrowym ciśnieniu śródświetlnym rtęci wynosiła 0,73 plus minus 0,2 zdarzenia na minutę na mikrometr kwadratowy w warunkach podstawowych. Dodatek ryanodyny drastycznie zmniejszył aktywność sygnalizacyjną wapnia.

imaging-ca2-signals-small-pulmonary-veins-at-physiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aby ocenić reakcje dyfuzji płuc i układu naczyniowego na ćwiczenia, opisujemy technikę wielokrotnego dyfuzji tlenu w celu określenia objętości krwi włośniczkowej i zdolności dyfuzji błony, a także echokardiografię kontrastową z pobudzoną solą fizjologiczną, aby ocenić rekrutację wewnątrzpłucnych zespoleń tętniczo-żylnych.

Ocena objętości krwi włośniczkowej w naczyniach włosowatych płuc, zdolności dyfuzyjnej błony i wewnątrzpłucnych zespoleń tętniczo-żylnych podczas wysiłku fizycznego

Opisujemy protokół obrazowania, który umożliwia klinicystom wizualizację, w czasie rzeczywistym, objętości przestrzeni wewnątrznaczyniowej i zewnątrznaczyniowej pacjenta oraz odpowiednie ustawienie parametrów diurezy i usuwania płynów dla bezpiecznego i skutecznego leczenia obrzęku płuc.

Przyłóżkowe badanie ultrasonograficzne do kierowania usuwaniem płynów u pacjentów z obrzękiem płuc: protokół Reverse-FALLS

Wymiary żył płucnych (PV) są ważnymi parametrami przy planowaniu izolacji żył płucnych. Echokardiografia przezprzełykowa 2D może dostarczyć tylko ograniczonych danych o PVs; jednak echokardiografia 3D może ocenić odpowiednie średnice i obszary PV, jak również ich przestrzenny związek z otaczającymi strukturami.

Trójwymiarowa metoda echokardiograficzna do wizualizacji i oceny określonych parametrów żył płucnych

Tutaj opisujemy korelacyjny przebieg pracy dla wycinania, zwiększania ciśnienia, utrwalania i obrazowania mysiej zastawki płucnej, aby określić konformację ogólną i lokalne struktury macierzy zewnątrzkomórkowej.

Chirurgia i przetwarzanie próbek do obrazowania korelacyjnego mysiej zastawki płucnej

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej może być wykorzystana do badania interakcji leukocytów-śródbłonka i perfuzji naczyń włosowatych w czasie rzeczywistym. Protokół ten opisuje metody obrazowania i ilościowego oznaczania tych parametrów w mikrokrążeniu płucnym za pomocą stabilizowanego próżniowo systemu obrazowania płuc.

Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo

Ultrasonografia przyłóżkowa (POCUS) płuc dostarcza szybkich odpowiedzi w szybko zmieniających się scenariuszach klinicznych. Przedstawiamy skuteczny i pouczający protokół pozyskiwania obrazów do stosowania w warunkach intensywnej terapii.

USG płuc w miejscu opieki nad pacjentem u dorosłych: akwizycja obrazu

Ocena ultrasonograficzna żyły głównej dolnej (IVC) w miejscu opieki nad pacjentem jest powszechnie wykorzystywana do identyfikacji, między innymi, statusu objętości. Obrazowanie powinno być wykonywane systematycznie, aby zapewnić powtarzalność. W niniejszym manuskrypcie omówiono metody i pułapki badania ultrasonograficznego IVC.

Metoda akwizycji obrazu do oceny ultrasonograficznej żyły głównej dolnej

Dokładna echokardiografia wewnątrzsercowa (ICE) wykazuje znaczną dokładność w szacowaniu struktury lewego przedsionka, co jest perspektywiczną i obiecującą metodą szacowania struktury serca. W tym miejscu proponujemy protokół trójwymiarowego modelowania lewego przedsionka i żył płucnych z ICE i szybką przebudową cewnika do mapowania anatomicznego (FAM).

Trójwymiarowe modelowanie lewego przedsionka i żył płucnych z precyzyjnym podejściem do echokardiografii wewnątrzsercowej

Ten protokół demonstruje izolację pod kontrolą mikroskopii i barwienie immunofluorescencyjne mysich żył płucnych. Przygotowujemy próbki tkanek zawierających lewy przedsionek, żyły płucne i odpowiadające im płuca i wybarwiamy je pod kątem sercowej troponiny T i Connexin 43.

Mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych

Protokół ten zapewnia szybkie, oparte na fenotypie podejście do zogniskowanej oceny ultrasonograficznej pacjenta z obniżonym ciśnieniem, przy użyciu obrazów podżebrowych żyły głównej dolnej i serca, z dodatkowymi widokami górnych płuc i przestrzeni opłucnej.

Ocena echokardiograficzna z wykorzystaniem badania tylko submieczykowatego u pacjentów z hipotensją

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący zastosowania POCUS przy łóżku pacjenta w zarządzaniu ARDS w obrębie OIOM-u. Zawiera ona szczegółowe metody oceny płuc, serca, przepony, żył i żołądka, które kierują wentylacją, przewidują odstawianie od piersi i zapobiegają powikłaniom.

Zastosowanie ultrasonografii punktowej (POCUS) w leczeniu ostrego zespołu niedociągu oddechowego (ARDS) na oddziale intensywnej terapii

Poznaj nową metodę obrazowania sygnałów wapniowych w małych żyłach płucnych myszy przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym. Protokół wykorzystuje Fluo-4 AM i mikroskopię konfokalną do analizy sygnalizacji Ca²⁺.

Obrazowanie sygnałów^Ca2+ w małych żyłach płucnych przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym

Przeglądaj więcej filmów