In vitro Test na zakrzepicę dla urządzeń wspomagających pracę komór

Naszym celem jest opracowanie praktycznego i dostępnego protokołu laboratoryjnego w celu identyfikacji potencjalnych zakrzepowych punktów zapalnych w urządzeniach wspomagających komorowe, wypełniając krytyczną lukę między wczesnym prototypowaniem a testami na zwierzętach. Testy na zwierzętach pozostały podstawową metodą oceny zakrzepicy w urządzeniach wspomagających pracę komór. Chociaż obliczeniowa dynamika płynów stała się nieocenionym narzędziem do weryfikacji projektów, nie może jeszcze zastąpić walidacji in vitro i in vivo.

Złożony charakter obecności krzepnięcia krwi i liczne czynniki zakłócające, co utrudnia odróżnienie rzeczywistej trombogenności urządzenia od artefaktów eksperymentalnych. Metody in vitro do oceny zakrzepicy w VED pozostają niedostatecznie wykorzystywane i do tej pory nie istnieje żadna znormalizowana metoda. Oferując kompleksowy protokół i przewodnik wideo, mamy nadzieję ułatwić szersze zastosowanie metod laboratoryjnych.

Metoda ta stanowi odpowiedź zarówno na techniczne, jak i etyczne wyzwanie związane z opracowywaniem wyrobów medycznych, zmniejszając zależność od testów na zwierzętach, jednocześnie poprawiając zdolność wykrywania ryzyka zakrzepicy na wczesnym etapie procesu rozwoju. Aby rozpocząć, wypełnij pętlę testową 150 mililitrami krwi. Wyeliminuj całe powietrze uwięzione w pętli.

Jeśli używasz pompy krwi o przepływie osiowym, obróć ją do pozycji pionowej, aby uwolnić powietrze poprzez wyporność. Jeśli używasz pompy odśrodkowej, odwróć ją do góry nogami i obróć, aby upewnić się, że powietrze nie zostanie uwięzione w wtórnych ścieżkach przepływu. Delikatnie postukaj w powierzchnie rurki i zbiornika i ściśnij wszelkie pęcherzyki powietrza, aby je usunąć.

Dokładnie sprawdź poziome odcinki przewodów i połączenia między rurkami a złączami, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Ściśnij worek do podawania dożylnego, aby zbliżyć poziom płynu do wąskiej górnej części. Następnie zaciśnij worek z hemostatem w poprzek linii płynu, aby wyeliminować granicę faz płyn-powietrze i zamknij zawór odpowietrzający.

Następnie zamknij kran na końcu przewodów ciśnieniowych. Zdejmij rurkę manometru i podłącz trzymililitrową strzykawkę. Otwórz kran i wciągnij od jednego do dwóch mililitrów płynu do linii przedłużającej, około czterech centymetrów.

Zamknąć zawór odcinający, odłączyć strzykawkę i ponownie podłączyć rurkę manometru. Otwórz zawór odcinający, aby umożliwić odczyty ciśnienia. Na koniec zalać port pobierania próbek za pomocą strzykawki.

Następnie przetnij lub rozerwij niestrzępiącą się chusteczkę na trzy równe fragmenty. Przekręcić róg jednego fragmentu, aby utworzyć końcówkę i włożyć ją do portu iniekcyjnego, aby wchłonąć resztki krwi. Przekręć drugi fragment.

Zwilż go solą fizjologiczną i włóż mokrą końcówkę do portu, aby usunąć całą pozostałą krew. Użyj trzeciego fragmentu, aby wchłonąć wszelkie pozostałości soli fizjologicznej w porcie. Teraz uruchom urządzenie wspomagające komorę lub VAD, z niską prędkością i uruchom je na około pięć sekund, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza w pompie.

Zatrzymaj pompę. Jeśli w torbie pojawią się bąbelki, powtórz odpowietrzanie. Uruchom ponownie pompę z niską prędkością, aby krew krążyła w pętli.

Przenieś jeden mililitr heparyny sodowej, dwa mililitry przygotowanego roztworu chlorku wapnia i 1,5 mililitra EDTA do oddzielnych probówek. Aby dodać heparynę do krwi w pętli, należy odessać 75 jednostek heparyny do mikropipety i dozować ją do trzymililitrowej strzykawki, jednocześnie dozując pipetę i pociągając tłok strzykawki bez rozlewania. Użyj poprzecznego portu trójdrogowego kranu do podawania substancji do pętli za pomocą strzykawki.

Obróć blokadę męskiej przynęty na kurku tak, aby otwór wtryskowy był skierowany do góry, aby zatrzymać pęcherzyki powietrza u góry. Teraz przymocuj strzykawkę do portu iniekcyjnego za pomocą blokady przynęty z portem skierowanym do góry i strzykawką skierowaną pionowo w dół. Narysować tłok strzykawki, aby napełnić ją krwią i zmieszać heparynę z krwią, jednocześnie zasysając powietrze do strzykawki.

Pozwolić, aby pęcherzyki powietrza uniosły się do górnej części strzykawki. Następnie wstrzyknij mieszaninę do pętli, upewniając się, że nie dostaje się powietrze. Wprowadź i wyjmij krew ze strzykawki cztery do pięciu razy, aby upewnić się, że krew w heparyni nie pozostanie zamknięta w przestrzeni w porcie.

Aby miareczkować czas krzepnięcia po aktywacji lub ACT krwi w pętli, najpierw dodaj 750 mikrolitrów jednomolowego roztworu chlorku wapnia do 150 mililitrów krwi w pętli. Aby zapobiec krzepnięciu krwi, należy szybko wstrzyknąć płyn po usunięciu resztek powietrza. Alternatywnie, rozcieńczyć chlorek wapnia w strzykawce jednym mililitrem soli fizjologicznej buforowanej tris, aby zmniejszyć przedwczesną krzepliwość.

Po pozostawieniu wstrzykniętego chlorku wapnia na cyrkulację przez co najmniej dwie minuty, podłączyć jednomililitrową strzykawkę do portu pobierania próbek. Pobrać i wyrzucić 0,5 mililitra krwi odpadowej, aby usunąć stojącą krew z portu. Następnie podłącz nową strzykawkę o pojemności jednego mililitra do portu pobierania próbek i pobierz 0,5 mililitra krwi do analizy.

Zmierz czas krzepnięcia po aktywacji za pomocą przyłóżkowego systemu krzepnięcia krwi pełnej. Wyczyść port pobierania próbek za pomocą niestrzępiących się chusteczek, jak pokazano wcześniej. Zapoznaj się z wartościami miareczkowania, aby uzyskać informacje o docelowym stężeniu chlorku wapnia.

Stopniowo zwiększaj stężenie wapnia, aby osiągnąć aktywowany czas krzepnięcia wynoszący 300 sekund. Badanie zakrzepicy in vitro należy rozpocząć po osiągnięciu ACT wynoszącego 300 sekund w pętli. Dostosuj pompę do żądanego natężenia przepływu i ciśnienia, modyfikując prędkość wirnika i regulując opór za pomocą zacisku Hoffmana.

Mierz ACT co 15 minut, pobierając próbkę krwi z pętli i umieszczając kroplę krwi w instrumencie ACT, jak pokazano wcześniej. Jeśli ACT spadnie poniżej 200 sekund, wstrzyknij dodatkowe 25 jednostek heparyny sodowej do pętli. Po godzinie wstrzyknij 1,5 mililitra 0,5-molowego EDTA do pętli, aby zahamować dalszą krzepnięcie.

Pozwól EDTA krążyć i mieszaj przez dwie minuty, a następnie zatrzymaj pompę. Za pomocą hemostatów zaciśnij rurkę podłączoną do wlotu i wylotu pompy, umieszczając zaciski w odległości od trzech do czterech centymetrów od króćców wlotowych i wylotowych. Ostrożnie odłącz wężyk, aby zwolnić pompę.

Następnie spuść krew z pompy i pętli przepływu do pojemnika. Na koniec przeciśnij pipetą sól fizjologiczną przez wlot i wylot pompy, aby zmyć resztki krwi. Osadzanie się płytek krwi było konsekwentnie obserwowane wzdłuż korzeni łopatek w prototypach pomp.

Elektropolerowanie elementów tytanowych wyeliminowało tworzenie się skrzepliny w tych obszarach. Prototyp miał również niedoskonałą kooptację w połączeniu elementów obudowy dziobowej i rufowej, co powodowało szczelinę, w której krew przedostawała się i krzepła. Docieranie i polerowanie poprawiło dopasowanie komponentów i zmniejszyło tworzenie się skrzepliny.

Błędy proceduralne i niepełne usunięcie pętli mogą wprowadzić artefakty. W tym przypadku błąd eksperymentalny podczas wstrzykiwania chlorku wapnia wywołał miejscową koagulację, a powstała skrzeplina dostała się do odśrodkowej pompy Maglev, blokując ścieżkę przepływu. Kuliste, luźno przylegające skrzepy obserwowane na powierzchniach są często wynikiem pęcherzyków powietrza zamkniętych w skrzepach.

Ciała obce i zanieczyszczenia krążące w pętli zostały również zamknięte w skrzeplinach i przylgnięte do powierzchni pompy. Skrzepliny pierścieniowe na złączach złączy rurek wskazywały na optymalny zakres ACT podczas testu.