Ekstrakcja i oczyszczanie tkanek Przygotowanie próbek mysiego rdzenia kręgowego
11 kwietnia 2025
To badanie przedstawia protokół ekstrakcji i przygotowania oczyszczonych próbek całego mózgu i rdzenia kręgowego z zachowanymi sygnałami fluorescencyjnymi, zwiększając wydajność eksperymentu i integralność danych w celu przyspieszenia badań neurobiologicznych.
Nasze badania koncentrują się na tym, w jaki sposób ośrodkowy układ nerwowy pośredniczy w funkcjach poznawczych i współdziała z układem odpornościowym. Naszym celem jest udoskonalenie metod badania mózgu i rdzenia kręgowego, odpowiadając na fundamentalne pytania dotyczące tych interakcji. Metody te utrzymują cały mózg i rdzeń kręgowy w stanie nienaruszonym, co pomaga nam dokładniej mapować komórkę za pomocą oczyszczania tkanek. Sprawia również, że proces jest szybszy i dokładniejszy, skracając czas i zmniejszając liczbę błędów w porównaniu z tradycyjnymi metodami cięcia i obrazowania.
Zmapowaliśmy mózg i obszary rdzenia kręgowego połączone z płucami, uzyskując . Nasze badania skupią się na zbadaniu komunikacji neuroimmunologicznej między mózgiem, rdzeniem kręgowym i płucami. I jak ta interakcja wpływa na odpowiedź immunologiczną.
[Instruktor] Na początek przymocuj kończyny myszy do szerokiej akrylowej tablicy za pomocą stalowych zacisków. Za pomocą nożyczek przetnij skórę między dwiema kośćmi udowymi i kontynuuj cięcie w górę, aż dojdziesz do przepony. Otwórz obie strony klatki piersiowej przez przeponę, używając nożyczek i prostych kleszczy, aby odsłonić serce. Wprowadzić igłę infuzyjną o średnicy 0,7 milimetra przymocowaną do rurki perfuzyjnej do lewej komory i wykonać nacięcie o średnicy od jednego do dwóch milimetrów w wyrostku prawego przedsionka. Po perfuzji oddziel skórę na grzbiecie i głowie myszy za pomocą nożyczek okulistycznych. Przeciąć kręgosłup w miejscu, w którym linia łącząca górne tylne krawędzie obu kończyn przecina się z kręgosłupem. Usuń tkankę mięśniową i tłuszczową z szyi i grzbietu myszy, aby odsłonić kręgosłup i czaszkę. Nożyczkami żylnymi przeciąć wzdłuż szczeliny linii środkowej między lewą i prawą stroną kręgosłupa i rdzenia kręgowego od dolnego końca kanału kręgowego. Następnie usuń górną część i obustronne strony odciętego kręgosłupa, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Powtarzaj kroki, aż dotrzesz do połączenia mózgowego. Umieść końcówkę jednego ostrza nożyc żylnych między otworem wielkim a mózgiem. Przesuń i przetnij wzdłuż szwu śródstrzałkowego, aby otworzyć czaszkę. Użyj kleszczy, aby usunąć czaszkę i odsłonić mózg. Teraz za pomocą kleszczy i nożyczek żylnych usuń tkankę rdzenia kręgowego mózgu myszy z końca czaszki. Użyj kleszczy preparacyjnych, aby usunąć błonę rdzenia kręgowego pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie, za pomocą szwów, przymocuj próbkę rdzenia kręgowego mózgu do płytki mocującej. Dodać co najmniej 20-krotność objętości próbki wynoszącej 4% paraformaldehydu. Po utrwaleniu wyrzucić paraformaldehyd i trzykrotnie przemyć próbkę PBS. Na początek umocuj wyekstrahowany rdzeń kręgowy mózgu myszy w paraformaldehydzie. W przypadku roztworu do usuwania lipidów należy zmieszać roztwory A i B w stosunku masowym dziewięć do jednego. Dodaj 50 mililitrów roztworu do usuwania lipidów do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i umieść w niej utrwaloną tkankę. Po inkubacji w roztworze C zmienić roztwór i umieścić szalkę hodowlaną z próbką całkowicie zanurzoną w roztworze C na kasecie świetlnej z linią skali. Aby przygotować roztwór żelu, dodaj 147 gramów roztworu C i trzy gramy agarozy do szklanej butelki o pojemności 200 mililitrów. Dobrze wymieszaj składniki za pomocą pręta mieszającego, a następnie podgrzewaj w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. Przenieś roztwór żelu do pieca laboratoryjnego ustawionego na 37 stopni Celsjusza. Wlej do formy głęboką na dwa milimetry warstwę roztworu żelu hartowanego o temperaturze 37 stopni Celsjusza i schładzaj go w lodówce o czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut, aż stanie się półstały. Umieść próbkę o dopasowanym współczynniku załamania światła w formie i dodaj roztwór żelu do poziomu lub nieco poniżej górnej części próbki. Umieść formę z powrotem w lodówce o czterech stopniach Celsjusza na dwie godziny. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i ponownie wstaw do lodówki. Usuń szkiełko nakrywkowe pęsetą i wyjmij osadzoną próbkę. Dodaj 30 mililitrów roztworu do obrazowania do 50-mililitrowej probówki i zanurz próbkę w roztworze. Nałożyć klej 502, aby mocno przymocować próbkę do uchwytu próbki, przed zamocowaniem uchwytu na urządzeniu do obrazowania. Uruchom oprogramowanie do skanowania i wybierz poziom powiększenia 4X w sekcji powiększenia. Kliknij przycisk kalibracji, aby aktywować tryb kalibracji. Kliknij przycisk podglądu, aby przejść do trybu podglądu. Następnie kliknij przycisk ruchu w kierunku Z, aby powoli przesuwać próbkę w górę od dna komory próbki, aż wygenerowany arkusz świetlny przejdzie przez próbkę. Wybierz odpowiedni kanał laserowy i opcję trybu oświetlenia. Wybierz kierunek ścieżki skanowania dla próbki. Kliknij przycisk automatycznego skanowania, aby rozpocząć przechwytywanie obrazów próbki. Protokół z powodzeniem zachował cały mózg myszy i rdzeń kręgowy, zachowując nienaruszone sygnały fluorescencyjne w celu uzyskania wyraźnego obrazowania. Obrazowanie fluorescencyjne próbki rdzenia kręgowego mózgu wyraźnie uwidoczniło szczegółowe struktury neuronalne. Obrazy w większym powiększeniu zapewniły lepszą wizualizację pojedynczych komórek znakowanych fluorescencyjnie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia protokół wyodrębniania i przygotowywania wyjaśnionych całych próbek mózgu i rdzenia kręgowego z zachowaniem fluorescencyjnych sygnałów. Podejście zwiększa efektywność eksperymentu i utrzymuje integralność danych, aby promować badania neuronaukowe. Opracowanie metod zapewnia szybszą i bardziej dokładną alternatywę dla tradycyjnych technik przekrojów i obrazowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Neuroimmunologia
- Techniki klarowania tkanek
Tło
- Badanie roli ośrodkowego układu nerwowego w funkcjach poznawczych.
- Eksplorowanie interakcji między mózgiem, rdzeniem kręgowym a układem odpornościowym.
- Poruszanie fundamentalnych pytań dotyczących komunikacji neuronowo-immunologicznej.
Cel badania
- Ulepszenie metod badania struktur mózgu i rdzenia kręgowego.
- Ułatwienie mapowania struktur komórkowych w całych tkankach.
- Zmniejszenie błędów i czasu przetwarzania w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
Zastosowane metody
- Badanie wykorzystało protokół klarowania tkanek dla próbek mózgu i rdzenia kręgowego myszy.
- Zastosowano całe tkanki mózgu i rdzenia kręgowego do szczegółowego mapowania komórek.
- Obejmowane były wielokrotne kluczowe kroki, w tym perfuzja i fiksacja próbek, aby utrzymać fluorescencyjne sygnały.
- Stosowano systematyczne podejście do osadzenia i obrazowania próbek.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie zachował fluorescencje dla jasnego obrazowania struktur neuronowych.
- Szczegółowe struktury neuronowe zostały zwizualizowane, dostarczając wglądu w łączność mózgu i rdzenia kręgowego.
- Ulepszone obrazowanie pozwoliło na obserwację pojedynczych oznakowanych komórek, co przyczyniło się do lepszego zrozumienia neuroanatomii.
Wnioski
- To badanie pokazuje, że całe i klarowane próbki mózgu i rdzenia kręgowego mogą znacząco poprawić jakość obrazowania.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia interakcji neuronowo-immunologicznych.
- Implikacje obejmują badanie mechanizmów neuronowych w kontekście zdrowia i choroby.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Preserving intact brain-spinal cord connectivity through advanced tissue clearing enables comprehensive mapping of neural and immune interactions, addressing a critical bottleneck in CNS target validation. This protocol streamlines sample preparation and imaging, reducing manual error and accelerating data acquisition for early discovery and translational research. Enhanced imaging fidelity supports predictive confidence in mechanistic studies and portfolio triage for neuroimmunology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution mapping of neural circuits and immune interfaces in intact CNS tissue.
- Supports mechanistic de-risking by preserving spatial relationships critical for target validation.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of neuroimmune pathways relevant to disease models.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible whole-organ samples for downstream imaging workflows.
- Delivers quantitative, high-content imaging outputs suitable for comparative analysis.
- Improves assay readiness by maintaining fluorescent signal integrity throughout processing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant system studies by enabling visualization of CNS-immune connectivity.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by preserving anatomical context.
- Reduces translational risk by enabling more accurate modeling of neuroimmune mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, supporting lead identification and mechanistic studies in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by enabling intact tissue analysis.
- Screening: Standardizes sample preparation for reproducible, quantitative imaging outputs.
- Analytics: Provides high-resolution, multi-channel imaging data for robust statistical comparison.
- Translational Research: Maintains anatomical and molecular fidelity for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for CNS tissue clearing and imaging across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Streamlines sample processing, enhances reproducibility, and supports high-throughput imaging.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neuroimmunology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS and immune-modulating assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CNS dissection, tissue clearing, and advanced imaging techniques.
- Demands access to specialized imaging platforms and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible sample preparation and imaging protocols.
- May require adaptation for different animal models or tissue types based on research focus.
- Potential limitations include tissue integrity challenges and the need for careful handling to preserve fluorescent signals.
