Obrazowanie sygnałów^Ca2+ w małych żyłach płucnych przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym

W tym protokole prezentujemy nowatorską technikę rejestrowania i analizowania sygnałów Ca²⁺ w żyłach wewnątrzpłucnych (małe żyły płucne lub PV) przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym. Technika ta obejmuje izolację małych PV, inkubację ich za pomocą wskaźnika Ca²⁺, kaniulowanie i zwiększanie ciśnienia, obrazowanie konfokalne sygnałów Ca²⁺ oraz analizę danych.

Sygnały wapniowe regulują czynność naczyń krwionośnych, różniąc się źródłem i rolą. Naszym celem jest zrozumienie ich specyficznych funkcji w ścianie naczyniowej i zidentyfikowanie nieprawidłowości związanych z chorobą. Większość badań naczyń krwionośnych płuc koncentruje się na tętnicach lub naczyniach włosowatych, a nie na żyłach płucnych.

W żadnym z badań nie oceniano sygnałów wapniowych w żyłach płucnych przy normalnym ciśnieniu śródświetlnym, pomimo ich fizjologicznego znaczenia. W żyłach płucnych dochodzi do zmian ciśnienia podczas cykli cardio, ale ich wpływ na sygnały wapniowe nie był badany. Nasz protokół umożliwia akwizycję i automatyczną analizę sygnałów wapniowych w małych żyłach płucnych przy normalnym ciśnieniu.

Nasz protokół umożliwia przyszłe badania nad tym, jak ciśnienie śródświetlne wpływa na sygnały wapniowe w małych żyłach płucnych, pogłębiając wiedzę na temat ich regulacji i roli w zdrowiu i chorobie. Na początek wyczyść narzędzia i naczynia do preparowania w 100% etanolu, a następnie umyj je w wodzie dejonizowanej. Z nożyczkami.

Otwórz klatkę piersiową myszy poddanej eutanazji. Użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć serce i płuca z jamy klatki piersiowej przy minimalnym dotykaniu płuc. Następnie umieść tkankę na płytce pokrytej powłoką uszczelniającą, zawierającej zimny, buforowany roztwór soli fizjologicznej HEPES.

Przypnij serce i płuca za pomocą szpilek rozwarstwiających, tak aby duże żyły płucne i tętnice płucne były wyraźnie widoczne, a lewy płat płuca był lekko rozciągnięty. Używając dużych żył płucnych jako punktów odniesienia, ostrożnie usuń tkankę otaczającą małe żyły międzypłucne za pomocą cienkich nożyczek. Następnie delikatnie odizoluj małe żyły płucne od otaczającej tkanki.

Następnie przygotuj stężenie zapasu 2,5 milimolowego Fluo-4 AM z DMSO. Korzystając z roztworu podstawowego, przygotuj roztwór ładujący. Umieść małe żyły płucne w 1,5-mililitrowej probówce z roztworem ładującym.

Przykryj probówkę folią aluminiową, inkubowaną w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Aby kaniulować małe żyły płucne, usuń żyłę z roztworu myjącego. Umieść go w przygotowanej komorze miografii ciśnieniowej.

Za pomocą kleszczy z cienką końcówką ostrożnie nałóż jeden koniec małej żyły płucnej na jedną z kaniul, a następnie użyj mikrofilamentu z nylonową nicią, aby zawiązać węzeł wokół kaniulowanego końca małej żyły płucnej i końcówki kaniuli, aby ją zabezpieczyć. Delikatnie przeciśnij roztwór soli fizjologicznej przez kaniulę, aby usunąć krew z żyły płucnej. Użyj nylonowej nici, aby związać drugi koniec szklaną kaniulą za pomocą mikrowłókien.

W celu obrazowania wapnia należy najpierw podłączyć regulator ciśnienia serwomechanizmu do rurki zawierającej buforowany roztwór soli fizjologicznej HEPES. Użyj kontrolera, aby zwiększyć ciśnienie w małej żyle płucnej z jednego końca. Teraz podłącz pompę perystaltyczną do wlotu i wylotu oraz wylotu i przelej roztwór.

Po okresie równowagi użyj 40-krotnego obiektywu do zanurzania w wodzie i systemu obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem, aby uzyskać obrazy wapnia dla 1000 klatek. Aby przeprowadzić analizę obrazu, uruchom specjalnie zaprojektowany program Spark i oprogramowanie. Użyj filtra pięć na pięć i filtra mediany, aby wygładzić obrazy, a następnie umieść ramkę przedstawiającą płaski obszar żyły płucnej z wieloma komórkami do automatycznego wykrywania zdarzeń.

Kliknij widok i automatyczne wykrywanie zdarzeń. Ustaw próg zdarzenia na amplitudę 1,3F przez F0, tolerancję na 20%, pole skanowania na siedem na siedem pikseli, a średnią bieżącą na siedem obrazów. Kliknij Rozpocznij wyszukiwanie lub ikonę oka.

Znajdź tabelę zdarzeń, klikając tabelę małych zdarzeń w menu widoku, a następnie oblicz zdarzenia na mikrometr kwadratowy, dzieląc liczbę wykrytych sygnałów jonów wapnia przez obszar wybranej ramki. Liczba spontanicznie występujących sygnałów wapniowych w małych żyłach płucnych przy pięciomilimetrowym ciśnieniu śródświetlnym rtęci wynosiła 0,73 plus minus 0,2 zdarzenia na minutę na mikrometr kwadratowy w warunkach podstawowych. Dodatek ryanodyny drastycznie zmniejszył aktywność sygnalizacyjną wapnia.