Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9.

Zakres naszych badań obejmuje ustalenie genetycznie modyfikowanych linii komarów z wykorzystaniem technologii CRISPR-Cas9. Wykorzystanie technologii CRISPR-Cas9 do tłumienia populacji komarów, PgSIT, a także do ustanowienia binarnych systemów ekspresji do przestrzennej czasowej kontroli ekspresji genów.

Uzyskaliśmy zarówno linie knockout, jak i knockin przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Nasze linie knockin obejmują wprowadzenie transaktywatora QF, który umożliwia przestrzenną kontrolę czasową genów znajdujących się dalej, takich jak markery fluorescencyjne, GFP, do znakowania specyficznego dla tkanki i reportery aktywności neuronalnej, G-CaMP6.

Opracowanie nowych linii mutantów komarów pozwoli na głębsze zrozumienie funkcji genów i implikacji nerwowych, fizjologicznych i behawioralnych. Może to doprowadzić do opracowania nowych sposobów zapobiegania przenoszeniu chorób przenoszonych przez komary. Nasze laboratorium opracowało technologię tłumienia populacji komarów, która opiera się na technologii CRISPR-Cas9 w celu wyeliminowania genów związanych z męską płodnością i żywotnością samic. Ustaliliśmy również wiele linii komarów do badania odporności sensorycznej komarów, w szczególności węchu i wzroku.

[Prowadzący wywiad] Aby przygotować konstrukt iniekcyjny dla mutantów nokautujących, rozcieńczyć białko Cas9 do pożądanego stężenia za pomocą buforu rozcieńczającego Cas9. Następnie rozcieńczyć podwielokrotność zsyntetyzowanego in vitro przewodnikowego RNA lub gRNA ultraczystą wodą. Wstępnie wymieszaj rozcieńczone białko Cas9 z każdym gRNA, aby utworzyć kompleks rybonukleoproteinowy. Następnie połącz wiele wstępnie zmieszanych roztworów kompleksów rybonukleoproteinowych. W przypadku insercji kaset genowych za pośrednictwem naprawy ukierunkowanej na homologię, rozcieńczyć i wymieszać białko Cas9 i gRNA. Rozcieńczyć plazmid dawcy ultraczystą wodą i połączyć wszystkie konstrukty. Następnie użyj filamentu kwarcowego, aby przygotować igły do mikroiniekcji. Za pomocą następującego programu. Pociągnij igły za pomocą laserowego ściągacza do mikropipet. Po ustawieniu aspiratora ręcznego zwilż bibuły filtracyjne z białym kółkiem i umieść je na wewnętrznej ścianie lub na wilgotnej bawełnie wewnątrz kolektora. Umieść w kolektorze od pięciu do 10 samic komarów, które były karmione krwią od pięciu do 10 dni temu. Następnie umieść kolektor w ciemności na 45 minut. Następnie usuń komary z kolektora. Po inkubacji usuń bibuły filtracyjne, aby zebrać zarodki. Wybierz zarodki w stadium preblastodermicznym, które są jasnoszare z papieru do pobrania. Przenieś wybrane zarodki za pomocą mokrej szczoteczki na dwustronną taśmę klejącą umieszczoną na wierzchu szkiełka nakrywkowego. Ustaw zarodki równolegle, upewniając się, że są obok siebie, a wszystkie tylne końce są skierowane do przodu, podczas gdy ich otoczenie pozostaje mokre. Podczas wyrównywania dodaj olej Halocarbon Oil 700 na zarodki, aby zapobiec wysuszeniu. Na mikrowtryskiwaczu ustaw ciśnienie kompensacyjne 300 hektopaskalów i ciśnienie wtrysku 500 hektopaskalów. Za pomocą mikroładowarki załaduj trzy mikrolitry konstruktu iniekcyjnego do igły. Umieścić szkiełko nakrywkowe z wyrównanymi zarodkami na szkiełku mikroskopowym i umieścić je pod mikroskopem do wstrzyknięcia. Następnie zamocuj igłę w uchwycie igły za pomocą mikromanipulatora pod kątem 10 stopni w kierunku tylnego końca zarodków. Delikatnie otworzyć igłę, lekko dotykając jej końcówki krawędzi szkiełka nakrywkowego. Następnie wstrzyknij zarodek za pomocą konstruktu plazmidu. Po wstrzyknięciu komarom Aedes agyptie za pomocą konstruktu iniekcyjnego należy użyć niestrzępiących się jednorazowych chusteczek, aby usunąć olej otaczający zarodki. Dodaj wodę dejonizowaną, aby spłukać zarodki. Przenieś wypłukane zarodki na mokrą bibułę filtracyjną i umieść bibułę filtracyjną na mokrej chusteczce w karatowym kubku o pojemności dziewięciu uncji. Następnie umieść mokrą bawełnę na dnie kubka, aby utrzymać wilgoć. Po utrzymywaniu zarodków w wilgoci przez trzy do czterech dni, przenieś bibułę filtracyjną z zarodkami do około trzech litrów dejonizowanej wody w sześciolitrowej patelni Sterilite do wylęgu. Po wykluciu się larw G zero dodaj na patelnię pokarm dla ryb zmieszany z wodą. Przebadać larwy G zero pod kątem markera fluorescencyjnego w stadium larwalnym od trzeciego do czwartego stadium rozwojowego. Oddziel larwy na podstawie ich stanu fluorescencyjnego. Larwy fluorescencyjne dodatnie i fluorescencyjne należy przechowywać w oddzielnych naczyniach. Oddziel komary, którym wstrzyknięto się według płci, gdy się przepoczwarzają i identyfikuj samce po ich mniejszym rozmiarze, bardziej wydatnym i spiczastym płatku narządów płciowych oraz szerszych łopatkach. Zidentyfikuj samice po ich większych rozmiarach, mniej wyraźnym płatku narządów płciowych i węższych wiosłach. Po zebraniu komarów fluorescencyjnie dodatnich lub fluorescencyjnie ujemnych każdej płci, należy skrzyżować każdą pulę z komarami płci przeciwnej z dzikiego szczepu Liverpool A. agyptie w proporcji od trzech do pięciu dzikich osobników na każdego fluorescencyjnego osobnika poddanego badaniu przesiewowemu, co pozwala im na kojarzenie się przez cztery dni. Po trzech do czterech dniach należy przebadać larwy G1 pod kątem markera fluorescencyjnego w stadium larwalnym od trzeciego do czwartego stadium rozwojowego.