Name: Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj edycję genomu CRISPR-Cas9 u komara Aedes aegypti w celu kontroli wektorów chorobotwórczych. Metoda umożliwia tworzenie linii knockout i knockin z kontrolą ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Judy Ishikawie i Avie Stevenson za pomoc w hodowli komarów. Praca ta została wsparta dofinansowaniem z nagród NIH (R01AI151004, RO1AI148300, RO1AI175152) przyznanych O.S.A. i K22AI166268 N.H.R. Figurki zostały stworzone przy użyciu BioRender.

<ol><li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnzalone%2C+AV+%22Nat+Biotechnol%22">Nat Biotechnol</a>. 38 (7), 824-844 (2020).</li>
<li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Shen, H., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repairs+and+their+application+in+plant+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repairs and their application in plant DNA integration.</a> Genes (Basel). 13 (2), 322(2022).</li>
<li>Vinauger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+learning+in+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of host learning in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Curr Biol. 28 (3), 333-344.e8 (2018).</li>
<li>Li, M., Bui, M., Yang, T., Bowman, C. S., White, B. J., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+Cas9+expression+yields+highly+efficient+genome+engineering+in+a+major+worldwide+disease+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Germline Cas9 expression yields highly efficient genome engineering in a major worldwide disease vector.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (49), E10540-E10549 (2017).</li>
<li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nat Commun. 9 (1), 3008(2018).</li>
<li>Rouyar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+line+for+characterizing+GABA-receptor+expression+to+study+the+neural+basis+of+olfaction+in+the+yellow-fever+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic line for characterizing GABA-receptor expression to study the neural basis of olfaction in the yellow-fever mosquito.</a> Front Physiol. 15, 1381164(2024).</li>
<li>Ang, J. X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+homology-based+DNA+repair+in+mosquitoes%3A+Impact+of+sequence+heterology+and+donor+template+source%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Considerations for homology-based DNA repair in mosquitoes: Impact of sequence heterology and donor template source.</a> PLoS Genet. 18 (2), e1010060(2022).</li>
<li>Zhang, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+precise+knockin+with+a+double+cut+HDR+donor+after+CRISPR%2FCas9-mediated+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage.</a> Genome Biol. 18 (1), 35(2017).</li>
<li>Coutinho-Abreu, I. V., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+advances+in+mosquito+olfaction+neurogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Technological advances in mosquito olfaction neurogenetics.</a> Trends Genet. 39 (2), 154-166 (2023).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+sex+determination+to+suppress+mosquito+populations%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Targeting sex determination to suppress mosquito populations.</a> eLife. 12, RP90199(2024).</li>
<li>Zhan, Y., Alonso San Alberto, D., Rusch, C., Riffell, J. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+vision-guided+target+attraction+in+Aedes+aegypti+using+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biol%22%5BJournal%5D)">Elimination of vision-guided target attraction in Aedes aegypti using CRISPR.</a> Current Biol. 31 (18), 4180-4187.e6 (2021).</li>
<li>Greppi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+heat+seeking+is+driven+by+an+ancestral+cooling+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mosquito heat seeking is driven by an ancestral cooling receptor.</a> Science. 367 (6478), 681-684 (2020).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+system%3A+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression%2C+lineage+tracing%2C+and+mosaic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li>
<li>Riabinina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+and+expanded+Q-system+reagents+for+genetic+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations.</a> Nat Methods. 12 (3), 5 p following 222 219-222 (2015).</li>
<li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).</li>
<li>Concordet, J. -P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).</li>
<li>Williams, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+fitness+costs+in+transgenic+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying fitness costs in transgenic Aedes aegypti mosquitoes.</a> J Vis Exp. , e65136(2023).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li>
<li>Coutinho-Abreu, I. V., Zhu, K. Y., Ramalho-Ortigao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+and+paratransgenesis+to+control+insect-borne+diseases%3A+current+status+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Int%22%5BJournal%5D)">Transgenesis and paratransgenesis to control insect-borne diseases: current status and future challenges.</a> Parasitol Int. 59 (1), 1-8 (2010).</li>
<li>Christian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+double-strand+breaks+with+TAL+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).</li>
<li>Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+restriction+enzymes%3A+zinc+finger+fusions+to+Fok+I+cleavage+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).</li>
<li>DeGennaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((orco+mutant+mosquitoes+lose+strong+preference+for+humans+and+are+not+repelled+by+volatile+DEET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET.</a> Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).</li>
<li>McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+integration+of+carbon+dioxide+and+other+sensory+cues+drives+mosquito+attraction+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans.</a> Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).</li>
<li>Lobo, N. F., Clayton, J. R., Fraser, M. J., Kafatos, F. C., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+germ-line+transformation+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High efficiency germ-line transformation of mosquitoes.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1312-1317 (2006).</li>
<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+with+CRISPR-Cas9+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti.</a> Cell Rep. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
<li>Handler, A. M., Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2nd+Transformation+of+the+Caribbean+fruit+fly%2C+Anastrephasuspensa%2C+with+a+piggyBac+vector+marked+with+polyubiquitin-regulated+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrephasuspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP.</a> Insect Biochem Mol Biol. 31 (2), 199-205 (2001).</li>
<li>Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarrell%2C+RA+%222nd+Mosquito+embryo+microinjection+under+halocarbon+oil+or+in+aqueous+solution%22">2nd Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution</a>. 2024 (7), Cold Spring Harb Protoc. (2024).</li>
<li>Sun, R., Raban, R., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+mutant+strains+with+transgenic+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating mutant strains with transgenic Cas9.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 671-678 (2023).</li>
<li>Giraldo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+neurogenetic+toolkit+to+decode+olfaction+in+the+African+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">An expanded neurogenetic toolkit to decode olfaction in the African malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Cell Rep Methods. 4 (2), 100714(2024).</li>
<li>Liu, G., Lin, Q., Jin, S., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR-Cas+toolbox+and+gene+editing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The CRISPR-Cas toolbox and gene editing technologies.</a> Mol Cell. 82 (2), 333-347 (2022).</li>
<li>Chu, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+efficiency+of+homology-directed+repair+for+CRISPR-Cas9-induced+precise+gene+editing+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).</li>
<li>Laursen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+sensors+that+alert+mosquitoes+to+nearby+hosts+and+egg-laying+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Humidity sensors that alert mosquitoes to nearby hosts and egg-laying sites.</a> Neuron. 111 (6), 874-887.e8 (2023).</li>
<li>Weng, S. -C., Antoshechkin, I., Marois, E., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+sex+separation+by+exploiting+differential+alternative+splicing+of+a+dominant+marker+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Efficient sex separation by exploiting differential alternative splicing of a dominant marker in Aedes aegypti.</a> PLoS Genet. 19 (11), e1011065(2023).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+confinable+gene+drive+system+in+the+human+disease+vector%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Development of a confinable gene drive system in the human disease vector.</a> eLife. 9, e51701(2020).</li>
<li>Dalla Benetta, E., et al. Engineered Antiviral Sensor Targets Infected Mosquitoes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDalla+Benetta%2C+E+%22The+CRISPR+journal%22">The CRISPR journal</a>. 6 (6), 543-556 (2023).</li>
<li>Li, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Type+lectins+link+immunological+and+reproductive+processes+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">C-Type lectins link immunological and reproductive processes in Aedes aegypti.</a> iScience. 23 (9), 101486(2020).</li>
<li>van Oers, M. M., Vlak, J. M., Voorma, H. O., Thomas, A. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+3%27+untranslated+region+of+baculovirus+p10+mRNA+in+high-level+expression+of+foreign+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the 3' untranslated region of baculovirus p10 mRNA in high-level expression of foreign genes.</a> J Gen Virol. 80 (Pt 8), 2253-2262 (1999).</li>
<li>Salem, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+SV40+polyA+on+gene+expression+of+baculovirus+expression+vector+systems%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The influence of SV40 polyA on gene expression of baculovirus expression vector systems.</a> PloS One. 10 (12), e0145019(2015).</li>
</ol>

O.S.A. jest założycielem Agragene, Inc. i Synvect, Inc. z udziałem w kapitale własnym. Warunki tej umowy zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski w San Diego zgodnie z jego zasadami dotyczącymi konfliktu interesów. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Technologia CRISPR-Cas zmieniła krajobraz edycji genomu, promując specyficzne dla celu zmiany w chromosomie1. Mimo że elementy transpozycyjne były niezbędne do powstania pierwszych transgenicznych komarów, ich miejsca insercji są nieco losowe, a ekspresja konstruktu ładunku (promotor + gen) może nie odpowiadać profilowi ekspresji rzeczywistego genu ze względu na efekt położenia genomu (tj. miejsce insercji), który zwykle prowadzi do ekspresji ektopowej21. Przed pojawieniem ...

Precyzyjna edycja genomu stała się prawdopodobnie łatwiejsza, ale możliwa, dzięki wprowadzeniu technologii CRISPR-Cas molekularnych nożyczek1. Technologie te wykorzystują mechanizm, który prokariotyczny układ odpornościowy wykorzystuje do walki z infekcjami fagowymi2. Wśród tych systemów, zgrupowane, regularnie przeplatane, krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) wraz z nukleazą Cas9 zwykle opierają się na 20 parach zasad RNA, przewodnikowych RNA (gRNA), z sekwencjami homologicznymi do docelowego DNA, po których następuje sekwencja NGG protospacer sąsiedniego motywu (PAM)3. GRNA załadowane do Cas9 kierują te nukleazy precyzyjnie do określonych miejsc docelowych w genomie, wywołując pęknięcia dwuniciowego DNA3. 
Pęknięcia podwójnej nici DNA indukują mechanizmy naprawcze, które łatają podwójną helisę4. Podczas gdy oczekuje się, że każda naprawa DNA będzie precyzyjna, istnieją mniej dokładne mechanizmy naprawy DNA, które mogą pozostawić blizny po sekwencji, a co za tym idzie, mutacje powodujące utratę funkcji4. Wśród podatnych na błędy mechanizmów naprawy DNA, niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) może powodować mutacje przesunięcia ramki, w tym małe delecje, insercje i zmiany nukleotydowe (SNP), które mogą powodować mutację powodującą utratę funkcji. Z drugiej strony, mechanizm Homology Directed Repair (HDR) opiera się na chromosomie homologicznym jako matrycy do kopiowania dokładnej sekwencji nieuszkodzonego allelu i dokonywania doskonałej naprawy docelowej sekwencji DNA4.
Na podstawie tej wiedzy, technologia CRISPR-Cas9 została opracowana do precyzyjnej edycji genomów, prawdopodobnie w dowolnej sekwencji zawierającej miejsce PAM3. U komarów technologia CRISPR-Cas9 została wykorzystana do wyeliminowania różnych genów poprzez embrionalną mikroiniekcję mieszaniny Cas9 i gRNA, wykorzystując mechanizm naprawy NHEJ5,6. Podobną mutagenezę linii zarodkowej uzyskuje się przez wstrzyknięcie mieszaniny gRNA + Cas9 do hemolimfy dorosłych samic komarów7. Technologia ta została ukuta jako kontrola ReMOT i opiera się na zmodyfikowanej wersji Cas9 oznaczonej peptydem, który jest pobierany przez jajniki przez endocytozę podczas procesu rozwoju jaja (witellogeneza)<klasa sup='xref'>7. Wbicie określonych kaset genowych do genomu jest możliwe tylko poprzez embrionalną mikroiniekcję mieszaniny gRNA i Cas9 (lub plazmidu wyrażającego te cząsteczki) wraz z plazmidem kodującym pożądaną kasetę DNA8. Wykorzystując mechanizm HDR, plazmid zawierający interesującą nas kasetę DNA otoczoną sekwencjami homologicznymi (500-1,000bp)9,10 przed i za miejscem docelowym jest używany jako matryca do ponownego napisania pęknięcia dwuniciowego, kopiując również kasetę DNA do sekwencji docelowej9. 
Technologia CRISPR-Cas9 została użyta do wyeliminowania wielu genów związanych głównie z systemami sensorycznymi komara Aedes aegypti11, ale także genów związanych z płodnością samców i żywotnością samic (PgSIT) do kontroli populacji12. Wyeliminowanie docelowych genów zostało również osiągnięte poprzez wbicie genów kodujących markery fluorescencyjne do sekwencji kodujących określone geny13,14. Strategia ta ma tę zaletę, że nie tylko indukuje mutacje z przesunięciem ramki ramki, ale także pozwala na użycie światła fluorescencyjnego do sortowania osobników nowej linii nokautu13,14. Genom A. aegypti został również zmodyfikowany za pomocą sekwencji binarnych systemów ekspresji, takich jak Q-system (QF-QUAS)11. Wpukanie genu kodującego transaktywator QF do promotora określonego genu zapewnia zdefiniowaną czasoprzestrzenną ekspresję transaktywatora15,16. Gdy linia komara wykazująca ekspresję QF zostanie skrzyżowana z inną linią komara zawierającą miejsca wiązania (QUAS) dla QF, ta ostatnia wiąże się z nią i wyzwala ekspresję genów poniżej sekwencji QUAS15,16. Ogólnie rzecz biorąc, system ten umożliwia specyficzną dla tkanek i czasu ekspresję takich genów efektorowych, które mogą być markerami fluorescencyjnymi używanymi do lokalizacji komórek lub wykrywania aktywności neuronalnej, a nawet nukleazami Cas9 do zakłócania genów w określonych tkankach (tj. nokaut somatyczny)<klasa sup = 'xref'>11. 
Biorąc pod uwagę wszystkie dostępne informacje na temat transformacji genetycznej A. aegypti, przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół z instrukcjami krok po kroku do przeprowadzenia edycji genomu za pomocą systemu CRISPR-Cas9 poprzez mikroiniekcję embrionalną. Omówiono strategie generowania zarówno nokautu, poprzez mutacje i delecje z przesunięciem ramki, w których pośredniczy NHEJ, jak i linii knockin, przez insercje kaset genowych za pośrednictwem HDR.

<table><tbody><tr><td>10x Cas9 bufor reakcyjny</td><td>PNA Bio&nbsp;</td><td>CB01</td><td></td></tr><tr><td>Benchling Software Benchling</td><td></td><td>N/A</td><td>www.benchling.com</td></tr><tr><td>Cas9 bufor rozcieńczający</td><td>PNA Bio&nbsp;</td><td>CB03</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 białko</td><td>PNA Bio&nbsp;</td><td>CP01-50</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; E. coli Kompetentne komórki</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987</td><td></td></tr><tr><td>Dwustronna taśma klejąca</td><td>Scotch Permanent</td><td>3136</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki Drosophila</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>32-109</td><td></td></tr><tr><td>Bibuły filtracyjne&nbsp;</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze&nbsp;</td><td>1450-042</td><td></td></tr><tr><td>Pokarm dla ryb&nbsp;</td><td>Płatki</td><td></td><td>złotej rybki Tetra B00025Z6YI&nbsp;</td></tr><tr><td>Flugs</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td>Mikroskop fluorescencyjny <td>AS273</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>&nbsp; Fragment genu M165 FC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zintegrowane technologie DNA Nie</td><td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>gRNA</td><td>Synthego</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 700&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop iniekcyjny</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>DM2000</td><td></td></tr><tr><td>JM109 &nbsp;E. coli Kompetentne komórki&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>T3005</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FemtoJet 4x&nbsp;</td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek do napełniania femtotipów&nbsp;</td><td>Mikromanipulator Eppendorf</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>TransferMan 4r&nbsp;</td></tr><tr><td>Ściągacze do mikropipet&nbsp;</td><td>Instrument Suttera&nbsp;</td>Szkło osłonowe mikroskopu <td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Marka rybacka&nbsp;</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe&nbsp;</td><td>Eisco</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Krew myszy (żywe myszy używane do karmienia)</td><td>Uniwersytet Kalifornijski</td><td>IACUC, Protokół wykorzystania zwierząt #S17187</td><td>Używany do karmienia krwią komarów; Szczegóły są zgodne z protokołami etyki zwierząt</td></tr><tr><td>NEB Q5 Polimeraza DNA High-Fidelity&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania plazmidu&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>Filament kwarcowy&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF100-70-10</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia transkrypcji</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>10977-023</td><td></td></tr></tbody></table>

edycja genomu u komara aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu crispr-cas9

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

Pojawienie się technologii CRISPR-Cas9 (ang. clustered, regularly interpersed, short palindromic repeats)-Cas9 zrewolucjonizowało dziedzinę inżynierii genetycznej i otworzyło drzwi do precyzyjnej edycji genomu u wielu gatunków, w tym organizmów niemodelowych. U komara Aedes aegypti za pomocą tej technologii osiągnięto mutacje powodujące utratę funkcji i insercje DNA. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9, koncentrując się zarówno na generowaniu linii nokautu genu, jak i knockin. W tym protokole igły kwarcowe są wypełnione mieszaniną przewodnika RNA, rekombinowanego Cas9 i plazmidu zawierającego kasetę DNA kodującą gen dla markera fluorescencyjnego, jeśli pożądana jest pukanie genu. Zarodki w stadium preblastodermy są ustawiane w rzędzie na pasku dwustronnej taśmy klejącej umieszczonym na szkiełku nakrywkowym, które następnie jest mocowane na szkiełku podstawowym. Za pomocą mikrowstrzykiwacza igły są delikatnie wprowadzane do tylnego końca zarodków i dozowana jest niewielka objętość mieszaniny CRISPR. Po wykluciu się zarodków larwy są sprawdzane pod kątem fluorescencyjnym, a poczwarki są sortowane według płci i rozdzielane w różnych klatkach. Po pojawieniu się dorosłych osobników są one wzajemnie krzyżowane z osobnikami typu dzikiego, karmione krwią i umieszczane w celu złożenia jaj. Po wykluciu się tych jaj zebrane fluorescencyjne larwy reprezentują osoby ze stabilną insercją kasety DNA do ich genomu. Larwy te są następnie hodowane do stadium dorosłego, krzyżowane z osobnikami typu dzikiego, a następnie oceniane za pomocą technik molekularnych w celu potwierdzenia, że dokładna sekwencja kasety DNA jest obecna w pożądanym miejscu genomu komara. Linie homozygotyczne można również uzyskać, postępując zgodnie z dostarczonym procesem schematu krzyżowania i molekularnych badań przesiewowych mutacji.

Projektowanie i walidacja ukierunkowanego celowania genów za pomocą gRNA dla rekombinacji homologicznej HDR 
Aby zapewnić precyzyjne celowanie w pożądany gen, zalecamy wybór kilku gRNA oraz umieszczenie ramion homologii 5' i 3' blisko miejsca cięcia w celu przeprowadzenia rekombinacji homologicznej za pośrednictwem HDR (Rycina 1A). Na przykład zaprojektowaliśmy dwa gRNA celujące w obie strony kodonu startowego badanego genu i wykorzystaliś...

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9.

Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Zakres naszych badań obejmuje ustalenie genetycznie modyfikowanych linii komarów z wykorzystaniem technologii CRISPR-Cas9. Wykorzystanie technologii CRISPR-Cas9 do tłumienia populacji komarów, PgSIT, a także do ustanowienia binarnych systemów ekspresji do przestrzennej czasowej kontroli ekspresji genów.Uzyskaliśmy zarówno linie knockout, jak i knockin przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Nasze linie knockin obejmują wprowadzenie transaktywatora QF, który umożliwia przestrzenną kontrolę czasową genów znajdujących się dalej, takich jak markery fluorescencyjne, GFP, do znakowania specyficznego dla tkanki i reportery aktywności neuronalnej, G-CaMP6.Opracowanie nowych linii mutantów komarów pozwoli na głębsze zrozumienie funkcji genów i implikacji nerwowych, fizjologicznych i behawioralnych. Może to doprowadzić do opracowania nowych sposobów zapobiegania przenoszeniu chorób przenoszonych przez komary. Nasze laboratorium opracowało technologię tłumienia populacji komarów, która opiera się na technologii CRISPR-Cas9 w celu wyeliminowania genów związanych z męską płodnością i żywotnością samic. Ustaliliśmy również wiele linii komarów do badania odporności sensorycznej komarów, w szczególności węchu i wzroku.[Prowadzący wywiad] Aby przygotować konstrukt iniekcyjny dla mutantów nokautujących, rozcieńczyć białko Cas9 do pożądanego stężenia za pomocą buforu rozcieńczającego Cas9. Następnie rozcieńczyć podwielokrotność zsyntetyzowanego in vitro przewodnikowego RNA lub gRNA ultraczystą wodą. Wstępnie wymieszaj rozcieńczone białko Cas9 z każdym gRNA, aby utworzyć kompleks rybonukleoproteinowy. Następnie połącz wiele wstępnie zmieszanych roztworów kompleksów rybonukleoproteinowych. W przypadku insercji kaset genowych za pośrednictwem naprawy ukierunkowanej na homologię, rozcieńczyć i wymieszać białko Cas9 i gRNA. Rozcieńczyć plazmid dawcy ultraczystą wodą i połączyć wszystkie konstrukty. Następnie użyj filamentu kwarcowego, aby przygotować igły do mikroiniekcji. Za pomocą następującego programu. Pociągnij igły za pomocą laserowego ściągacza do mikropipet. Po ustawieniu aspiratora ręcznego zwilż bibuły filtracyjne z białym kółkiem i umieść je na wewnętrznej ścianie lub na wilgotnej bawełnie wewnątrz kolektora. Umieść w kolektorze od pięciu do 10 samic komarów, które były karmione krwią od pięciu do 10 dni temu. Następnie umieść kolektor w ciemności na 45 minut. Następnie usuń komary z kolektora. Po inkubacji usuń bibuły filtracyjne, aby zebrać zarodki. Wybierz zarodki w stadium preblastodermicznym, które są jasnoszare z papieru do pobrania. Przenieś wybrane zarodki za pomocą mokrej szczoteczki na dwustronną taśmę klejącą umieszczoną na wierzchu szkiełka nakrywkowego. Ustaw zarodki równolegle, upewniając się, że są obok siebie, a wszystkie tylne końce są skierowane do przodu, podczas gdy ich otoczenie pozostaje mokre. Podczas wyrównywania dodaj olej Halocarbon Oil 700 na zarodki, aby zapobiec wysuszeniu. Na mikrowtryskiwaczu ustaw ciśnienie kompensacyjne 300 hektopaskalów i ciśnienie wtrysku 500 hektopaskalów. Za pomocą mikroładowarki załaduj trzy mikrolitry konstruktu iniekcyjnego do igły. Umieścić szkiełko nakrywkowe z wyrównanymi zarodkami na szkiełku mikroskopowym i umieścić je pod mikroskopem do wstrzyknięcia. Następnie zamocuj igłę w uchwycie igły za pomocą mikromanipulatora pod kątem 10 stopni w kierunku tylnego końca zarodków. Delikatnie otworzyć igłę, lekko dotykając jej końcówki krawędzi szkiełka nakrywkowego. Następnie wstrzyknij zarodek za pomocą konstruktu plazmidu. Po wstrzyknięciu komarom Aedes agyptie za pomocą konstruktu iniekcyjnego należy użyć niestrzępiących się jednorazowych chusteczek, aby usunąć olej otaczający zarodki. Dodaj wodę dejonizowaną, aby spłukać zarodki. Przenieś wypłukane zarodki na mokrą bibułę filtracyjną i umieść bibułę filtracyjną na mokrej chusteczce w karatowym kubku o pojemności dziewięciu uncji. Następnie umieść mokrą bawełnę na dnie kubka, aby utrzymać wilgoć. Po utrzymywaniu zarodków w wilgoci przez trzy do czterech dni, przenieś bibułę filtracyjną z zarodkami do około trzech litrów dejonizowanej wody w sześciolitrowej patelni Sterilite do wylęgu. Po wykluciu się larw G zero dodaj na patelnię pokarm dla ryb zmieszany z wodą. Przebadać larwy G zero pod kątem markera fluorescencyjnego w stadium larwalnym od trzeciego do czwartego stadium rozwojowego. Oddziel larwy na podstawie ich stanu fluorescencyjnego. Larwy fluorescencyjne dodatnie i fluorescencyjne należy przechowywać w oddzielnych naczyniach. Oddziel komary, którym wstrzyknięto się według płci, gdy się przepoczwarzają i identyfikuj samce po ich mniejszym rozmiarze, bardziej wydatnym i spiczastym płatku narządów płciowych oraz szerszych łopatkach. Zidentyfikuj samice po ich większych rozmiarach, mniej wyraźnym płatku narządów płciowych i węższych wiosłach. Po zebraniu komarów fluorescencyjnie dodatnich lub fluorescencyjnie ujemnych każdej płci, należy skrzyżować każdą pulę z komarami płci przeciwnej z dzikiego szczepu Liverpool A. agyptie w proporcji od trzech do pięciu dzikich osobników na każdego fluorescencyjnego osobnika poddanego badaniu przesiewowemu, co pozwala im na kojarzenie się przez cztery dni. Po trzech do czterech dniach należy przebadać larwy G1 pod kątem markera fluorescencyjnego w stadium larwalnym od trzeciego do czwartego stadium rozwojowego.

genome-editing-yellow-fever-mosquito-aedes-aegypti-using-crispr

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W tym filmie pokazujemy dostarczanie konstruktu napędu genowego do zarodka komara Anopheles gambiae za pomocą techniki mikroiniekcji zarodka. Procedura ta pozwala na integrację dostarczonego konstruktu DNA, poprzez rekombinację homologiczną, z komórkami linii rozrodczej w celu wytworzenia przekształconej populacji komarów.

Mikroiniekcja zarodka komara: technika dostarczania egzogennego DNA do żółtka zarodka Anopheles Gambiae w celu wytworzenia mutacji linii zarodkowej

Opisujemy metodę generowania mutantów warunkowego knockdown opartych na glmS w Plasmodium falciparum przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9.

Edycja genu CRISPR/Cas9 w celu stworzenia warunkowych mutantów ludzkiego pasożyta malarii P. falciparum

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.

Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Ten artykuł przedstawia krok po kroku protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 orientalnej muszki owocowej Bactrocera dorsalis. Szczegółowe kroki przewidziane w tym ustandaryzowanym protokole posłużą jako przydatny przewodnik do generowania zmutowanych much do funkcjonalnych badań genów u B. dorsalis.

Protokoły mutagenezy CRISPR/Cas9 muszki owocowej Bactrocera dorsalis

Obecny protokół opisuje, jak mierzyć dane dotyczące typowych parametrów życia komarów Aedes aegypti, w tym płodności, rozmiaru skrzydeł, płodności, stosunku płci, żywotności, czasu rozwoju, wkładu samców i długowieczności dorosłych. Pomiary te można wykorzystać do oceny przydatności komarów transgenicznych.

Ilościowe określanie kosztów przystosowania u transgenicznych komarów Aedes aegypti

Poznaj edycję genomu CRISPR-Cas9 u komara Aedes aegypti w celu kontroli wektorów chorobotwórczych. Metoda umożliwia tworzenie linii knockout i knockin z kontrolą ekspresji genów.

Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9

Przeglądaj więcej filmów