Testy fluorescencyjne do badania interakcji Mycobacterium tuberculosis z receptorem immunologicznym SLAMF1

Nasze badania stanowią przydatny przewodnik do badania interakcji biochemicznej między gruźlicą drobnoustrojów a czujnikami mikrobiologicznymi wyrażającymi ludzkie mikrofagi i będą istotne dla sztywniejszych cząsteczek, które odgrywają rolę w wnikaniu mikrobakterii tuberculosis do fibrocytów. Interakcja receptorów była badana przez lata przy użyciu podejść, które zwykle wykorzystują maszyny reporterowe, hermetyczne cząsteczki, wyrównane białka rekombinowane, modele nokautu, knockdown, niższej ekspresji. Techniki te mogą być trudne, czasochłonne, a czasem kosztowne.

Korzystając z opublikowanego protokołu, po raz pierwszy wykazaliśmy, że w makrofagach receptor SLMF1 oddziałuje z prątkami gruźlicy, promując wychwyt bakteryjny i prowadząc do dojrzewania endolizosomów. Pokonaliśmy trudności związane z eksperymentami z ekspresją genów i opisaliśmy nowy cel dla nowych strategii terapeutycznych. Nasz protokół oferuje dwie alternatywy do wykrywania interakcji biochemicznej między gruźlicą drobnoustrojów a czujnikiem mikrobiologicznym SLMF1 za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej, dwóch zwykle dostępnych i owocnie stosowanych technik.

Metodologia ta ma wiele potencjalnych zastosowań i może być łatwo zaadaptowana w innych kontekstach badawczych. Zapewniamy prosty protokół, który ocenia interakcję z receptorem prątków gruźlicy przy użyciu bakterii inaktywowanych i sonikowanych całymi komórkami, które można przeprowadzić w warunkach BSL2, ale łatwo dostosować do innych receptorów i żywych szczepów. W razie potrzeby testy te można również wykonać w warunkach BSL3 z różnymi żywymi patogenami.

Na początek ostrożnie przenieś krew pobraną od zdrowych dawców do 50-mililitrowych probówek i rozcieńcz ją do połowy objętości solą fizjologiczną. Przygotować pożywkę o gradiencie gęstości i odwirować próbkę w celu oddzielenia komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, PBMC. Zebrać PBMC z białawego halo.

Po zliczeniu komórek w komorze zliczania komórek wykonaj selekcję magnetyczną za pomocą kulek CD14, aby zebrać monocyty CD14 dodatnie. Następnie ponownie zawieś wyizolowane komórki w pożywce RPMI 1640. Wysiewaj 500 mikrolitrów monocytów CD14 dodatnich w stężeniu jeden razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr do każdej studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej pod nieobecność surowicy, aby promować przyleganie.

Po dwóch godzinach umyj studzienki wstępnie podgrzanym podłożem RPMI 1640, aby usunąć nieprzylegające komórki. Różnicować monocyty na makrofagi za pomocą jednego mililitra kompletnej pożywki RPMI 1640 przez 16 do 18 godzin. Następnego dnia umyj studzienki jednym mililitrem PBS i dodaj jeden mililitr kompletnego podłoża RPMI 1640 do każdej studzienki.

Stymulować makrofagi 10 mikrolitrami sonikowanych antygenów Mycobacterium tuberculosis przez 24 godziny. Następnego dnia, używając pipety P-1000, wyrzuć całe medium RPMI z dołków płytki. Dodaj zimny PBS i pipetuj w górę iw dół, aby zebrać makrofagi.

Przenieś komórki do 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych. Wirować probówki o stężeniu 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w uzupełnionym buforze do testów radioimmunoprecypitacyjnych.

Inkubować zawiesinę na lodzie przez godzinę, wirując co 10 minut. Odwirować zawiesinę o stężeniu 14 000 G przez 15 minut i zebrać supernatant. Inkubować jeden razy 10 do mocy sześciu całych inaktywowanych komórek mycobacterium tuberculosis z 50 mikrolitrami ekstraktu białkowego od jednego razy 10 do mocy sześciu makrofagów przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w obracającym się uchwycie mikroprobówki.

Następnego dnia, aby wybarwić kompleks bakterii białkowych, dodaj przeciwciało anty-ludzkie SLAMF1 do mikroprobówki, zwiruj mieszaninę i inkubuj przez noc przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Po przemyciu kompleksów bakterii białkowych za pomocą FACS, należy je ponownie zawiesić w buforze FACS i pobrać próbkę na cytometr przepływowy. Za pomocą pęsety chirurgicznej z okrągłym noskiem umieść 12-milimetrowe okrągłe szkiełka pokrywy w dołkach 24-dołkowej płytki hodowlanej.

Inkubować szkiełko nakrywkowe z antygenami rodaminy Mycobacterium tuberculosis przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji dodać 100 mikrolitrów ekstraktu białkowego rozcieńczonego w 300 mikrolitrach PBS i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem. Owiń pokrywkę płytki hodowlanej folią parafinową.

Dodaj 60 mikrolitrów kropli wcześniej miareczkowanego przeciwciała pierwszorzędowego anty SLAMF1 na pokrywkę pokrytą folią parafinową. Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe z płytki za pomocą zakrzywionej pęsety chirurgicznej i igieł z cienką końcówką. Po inkubacji z pierwszorzędowym i drugorzędowym roztworem przeciwciał usunąć nadmiar płynu i założyć szkiełko nakrywkowe na kroplę płynu montażowego umieszczoną na szkiełku podstawowym.

Umieść szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym i obserwuj komórki za pomocą odpowiednich filtrów. Monocyty z powodzeniem wyizolowano z PBMC o czystości 95% lub wyższej, a makrofagi pochodzące z monocytów wytworzono po przestrzeganiu zaleceń lekarskich i hodowli przez noc. Ekspresję powierzchniową SLAMF1 indukowano w makrofagach stymulowanych antygenami Mycobacterium tuberculosis, a jej poziom potwierdzono za pomocą cytometrii przepływowej.

Interakcję między SLAMF1 a całymi komórkami prątków prątków gruźlicy wykazano za pomocą testu sieciowania, a następnie cytometrii przepływowej. Interakcję między SLAMF1 a antygenami Mycobacterium tuberculosis uwidoczniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z kolokalizacją potwierdzoną połączonymi obrazami.