Obrazowanie sygnałówCa2+ w małych żyłach płucnych przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym
21 marca 2025
W tym protokole prezentujemy nowatorską technikę rejestrowania i analizowania sygnałów Ca2+ w żyłach wewnątrzpłucnych (małe żyły płucne lub PV) przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym. Technika ta obejmuje izolację małych PV, inkubację ich za pomocą wskaźnika Ca2+, kaniulowanie i zwiększanie ciśnienia, obrazowanie konfokalne sygnałów Ca2+ oraz analizę danych.
Sygnały wapniowe regulują czynność naczyń krwionośnych, różniąc się źródłem i rolą. Naszym celem jest zrozumienie ich specyficznych funkcji w ścianie naczyniowej i zidentyfikowanie nieprawidłowości związanych z chorobą. Większość badań naczyń krwionośnych płuc koncentruje się na tętnicach lub naczyniach włosowatych, a nie na żyłach płucnych.
W żadnym z badań nie oceniano sygnałów wapniowych w żyłach płucnych przy normalnym ciśnieniu śródświetlnym, pomimo ich fizjologicznego znaczenia. W żyłach płucnych dochodzi do zmian ciśnienia podczas cykli cardio, ale ich wpływ na sygnały wapniowe nie był badany. Nasz protokół umożliwia akwizycję i automatyczną analizę sygnałów wapniowych w małych żyłach płucnych przy normalnym ciśnieniu.
Nasz protokół umożliwia przyszłe badania nad tym, jak ciśnienie śródświetlne wpływa na sygnały wapniowe w małych żyłach płucnych, pogłębiając wiedzę na temat ich regulacji i roli w zdrowiu i chorobie. Na początek wyczyść narzędzia i naczynia do preparowania w 100% etanolu, a następnie umyj je w wodzie dejonizowanej. Z nożyczkami.
Otwórz klatkę piersiową myszy poddanej eutanazji. Użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć serce i płuca z jamy klatki piersiowej przy minimalnym dotykaniu płuc. Następnie umieść tkankę na płytce pokrytej powłoką uszczelniającą, zawierającej zimny, buforowany roztwór soli fizjologicznej HEPES.
Przypnij serce i płuca za pomocą szpilek rozwarstwiających, tak aby duże żyły płucne i tętnice płucne były wyraźnie widoczne, a lewy płat płuca był lekko rozciągnięty. Używając dużych żył płucnych jako punktów odniesienia, ostrożnie usuń tkankę otaczającą małe żyły międzypłucne za pomocą cienkich nożyczek. Następnie delikatnie odizoluj małe żyły płucne od otaczającej tkanki.
Następnie przygotuj stężenie zapasu 2,5 milimolowego Fluo-4 AM z DMSO. Korzystając z roztworu podstawowego, przygotuj roztwór ładujący. Umieść małe żyły płucne w 1,5-mililitrowej probówce z roztworem ładującym.
Przykryj probówkę folią aluminiową, inkubowaną w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Aby kaniulować małe żyły płucne, usuń żyłę z roztworu myjącego. Umieść go w przygotowanej komorze miografii ciśnieniowej.
Za pomocą kleszczy z cienką końcówką ostrożnie nałóż jeden koniec małej żyły płucnej na jedną z kaniul, a następnie użyj mikrofilamentu z nylonową nicią, aby zawiązać węzeł wokół kaniulowanego końca małej żyły płucnej i końcówki kaniuli, aby ją zabezpieczyć. Delikatnie przeciśnij roztwór soli fizjologicznej przez kaniulę, aby usunąć krew z żyły płucnej. Użyj nylonowej nici, aby związać drugi koniec szklaną kaniulą za pomocą mikrowłókien.
W celu obrazowania wapnia należy najpierw podłączyć regulator ciśnienia serwomechanizmu do rurki zawierającej buforowany roztwór soli fizjologicznej HEPES. Użyj kontrolera, aby zwiększyć ciśnienie w małej żyle płucnej z jednego końca. Teraz podłącz pompę perystaltyczną do wlotu i wylotu oraz wylotu i przelej roztwór.
Po okresie równowagi użyj 40-krotnego obiektywu do zanurzania w wodzie i systemu obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem, aby uzyskać obrazy wapnia dla 1000 klatek. Aby przeprowadzić analizę obrazu, uruchom specjalnie zaprojektowany program Spark i oprogramowanie. Użyj filtra pięć na pięć i filtra mediany, aby wygładzić obrazy, a następnie umieść ramkę przedstawiającą płaski obszar żyły płucnej z wieloma komórkami do automatycznego wykrywania zdarzeń.
Kliknij widok i automatyczne wykrywanie zdarzeń. Ustaw próg zdarzenia na amplitudę 1,3F przez F0, tolerancję na 20%, pole skanowania na siedem na siedem pikseli, a średnią bieżącą na siedem obrazów. Kliknij Rozpocznij wyszukiwanie lub ikonę oka.
Znajdź tabelę zdarzeń, klikając tabelę małych zdarzeń w menu widoku, a następnie oblicz zdarzenia na mikrometr kwadratowy, dzieląc liczbę wykrytych sygnałów jonów wapnia przez obszar wybranej ramki. Liczba spontanicznie występujących sygnałów wapniowych w małych żyłach płucnych przy pięciomilimetrowym ciśnieniu śródświetlnym rtęci wynosiła 0,73 plus minus 0,2 zdarzenia na minutę na mikrometr kwadratowy w warunkach podstawowych. Dodatek ryanodyny drastycznie zmniejszył aktywność sygnalizacyjną wapnia.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje specyficzne funkcje sygnałów wapniowych (Ca2+) w małych żyłach płucnych (PVs) przy fizjologicznych ciśnieniach wewnątrzświatowych, co stanowi obszar dotychczas nieeksplorowany w badaniach nad naczyniami krwionośnymi płuc. Autorzy przedstawiają nowy protokół izolacji małych PVs, stosowania wskaźników Ca2+ oraz przeprowadzania obrazowania konfokalnego w celu analizy tych sygnałów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Fizjologia układu sercowo-naczyniowego
- Sygnalizacja wapniowa
- Biologia naczyniowa
Wstęp
- Sygnały wapniowe są kluczowe dla funkcji naczyń krwionośnych.
- Badanie żył płucnych jest niezbędne, ponieważ wpływają one na przepływ krwi w płucach.
- Wcześniejsze badania nie oceniały sygnałów Ca2+ w żyłach płucnych przy normalnym ciśnieniu.
Zastosowane metody
- Izolacja małych naczyń płucnych (PV) z płuc myszy
- Zastosowanie Fluo-4 AM do obrazowania wapnia
- Mikroskopia konfokalna do detekcji i analizy sygnału
Główne wyniki
- Opracowanie protokołu analizy sygnałów Ca2+ w małych pęcherzykach parasekrecyjnych (PV).
- Zmierzona bazowa częstotliwość sygnałów Ca2+ wyniosła 0,73 ± 0,2 zdarzeń na minutę na mikrometr kwadratowy.
- Zastosowanie rynodyny znacząco zredukowało aktywność sygnałową Ca2+.
Wnioski
- Badanie pogłębia zrozumienie wpływu ciśnienia wewnątrznaczyniowego na sygnały Ca2+ w małych żyłach płucnych (PVs).
- Wyniki mają znaczenie dla zrozumienia regulacji naczyniowej w stanie zdrowia i choroby.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe obrazowanie sygnałów Ca2+ w małych żyłach płucnych przy ciśnieniach fizjologicznych wypełnia krytyczną lukę w biologii naczyniowej, umożliwiając mechaniczną weryfikację i redukcję ryzyka przy walidacji celów naczyniowych w płucach. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków, zapewniając bezpośrednie, ilościowe odczyty sygnalizacji naczyniowej w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Metoda ta wspiera decyzje dotyczące portfela projektów poprzez wyjaśnienie funkcjonalnego wpływu potencjalnych interwencji na szlaki sygnalizacji naczyniowej istotne dla danej jednostki chorobowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę sygnalizacji zależnej od Ca2+ w naczyniowych układach istotnych dla procesów chorobowych.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez izolację wpływu modulacji receptorów ryzodynowych na funkcje naczyniowe.
- Zapewnia ilościowe punkty końcowe dla funkcjonalnej walidacji celu w badaniach nad naczyniami płucnymi.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ustanawia powtarzalny schemat obrazowania i kwantyfikacji sygnałów Ca2+ w nienaruszonych tkankach naczyniowych.
- Ułatwia standaryzację analizy dzięki określonym warunkom ciśnienia i zautomatyzowanym progom detekcji zdarzeń.
- Umożliwia wiarygodne porównanie wpływu związków na dynamikę sygnalizacji Ca2+ w naczyniach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje warunki eksperymentalne do ciśnień fizjologicznych, aby zwiększyć istotność translacyjną wyników.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej, zapewniając funkcjonalne odczyty istotne dla przebiegu choroby.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne, umożliwiając wczesne wykrycie efektów poza docelowych lub niepożądanych skutków naczyniowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół obrazowania wpisuje się w kontinuum od fazy odkryć do badań przedklinicznych, zapewniając platformę do testowania hipotez, walidacji celów oraz ilościowej oceny sygnalizacji naczyniowej w warunkach fizjologicznych.
- Biologia odkryć: Wspiera analizę szlaków sygnalizacyjnych Ca2+ w żyłach płucnych w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewy: Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wyniki do porównań między różnymi warunkami i związkami.
- Analityka: Umożliwia zautomatyzowaną detekcję zdarzeń i kwantyfikację ich częstotliwości w celu przeprowadzenia rzetelnej analizy statystycznej.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia in vitro z istotnością in vivo poprzez utrzymanie fizjologicznych warunków ciśnienia.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku platformę obrazowania i analizy dla różnorodnych programów badań naczyniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naczyniowych.
- Wartość operacyjna: standaryzuje przepływy pracy w zakresie obrazowania i analizy w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: wspiera decyzje typu go/no-go poprzez dostarczanie ilościowych, fizjologicznie istotnych danych na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację celów naczyniowych i potencjalnych interwencji z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie sekcji naczyniowej, myografii ciśnieniowej oraz obrazowania konfokalnego.
- Wymagany jest dostęp do konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym o wysokiej rozdzielczości oraz oprogramowania do zautomatyzowanej analizy.
- Konieczna jest standaryzacja ustawień ciśnienia i progów detekcji zdarzeń pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja do różnych rozmiarów naczyń lub gatunków w celu zapewnienia istotności translacyjnej.
- Metoda ograniczona do analizy ex vivo; dla pełnej pewności translacyjnej może być wymagana walidacja in vivo.
