Name: Testy fluorescencyjne do badania interakcji Mycobacterium tuberculosis z receptorem immunologicznym SLAMF1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj testy fluorescencyjne do badania interakcji Mycobacterium tuberculosis z receptorem SLAMF1 w ludzkich makrofagach. Ta metoda cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej pozwala zrozumieć mechanizmy rozpoznawania patogenów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (granty o numerach SIB 0618/2019, SIB 2582/2012 dla V.P.), Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, granty o numerach PICT-2012-2459 i PICT A 2017-1896 dla V.P. i PICT-2021-I-INVI-00584 dla A.B.); Fundacja Florencio Fiorini; oraz Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET, grant nr PIO 15720150100010CO do V.P.). Dziękujemy Natalii Menite i Gastónowi Villafañe za wsparcie techniczne. Dziękujemy dr Pauli Barrionuevo i dr Lucianie Balboa za dyskusję naukową podczas publikacji, która dała początek rozwojowi testów przedstawionych w tej pracy. Na koniec dziękujemy dr Estermannowi za jego porady dotyczące protokołów sieciowania, Lic. Moroni za jego rady dotyczące pracy z polilizyną i licem. Moriconi za pomoc przy schematycznych figurach.

Wszystkie zabiegi z udziałem makrofagów pochodzących od ludzkich monocytów zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską (2013) oraz w porozumieniu z Komitetem Etyki UNNOBA (COENOBA). Pisemną świadomą zgodę uzyskano przed pobraniem próbki. Rozkład w grupie mężczyzn/kobiet wynosił 13/6, a mediana wieku wynosiła 32 lata, z rozstępem międzykwartylowym (IQR) 18-75 lat. Obecność wcześniejszych patologii, chorób współistniejących lub pozytywna diagnoza gruźlicy zostały określone jako kryteria wykluczenia. Szczegółowe informacje na temat odczynników i wyposażenia są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Hodowla i stymulacja makrofagów pochodzących z monocytów
<ol>
	<li>Pobieranie krwi<ol>
		<li>Pobrać 60 ml krwi od zdrowych dawców przez nakłucie żyły w strzykawce z heparyną. UWAGA: Ekstrakcja krwi musi być wykonana przez biochemika lub technika flebotomii.</li>
		<li>Wyrzuć igłę do pojemnika na ostre odpady i wszelki materiał, który miał kontakt z krwią dawcy, do pojemnika na odpady patologiczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja monocytów i generacja makrofagów<ol>
		<li>Ostrożnie przenieś krew do probówek o pojemności 50 ml i rozcieńcz ją do połowy roztworem soli fizjologicznej.</li>
		<li>Przeprowadzić wirowanie na pożywce o gradiencie gęstości, aby uzyskać jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC).</li>
		<li>Zbierz PBMC z białawej aureoli.</li>
		<li>Wykonać dwa płukania roztworem soli fizjologicznej o stężeniu 400 x g przez 10 minut i końcowe płukanie roztworem soli fizjologicznej o sile 200 x g przez 15 minut w temperaturze 20 °C w celu usunięcia płytek krwi.</li>
		<li>Określ liczbę PBMC w komorze zliczania komórek i przeprowadź dodatnią selekcję magnetyczną CD14 za pomocą kulek CD14. UWAGA: Podczas wyboru magnetycznego należy dokładnie postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Dodatkowo można sprawdzić czystość wyizolowanych monocytów za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Ponownie zawiesić izolowane komórki w RPMI 1640 i określić liczbę monocytów w komorze zliczania komórek.</li>
		<li>Wysiewaj 500 μl 1 × 106 / ml CD14 dodatnich wybranych monocytów na dołek na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej przy braku surowicy, aby promować przyleganie.</li>
		<li>Po 2 godzinach usuń nieprzylegające komórki, myjąc je wstępnie podgrzanym RPMI 1640.</li>
		<li>Aby rozróżnić makrofagi, należy hodować przylegające monocyty przez dodatkowe 16-18 godzin (przez noc) w 1 ml kompletnej pożywki (pożywka RPMI 1640 uzupełniona L-glutaminą, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny).</li>
		<li>Następnego dnia zmień pożywkę hodowlaną. Usuń pożywkę, przemyj 1 ml 1x PBS i dodaj 1 ml kompletnej pożywki.</li>
		<li>Stymulować makrofagi sonikacją M. tuberculosis (M. tuberculosis antigens (Ags)) przez 24 godziny. Stosować 10 μl M. tuberculosis Ags (10 μl = 1 × 106 bakterii) na 1 × 106 makrofagów pochodzących z monocytów. UWAGA: 10 μL M. tuberculosis Ags (Mtb Ags) = 1 × 106 bakterii, oznaczone ilościowo za pomocą średnicy zewnętrznej 600nm w spektrofotometrze, biorąc pod uwagę średnicę zewnętrzną 1 jako 1 x 108 bakterii/ml. Stosować komory bezpieczeństwa biologicznego BSL2 i inkubator w temperaturze 37 °C w atmosferze o stężeniu 5% CO2 na wszystkich etapach hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdzenie wyrażenia SLAMF1<ol>
		<li>Zbierz makrofagi z jednej studzienki. Umieść płytkę hodowlaną na zimnej powierzchni. Odłącz ogniwa, wykonując ruchy w górę iw dół, dodając 1 ml zimnego FACS (1x PBS + 2% FBS) dwa razy z rzędu. Do pobrania użyj probówki z okrągłym dnem do cytometrii.</li>
		<li>Odwirować komórki o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez jego wysypanie.</li>
		<li>Barwić komórki sprzężonym z fluoroforem przeciwciałem anty-ludzkim SLAMF1 przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Wirować po dodaniu 1,25 μL przeciwciała.</li>
		<li>Umyj komórki, aby wyeliminować nadmiar przeciwciał za pomocą FACS, ponownie zawieś osad w FACS i pobierz próbkę za pomocą cytometru przepływowego. UWAGA: 1,25 μl przeciwciała anty-SLAMF1 odpowiada 0,0625 μg, które służy do znakowania makrofagów 0,5 x 106 . Jednak zdecydowanie zaleca się miareczkowanie przeciwciała, a także wykonanie odpowiedniej kontroli izotypu lub fluorescencji minus jeden (FMO).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie ekstraktu z białka komórkowego
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu do lizy<ol>
		<li>Przygotować bufor do testu immunoprecypitacji radiowej (RIPA) z NaCl 150 mM, Tris 10 mM, EDTA 5 mM, SDS 1%, Triton X-100 1% i deoksycholanem sodu 1%.</li>
		<li>Uzupełnij bufor RIPA o 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) i inhibitory proteazy, takie jak pepstatyna A i leupeptyna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie komórek i izolacja białek<ol>
		<li>Wyrzuć cały RPMI z dołków płytkowych za pomocą pipety P1000 i zbierz makrofagi przez pipetowanie w górę iw dół za pomocą zimnego 1x PBS.</li>
		<li>Przenieś komórki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Zebrać jedną studzienkę na mikroprobówkę.</li>
		<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać 1 ml zimnego PBS i powtórzyć kroki 2.2.2 i 2.2.3, zbierając komórki do tej samej probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 100 μl 1x PBS i połączyć cztery probówki. Powtórz krok 2.2.3. Każda probówka będzie zawierała 2 x 106 makrofagów.</li>
		<li>Dodać 100 μl uzupełnionego buforu RIPA i inkubować zawiesinę na lodzie przez 1 godzinę, wirując co 10 minut.</li>
		<li>Wirować przy 14 000 x g przez 15 min. Zebrać supernatant i przechowywać go do czasu użycia w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Interakcja M. tuberculosis -SLAMF1 za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Sieciowanie białek i bakterii<ol>
		<li>Inkubować 1 × 106 całych inaktywowanych komórek M. tuberculosis (WCMtb, M. tuberculosis inaktywowanych przez promieniowanie gamma) z ekstraktem białkowym z 1 x 106 makrofagów (50 μl) przez noc w temperaturze 4 °C w obracającym się uchwycie na mikroprobówki. UWAGA: 10 μL WCMtb = 1 × 106 bakterii, oznaczone ilościowo za pomocą średnicy zewnętrznej 600nm w spektrofotometrze, biorąc pod uwagę średnicę zewnętrzną 1 jako 1 x 108 bakterii/ml.</li>
		<li>Następnego dnia dodać 500 μl 1% formaldehydu rozcieńczonego w 1x PBS. Inkubować przez 15 minut pod mieszaniem (wytrząsarką) w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Dodać 25 μl 0,125 M glicyny rozcieńczonej w wodzie. Inkubować przez 5 minut pod mieszaniem (wytrząsaczem) w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyć dwukrotnie 1 ml 1x PBS w 14 000 x g przez 5 min. Wyrzucić supernatant między etapami mycia.</li>
		<li>Zawiesić osad i inkubować zawiesinę w 500 μl 2 mM środka sieciującego z glikolu etylenowego bis (bursztynian sukcynimidylu) (EGS) rozcieńczonego w mieszaninie 1:1 lodowatego kwasu octowego:woda przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. UWAGA: Zdecydowanie zaleca się przygotowanie odczynników w momencie użycia. Aby przygotować EGS, lodowaty kwas octowy i wodę należy zmieszać w równych proporcjach i podgrzać do temperatury 70 °C. Jeśli roztwór nie jest gorący, EGS nie jest całkowicie zawieszony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie SLAMF1<ol>
		<li>Powtórzyć krok 3.1.4, używając 500 μl 1x PBS w pierwszym praniu i 1 ml w drugim.</li>
		<li>Kompleks białkowo-bakteryjny barwić przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności przeciwciałem anty-ludzkim SLAMF1 (jak w kroku 1.3.3), dodając przeciwciało do mikroprobówki i wirując. Użyj ilości przeciwciała odpowiedniej dla 1 x 106 komórek (2,5 μl lub 0,125 μg).</li>
		<li>Umyj komórki, aby wyeliminować nadmiar przeciwciał za pomocą FACS, ponownie zawieś osad w FACS i pobierz próbkę do cytometru przepływowego (jak w kroku 1.3.4). UWAGA: Wykonaj odpowiednią kontrolę izotypu lub FMO.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Znakowanie antygenów M. tuberculosis 
<ol>
	<li>Zawiesić rodaminę B w etanolu w stężeniu podstawowym 5 mg/ml (1000x). Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Dodać 1 μl rodaminy B na 100 μl M. tuberculosis Ags w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciągłym mieszaniu (wir).</li>
	<li>Przemyć co najmniej 3 razy w temperaturze 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze 24 °C, używając 1 ml 1x PBS, aż supernatant stanie się przezroczysty. Granulka (Mtb-R Ags) będzie wyglądać na jasnoróżową.</li>
	<li>Ponownie zawiesić Mtb-R Ags w 100 μl 1x PBS, aby przywrócić początkową objętość. UWAGA: Zalecana jest praca w sterylnych warunkach. Upewnij się, że barwienie zostało wykonane bezpośrednio przed wykonaniem eksperymentów.</li>
</ol>
5. Interakcja M. tuberculosis -SLAMF1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Sieciowanie bakteryjno-białkowe<ol>
		<li>Wprowadzić okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm do 24-dołkowych płytek hodowlanych (1 szkiełko nakrywkowe na dołek) za pomocą pęsety chirurgicznej z okrągłym noskiem. UWAGA: Dokładnie wyczyść szkiełka nakrywkowe 70% etanolem. W razie potrzeby można je sterylizować w autoklawie lub sterylizować w świetle UV przez 30 minut.</li>
		<li>Inkubować szkiełko nakrywkowe z 400 μl 10 μg/ml poli-D-lizyny przez noc w temperaturze 4 °C. Przykryć płytkę folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.</li>
		<li>Następnego dnia wyjmij płytkę z lodówki i umyj szkiełko nakrywkowe dwukrotnie 1 ml wody.</li>
		<li>Pozostaw szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia.</li>
		<li>Rozcieńczyć 20 μL (2 x 106) Mtb-R Ags w 180 μL 1x PBS. Ostatnie 200 μl wystarcza do całkowitego pokrycia szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Inkubować szkiełko nakrywkowe z Mtb-R Ags przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym.</li>
		<li>Wylej pozostały płyn i przemyj dwukrotnie 1 ml 1x PBS. UWAGA: Na tym etapie prawidłowe przyleganie Mtb-R do szkiełka nakrywkowego można sprawdzić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu filtrów odpowiadających kanałowi czerwonemu.</li>
		<li>Dodać 400 μl buforu blokującego (10% FBS w 1x PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w mieszaniu (wytrząsaczu).</li>
		<li>Przemyć dwukrotnie 400 μl buforu blokującego.</li>
		<li>Inkubować ze 100 μl ekstraktu białkowego rozcieńczonego w 300 μl 1x PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w mieszaniu (wytrząsaniu).</li>
		<li>Dodać 400 μl 1% formaldehydu rozcieńczonego w 1x PBS. Inkubować przez 15 minut pod mieszaniem (wytrząsaczem) w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 500 μl glicyny 0,125 M rozcieńczonej w wodzie. Inkubować przez 5 minut pod mieszaniem (wytrząsaczem) w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyć dwukrotnie 1 ml 1x PBS.</li>
		<li>Dodać 400 μl 2 mM EGS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w mieszaniu (wytrząsaczu).</li>
		<li>Powtórz krok 5.1.13 UWAGA: Zdecydowanie zaleca się przygotowanie odczynników w momencie użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie SLAMF1<ol>
		<li>Owiń pokrywkę płytki hodowlanej folią parafinową.</li>
		<li>Dodać kroplę 60 μl uprzednio miareczkowanego przeciwciała pierwszorzędowego anty-SLAMF1 (rozcieńczenie 1:75) na pokrywkę pokrytą folią parafinową.</li>
		<li>Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe z płytki za pomocą zakrzywionej pęsety chirurgicznej i igieł z cienką końcówką. UWAGA: Aby ułatwić usuwanie szkiełek nakrywkowych, igłę można wygiąć pod kątem około 45°.</li>
		<li>Odwrócić szkiełko nakrywkowe na kropli zawierającej przeciwciało. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Podnieś szkiełko nakrywkowe i umyj je dwukrotnie buforem blokującym.</li>
		<li>Odwrócić szkiełko nakrywkowe na nową kroplę zawierającą przeciwciało drugorzędowe (rozcieńczenie 1:200). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Powtórz krok 5.2.5.</li>
		<li>Usuń nadmiar płynu i zamontuj szkiełko nakrywkowe na kropli płynu montażowego umieszczonej na szkiełku podstawowym.</li>
		<li>Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu odpowiednich filtrów. UWAGA: Zalecana jest praca w sterylnych warunkach. Rozcieńczyć przeciwciała w buforze blokującym. Z szkiełkiem nakrywkowym należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć zadrapań, które mogą utrudniać obserwację pod mikroskopem. Zdecydowanie zaleca się stosowanie płynu montażowego odpowiedniego do fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Global Tuberculosis Report 2023. , World Health Organization. Available at: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/tb/publications/global_report/en/">https://www.who.int/tb/publications/global_report/en/</a> (2023).</li>
<li>Ahmad, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage%3A+A+cell+with+many+faces+and+functions+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage: A cell with many faces and functions in tuberculosis.</a> Front Immunol. 13, 882130(2022).</li>
<li>Bo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis-macrophage+interaction%3A+Molecular+updates%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis-macrophage interaction: Molecular updates.</a> Front Cell Infect Microbiol. 13, 1187205(2023).</li>
<li>Papp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AmpliSeq+transcriptome+analysis+of+human+alveolar+and+monocyte-derived+macrophages+over+time+in+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">AmpliSeq transcriptome analysis of human alveolar and monocyte-derived macrophages over time in response to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PLoS One. 13 (5), e0198069(2018).</li>
<li>Zhai, W., Wu, F., Zhang, Y., Fu, Y., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+escape+mechanisms+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The immune escape mechanisms of Mycobacterium tuberculosis.</a> Int J Mol Sci. 20 (2), 340(2019).</li>
<li>Van Crevel, R., Ottenhoff, T. H. M., Van der Meer, J. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+to+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis.</a> Clin Microbiol Rev. 15 (2), 294-309 (2002).</li>
<li>Mortaz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+pattern+recognition+receptors+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interaction of pattern recognition receptors with Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Immunol. 35 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Stamm, C. E., Collins, A. C., Shiloh, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+consequences+to+both+host+and+bacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sensing of Mycobacterium tuberculosis and consequences to both host and bacillus.</a> Immunol Rev. 264 (1), 204-219 (2015).</li>
<li>Zihad, S. M. N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pattern+recognition+receptors+in+sensing+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Role of pattern recognition receptors in sensing Mycobacterium tuberculosis.</a> Heliyon. 9 (10), e20636(2023).</li>
<li>Barbero, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAMF1+signaling+induces+Mycobacterium+tuberculosis+uptake+leading+to+endolysosomal+maturation+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">SLAMF1 signaling induces Mycobacterium tuberculosis uptake leading to endolysosomal maturation in human macrophages.</a> J Leukoc Biol. 109 (8), 257-273 (2021).</li>
<li>Pasquinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+signaling+lymphocytic+activation+molecule-associated+protein+interrupts+IFN-%CE%B3+production+in+human+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of signaling lymphocytic activation molecule-associated protein interrupts IFN-γ production in human tuberculosis.</a> J Immunol. 172 (2), 1177-1185 (2004).</li>
<li>Pasquinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+mitogen-activated+protein+kinases+contributes+to+interferon-%CE%B3+production+in+response+to+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of mitogen-activated protein kinases contributes to interferon-γ production in response to Mycobacterium tuberculosis.</a> J Infect Dis. 207 (2), 340-350 (2012).</li>
<li>Pasquinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-%CE%B3+production+during+active+tuberculosis+is+regulated+by+mechanisms+that+involve+IL-17%2C+SLAM%2C+and+CREB%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">IFN-γ production during active tuberculosis is regulated by mechanisms that involve IL-17, SLAM, and CREB.</a> J Infect Dis. 199 (5), 661-665 (2009).</li>
<li>Pellegrini, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+autophagy+during+human+active+tuberculosis+is+modulated+by+SLAMF1%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Neutrophil autophagy during human active tuberculosis is modulated by SLAMF1.</a> Autophagy. 17 (2), 423-426 (2021).</li>
<li>Song, T., Dong, C., Xiong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+lymphocyte-activation+molecule+SLAMF1+augments+mycobacteria+BCG-induced+inflammatory+response+and+facilitates+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Signaling lymphocyte-activation molecule SLAMF1 augments mycobacteria BCG-induced inflammatory response and facilitates bacterial clearance.</a> Int J Med Microbiol. 305 (6), 572-580 (2015).</li>
<li>Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+ELISA+as+a+method+to+determine+the+dissociation+constant+of+receptor-ligand+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor-ligand interaction.</a> J Vis Exp. (132), e57032(2018).</li>
<li>Patching, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+spectroscopy+for+characterization+of+membrane+protein-ligand+interactions+and+its+potential+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance spectroscopy for characterization of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1), 43-55 (2014).</li>
<li>Draczkowski, P., Matosiuk, D., Jozwiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+in+membrane+protein+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry in membrane protein research.</a> J Pharm Biomed Anal. 87, 296-304 (2014).</li>
<li>Smith, D. S., Eremin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+polarization+immunoassays+and+related+methods+for+simple%2C+high-throughput+screening+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules.</a> Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).</li>
<li>García-Nafría, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy%3A+Moving+beyond+X-ray+crystal+structures+for+drug+receptors+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy: Moving beyond X-ray crystal structures for drug receptors and drug development.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 60, 51-71 (2020).</li>
<li>Asami, J., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+understanding+of+the+toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural and functional understanding of the toll-like receptors.</a> Protein Sci. 30 (4), 761-772 (2021).</li>
<li>Phạm, T. T. T., Rainey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-cell+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+to+probe+cell+surface+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">On-cell nuclear magnetic resonance spectroscopy to probe cell surface interactions.</a> Biochem Cell Biol. 99 (6), 683-692 (2021).</li>
<li>El Deeb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+as+a+powerful+growing+analytical+technique+for+the+investigation+of+biomolecular+interaction+and+the+determination+of+binding+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis as a powerful growing analytical technique for the investigation of biomolecular interaction and the determination of binding parameters.</a> Methods Appl Fluoresc. 10 (4), 045001(2022).</li>
<li>El Khamlichi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+resonance+energy+transfer+as+a+method+to+study+protein-protein+interactions%3A+Application+to+G+protein-coupled+receptor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence resonance energy transfer as a method to study protein-protein interactions: Application to G protein-coupled receptor biology.</a> Molecules. 24 (3), 505(2019).</li>
<li>Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+techniques+to+study+ligand-receptor+interactions+and+receptor+activation+by+TNF+superfamily+members%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members.</a> Methods Enzymol. 545, 103-125 (2014).</li>
<li>Park, A. M. W., Schirmer, P. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy%3A+A+multifaceted+tool+to+study+membrane+proteins+and+their+interactions+with+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy: A multifaceted tool to study membrane proteins and their interactions with ligands.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1), 74-89 (2014).</li>
<li>Zalejski, J., Sun, J., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+mystery+inside+cells+by+using+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Imaging%22%5BJournal%5D)">Unravelling the mystery inside cells by using single-molecule fluorescence imaging.</a> J Imaging. 9 (9), 183(2023).</li>
<li>Zheng, S., Zou, M., Shao, Y., Wu, H., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+measurements+of+receptor-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional measurements of receptor-ligand interactions.</a> Front Mol Biosci. 10, 1075587(2023).</li>
<li>Zlotnikov, I. D., Kudryashova, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+simulation+of+the+receptor-ligand+interactions+of+mannose+receptor+CD206+in+comparison+with+the+lectin+concanavalin+A+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Moscow%29%22%5BJournal%5D)">Computer simulation of the receptor-ligand interactions of mannose receptor CD206 in comparison with the lectin concanavalin A model.</a> Biochemistry (Moscow). 87 (1), 54-69 (2022).</li>
<li>Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+molecular+mechanisms+of+protein-ligand+interactions+by+molecular+docking+and+molecular+dynamics+simulation%3A+A+case+of+oligopeptide+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Math+Methods+Med%22%5BJournal%5D)">Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: A case of oligopeptide binding protein.</a> Comput Math Methods Med. 2018, 7604567(2018).</li>
<li>Farina, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+studying+receptor-ligand+interactions+on+living+cells%27+surface+by+using+NUS%2FT1%CF%81-NMR+methodologies+combined+with+computational+techniques%3A+The+RGDechi15D-%CE%B1v%CE%B25+integrin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">A novel approach for studying receptor-ligand interactions on living cells' surface by using NUS/T1ρ-NMR methodologies combined with computational techniques: The RGDechi15D-αvβ5 integrin complex.</a> Comput Struct Biotechnol J. 19, 3303-3318 (2021).</li>
<li>Driessen, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphatidylinositol+mannosides+in+the+interaction+between+mycobacteria+and+DC-SIGN%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of phosphatidylinositol mannosides in the interaction between mycobacteria and DC-SIGN.</a> Infect Immun. 77 (10), 4538-4547 (2009).</li>
<li>Bansal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+homology+3-interacting+domain+of+Rv1917c+of+Mycobacterium+tuberculosis+induces+selective+maturation+of+human+dendritic+cells+by+regulating+PI3K-MAPK-NF-%CE%BAB+signaling+and+drives+Th2+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Src homology 3-interacting domain of Rv1917c of Mycobacterium tuberculosis induces selective maturation of human dendritic cells by regulating PI3K-MAPK-NF-κB signaling and drives Th2 immune responses.</a> J Biol Chem. 285 (47), 36511-36522 (2010).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPE57+induces+activation+of+macrophages+and+drives+Th1-type+immune+responses+through+TLR2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">PPE57 induces activation of macrophages and drives Th1-type immune responses through TLR2.</a> J Mol Med. 93 (6), 645-662 (2015).</li>
<li>Olesen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN+%28CD209%29%2C+pentraxin+3+and+vitamin+D+receptor+gene+variants+associate+with+pulmonary+tuberculosis+risk+in+West+Africans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Immun%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN (CD209), pentraxin 3 and vitamin D receptor gene variants associate with pulmonary tuberculosis risk in West Africans.</a> Genes Immun. 8, 456-467 (2007).</li>
<li>Berger, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+is+a+microbial+sensor+that+regulates+bacterial+phagosome+functions+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">SLAM is a microbial sensor that regulates bacterial phagosome functions in macrophages.</a> Nat Immunol. 11 (10), 920-927 (2010).</li>
<li>Degos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omp25-dependent+engagement+of+SLAMF1+by+Brucella+abortus+in+dendritic+cells+limits+acute+inflammation+and+favours+bacterial+persistence+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Omp25-dependent engagement of SLAMF1 by Brucella abortus in dendritic cells limits acute inflammation and favours bacterial persistence in vivo.</a> Cell Microbiol. 22 (4), e13156(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Badanie to stanowi przydatny przewodnik do badania interakcji biochemicznej między M. tuberculosis a czujnikami mikrobiologicznymi ulegającymi ekspresji w ludzkich makrofagach, kluczowym typie komórek biorących udział w odpowiedzi gospodarza podczas gruźlicy. Dostarczone protokoły będą istotne dla rozszyfrowania cząsteczek, które odgrywają rolę w wnikaniu M. tuberculosis do fagocytów.
Scharakteryzowanie interakcji biomolekularnych, takich jak ta między patogenami a immunorece...

Mycobacterium tuberculosis, patogen wywołujący gruźlicę zidentyfikowany 142 lata temu, pozostaje globalnym wyzwaniem, zarażając obecnie co najmniej jedną czwartą światowejpopulacji1. Przenoszony drogą kropelkową od zakażonych osób, M. tuberculosis dociera do makrofagów pęcherzykowych w płucach, gdzie może przetrwać przez długi czas w stanie utajonym 2,3. Nie tylko aktywowana jest lokalna odpowiedź makrofagiczna, ale w ostatnich latach opisano, że monocyty obwodowe mogą być rekrutowane do dróg oddechowych i różnicować się w makrofagi pęcherzykowe, generując jeszcze silniejszą odpowiedź przeciwko M. tuberculosis niż ich odpowiednik pochodzenia płodowego 2,4.
Makrofagi są podstawowymi graczami odporności wrodzonej. Po spożyciu M. tuberculosis makrofagi wykazują liczne funkcje bakteriobójcze, takie jak wydzielanie cytokin prozapalnych, fuzja fagolizosomu i aktywacja innych komórek odpornościowych w celu zabicia M. tuberculosis 2,3. Jednak złożona struktura architektoniczna tego patogenu dostarcza efektorów (np. białek i lipidów) zdolnych do regulacji metabolizmu i funkcji makrofagów, a w konsekwencji procesu zapalnego3. Ta manipulacja reakcjami makrofagów, poprzez wydzielanie czynników wirulencji lub wykorzystanie czynników gospodarza, prowadzi do różnych strategii ucieczki wywieranych przez M. tuberculosis. Niektóre kluczowe mechanizmy unikania obejmują indukcję cytokin przeciwzapalnych, hamowanie dojrzewania i zakwaszania fagolizosomów, zmiany stresu oksydacyjnego, zakłócenie autofagii oraz niedobory podczas przetwarzania i prezentacji antygenu 3,5.
Ściśle regulowana interakcja między makrofagami a M. tuberculosis ma kluczowe znaczenie dla rozwoju prawidłowej odpowiedzi immunologicznej. Dlatego badanie tych synaps jest kluczem do identyfikacji mechanizmów immunoprotekcyjnych lub immunopatogennych indukowanych przez wzajemne oddziaływanie gospodarz-patogen, a także do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych. Wiele receptorów pośredniczy w rozpoznawaniu i/lub internalizacji M. tuberculosis, w tym TLR 6,7,8, NLR 7,8, receptory dopełniacza 6,8, receptory lektyny typu C 6,8 i receptory zmiatacze 6,8. Coraz więcej danych wskazuje, że zarówno powierzchniowe, jak i wewnątrzkomórkowe PRR odgrywają ważną rolę podczas infekcji, rozpoznając opsonizowane i nieopsonizowane M. tuberculosis.
Zihad i Sifat i wsp. dokonali niedawno przeglądu udziału PRR w odpowiedziach wywołanych przez M. tuberculosis przez komórki wrodzone9. W szczególności większość członków rodziny TLR jest zaangażowana w interakcję z ligandami M. tuberculosis 6,7. Powierzchnia TLR2 rozpoznaje antygeny prątków, takie jak acylowane lipoproteiny, lipoproteina 19-kDa, lipoproteina LprA, lipoproteina LprG, antygen 30-kDa, antygen 38-kDa, MymA, kwas prolinowo-prolinowy-glutaminowy (PPE)-57, LAM, LM, PIM, białko szoku cieplnego 60, białko sygnatury Rv1509 i wydzielane białko ESAT-67. Błona TLR4 oddziałuje z białkami szoku cieplnego, antygenem 38-kDa, RpfE, Rv0652, Rv0335c, Rv2659c, Rv1738, Rv2627c, Rv2628, GrpE i HBHA. Z drugiej strony, ligandy dla endosomalnych TLR (TLR 3, 7, 8 i 9) obejmują dsRNA, tRNA, ssRNA, fagosomalne RNA i dsDNA M. tuberculosis. Ponadto TLR2 odgrywa aktywną rolę w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej, gdy działa w połączeniu z TLR1 i TLR6, TLR4 i TLR9 6,7. NOD2 i NLRP3 są najlepiej scharakteryzowanymi cytoplazmatycznymi NLR w gruźlicy. Chociaż ich specyficzne ligandy są nadal badane, receptory te są aktywowane odpowiednio przez dipeptyd muramylowy lub ESAT-6 7,8. Receptory lektyny typu C są klasycznie zaangażowane w endocytozę M. tuberculosis. Podczas gdy dektyna-2 działa jako bezpośredni PRR dla ManLAM ściany komórkowej M. tuberculosis, ligand Dectin-1 nie został jeszcze odkryty8. Zarówno Mincle, jak i MCL rozpoznają glikolipidowy trehalozo-6,6′-dimykolan (TDM), zwany również czynnikiem pępowinowym7. DCAR oddziałuje z glikolipidami prątków, mannozydami fosfatydylo-mio-inozytolu (PIM)7. CR3 rozpoznaje prątki LAM i PIM, DC-SIGN liguje ManLAM, MR rozpoznaje szereg składników M. tuberculosis, w tym ManLAM, PIM, LM, glikoproteinę 38-kDa, antygen 19-kDa i inne mannozylowane białka, podczas gdy ligand DCIR jest nadal niezidentyfikowany.
Rozpuszczalne CLR obejmują SP-A, który rozpoznaje ManLam, LM, glikoproteinę 60 kDa i glikoproteinę Apa; SP-D współdziała z LAM, LM i PILAM; oraz MBL, który specjalizuje się w rozpoznawaniu ManLAM 6,7. Receptory zmiataczy są również fagocytarnymi PRR. SR-A i MARCO mają TDM jako swój ligand, SR-B1 rozpoznaje ESAT-6, a CD36 wiąże ManLAM i LM 7,8. Dodatkowo Dectin-1, Mincle i MARCO mogą również łączyć się z TLR2 lub TLR4 w celu wyzwalania sygnałów po wykryciu M. tuberculosis PAMPs 6,7. CD14 jest receptorem powierzchniowym, który ma zdolność internalizacji nieopsonizowanych bakterii, a także rozpoznaje białko szoku cieplnego Chaperonin 60.1. W szczególności CD14 działa jako koreceptor wraz z MARCO i TLR26. AIM2 jest receptorem cytozolowym, który może wyczuwać ssDNA na M. tuberculosis ucieka z fagosomu8. Wreszcie, AhR jest czynnikiem transkrypcyjnym aktywowanym ligandem, który wiąże pigmentowany czynnik wirulencji naftochinon ftiokol z M. tuberculosis6. 
Wiele z opisanych powyżej interakcji zostało postulowanych, a nie ściśle zademonstrowanych. Nawet ligandy dla niektórych receptorów pozostają nieznane, co wzmacnia potrzebę lepszego zrozumienia dziedziny immunorozpoznawania M. tuberculosis. W tym kontekście, cząsteczka kostymulacyjna SLAMF1 (Signaling Lymphocytic Activation Molecule) została niedawno opisana jako receptor M. tuberculosis przez Barbero i wsp.10. Działając nie tylko jako cząsteczka sygnałowa, ale także jako czujnik M. tuberculosis, SLAMF1 odgrywa szczególnie intrygującą rolę w gruźlicy. SLAMF1 może indukować aktywację komórek odpornościowych poprzez modulowanie funkcji ochronnych, takich jak wytwarzanie IFN-γ przez limfocyty T poprzez fosforylację Erk / CREB 11,12,13, autofagię w neutrofilach 14 i klirens bakteryjny w makrofagach15.
Interakcje receptor-ligand były badane przez lata przy użyciu technik takich jak ELISA, powierzchniowy rezonans plazmonów (SPR), izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC), polaryzacja fluorescencyjna (FP), krystalografia rentgenowska, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), termoforeza w mikroskali (MST), rezonansowy transfer energii (np. BRET lub FRET), mikroskopia konfokalna, mikroskopia elektronowa, mikroskopia krioelektronowa (Cryo-EM) i mikroskopia sił atomowych (AFM)16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Niektóre z tych podejść implikują użycie genów reporterowych, znakowanych rekombinowanych białek lub cząsteczek chimerycznych, modeli nokautu, knockdownu lub nadekspresji. Alternatywnie, narzędzia obliczeniowe mogą przewidywać interakcje receptor-ligand i miejsca wiązania i są często używane w połączeniu z podejściami biologicznymi w celu uzyskania kompleksowego zrozumienia interakcji 29,30,31. W tym miejscu opisano dwie alternatywy wykrywania interakcji biochemicznych, a także sekcję dotyczącą fluorescencyjnego znakowania bakterii. Przedstawiono protokół, który umożliwia badanie interakcji receptor-patogen in vitro, w szczególności oceniając zaangażowanie SLAMF1-M. w gruźlicę za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej, dwóch zwykle dostępnych i rutynowo stosowanych technik.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>Nr kat. A21121</td><td>Do mikroskopii fluorescencyjnej</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-SLAMF1 FITC&nbsp;</td><td>eBionauka</td><td>11-1509-42</td><td>Do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-SLAMF1 PE&nbsp;</td><td>Legenda biologiczna</td><td>306308</td><td>Do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>przeciwciało pierwotne anty-SLAMF1&nbsp;</td><td>Legenda biologiczna</td><td>306302</td><td>Do mikroskopii fluorescencyjnej</td></tr><tr><td>Aqua-Poly/Mocowanie</td><td>Nauki polilogiczne</td><td>18606-20</td><td>Nośniki montażowe</td></tr><tr><td>Mikrokulki CD14</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-052</td><td>Do izolacji monocytów</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 12mm</td><td>HDA</td><td>-</td><td>Do oznaczania interakcji za pomocą mikroskopii</td></tr><tr><td>EGS (Grupa)</td><td>ThermoFisher Naukowy&nbsp;</td><td>21565</td><td>Do leczenia sieciowania</td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>338960</td><td>Cytometr przepływowy z oprogramowaniem BD FACSDiva</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Natocor</td><td>-</td><td>Inaktywowane i napromieniane, do hodowli makrofagów</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva (Cytiwa)</td><td>17144003</td><td>Do separacji PBMC</td></tr><tr><td>Fidżi/ImageJ</td><td>Oprogramowanie Open Source</td><td>-</td><td>Do analizy mikrograficznej</td></tr><tr><td>FlowJo 7.6.2&nbsp;</td><td>Gwiazda drzewa</td><td>-</td><td>Do analizy metodą cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Merck</td><td>K47740803613</td><td>Do leczenia sieciowania</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Szkło Klass</td><td>-</td><td>Do oznaczania interakcji za pomocą mikroskopii</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>Klasa g8898 powiedział:</td><td>Do leczenia sieciowania</td></tr><tr><td>Imager.A2 (Obrazik)</td><td>Carl Zeiss</td><td>430005-9901-000</td><td>Mikroskop fluorescencyjny z modułem oświetleniowym Colibri 7</td></tr><tr><td>iMark (Znacznik iMark</td><td>BIO-RAD</td><td>1681130</td><td>Czytnik absorbancji mikropłytek&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49419</td><td>Do hodowli makrofagów</td></tr><tr><td>M. tuberculosis, szczep H37Rv, całe komórki napromieniowane promieniami gamma&nbsp;</td><td>Zasoby BEI, NIAID, NIH</td><td>NR-14819 (wersja angielska)</td><td>Do oznaczania interakcji</td></tr><tr><td>M. tuberculosis, szczep H37Rv, lizat pełnokomórkowy</td><td>Zasoby BEI, NIAID, NIH</td><td>NR-14822 (wersja angielska)</td><td>Do stymulacji makrofagów i oznaczania interakcji</td></tr><tr><td>Neofuge 13R</td><td>Siła leczenia</td><td>Neofuge 13R</td><td>Wirówka z chłodzeniem o dużej prędkości do ekstrakcji białek</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>15140122</td><td>Do hodowli makrofagów</td></tr><tr><td>PMSF (Kanał PMSF)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>36978</td><td>Do izolacji białek</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-003-M</td><td>Do obróbki szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Zobacz materiał P8340 powiedział:</td><td>Do izolacji białek</td></tr><tr><td>Rodamina B&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>21955</td><td>Barwienie M. tuberculosis</td></tr><tr><td>Silnik RPMI 1640</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>11875093</td><td>Do hodowli makrofagów</td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall ST 16/16R</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>75004240</td><td>Do izolacji PBMC i monocytów</td></tr></tbody></table>

testy fluorescencyjne do badania interakcji mycobacterium tuberculosis z receptorem immunologicznym slamf1

Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1

Ocena bezpośredniej interakcji między patogenami a receptorami immunologicznymi zwykle obejmuje wyrafinowane techniki lub zakłada użycie szczepów transgenicznych i komórek modyfikowanych genetycznie. W tym miejscu opisano alternatywną metodę wykrywania interakcji biochemicznej między czujnikiem mikrobiologicznym makrofagów SLAMF1 a Mycobacterium tuberculosis . Opracowano dwa podejścia techniczne wykorzystujące cytometrię przepływową i mikroskopię fluorescencyjną. Wygenerowano całkowite ekstrakty białkowe z ludzkich makrofagów, a następnie inkubowano z całymi komórkami antygenów M. tuberculosis (WCMtb) lub M. tuberculosis (Mtb Ags) przez noc w temperaturze 4 °C, a na koniec usieciowano za pomocą traktowania formaldehydem/glicyną/glikolem etylenowym bis (bursztynian sukcynimidylu). Interakcję SLAMF1 z WCMtb za pomocą cytometrii przepływowej wykryto za pomocą przeciwciała anty-SLAMF1 specyficznego dla PE. Istnienie interakcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przeprowadzono poprzez dołączenie Mtb Ag barwionych rodaminą-PE do szkiełek pokrytych poli-D-lizyną, które inkubowano z całkowitym ekstraktem białkowym z makrofagów pochodzących z monocytów. Po leczeniu sieciowaniem SLAMF1 wizualizowano za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych (anty-SLAMF1) i drugorzędowych (Alexa Fluor 488). Testy dostarczyły silnego narzędzia biochemicznego do pomiaru interakcji między patogenem a immunoreceptorem, pokonując trudności związane z eksperymentami z transgenicznymi liniami komórkowymi i modulacją ekspresji genów białek.

W niniejszej pracy przedstawiono protokół, który umożliwia ocenę interakcji M. tuberculosis z receptorem immunologicznym SLAMF1 w ludzkich makrofagach (ryc. 1). W tym celu pozyskano krew obwodową od zdrowych dawców. Następnie PBMC oddzielono przez wirowanie na pożywce o gradiencie gęstości, a monocyty wyizolowano przez pozytywną selekcję magnetyczną (czystość ≥95%, ryc. 2A, B). Wyizolowane monocyty przyklejono do plastikowych płytek hod...

Badanie to zawiera protokół oceny interakcji Mycobacterium tuberculosis z czujnikiem mikrobiologicznym SLAMF1. Testy przeprowadzono na ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej. Opisane narzędzia są istotne dla badania interakcji między patogenami a immunoreceptorami.

Testy fluorescencyjne do badania interakcji Mycobacterium tuberculosis z receptorem immunologicznym SLAMF1

The evaluation of direct interaction between pathogens and immune receptors usually involves sophisticated techniques or implies the use of transgenic ...

Nasze badania stanowią przydatny przewodnik do badania interakcji biochemicznej między gruźlicą drobnoustrojów a czujnikami mikrobiologicznymi wyrażającymi ludzkie mikrofagi i będą istotne dla sztywniejszych cząsteczek, które odgrywają rolę w wnikaniu mikrobakterii tuberculosis do fibrocytów. Interakcja receptorów była badana przez lata przy użyciu podejść, które zwykle wykorzystują maszyny reporterowe, hermetyczne cząsteczki, wyrównane białka rekombinowane, modele nokautu, knockdown, niższej ekspresji. Techniki te mogą być trudne, czasochłonne, a czasem kosztowne.Korzystając z opublikowanego protokołu, po raz pierwszy wykazaliśmy, że w makrofagach receptor SLMF1 oddziałuje z prątkami gruźlicy, promując wychwyt bakteryjny i prowadząc do dojrzewania endolizosomów. Pokonaliśmy trudności związane z eksperymentami z ekspresją genów i opisaliśmy nowy cel dla nowych strategii terapeutycznych. Nasz protokół oferuje dwie alternatywy do wykrywania interakcji biochemicznej między gruźlicą drobnoustrojów a czujnikiem mikrobiologicznym SLMF1 za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej, dwóch zwykle dostępnych i owocnie stosowanych technik.Metodologia ta ma wiele potencjalnych zastosowań i może być łatwo zaadaptowana w innych kontekstach badawczych. Zapewniamy prosty protokół, który ocenia interakcję z receptorem prątków gruźlicy przy użyciu bakterii inaktywowanych i sonikowanych całymi komórkami, które można przeprowadzić w warunkach BSL2, ale łatwo dostosować do innych receptorów i żywych szczepów. W razie potrzeby testy te można również wykonać w warunkach BSL3 z różnymi żywymi patogenami.Na początek ostrożnie przenieś krew pobraną od zdrowych dawców do 50-mililitrowych probówek i rozcieńcz ją do połowy objętości solą fizjologiczną. Przygotować pożywkę o gradiencie gęstości i odwirować próbkę w celu oddzielenia komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, PBMC. Zebrać PBMC z białawego halo.Po zliczeniu komórek w komorze zliczania komórek wykonaj selekcję magnetyczną za pomocą kulek CD14, aby zebrać monocyty CD14 dodatnie. Następnie ponownie zawieś wyizolowane komórki w pożywce RPMI 1640. Wysiewaj 500 mikrolitrów monocytów CD14 dodatnich w stężeniu jeden razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr do każdej studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej pod nieobecność surowicy, aby promować przyleganie.Po dwóch godzinach umyj studzienki wstępnie podgrzanym podłożem RPMI 1640, aby usunąć nieprzylegające komórki. Różnicować monocyty na makrofagi za pomocą jednego mililitra kompletnej pożywki RPMI 1640 przez 16 do 18 godzin. Następnego dnia umyj studzienki jednym mililitrem PBS i dodaj jeden mililitr kompletnego podłoża RPMI 1640 do każdej studzienki.Stymulować makrofagi 10 mikrolitrami sonikowanych antygenów Mycobacterium tuberculosis przez 24 godziny. Następnego dnia, używając pipety P-1000, wyrzuć całe medium RPMI z dołków płytki. Dodaj zimny PBS i pipetuj w górę iw dół, aby zebrać makrofagi.Przenieś komórki do 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych. Wirować probówki o stężeniu 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w uzupełnionym buforze do testów radioimmunoprecypitacyjnych.Inkubować zawiesinę na lodzie przez godzinę, wirując co 10 minut. Odwirować zawiesinę o stężeniu 14 000 G przez 15 minut i zebrać supernatant. Inkubować jeden razy 10 do mocy sześciu całych inaktywowanych komórek mycobacterium tuberculosis z 50 mikrolitrami ekstraktu białkowego od jednego razy 10 do mocy sześciu makrofagów przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w obracającym się uchwycie mikroprobówki.Następnego dnia, aby wybarwić kompleks bakterii białkowych, dodaj przeciwciało anty-ludzkie SLAMF1 do mikroprobówki, zwiruj mieszaninę i inkubuj przez noc przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Po przemyciu kompleksów bakterii białkowych za pomocą FACS, należy je ponownie zawiesić w buforze FACS i pobrać próbkę na cytometr przepływowy. Za pomocą pęsety chirurgicznej z okrągłym noskiem umieść 12-milimetrowe okrągłe szkiełka pokrywy w dołkach 24-dołkowej płytki hodowlanej.Inkubować szkiełko nakrywkowe z antygenami rodaminy Mycobacterium tuberculosis przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji dodać 100 mikrolitrów ekstraktu białkowego rozcieńczonego w 300 mikrolitrach PBS i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Owiń pokrywkę płytki hodowlanej folią parafinową.Dodaj 60 mikrolitrów kropli wcześniej miareczkowanego przeciwciała pierwszorzędowego anty SLAMF1 na pokrywkę pokrytą folią parafinową. Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe z płytki za pomocą zakrzywionej pęsety chirurgicznej i igieł z cienką końcówką. Po inkubacji z pierwszorzędowym i drugorzędowym roztworem przeciwciał usunąć nadmiar płynu i założyć szkiełko nakrywkowe na kroplę płynu montażowego umieszczoną na szkiełku podstawowym.Umieść szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym i obserwuj komórki za pomocą odpowiednich filtrów. Monocyty z powodzeniem wyizolowano z PBMC o czystości 95% lub wyższej, a makrofagi pochodzące z monocytów wytworzono po przestrzeganiu zaleceń lekarskich i hodowli przez noc. Ekspresję powierzchniową SLAMF1 indukowano w makrofagach stymulowanych antygenami Mycobacterium tuberculosis, a jej poziom potwierdzono za pomocą cytometrii przepływowej.Interakcję między SLAMF1 a całymi komórkami prątków prątków gruźlicy wykazano za pomocą testu sieciowania, a następnie cytometrii przepływowej. Interakcję między SLAMF1 a antygenami Mycobacterium tuberculosis uwidoczniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z kolokalizacją potwierdzoną połączonymi obrazami.

fluorescence-assays-for-study-mycobacterium-tuberculosis-interaction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Barbero, A. M., et.al. Testy fluorescencyjne do badania interakcji Mycobacterium tuberculosis z receptorem odpornościowym SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)Ten film demonstruje test oparty na fluorescencji badający interakcję między receptorem makrofagów a antygenami Mycobacterium tuberculosis . Antygeny znakowane fluorescencją na slipie są inkubowane z ekstraktami białek makrofagów, sieciowane, znakowane przeciwciałami i wizualizowane przez nakładające się sygnały fluorescencji.

Test fluorescencyjny do badania interakcji receptorów makrofagów z antygenami bakteryjnymi

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

Ten film demonstruje obrazowanie fluorescencji enzymu reporterowego (REF) do wykrywania in vivo infekcji Mycobacterium tuberculosis. Zakażonym myszom wstrzykuje się dootrzewnowo substrat do obrazowania REF. Po hydrolizie przez bakteryjny enzym β-laktamazę substrat wydziela fluorescencję, której wykrycie pomaga w ocenie infekcji.

Obrazowanie fluorescencyjne enzymów reporterowych do śledzenia infekcji bakteryjnych in vivo

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Opisujemy obrazowanie optyczne myszy zakażonych Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) za pomocą fluorescencji enzymu reporterowego (REF). Protokół ten ułatwia czułe i swoiste wykrywanie M. tuberculosis w przedklinicznych modelach zwierzęcych do celów patogenezy, terapii i badań nad szczepionkami.

Obrazowanie Mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Poznaj testy fluorescencyjne do badania interakcji Mycobacterium tuberculosis z receptorem SLAMF1 w ludzkich makrofagach. Ta metoda cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej pozwala zrozumieć mechanizmy rozpoznawania patogenów.

Testy fluorescencyjne do badania interakcji Mycobacterium tuberculosis z receptorem immunologicznym SLAMF1

Przeglądaj więcej filmów