Name: Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: Poznaj metodę badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego. Protokół umożliwia ocenę odpowiedzi komórkowych i nowej formacji kostnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez NIH/NIDCR R01-DE030716-01 i NIH/NIAMS R01-DE030716-01S1 do AS, NIH/NIAMS R01AR080131 do RG oraz UConn REP Convergence Grant dla RG i AS.

Następujące procedury zostały przeprowadzone za zgodą University of Connecticut Health Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Wszystkie operacje zostały przeprowadzone w sterylnych warunkach, zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH). Ból i ryzyko infekcji były kontrolowane za pomocą odpowiednich środków przeciwbólowych i antyseptycznych, aby zapewnić pomyślny wynik.
1. Przygotowanie pola operacyjnego i narzędzi
<ol>
	<li>Przygotuj salę zabiegową, dezynfekując powierzchnie robocze środkiem dezynfekującym klasy klinicznej. 
	UWAGA: Chirurg powinien nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym sterylne rękawiczki jednorazowe, czepek do włosów, fartuch i maskę.</li>
	<li>Przygotuj poduszkę grzewczą pokrytą sterylną podkładką chirurgiczną. Zbierz i ułóż wszystkie sterylne narzędzia i odczynniki (Tabela materiałów) w wygodny dostęp.</li>
</ol>
2. Znieczulenie przedoperacyjne
<ol>
	<li>Zważ wszystkie myszy przed operacją. Obliczyć objętości leku przeciwbólowego, który należy zastosować, w oparciu o dostępną postać buprenorfiny.</li>
	<li>Zamontuj jednostkę do znieczulenia zwierząt w sterylnej przestrzeni roboczej, która obejmuje komorę indukcyjną i zespół stożka nosowego. Ustaw wydajność tlenu na 2 litry min-1 i izofluran na 1,5-3% (v/v) w zależności od wieku i wagi myszy.</li>
	<li>Po podaniu mysz uspokojonej wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i umieść je na sterylnej podkładce chirurgicznej w pozycji leżącej. Nałóż lubrykant okulistyczny na oba oczy. Umieść stożek nosowy nad głową. Sprawdź, czy mysz jest odpowiednio znieczulona, delikatnie szczypiąc palec u nogi. Przed kontynuowaniem upewnij się, że nie ma reakcji odruchowej kończyn tylnych.</li>
	<li>Przed zabiegiem chirurgicznym należy na krótko usunąć mysz ze stożka nosowego, aby wstrzyknąć całkowitą dawkę buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu drogą podskórną; całkowita dawka wynosi 3,25 mg/kg.</li>
</ol>
3. Opis zabiegu chirurgicznego
UWAGA: Ten zabieg chirurgiczny wykorzystuje samce i samice myszy C57BL/6 w wieku od 10 tygodni do 24 tygodni. Procedura może być wykonywana na myszach w wieku od 6 tygodni do 33 tygodni oraz na różnych szczepach wsobnych, jak pokazują inni10,11. Młodsze myszy mogą wymagać krótszych igieł, podczas gdy starsze lub większe myszy mogą wymagać dłuższej igły.
<ol>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml wyposażoną w igłę 26 G sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Odłóż to na bok.</li>
	<li>Usuń sierść z tylnej kończyny, na której zostanie wykonany zabieg, za pomocą elektrycznych lub zasilanych bateryjnie maszynek do strzyżenia (ostrze #40) i usuń luźne futro z pola operacyjnego. Za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką potraktuj pole operacyjne peelingiem na bazie jodu (10% jodu powidonu), a następnie 70% alkoholem izopropylowym. Wyszoruj miejsce operowane, zaczynając od środka kolana i wykonując okrężny ruch na zewnątrz. Pozostaw miejsce do wyschnięcia. Powtórz kroki peelingu 3 razy. </li>
	<li>Połóż mysz na plecach i zegnij kolano nogi operacyjnej. Przytrzymaj nogę myszy w ręce niedominującej tak, aby kolano było zgięte nad środkowym palcem, drugi palec spoczywał na kości udowej, a kciuk spoczywał na kości piszczelowej.</li>
	<li>Wykonaj małe, płytkie poziome nacięcie tuż pod rzepką za pomocą skalpela. 
	UWAGA: Ten krok poprawia wizualizację miejsca wstawienia. Z doświadczeniem ten krok można pominąć.</li>
	<li>Zlokalizuj przestrzeń stawową, umieszczając igłę poziomo w poprzek zgiętego kolana i wyczuwając przestrzeń między kością udową a piszczelową. Korzystając z tego anatomicznego miejsca do prowadzenia, weź igłę 25 G i ręcznie przewierć (przekręcając igłę i jednocześnie wywierając umiarkowany nacisk na igłę) do dystalnej części kości udowej od kolana w kierunku bliższej strony. Wbić igłę przez rzepkę lub wokół niej.</li>
	<li>Prześwietl mysz, aby upewnić się, że igła została prawidłowo umieszczona w jamie szpikowej, jak najbliżej środka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Wyjąć igłę 25 G i natychmiast włożyć igłę 26 G do tego samego otworu w jamie szpiku. Rozwiercaj boki jamy szpikowej okrężnymi ruchami co najmniej 5 razy, aż będzie gładka. Utrzymuj stałą liczbę ruchów rozwiercania między każdą myszą. 
	UWAGA: Kroki 3.5 i 3.7 mogą spowodować zranienie chirurgia igłą, jeśli nie będą traktowane ostrożnie.</li>
	<li>Wyjąć igłę 26 G i wymienić igłę 26 G podłączoną do strzykawki z solą fizjologiczną. Przepłucz wnękę, aż przepływ zwrotny będzie czysty. Zwykle wymaga to 1,5-2 ml soli fizjologicznej. Wyjąć strzykawkę i igłę i bezpiecznie wyrzucić je do ostrego pojemnika. 
	UWAGA: Podczas pchania płynu nie powinno być oporu. Jeśli tak, należy ponownie wprowadzić igłę, aby upewnić się, że znajduje się ona w jamie ustnej. Może być konieczne wyciągnięcie igły do połowy.</li>
	<li>Zamknij ranę skóry za pomocą miejscowego szwu adhezyjnego.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Bezpośrednio po zabiegu chirurgicznym należy podać pozostałą połowę dawki buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu, dozując z kroku 2.4. 
	UWAGA: Buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu zapewnia ulgę w bólu do 72 godzin.</li>
	<li>Monitoruj zwierzęta na poduszce grzewczej pod kątem oznak normalnego, niezakłóconego oddychania, dopóki nie obudzą się po operacji. Po przejściu na ambulatorium przywróć myszy do klatki.</li>
	<li>Kontynuuj monitorowanie myszy raz dziennie przez 3 dni po operacji, aby upewnić się, że goją się prawidłowo i mają pełną mobilność, obserwując oznaki bólu.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie kości do skanowania i analizy μCT
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji zgodnie z metodą humanitarnej eutanazji regulowaną i zatwierdzoną przez IACUC lub inną obowiązującą politykę instytucjonalną. W tym przypadku zastosowano pierwotną metodę eutanazji polegającą na wdychaniu CO2 , a następnie wtórną metodę zwichnięcia szyjki macicy.</li>
	<li>Zbierz kości udowe, odrywając skórę wokół kończyn tylnych i usuwając całą kończynę w stawie biodrowym.</li>
	<li>Umieść każdą kończynę między dwiema gąbkami w kasecie do zatapiania. Przenieś kości w kasetach do 10% roztworu formaliny i utrwal je w temperaturze 4 °C przez 5-7 dni, biorąc pod uwagę wiek i wielkość myszy. 
	UWAGA: Zarówno nadmierna, jak i niedostateczna fiksacja powodują słabą rozdzielczość szpiku.</li>
	<li>Po utrwaleniu umyj kasety w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 5 minut 3 razy.</li>
	<li>Wyjmij kończyny z kaset i w razie potrzeby odetnij mięśnie za pomocą skalpela. 
	UWAGA: W zależności od dalszych zastosowań, nieostrożne obchodzenie się z nią może naruszyć warstwę okostną kości.</li>
	<li>Oddziel kość udową w kolanie, ostrożnie przecinając więzadła za pomocą małych nożyczek chirurgicznych lub skalpela. 
	UWAGA: Piszczele mogą być używane do innych zastosowań lub wyrzucone.</li>
	<li>Przenieś kości udowe do stożkowych probówek o pojemności 1,7 ml lub 15 ml do 70% roztworu etanolu. Kości mogą pozostać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C, dopóki nie będą gotowe do skanowania μCT.</li>
	<li>Skanuj i oceniaj kości udowe pod kątem parametrów beleczkowania, uzyskując dane jakościowe i ilościowe.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie kości do zamrożonego podziału i histologii
UWAGA: Kości mogą być przetwarzane do zamrożonego przekroju i histologii po przejściu skanowania μCT. Skanowanie nie ma wpływu na znakowanie fluorescencyjne ani późniejsze barwienie przeciwciałami.
<ol>
	<li>Przenieś kości z 70% etanolu do PBS i umyj 3 razy po 5 minut na pranie.</li>
	<li>Inkubować w serii roztworów sacharozy od 10%, 20% do 30% w PBS w temperaturze 4 °C przez noc przy każdym stężeniu. Przechowywać kości w 30% sacharozie do 5 dni w temperaturze 4 °C lub w tym roztworze w temperaturze -20 °C przez 6-12 miesięcy, aż będą gotowe do osadzenia. 
	UWAGA: Zastosowanie gradientu sacharozy powoduje lepszą penetrację tkanek. Po kroku 6.1 kości można umieścić bezpośrednio w 30% roztworze sacharozy na noc.</li>
	<li>Osadzanie kości w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) za pomocą form do zatapiania w krioemburgu. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do krojenia.</li>
	<li>Cięcie osadzonych kości metodą taśmy kriofilmowej z temperaturą kriostatu ustawioną w zakresie od -24 °C do -26 °C.</li>
	<li>Przyklej skrawki kriofilmu do szkiełka adhezyjnego za pomocą kleju optycznego i utwardź go do momentu stwardnienia za pomocą środka sieciującego w ultrafiolecie (UV).</li>
</ol>
7. Przetwarzanie dla cytometrii przepływowej
UWAGA: Ten protokół jest kompatybilny z różnymi przeciwciałami. Aby scharakteryzować szkieletowe komórki macierzyste i progenitorowe, zaleca się zebranie 3-4 kości razem, ponieważ są to rzadkie populacje komórek w szpiku kostnym.
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę do barwienia (FSM) do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Aby przygotować 1000 ml roztworu FSM, połącz: 100 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS), 10 ml kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 20 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 870 ml dd H2O. Przepuścić roztwór FSM przez filtr 0,2 μm.</li>
	<li>Przed pobraniem tkanki należy wypełnić szalki Petriego 4-5 ml sterylnego PBS bez wapnia i magnezu.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę wytrawiającą
	<ol>
		<li>Na każde 4-6 kości udowych przygotuj mieszaninę trawiącą w 10 ml PBS zawierającą 0,005 g kolagenazy P i 0,02 g hialuronidazy. Wymieszać przez delikatne wirowanie i przepuścić mieszaninę przez filtr 0,22 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz kości w 3. dniu po operacji, zgodnie z opisem w kroku 5.2. Usuń wszystkie mięśnie i tkankę łączną za pomocą ostrza skalpela.</li>
	<li>Napełnij szalkę Petriego 5 ml pożywki wytrawiającej. Umieść 4-6 kości w pożywce wytrawiającej. Drobno posiekaj każdą kość, wykonując pierwsze cięcie wzdłuż i bocznie.</li>
	<li>Przenieść tkankę do probówki okrągłodennej o pojemności 14 ml i uszczelnić parafilmem. Przykryj rurki folią aluminiową.</li>
	<li>Wstrząsać w temperaturze 37 °C przez 20 minut, trzymając probówkę poziomo na shakerze.</li>
	<li>Wyjmij rurkę z shakera. Komórki zostaną zbite na dole. Delikatnie zebrać strawiony materiał, nie naruszając komórek na dnie, i przepuścić trawienie przez filtr 70 μm. Zebrać filtrat do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml zimnego FSM i przechowywać go na lodzie.</li>
	<li>Do komórek dodaj pozostałe 5 ml mieszanki trawiącej. Ponownie uszczelnij parafolią i przykryj folią aluminiową. Potrząśnij rurką zgodnie z powyższym opisem. Powtórz kroki 7.7-7.8.</li>
	<li>Po 20 minutach inkubacji w temperaturze 37 °C, przenieść wytrawianie do tej samej probówki zawierającej trawienie z etapu 7.8, przechodząc przez filtr 70 μm z kolejnymi 10 ml FSM.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 274 x g w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i zebrać osad komórkowy. Usuń granulkę, delikatnie stukając w rurkę. 
	UWAGA: Siła odśrodkowa (g) opiera się na promieniu wirnika wynoszącym 170 mm. Sprawdź promień wirnika i odpowiednio dostosuj prędkość.</li>
	<li>Aby przeprowadzić lizę czerwonych krwinek, dodaj 1 ml buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK). Trzymaj wszystkie odczynniki i komórki na lodzie.</li>
	<li>Inkubować komórki w ACK przez około 5 minut w temperaturze pokojowej. Nie przekraczaj 5 minut, aby uniknąć nadmiernej lizy komórek.</li>
	<li>Dodać 9 ml FSM. Wirować przy 274 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant. Rozbij osad komórkowy, delikatnie grabiąc rurkę na stojaku na tuby.</li>
	<li>Dodaj 10 ml FSM (objętość na 4 kości, można dostosować w zależności od liczby połączonych kości) i ponownie zawiesić.</li>
	<li>Pobrać podwielokrotność każdej próbki i dodać jodek propidyny (PI) zgodnie z instrukcjami producenta. Policz żywe i całkowite komórki za pomocą licznika komórek.</li>
	<li>Kontynuuj barwienie przeciwciał próbek przy użyciu żądanych markerów do analizy cytometrii przepływowej12,13,14.</li>
</ol>

Improved Bone Marrow Injury Model for Intramembranous Bone Repair Studies

<ol><li>Bahney, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+biology+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular biology of fracture healing.</a> J Orthop Res. 37 (1), 35-50 (2019).</li>
<li>Ko, F. C., Sumner, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+faithfully+does+intramembranous+bone+regeneration+recapitulate+embryonic+skeletal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">How faithfully does intramembranous bone regeneration recapitulate embryonic skeletal development.</a> Dev Dyn. 250 (3), 377-392 (2021).</li>
<li>Patt, H. M., Maloney, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+regeneration+after+local+injury%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow regeneration after local injury: a review.</a> Exp Hematol. 3 (2), 135-148 (1975).</li>
<li>Chitnis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+bone+fractures%3A+treatment+patterns+and+factors+contributing+to+use+of+intramedullary+nailing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Med+Devices%22%5BJournal%5D)">Long bone fractures: treatment patterns and factors contributing to use of intramedullary nailing.</a> Expert Rev Med Devices. 17 (7), 731-737 (2020).</li>
<li>Singaram, S., Naidoo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physical+impact+of+long+bone+fractures+on+adults+in+KwaZulu-Natal%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afr+J+Physiother%22%5BJournal%5D)">The physical impact of long bone fractures on adults in KwaZulu-Natal.</a> S Afr J Physiother. 76 (1), 1393(2020).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthopedic+implants+and+devices+for+bone+fractures+and+defects%3A+past%2C+present+and+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Eng+Regen%22%5BJournal%5D)">Orthopedic implants and devices for bone fractures and defects: past, present and perspective.</a> Eng Regen. 1, 6-18 (2020).</li>
<li>Marsell, R., Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">The biology of fracture healing.</a> Injury. 42 (6), 551-555 (2011).</li>
<li>Katagiri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphogenetic+protein-induced+heterotopic+bone+formation%3A+what+have+we+learned+from+the+history+of+a+half+century%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+Dent+Sci+Rev%22%5BJournal%5D)">morphogenetic protein-induced heterotopic bone formation: what have we learned from the history of a half century.</a> Jpn Dent Sci Rev. 51 (2), 42-50 (2015).</li>
<li>Wise, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+gene+expression+profiling+during+rat+femoral+marrow+ablation-induced+intramembranous+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Temporal gene expression profiling during rat femoral marrow ablation-induced intramembranous bone regeneration.</a> PLoS One. 5 (10), e12987(2010).</li>
<li>Chen, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biglycan-deficient+mice+have+delayed+osteogenesis+after+marrow+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Biglycan-deficient mice have delayed osteogenesis after marrow ablation.</a> Calcified Tissue Int. 72 (5), 577-582 (2003).</li>
<li>Moran, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembranous+bone+regeneration+differs+among+common+inbred+mouse+strains+following+marrow+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Intramembranous bone regeneration differs among common inbred mouse strains following marrow ablation.</a> J Orthop Res. 33 (9), 1374-1381 (2015).</li>
<li>Jeffery, E. C., Mann, T. L. A., Pool, J. A., Zhao, Z., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+periosteal+skeletal+stem%2Fprogenitor+cells+contribute+distinct+to+bone+maintenance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells contribute distinct to bone maintenance and repair.</a> Cell Stem Cell. 29 (11), 1547-1561.e6 (2022).</li>
<li>Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+characterization+of+murine+young-adult+long+bone+skeletal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors.</a> Front Endocrinol. 13, 930358(2022).</li>
<li>Chan, C. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+specification+of+the+mouse+skeletal+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and specification of the mouse skeletal stem cell.</a> Cell. 160 (1-2), 285-298 (2015).</li>
<li>Moran, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembranous+bone+regeneration+in+diversity+outbred+mice+is+heritable%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Intramembranous bone regeneration in diversity outbred mice is heritable.</a> Bone. 164, 116524(2022).</li>
<li>Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+bone+healing%3A+fracture%2C+marrow+ablation%2C+and+distraction+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis.</a> Curr Protoc Mouse Biol. 5 (1), 35-49 (2015).</li>
<li>Cooper, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+critical+size+in+calvarial+bone+defects%3A+revisiting+the+concept+of+a+critical-size+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect.</a> Plast Reconstr Surg. 125 (6), 1685-1692 (2010).</li>
<li>Yu, Y., Bahney, C., Hu, D., Marcucio, R. S., Miclau, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+rigidly+stabilized+fractures+for+assessing+intramembranous+ossification%2C+distraction+osteogenesis%2C+or+healing+of+critical+sized+defects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating rigidly stabilized fractures for assessing intramembranous ossification, distraction osteogenesis, or healing of critical sized defects.</a> J Vis Exp. (62), e3552(2012).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+calvarial+defects+repair+with+PDGF-BB+mimetic+peptide+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Enhancing calvarial defects repair with PDGF-BB mimetic peptide hydrogels.</a> J Control Release. 370, 277-286 (2024).</li>
<li>Stanton, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+calvarial+defect+model+for+the+investigation+of+the+osteogenic+potential+of+newborn+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+in+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">A murine calvarial defect model for the investigation of the osteogenic potential of newborn umbilical cord mesenchymal stem cells in bone regeneration.</a> Plast Reconstr Surg. 153 (3), 637-646 (2023).</li>
<li>Manassero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+segmental+femoral+critical-size+defect+model+in+mice+stabilized+by+plate+osteosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis.</a> J Vis Exp. (116), e52940(2016).</li>
<li>Petersen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomaterial+with+a+channel-like+pore+architecture+induces+endochondral+healing+of+bone+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A biomaterial with a channel-like pore architecture induces endochondral healing of bone defects.</a> Nat Commun. 9 (1), 4430(2018).</li>
<li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomic+interrogation+of+the+murine+bone+marrow+signaling+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape.</a> Bone Res. 11 (1), 59(2023).</li>
<li>Yu, V. W. C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the bone marrow niche.</a> Curr Opin Hematol. 23 (4), 331-338 (2016).</li>
<li>Matsushita, Y., Ono, W., Ono, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+plate+skeletal+stem+cells+and+their+transition+from+cartilage+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Growth plate skeletal stem cells and their transition from cartilage to bone.</a> Bone. 136, 115359(2020).</li>
<li>Mizuhashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+zone+of+the+growth+plate+houses+a+unique+class+of+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells.</a> Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).</li>
<li>Muruganandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FoxA2%2B+long-term+stem+cell+population+is+necessary+for+growth+plate+cartilage+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A FoxA2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury.</a> Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do przekazania.

Celem było opracowanie wiarygodnej i powtarzalnej metody badania procesów molekularnych i komórkowych regulujących naprawę kości, koncentrując się na bezpośredniej konwersji szkieletowych komórek macierzystych i progenitorowych (SSPC) w osteoblasty odkładające się w kościach w przestrzeni/jamie szpiku kostnego. Opisana tutaj metoda mechanicznej ablacji szpiku kostnego jest zoptymalizowanym i zwalidowanym protokołem ablacji szpiku kostnego przez uraz mechaniczny, który pozwala na badanie wewnątrzbłoniastego tworzenia się ...

Długie urazy kości goją się drogą wewnątrzchrzęstną lub wewnątrzbłoniastą kości. W przeciwieństwie do szlaku endochrzęstnego, który wymaga etapu prekursorowego chrząstki, naprawa kości poprzez kostnienie śródbłoniaste obejmuje bezpośrednią konwersję komórek macierzystych i progenitorowych szkieletu (SSPCS) w osteoblasty tworzące kości1. Klinicznie proces ten jest istotny dla gojenia kości w różnych kontekstach, w tym krytycznych defektów wielkości, ustabilizowanych złamań, wad kory mózgowej, osteogenezy dystrakcyjnej, urazów spowodowanych resekcjami guza, i osteointegracja implantów endoprotezozastępczych stawów2,3. Co ciekawe, w badaniach pacjentów ze złamaniami kości długich, 66%-82% miało złamania z przemieszczeniem, które wymagały urządzeń mocujących do stabilizacji kości4,5. Te sztywno ustabilizowane kości goją się głównie poprzez kostnienie śródbłoniaste, gdy złamane końce kości stykają się ze sobą bezpośrednio6,7. Jednak mechanistyczna regulacja śródbłoniastej regeneracji kości pozostaje stosunkowo słabo zbadana w porównaniu z tworzeniem kości za pośrednictwem szlaków endochrzęstnych. Zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) terapie wspomagające gojenie się kości są utrudnione ze względu na ograniczoną skuteczność kliniczną i wysokie koszty oraz wiążą się ze znaczącymi skutkami ubocznymi8.
Mechaniczna ablacja szpiku kostnego dostarcza cennego modelu do badania wewnątrzbłoniastego tworzenia się kości. Ten prosty model urazu pozwala na badanie regeneracji kości w szpiku kostnym bez naruszania kości korowej. Po ablacji BM proces gojenia obejmuje odrębne, ale nakładające się na siebie fazy. Faza początkowa następuje w ciągu pierwszych 1 do 5 dni i obejmuje tworzenie się skrzepów i stan zapalny, w którym komórki zapalne i cytokiny inicjują gojenie. Od 3 do 14 dnia druga faza charakteryzuje się regeneracją, w tym neowaskularyzacją, migracją i proliferacją mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), różnicowaniem osteoblastycznym i tworzeniem tkanych kości. Końcowa faza przebudowy rozpoczyna się około 10 dni po zabiegu, a tkanka kostna przechodzi dojrzewanie i restrukturyzację, aż szpik kostny zostanie w pełni przywrócony do dnia 569. Ten szybki czas gojenia sprawia, że model ablacji BM jest idealny do badania wczesnych reakcji naprawy kości, szczególnie w krytycznych okresach stanu zapalnego, rekrutacji komórek progenitorowych i różnicowania osteoblastów. Za pomocą technik takich jak histologia, cytometria przepływowa i ilościowa analiza μCT można ocenić odpowiedzi komórkowe i tworzenie kości we wczesnych stadiach naprawy. Wykorzystując wyżej wymienione techniki, model ablacji BM może dostarczyć informacji na temat mechanizmów śródbłonowej regeneracji kości i pomóc w identyfikacji kluczowych celów terapeutycznych w celu poprawy gojenia się kości.

<table><tbody><tr><td>10% roztwór formaliny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>25 G 0,625 cala Igła podskórna Air-tite EZ Flo</td><td>Ait Tite/ Fisher Scientific</td><td>14-817-239; ref #NEZ25058</td><td></td></tr><tr><td>26 G 1/2" Jednorazowe igły podskórne</td><td>Exel International/ Fisher Scientific</td><td>14-840-83; Nr ref. #26402</td><td>Wszelkie igły 26 G można zastąpić, muszą być odłączane od strzykawki&nbsp;</td></tr><tr><td>3 ml sterylna strzykawka</td><td>Fisherbrand/ Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-955-457</td><td></td></tr><tr><td>AB Sterylna podkładka</td><td>McKesson/ Fisher Scientific</td><td>NC0593755</td><td>Alternatywnie można użyć autoklawowalnych wkładek chłonnych&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas octowy, glidowaty</td><td>milipor Sigma</td><td>AX0073</td><td>Należy rozcieńczyć do 1%</td></tr> <tr><td>buforu lizującego chlorku amonu i potasu (ACK)</td><td>Gibco/ Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A1049201</td><td>Służy do lizy czerwonych krwinek w ramach przygotowań do cytometrii przepływowej&nbsp;</td></tr><tr><td>Komora indukcyjna do znieczulenia 2 l</td><td>VetEquip</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Betadiny (Prowidon-Jod)&nbsp;</td><td>Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher Scientific</td><td>NC0158124</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina HCL do wstrzykiwań 0,3 mg/ml&nbsp;</td><td>Generyczny/ Covetrus</td><td>59122</td><td>Musi uzyskać stanową i federalną licencję DEA na zakup substancji kontrolowanej</td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>206700-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11249002001</td><td>Służy do trawienia kości</td></tr><tr><td>Waciki bawełniane i aplikatory</td><td>Fisherbrand/ Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22-363-172</td><td></td></tr><tr><td>Kriofilm typu II C(10), 3,5 cm</td><td>sekcja laboratoryjna, Japonia</td> Roztwór do barwienia <td>CFS 105</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab228549</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa waga gramowa</td><td>Toprime / Amazon</td><td>B06X6LW4V9</td><td>Może używać dowolnej wagi marki do ważenia myszy Kleszcze</td></tr><tr><td>preparacyjne&nbsp;</td><td>Fisherbrand/ Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-953E; 08-953F</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne&nbsp;</td><td>Fisherbrand/ Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Endure Niskoprofilowe ostrza kriostatu/mikrotomu</td><td>Tanner Scientific</td><td>TNR315LP</td><td></td></tr><tr><td>Ethiqa XR Buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu 1,3 mg / ml</td><td>Ethiqa XR / Cevetrus</td><td>72117</td><td>Musi uzyskać stanową i federalną licencję DEA na zakup substancji kontrolowanej</td></tr><tr><td>Fast Green, 0,2%</td> <td>Electron Miscroscopy Sciences EMS</td><td>50-319-57</td><td></td></tr><tr><td>Ciepło płodu bydlęcego dezaktywowany</td><td>Gibco/ Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A5256801</td><td>Służy do produkcji środków barwiących FACS (FSM)</td></tr><tr><td>Rozwiązanie montażowe Fluoromount-G&nbsp;</td><td>Południowa Biotechnologia&nbsp;</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>GLUSEAL Klej do stosowania miejscowego do skóry&nbsp;</td><td>Chirurgiczne zapalenie Azs (AD) chirurgiczne&nbsp;</td><td>GLU-550</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik Alexa 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21244</td><td>Rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td> <td>Gibco / Thermo Fisher Scientific</td><td>14065056</td><td>Używany do produkcji środków barwiących FACS (FSM)</td></tr> <tr><td>Podkładka grzewcza (duża)</td> <td>Boncare / Amazon</td><td>B0CLHSWXSX</td><td>Można użyć dowolnej marki poduszki grzewczej, zdejmij osłonę z tkaniny&nbsp;</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>MilliporeSigma/ Fisher Scientific</td><td>M1051740500</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>MilliporeSigma</td><td>HX0514</td><td>Służy do trawienia kości</td></tr><tr><td>Izofluran System znieczulenia zwierząt</td><td>VetEquip</td><td>901810</td><td></td></tr><tr><td>KUBTEC Parametr Gabinet 2D System rentgenowski</td><td>OncoMed Solutions</td><td>N/A</td><td>Można zastosować dowolny system obrazowania w szafie rentgenowskiej</td></tr><tr><td>Mikrowirówka Dętki</td><td>Corning/ Thomas Scientific&nbsp;</td><td>8600A52</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe mikroskopu, 18 mm x 18 mm, # 1 Grubość</td><td>Globe Scientific</td><td>1414-10</td><td></td></tr><tr><td>Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy HEPES (1M)&nbsp;</td><td>Gibco/ Thermo Fisher Scientific</td><td>156300-80</td><td>Służy do produkcji środków barwiących FACS (FSM)</td></tr><tr><td>Klej optyczny Norland NO61</td><td>Edmund Optical</td><td>37-322</td><td>Służy do przyklejania odcinków kriofilmu do szkiełka&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne królika Osterix&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab209484</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Peroxigard Gotowy do użycia jednoetapowy środek dezynfekujący</td><td>Virox Technologies</td><td>29101</td><td>Można zastąpić dowolnym innym środkiem dezynfekującym klasy klinicznej/laboratoryjnej</td></tr><tr><td>Jodek propidium (PI)&nbsp;</td><td>Invitrogen/ Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>P1304MP</td><td>Jądrowa plama fluorescencyjna używana do wykrywania martwych komórek w celu zwiększenia liczby zjadliwości</td></tr><tr><td>Akumulatorowy trymer elektryczny</td><td>Wahl / Amazon</td><td>B001FWXKUE</td><td>Można użyć dowolnych maszynek do strzyżenia, mniejszy trymer ułatwi golenie mniejszych zwierząt</td></tr><tr><td>Stożek do nosa gryzoni</td><td>VetEquip</td><td>921609</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O, 85% czysty, certyfikowany</td><td>przez Fisher Scientific</td><td>AC419211000</td><td></td></tr><tr><td>Seal'N Freeze Cryotray Square Molds</td><td>Electron Miscroscopy Sciences EMS</td><td>62642-01</td><td>Używane do zatapiania, można stosować inne formy do zatapiania. Ten konkretny model posiada głębszą formę, a także pokrywę do uszczelnienia bloku&nbsp;</td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6506</td><td>Azotan srebra do barwienia von Kossa</td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Gibco/ Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>Alternatywnie można użyć świeżo przygotowanego PBS, który został przefiltrowany i autoklawowany</td></tr><tr><td>Sterylne standardowe skalpele</td><td>Integra Miltex/ Fisher Scientific</td><td>12-460-455</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne standardowe skalpele</td><td>Integra Miltex/ Fisher Scientific</td><td>12-460-455</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza w proszku 1 KG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>036508-A1</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice Miscroscope Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand/ Fisher Scientific&nbsp;</td><td>1255015</td><td>Szkiełka samoprzylepne</td></tr><tr><td>Sure-Tek Przetwarzanie / Zatapianie Kasety</td><td>Fisherbrand Histosette/ Fisher Scientific</td><td>22-048-141</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Plus Optymalna temperatura cięcia Związek O.C.T Fisher</td><td>Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Gąbki do tkanek</td><td>Epredia/ Fisher Scientific</td><td>84-53</td><td>Gąbki tkankowe chronią tkanki przed nadmiernym rozmnażaniem&nbsp;</td></tr><tr><td>Toluidyna Blue</td><td>Fisher AC348600050</td><td></td><td></td> Scientific</tr></tbody></table>

ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

Improved Methodology for Studying Postnatal Osteogenesis via Intramembranous Ossification in a Murine Bone Marrow Injury Model

Długie urazy kostne goją się poprzez wewnątrzchrzęstne lub śródbłonowe ścieżki tworzenia kości. W przeciwieństwie do szlaku endochrzęstnego, który wymaga szablonu chrząstki, proces kostnienia śródbłoniastego obejmuje bezpośrednią konwersję szkieletowych komórek macierzystych i progenitorowych (SSPC) w osteoblasty tworzące kości. Istnieją ograniczone metody chirurgiczne do modelowania tego procesu u myszy eksperymentalnych. W tym miejscu ulepszyliśmy model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy, aby ułatwić badanie naprawy kości poprzez kostnienie śródbłoniaste i ocenić postnatalne regulatory osteogenezy. Metoda ta jest wysoce powtarzalna i przyjazna dla użytkownika, a także pozwala na czasową ocenę tworzenia się nowej kości w krótkim czasie (3-7 dni po urazie) za pomocą mikrotomografii komputerowej (μCT) i histologii zamrożonego skrawka. Co więcej, udział SSPC i dojrzałych osteoblastów można łatwo ocenić przy użyciu kombinacji fluorescencyjnych myszy reporterowych i tego śródbłoniastego modelu uszkodzenia szpiku kostnego. W kontekstach klinicznych wewnątrzbłoniaste tworzenie kości jest istotne dla leczenia krytycznych ubytków wielkości, ustabilizowanych złamań, ubytków kory mózgowej, urazów spowodowanych resekcjami guza i wymiany stawów.

Skuteczność procedury mechanicznej ablacji szpiku kostnego (BM) została potwierdzona za pomocą obrazowania rentgenowskiego podczas wprowadzania igły 26G do jamy szpikowej (Rycina 2A). W przypadku, gdy obrazowanie rentgenowskie wskazywało, że igła została wprowadzona pod niewłaściwym kątem lub przebiła kość, igłę wprowadzano ponownie pod odpowiednim kątem i ponownie obrazowano w celu potwierdzenia prawidłowego umiejscowienia. Zwierzęta, u których nie udało się osiągnąć prawidłowej pozycji, by...

Model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy jest użytecznym narzędziem do badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste. Ten uproszczony protokół chirurgiczny opisuje procedurę ablacji szpiku kostnego w celu dalszej oceny tworzenia się nowej kości i odpowiedzi komórkowych po urazie.

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage ...

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu mechanizmów naprawy kości z wykorzystaniem modelu uszkodzenia szpiku kostnego. Naszym celem jest odkrycie, w jaki sposób kostnienie błoniaste jest regulowane podczas gojenia oraz zbadanie podejść terapeutycznych, które można wykorzystać do poprawy regeneracji kości. Niedawne badania w tej dziedzinie ustaliły markery powierzchniowe definiujące szkieletowe komórki macierzyste i progenitorowe, ujawniając ich kluczową rolę w rozwoju i naprawie kości.Nasz protokół umożliwia zbadanie udziału tych komórek w kostnieniu błoniastym, co pozwala nam zbadać ich regulację i potencjał terapeutyczny podczas naprawy kości. Nasz protokół wypełnia lukę w zrozumieniu naprawy kości wyłącznie poprzez kostnienie śródbłoniaste w kontekście postnatalnym, przy użyciu modelu, który jest istotny klinicznie. W przeciwieństwie do innych modeli urazów stosowanych do badania kostnienia błoniastego, nasz protokół zapewnia bardziej kontrolowane środowisko i powtarzalne reakcje na urazy, szczególnie w kościach długich.W przyszłości nasze laboratorium będzie wykorzystywać model uszkodzenia szpiku kostnego wraz z miejscowymi podejściami farmakologicznymi do przejściowej modulacji epigenetycznych regulatorów osteogenezy. Naszym celem jest poprawa regeneracji i gojenia kości poprzez nowatorskie podejścia terapeutyczne. Na początek przygotuj i zdezynfekuj wszystkie powierzchnie robocze za pomocą klinicznego środka dezynfekującego do dezynfekcji.Przykryj platformę grzewczą sterylną podkładką chirurgiczną. Zbierz i ułóż wszystkie sterylne narzędzia, a także odczynniki. Teraz zważ mysz za pomocą wagi precyzyjnej.Na podstawie dostępnej postaci buprenorfiny należy obliczyć wymaganą objętość do podania leku przeciwbólowego. Po znieczuleniu myszy ostrożnie wyjmij ją z komory indukcyjnej. Umieść zwierzę na sterylnej podkładce chirurgicznej w pozycji leżącej na plecach i dopasuj stożek nosowy do głowy myszy.Na krótko wyjąć mysz ze stożka nosowego i wstrzyknąć obliczoną dawkę przeciwbólowego buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu drogą podskórną. Następnie ostrożnie umieść mysz z powrotem w jednostce znieczulenia stożka nosowego. Napełnij trzymililitrową strzykawkę wyposażoną w igłę o rozmiarze 26 sterylnym roztworem soli fizjologicznej i odłóż ją na bok.Usuń sierść z tylnej kończyny, gdzie zabieg zostanie wykonany za pomocą maszynki do strzyżenia elektrycznego lub akumulatorowego. Za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką nałóż 10% peeling jodowo-powidonowy na miejsce operowane, a następnie nałóż peeling z 70% alkoholem izopropylowym i pozostaw obszar do całkowitego wyschnięcia. Teraz połóż mysz na plecach i zegnij kolano nogi operacyjnej.Przytrzymaj nogę ręką niedominującą tak, aby kolano było zgięte nad środkowym palcem. Drugi palec spoczywa na kości udowej, a kciuk na kości piszczelowej. Za pomocą skalpela wykonaj małe, płytkie poziome nacięcie tuż pod rzepką.Zlokalizuj przestrzeń stawową z igłą umieszczoną poziomo w poprzek zgiętego kolana i wyczuj przestrzeń między kością udową a piszczelową. Użyj tego anatomicznego przewodnika, aby ręcznie wwiercić się w dystalną część kości udowej od kolana w kierunku bliższej strony za pomocą igły o rozmiarze 25. Wbić igłę przez rzepkę lub wokół niej.Potwierdź prawidłowe umieszczenie igły w jamie szpikowej za pomocą zdjęcia rentgenowskiego, upewniając się, że znajduje się jak najbliżej środka. Po wyjęciu igły o rozmiarze 25 należy natychmiast włożyć igłę o rozmiarze 26 do tego samego otworu w jamie szpiku. Rozwiercaj boki jamy szpikowej okrężnymi ruchami co najmniej pięć razy, aż poczujesz gładkość.Następnie wyjmij igłę o rozmiarze 26 i przepłucz wnękę 1,5 do 2 mililitrów soli fizjologicznej, aż przepływ wsteczny będzie czysty. Strzykawkę i igłę należy bezpiecznie wyrzucić do przeznaczonego do tego pojemnika. Następnie zamknij ranę skóry za pomocą miejscowego szwu adhezyjnego.Bezpośrednio po zabiegu należy podać pozostałą dawkę buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu, zgodnie z wcześniejszymi obliczeniami. Monitoruj zwierzę na poduszce grzewczej pod kątem oznak normalnego, niezakłóconego oddychania.

improved-methodology-for-studying-postnatal-osteogenesis-via

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje metodę stabilizacji złamań kości długich opartą na zastosowaniu zmodyfikowanych zewnętrznych stabilizatorów Ilizarova 1-3. Po zastosowaniu stabilizatorów i wywołaniu urazu kostnego można oceniać proces gojenia, przeprowadzać osteogenezę dystrakcyjną lub tworzyć staw rzekomy bądź defekt o rozmiarze krytycznym w celu badania interwencji terapeutycznych.

Tworzenie sztywno stabilizowanych złamań do oceny kostnienia błonowego, osteogenezy dystrakcyjnej lub gojenia ubytków o rozmiarze krytycznym

Ilościowy pomiar funkcji progenitora kości w gojeniu złamań wymaga technologii obrazowania seryjnego o wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu przedstawiono protokoły wykorzystujące mikroskopię przyżyciową i śledzenie linii kostnych w celu sekwencyjnego obrazowania i ilościowego określenia migracji, proliferacji i różnicowania endogennych osteogennych komórek macierzystych / progenitorowych w procesie naprawy złamań kości.

Sekwencyjne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do naśladowania poważnych uszkodzeń kości w badaniach biomedycznych. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, ustalenie ustabilizowanych zmian kostnych u myszy wykracza poza możliwości większości grup badawczych. W tym artykule opisujemy prostą metodę ustalania i analizowania eksperymentalnych wad kości udowej u myszy.

Prosty model ubytku kości udowej o krytycznej wielkości u myszy

Chociaż modele mysie są nieocenionymi narzędziami do inżynierii tkanki kostnej, modele długich wad kostnych są rzadkie. Ta potrzeba zmotywowała do opracowania obecnego protokołu, który wykorzystuje płytkę blokującą z czterema i dedykowanym przyrządem do wykonania i ustabilizowania powtarzalnego ubytku udowego o krytycznej wielkości przy niskiej zachorowalności.

Ustalenie segmentalnego modelu ubytku krytycznej wielkości kości udowej u myszy stabilizowanych przez osteosyntezę płytkową

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Ten protokół opisuje technikę osteosyntezy wykorzystującą gwóźdź blokujący śródszpikowy do standaryzacji osteotomii kości udowej, która może być używana do analizy prawidłowego i wadliwego gojenia kości u myszy.

Śródszpikowy gwóźdź blokujący do standaryzowanego mocowania osteotomii kości udowej w celu analizy prawidłowego i wadliwego gojenia kości u myszy

Ocena rozwoju tkanki w złamaniu modzeli podczas gojenia kości śródchrzęstnej jest niezbędna do monitorowania procesu gojenia. W tym miejscu informujemy o zastosowaniu zewnętrznego stabilizatora kompatybilnego z rezonansem magnetycznym (MRI) dla kości udowej myszy, aby umożliwić skany MRI podczas regeneracji kości u myszy.

In vivo (in vivo) Ocena rozwoju kalusa złamania podczas gojenia kości u myszy przy użyciu urządzenia do osteosyntezy kompatybilnego z MRI dla kości udowej myszy

Ten protokół opisuje minimalnie inwazyjną technikę osteosyntezy wykorzystującą śródszpikową do standaryzowanej stabilizacji złamań kości udowej, która może być wykorzystana do analizy endochrzęstnego gojenia kości u myszy.

Minimalnie inwazyjny model do analizy gojenia złamań śródchrzęstnych u myszy w standaryzowanych warunkach biomechanicznych

Model mysiego zamkniętego złamania kości udowej jest potężną platformą do badania gojenia złamań i nowatorskich strategii terapeutycznych przyspieszających regenerację kości. Celem tego protokołu chirurgicznego jest wygenerowanie jednostronnie zamkniętych złamań kości udowej u myszy za pomocą śródszpikowego pręta stalowego do stabilizacji kości udowej.

Generowanie zamkniętych złamań kości udowej u myszy: model do badania gojenia kości

Ten protokół opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu wykrycie złamania trzonu w kości udowej myszy, która jest stabilizowana drutem śródszpikowym, do badań nad gojeniem złamań.

Ustalenie modelu złamania kości udowej trzonu u myszy

Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę analizy naprawy kości żuchwy. Opisujemy powtarzalną technikę nieustabilizowanego złamania żuchwy w modelu mysim, pozwalającą na analizę procesu naprawy kości śródchrzęstnej przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i ubytku kości.

Mniej inwazyjna technika niestabilizowanego złamania żuchwy w modelach mysich

Poznaj metodę badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego. Protokół umożliwia ocenę odpowiedzi komórkowych i nowej formacji kostnej.

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów