Name: Ekstrakcja i oczyszczanie tkanek Przygotowanie próbek mysiego rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj protokół ekstrakcji i oczyszczania tkanek rdzenia kręgowego myszy z zachowaniem sygnałów fluorescencyjnych. Ta metoda umożliwia szczegółowe mapowanie struktur nerwowych w badaniach neuroimmunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (grant nr 82101249 i nr 82471204 dla XY Sun). Chińska Fundacja Badań Podoktoranckich (grant nr 2022M722125 dla XY Sun).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) oraz National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Niniejsze badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szpitala Renji, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. W tym przypadku do niniejszego badania wykorzystano 7-8 tygodniowe samce myszy szczepu STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J (pochodzenie C57BL/6J x CBA). Zwierzęta zostały pozyskane w celach handlowych (patrz tabela materiałów) i trzymane w standardowych klatkach (22 °C ± 2 °C, 12 godzin/12 godzin cykl światła/ciemności, pożywienie i woda ad libitum).
1. Perfuzja
<ol>
	<li>Głęboko znieczulić dorosłe myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia pentobarbitalu sodu (0,5% rozpuszczonego w sterylnej wodzie destylowanej, 50 mg/kg, i.p, patrz tabela materiałów) podawanego we wstrzyknięciu dootrzewnowym za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Przymocuj kończyny myszy do białej akrylowej tablicy za pomocą stalowych zacisków. Przetnij skórę między dwiema kośćmi udowymi myszy i kontynuuj cięcie w górę, aż dojdziesz do przepony. Otwórz obie strony klatki piersiowej przez przeponę, aby odsłonić serce za pomocą nożyczek i prostych kleszczy.</li>
	<li>Wprowadzić igłę infuzyjną 0,7 mm do lewej komory. Wykonaj nacięcie 1-2 mm w prawym uszku przedsionka.</li>
	<li>Wykonać perfuzję z 1x PBS zawierającą 10 U/ml heparyny sodowej z szybkością 10 ml / min za pomocą pompy perystaltycznej (patrz tabela materiałów) w celu całkowitego oczyszczenia krwi. Całkowite zblednięcie wątroby wskazuje na pomyślne usunięcie odpadów.</li>
	<li>Ukrwić 50 ml wstępnie schłodzonego 4% PFA za pomocą pompy perystaltycznej z szybkością 10 ml/min. Monitorować objawy, takie jak zwijanie ogona myszy i drganie mięśni. 
	UWAGA: Nieudana perfuzja może wpłynąć na kolejne procesy oczyszczania. Objawy te (zwijanie ogona myszy i drganie mięśni) wskazują na normalną perfuzję i nie wskazują na przytomność lub niewystarczające znieczulenie.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Ostrożnie wypreparuj cały mózg i rdzeń kręgowy za pomocą nożyczek i kleszczy, aby uniknąć uszkodzenia próbki.</li>
	<li>Oddziel skórę na grzbiecie i głowie myszy za pomocą nożyczek okulistycznych. Przeciąć kręgosłup w miejscu, w którym linia łącząca górne tylne krawędzie obu kończyn przecina się z kręgosłupem.</li>
	<li>Usuń tkankę mięśniową i tłuszczową z szyi i grzbietu myszy, aby odsłonić kręgosłup i czaszkę. Wytnij wzdłuż szczeliny linii środkowej między lewą i prawą stroną kręgosłupa i rdzenia kręgowego od dolnego końca kanału kręgowego za pomocą nożyczek do żyły.</li>
	<li>Usuń górną część i obustronne strony odciętego kręgosłupa, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Powtarzaj kroki, aż dotrzesz do połączenia mózgowego.</li>
	<li>Umieść końcówkę jednego ostrza nożyczek wenus między otworem wielkim a mózgiem. Przesuń i przetnij wzdłuż szwu środkowego strzałkowego, aby otworzyć czaszkę. Użyj kleszczy, aby usunąć czaszkę i odsłonić mózg.</li>
	<li>Usuń tkankę rdzenia kręgowego mózgu myszy z końca czaszki za pomocą kleszczy i nożyczek do wenus. 
	UWAGA: Przecięcia lub uszkodzenia powierzchni mogą ulec nasileniu podczas późniejszego oczyszczania, potencjalnie powodując nieprzewidywalne uszkodzenie próbki. Z próbkami należy obchodzić się ostrożnie.</li>
	<li>Użyj kleszczy preparacyjnych, aby usunąć błonę rdzenia kręgowego pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Przymocuj próbkę rdzenia mózgowo-rdzeniowego do płytki mocującej (patrz Tabela materiałów) za pomocą szwów. Dodać co najmniej 20-krotność objętości próbki wynoszącej 4% PFA i umieścić ją na wytrząsarce w temperaturze 4 °C w celu powolnego mieszania. Fix na noc na 16-24 h. 
	UWAGA: Nadmierna fiksacja prowadzi do nadmiernego sieciowania białek, zmniejszając skuteczność oczyszczania14. Niewystarczające lub opóźnione utrwalenie może powodować degradację antygenu i zniszczenie morfologii tkanki.</li>
	<li>Wyrzucić PFA i przemyć próbkę 3x 1x PBS. Upewnij się, że objętość PBS jest co najmniej 10-krotnie większa od objętości próbki, całkowicie zanurzając próbkę. Każde mycie trwa 2 godziny z mieszaniem na wytrząsarce z prędkością nie mniejszą niż 60 obr./min w celu dokładnego usunięcia resztek PFA.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie tkanek
UWAGA: Tutaj używany jest zestaw do oczyszczania tkanek (zobacz Tabelę Materiałów).
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do usuwania lipidów, mieszając roztwór A i roztwór B w stosunku masowym 9:1, 
	UWAGA: Zaleca się, aby objętość roztworu do usuwania lipidów była większa niż 20 razy większa od objętości próbki.</li>
	<li>Umieść utrwaloną tkankę w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaj 50 ml roztworu do usuwania lipidów. Umieścić probówkę wirówkową w wytrząsarce w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając z prędkością 60 obr./min w celu usunięcia lipidów. Zmieniaj roztwór do usuwania lipidów codziennie przez 3-5 dni. Aby określić zakończenie, umieść probówkę wirówkową na kasecie świetlnym z linią skali. Jeśli linia podziałki jest wyraźnie widoczna i niezniekształcona w próbce, proces jest zakończony.</li>
	<li>Umieścić próbkę w 20 ml roztworu C na wytrząsarce w temperaturze 25 °C, wstrząsając z prędkością mniejszą niż 60 obr./min w celu dopasowania współczynnika załamania światła. Zmień roztwór C po 24 godzinach. Umieścić naczynie hodowlane z próbką całkowicie zanurzoną w roztworze C na kasecie świetlnym z linią podziałki. Jeśli podziałka jest wyraźnie widoczna i niezniekształcona w próbce, proces dopasowywania jest zakończony. 
	UWAGA: W przypadku tkanek dorosłych myszy dopasowanie współczynnika załamania światła zwykle kończy się w ciągu 2 dni.</li>
</ol>
4. Osadzanie tkanek
<ol>
	<li>Przygotować roztwór żelu ze 147 g roztworu C w szklanej butelce o pojemności 200 ml, dodać 3,0 g agarozy, dobrze wymieszać przez wirowanie, a następnie podgrzać w kuchence mikrofalowej do wrzenia i natychmiast wyłączyć kuchenkę mikrofalową. Przenieść probówkę wirówkową do inkubatora o temperaturze 37 °C, aż agaroza się rozpuści. 
	UWAGA: Zaleca się przygotowanie świeżego roztworu żelu w razie potrzeby.</li>
	<li>Oczyszczoną próbkę należy zatopić w formie warstwą roztworu żelu o temperaturze 37 °C o głębokości 2 mm i schłodzić w lodówce o temperaturze 4 °C przez 30 minut, aż do jej częściowego zestalenia. Umieść próbkę o dopasowanym współczynniku załamania światła w formie i dodaj roztwór żelu, aby był równy lub nieco poniżej górnej części próbki.</li>
	<li>Umieść formę z powrotem w lodówce o temperaturze 4 °C na 2 godziny. Dodaj roztwór żelu, aż zrówna się z powierzchnią formy. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Przyspieszyć krzepnięcie w lodówce o temperaturze 4 °C przez 2 godziny. Osadzoną próbkę należy przechowywać przez noc w lodówce o temperaturze 4 °C. Kontynuuj obrazowanie tak szybko, jak to możliwe.</li>
</ol>
5. Skanowanie
<ol>
	<li>Usuń szkiełko nakrywkowe pęsetą i wyjmij osadzoną próbkę. Umieść próbkę w probówce o pojemności 50 ml i dodaj 30 ml roztworu do obrazowania, aby całkowicie zanurzyć próbkę.</li>
	<li>Nałożyć klej 502, aby mocno przymocować próbkę do uchwytu próbki. Zamocuj uchwyt na urządzeniu do przetwarzania obrazu.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do skanowania zgodnie z opisem. Wybierz poziom powiększenia 4x w sekcji powiększenia. Kliknij przycisk Kalibracja, aby aktywować tryb kalibracji.</li>
	<li>Kliknij przycisk Podgląd, aby przejść do trybu podglądu. Kliknij przycisk ruchu w kierunku Z, aby powoli przesuwać próbkę w górę od dna komory próbki, aż wygenerowany arkusz świetlny przejdzie przez próbkę.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni kanał laserowy i opcję trybu oświetlenia. Wybierz kierunek ścieżki skanowania dla próbki. Kliknij przycisk Auto Scan (Automatyczne skanowanie), aby rozpocząć przechwytywanie próbki.</li>
</ol>

<ol><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nat Rev Neurosci. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
<li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).</li>
<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution%3A+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chem Biol. 23 (1), 137-157 (2016).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+nociceptor+neurons+in+the+spleen+promotes+germinal+center+responses+and+humoral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Innervation of nociceptor neurons in the spleen promotes germinal center responses and humoral immunity.</a> Cell. 187 (12), 2935-2951.e19 (2024).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+sympathetic+innervations+modulate+the+lung+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Local sympathetic innervations modulate the lung innate immune responses.</a> Sci Adv. 6 (20), eaay1497(2020).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Sci Adv. 5 (1), eaau8355(2019).</li>
<li>Bagnoli, S., Terzibasi Tozzini, E., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Brain+clearing+and+immunofluorescence+in+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-Brain clearing and immunofluorescence in Nothobranchius furzeri.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 698-704 (2023).</li>
<li>Lu, T., Shinozaki, M., Nagoshi, N., Nakamura, M., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+of+supraspinal+inputs+to+the+thoracic+and+lumbar+spinal+cord+mapped+by+retrograde+tracing+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">3D imaging of supraspinal inputs to the thoracic and lumbar spinal cord mapped by retrograde tracing and light-sheet microscopy.</a> J Neurochem. 162 (4), 352-370 (2022).</li>
<li>Saritas, T., Puelles, V. G., Su, X. T., Ellison, D. H., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+and+imaging+of+immunolabeled+kidney+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue.</a> J Vis Exp. (149), e60002(2019).</li>
<li>Song, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+mapping+of+single+neurons+by+calibrated+3D+reconstruction+of+brain+slices+reveals+topographic+projection+in+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Precise mapping of single neurons by calibrated 3D reconstruction of brain slices reveals topographic projection in mouse visual cortex.</a> Cell Rep. 31 (8), 107682(2020).</li>
<li>Fournel, R., Veruki, M. L., Hartveit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+reconstruction+and+quantitative+morphometric+analysis+of+bipolar+cells+in+live+rat+retinal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Digital reconstruction and quantitative morphometric analysis of bipolar cells in live rat retinal slices.</a> J Comp Neurol. 530 (10), 1700-1728 (2022).</li>
<li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nat Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li>
<li>Peng, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+histological+assessment+of+prostate+specimens+in+the+three-dimensional+space+by+hydrophilic+tissue+clearing+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Rapid histological assessment of prostate specimens in the three-dimensional space by hydrophilic tissue clearing and confocal microscopy.</a> J Histochem Cytochem. 70 (8), 597-608 (2022).</li>
<li>Singhal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+histomorphometric+changes+in+tissue+architecture+in+relation+to+alteration+in+fixation+protocol+-+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Diagn+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of histomorphometric changes in tissue architecture in relation to alteration in fixation protocol - An in vitro study.</a> J Clin Diagn Res. 10 (8), ZC28-ZC32 (2016).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+landscape+for+tissue+clearing+based+on+hydrophilic+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents.</a> Cell Rep. 24 (8), 2196-2210.e9 (2018).</li>
<li>Lee, S. H., Son, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+wave%2C+late-stage+neuroinflammation+in+cleared+brains+of+aged+5xFAD+Alzheimer%27s+mice+detected+by+macrolaser+light+sheet+microscopy+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Second wave, late-stage neuroinflammation in cleared brains of aged 5xFAD Alzheimer's mice detected by macrolaser light sheet microscopy imaging.</a> Int J Mol Sci. 24 (23), 242317058(2023).</li>
<li>Zhao, J., Lai, H. M., Qi, Y., He, D., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+tissue+clearing+and+the+path+forward+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Current status of tissue clearing and the path forward in neuroscience.</a> ACS Chem Neurosci. 12 (1), 5-29 (2021).</li>
<li>Ou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+optical+transparency+in+live+animals+with+absorbing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules.</a> Science. 385 (6713), eadm6869(2024).</li>
<li>Ou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+optical+transparency+in+live+animals+with+absorbing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules.</a> Science. 385, eadm6869(2024).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Proponowany protokół eksperymentalny polega na wykorzystaniu myszy, których mózgi są połączone z rdzeniem kręgowym znakowanym fluorescencyjnymi wirusami śledzenia neuronów. Protokół ten zawiera wyczerpujące i szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania próbek całego mózgu, które pozostają połączone z rdzeniem kręgowym. Protokół skrupulatnie opisuje każdy krok, zapewniając, że badacze mogą odtworzyć proces z precyzją.
Kilka kluczowych etapów tego protokołu przyczynia się do poprawy jakości o...

Dokładne mapowanie i analiza rozmieszczenia nerwów dostarczają cennych informacji na temat strukturalnej i funkcjonalnej organizacji ośrodkowego układu nerwowego, torując drogę dla innowacyjnych strategii terapeutycznych i zwiększając nasze ogólne zrozumienie mechanizmów neuronalnych. Obecnie brakuje kompleksowych samouczków wideo, które pomogłyby naukowcom w przygotowaniu i ekstrakcji próbek mózgu połączonych z rdzeniem kręgowym oraz osiągnięciu pomyślnego oczyszczenia tkanek.
Dostępnych jest kilka metod oczyszczania tkanek: hydrofobowe, hydrofilowe, oparte na hydrożelu i metody oczyszczania rozszerzania tkanek1,2,3. Technika oczyszczania tkanek jest szeroko stosowana w badaniu narządów, takich jak śledziona4, lungs5, mięsień brzuchaty łydki6, brain7, rdzeń kręgowy8 i nerki9. Nasz protokół dostarczy szczegółowych instrukcji, jak przygotować próbki całego mózgu połączone z rdzeniem kręgowym, które zostały oznaczone markerem fluorescencyjnym przy użyciu myszy szczepu STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J. Będzie zawierał wskazówki krok po kroku dotyczące ekstrakcji próbki i opisze protokół oczyszczania przy użyciu zestawów hydrofilowych do oczyszczania tkanek. Protokół ten pomaga naukowcom opanować cały proces, od pobrania próbki rdzenia mózgowo-rdzeniowego po przygotowanie, a następnie skanowanie. To nie tylko zwiększy wydajność eksperymentów, ale także zapewni integralność i jakość próbek, dostarczając dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych wspierających badania neurobiologiczne.
W porównaniu z konwencjonalnymi metodami cięcia, obrazowania i rekonstrukcji trójwymiarowej10,11, przedstawione tutaj podejście oferuje kilka kluczowych zalet, takich jak (1) zwiększona integralność strukturalna: poprzez zachowanie struktury całego narządu, metoda ta zmniejsza ryzyko utraty krytycznych informacji, które mogą wystąpić podczas sekcji12; (2) Kompleksowe pozyskiwanie danych: zastosowanie zestawu do oczyszczania tkanek pozwala na szczegółowe mapowanie komórek, które są trudne do osiągnięcia przy użyciu tradycyjnych technik; (3) Wydajność i dokładność: Protokół usprawnia cały proces od ekstrakcji próbki do obrazowania, skracając czas wymagany przez procedury immunohistochemiczne lub barwienia oraz minimalizując błędy związane z cięciem i montażem13.
Protokół pokonuje ograniczenia tradycyjnych metod podziału, które często skutkują niekompletnymi i fragmentarycznymi danymi. Zachowując nienaruszone połączenie mózg-rdzeń kręgowy i wykorzystując nowoczesne metody oczyszczania tkanek, protokół ten zapewnia bardziej holistyczne spojrzenie na ośrodkowy układ nerwowy, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia złożonych mechanizmów i funkcji neuronalnych. Podstawowym celem tej metody jest umożliwienie kompleksowego obrazowania ośrodkowego układu nerwowego poprzez przygotowanie próbek całego mózgu połączonych z rdzeniem kręgowym, które zostały znakowane fluorescencyjnymi markerami neuronalnymi. Protokół ten ma na celu ułatwienie szczegółowej wizualizacji struktur nerwowych i rozmieszczenia komórek przy użyciu zaawansowanych metod anatomicznych i technik oczyszczania tkanek.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Shandong Weigao Group Medical Polymer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>502 klej</td> Strzykawka <td>insulinowa Deli Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD</td><td>Becton,Dickinson i&nbsp; Firma</td><td>328421</td><td></td></tr><tr><td>Ząbkowane kleszcze preparacyjne z zębami</td><td>Jinzhong</td><td>JD1050</td><td></td></tr><tr><td>Okrągły stalowy zacisk</td><td>Weili</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>Jinzhong</td><td>y00030</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze hemostatyczne zgięte z zębem</td><td>Jinzhong</td><td>J31020</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze hemostatyczne proste z zębem</td><td>Jinzhong</td><td>J31010</td><td></td></tr><tr><td>Igła infuzyjna 0,7 mm</td><td>Kindly Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linia wagi do kasetonów świetlnych</td><td>Nuohai Life Science</td><td>NH210901</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze proste do mikrodysekcji</td><td>Jinzhong</td><td>WA3020</td><td></td></tr><tr><td>NobeliumSoftware</td><td>Nuohai</td><td>Life Science Oprogramowanie</td><td></td>do skanowania</tr><tr><td>paraformaldehydu</td><td>Biosharp</td><td>BL539A</td><td></td></tr><tr><td>Pompy perystaltyczne</td><td>Nuohai Life Science</td><td>NH1000</td><td></td></tr><tr><td>Głowica pomp perystaltycznych</td><td>Nuohai Life Science</td><td>NH-15</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Shanghai Pharma</td><td>H31022051</td><td></td></tr><tr><td>STOCK Tg (Thy1-EGFP) Myszy szczepu MJrs/J</td><td>Laboratorium Jacksona 007788</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne z prostymi zębami</td><td>Jinzhong</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania tkanek (hirofilny)</td> <td>Nuohai Life Science</td><td>NH-CR-210701</td><td></td></tr><tr><td>Zabieg do hodowli tkankowych 100mm x 20mm</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tkanek</td><td>Jinzhong</td><td>J21040</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Venus</td><td>Jinzhong</td><td>YBC010</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja i oczyszczanie tkanek przygotowanie próbek mysiego rdzenia kręgowego

Extraction and Tissue Clearing Preparation of Mouse Brain-Spinal Cord Samples

Badania neurobiologiczne skoncentrowane na centralnym układzie nerwowym wymagają dogłębnego zrozumienia różnych czynników, w tym rozmieszczenia komórek, połączeń neuronalnych i dynamiki molekularnej. Tradycyjne metodologie badania całego mózgu i rdzenia kręgowego często obejmują izolację, cięcie i skanowanie wycinków tkanki, a następnie pracochłonny proces trójwymiarowej rekonstrukcji obrazu. To konwencjonalne podejście może być zarówno czasochłonne, jak i kłopotliwe. Postępy w technikach oczyszczania tkanek i obrazowania całych narządów zrewolucjonizowały analizę całego mózgu i rdzenia kręgowego. Aby zmaksymalizować potencjał tych innowacyjnych metod, konieczne jest pobranie i usunięcie próbek mózgu przy jednoczesnym zachowaniu ich połączenia z rdzeniem kręgowym. Protokół ten zawiera szczegółowy i systematyczny przewodnik dotyczący przygotowywania próbek mózgu połączonego z rdzeniem kręgowym, przedstawiający procedury ekstrakcji i oczyszczania. Usprawniając te procesy, podejście to znacznie zwiększa wydajność eksperymentów i integralność danych, wspierając w ten sposób postęp w badaniach neurobiologicznych i umożliwiając bardziej kompleksowe badania złożoności ośrodkowego układu nerwowego.

Niniejszy protokół umożliwia skuteczną izolację całego mózgu wraz z rdzeniem kręgowym u samców myszy linii STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J. Procedura ta sprawia również, że próbki stają się przezroczyste, co zapewnia pełne zachowanie i zarejestrowanie sygnałów fluorescencyjnych, dostarczając wyraźne i szczegółowe obrazy przy zachowaniu integralności oryginalnej fluorescencji.
Rysunek 1 przedstawia niena...

To badanie przedstawia protokół ekstrakcji i przygotowania oczyszczonych próbek całego mózgu i rdzenia kręgowego z zachowanymi sygnałami fluorescencyjnymi, zwiększając wydajność eksperymentu i integralność danych w celu przyspieszenia badań neurobiologicznych.

Ekstrakcja i oczyszczanie tkanek Przygotowanie próbek mysiego rdzenia kręgowego

Neuroscience research focused on the central nervous system necessitates a thorough understanding of various factors, including cell distribution, ...

Nasze badania koncentrują się na tym, w jaki sposób ośrodkowy układ nerwowy pośredniczy w funkcjach poznawczych i współdziała z układem odpornościowym. Naszym celem jest udoskonalenie metod badania mózgu i rdzenia kręgowego, odpowiadając na fundamentalne pytania dotyczące tych interakcji. Metody te utrzymują cały mózg i rdzeń kręgowy w stanie nienaruszonym, co pomaga nam dokładniej mapować komórkę za pomocą oczyszczania tkanek. Sprawia również, że proces jest szybszy i dokładniejszy, skracając czas i zmniejszając liczbę błędów w porównaniu z tradycyjnymi metodami cięcia i obrazowania.Zmapowaliśmy mózg i obszary rdzenia kręgowego połączone z płucami, uzyskując . Nasze badania skupią się na zbadaniu komunikacji neuroimmunologicznej między mózgiem, rdzeniem kręgowym i płucami. I jak ta interakcja wpływa na odpowiedź immunologiczną.[Instruktor] Na początek przymocuj kończyny myszy do szerokiej akrylowej tablicy za pomocą stalowych zacisków. Za pomocą nożyczek przetnij skórę między dwiema kośćmi udowymi i kontynuuj cięcie w górę, aż dojdziesz do przepony. Otwórz obie strony klatki piersiowej przez przeponę, używając nożyczek i prostych kleszczy, aby odsłonić serce. Wprowadzić igłę infuzyjną o średnicy 0,7 milimetra przymocowaną do rurki perfuzyjnej do lewej komory i wykonać nacięcie o średnicy od jednego do dwóch milimetrów w wyrostku prawego przedsionka. Po perfuzji oddziel skórę na grzbiecie i głowie myszy za pomocą nożyczek okulistycznych. Przeciąć kręgosłup w miejscu, w którym linia łącząca górne tylne krawędzie obu kończyn przecina się z kręgosłupem. Usuń tkankę mięśniową i tłuszczową z szyi i grzbietu myszy, aby odsłonić kręgosłup i czaszkę. Nożyczkami żylnymi przeciąć wzdłuż szczeliny linii środkowej między lewą i prawą stroną kręgosłupa i rdzenia kręgowego od dolnego końca kanału kręgowego. Następnie usuń górną część i obustronne strony odciętego kręgosłupa, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Powtarzaj kroki, aż dotrzesz do połączenia mózgowego. Umieść końcówkę jednego ostrza nożyc żylnych między otworem wielkim a mózgiem. Przesuń i przetnij wzdłuż szwu śródstrzałkowego, aby otworzyć czaszkę. Użyj kleszczy, aby usunąć czaszkę i odsłonić mózg. Teraz za pomocą kleszczy i nożyczek żylnych usuń tkankę rdzenia kręgowego mózgu myszy z końca czaszki. Użyj kleszczy preparacyjnych, aby usunąć błonę rdzenia kręgowego pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie, za pomocą szwów, przymocuj próbkę rdzenia kręgowego mózgu do płytki mocującej. Dodać co najmniej 20-krotność objętości próbki wynoszącej 4% paraformaldehydu. Po utrwaleniu wyrzucić paraformaldehyd i trzykrotnie przemyć próbkę PBS. Na początek umocuj wyekstrahowany rdzeń kręgowy mózgu myszy w paraformaldehydzie. W przypadku roztworu do usuwania lipidów należy zmieszać roztwory A i B w stosunku masowym dziewięć do jednego. Dodaj 50 mililitrów roztworu do usuwania lipidów do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i umieść w niej utrwaloną tkankę. Po inkubacji w roztworze C zmienić roztwór i umieścić szalkę hodowlaną z próbką całkowicie zanurzoną w roztworze C na kasecie świetlnej z linią skali. Aby przygotować roztwór żelu, dodaj 147 gramów roztworu C i trzy gramy agarozy do szklanej butelki o pojemności 200 mililitrów. Dobrze wymieszaj składniki za pomocą pręta mieszającego, a następnie podgrzewaj w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. Przenieś roztwór żelu do pieca laboratoryjnego ustawionego na 37 stopni Celsjusza. Wlej do formy głęboką na dwa milimetry warstwę roztworu żelu hartowanego o temperaturze 37 stopni Celsjusza i schładzaj go w lodówce o czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut, aż stanie się półstały. Umieść próbkę o dopasowanym współczynniku załamania światła w formie i dodaj roztwór żelu do poziomu lub nieco poniżej górnej części próbki. Umieść formę z powrotem w lodówce o czterech stopniach Celsjusza na dwie godziny. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i ponownie wstaw do lodówki. Usuń szkiełko nakrywkowe pęsetą i wyjmij osadzoną próbkę. Dodaj 30 mililitrów roztworu do obrazowania do 50-mililitrowej probówki i zanurz próbkę w roztworze. Nałożyć klej 502, aby mocno przymocować próbkę do uchwytu próbki, przed zamocowaniem uchwytu na urządzeniu do obrazowania. Uruchom oprogramowanie do skanowania i wybierz poziom powiększenia 4X w sekcji powiększenia. Kliknij przycisk kalibracji, aby aktywować tryb kalibracji. Kliknij przycisk podglądu, aby przejść do trybu podglądu. Następnie kliknij przycisk ruchu w kierunku Z, aby powoli przesuwać próbkę w górę od dna komory próbki, aż wygenerowany arkusz świetlny przejdzie przez próbkę. Wybierz odpowiedni kanał laserowy i opcję trybu oświetlenia. Wybierz kierunek ścieżki skanowania dla próbki. Kliknij przycisk automatycznego skanowania, aby rozpocząć przechwytywanie obrazów próbki. Protokół z powodzeniem zachował cały mózg myszy i rdzeń kręgowy, zachowując nienaruszone sygnały fluorescencyjne w celu uzyskania wyraźnego obrazowania. Obrazowanie fluorescencyjne próbki rdzenia kręgowego mózgu wyraźnie uwidoczniło szczegółowe struktury neuronalne. Obrazy w większym powiększeniu zapewniły lepszą wizualizację pojedynczych komórek znakowanych fluorescencyjnie.

extraction-tissue-clearing-preparation-mouse-brain-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy protokół perfuzji transkardiakalnej u myszy, usuwania i sekcjonowania mózgu, a także barwienia immunoperoksydazowego, zatapiania w żywicy i przygotowywania ultracienkich przekrojów z sekcji mózgu. Po zakończeniu tych procedur materiał poddany immunobarwieniu jest gotowy do badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgu myszy do immunoelektromikroskopii

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Opisano metodę przygotowania translacyjnie aktywnych, nienaruszonych synaptoneurosomów (SNs) z kory mózgu myszy. Metoda ta wykorzystuje nieciągły gradient gęstości Percoll-sukroza, co umożliwia szybkie przygotowanie aktywnych SNs.

Przygotowanie synaptoneurosomów z kory mózgu myszy z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sukroza

Mikroskopia wielofotonowa całych organów myszy jest możliwa dzięki optycznemu klarowaniu organu przed obrazowaniem, jednak nie wszystkie protokoły zachowują sygnał fluorescencyjny białek fluorescencyjnych. Stosując metodę klarowania optycznego z dehydratacją opartą na etanolu oraz klarowaniem za pomocą mieszaniny alkoholu benzylowego i benzojanu benzylowego, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe całego mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP.

Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją YFP

Ten film przedstawia szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący przygotowania zamrożonych skrawków tkanki mózgowej myszy do dalszych analiz.

Przetwarzanie mózgu myszy do dalszej analizy

Źródło: Pekarek, B. T., et. al., Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)W tym filmie pokazujemy przygotowanie, obrazowanie i analizę oczyszczonego mózgu myszy w celu zbadania dendrytycznych altan dendrytycznych, morfologii kręgosłupa i rozmieszczenia neuronów przy użyciu mikroskopii konfokalnej i technik rekonstrukcji 3D.

Obrazowanie mikroskopem konfokalnym nienaruszonych altan dendrytycznych i morfologii kręgosłupa w oczyszczonym mózgu myszy

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Tutaj prezentujemy protokół hydraulicznego wytłaczania rdzenia kręgowego, jak również identyfikacji i izolacji specyficznych zwojów korzenia grzbietowego (DRG) u tego samego gryzonia. W porównaniu ze standardowymi metodami izolacji rdzenia kręgowego, metoda ta jest znacznie szybsza i zmniejsza ryzyko uszkodzenia tkanek.

Hydrauliczne wytłaczanie rdzenia kręgowego i izolacja zwojów korzenia grzbietowego u gryzoni

Ten artykuł przedstawia dwa zoptymalizowane protokoły badania rezydentnych i obwodowo pochodzących komórek odpornościowych w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym mózgu, rdzeniu kręgowym i oponach mózgowych. Każdy z tych protokołów pomaga ustalić funkcję i skład komórek zajmujących te przedziały w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych.

Izolowanie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i związanych z nimi opon mózgowych w celu dalszej analizy komórek odpornościowych

Neuronalna morfologia dendrytyczna często leży u podstaw funkcji. Rzeczywiście, wiele procesów chorobowych, które wpływają na rozwój neuronów, objawia się fenotypem morfologicznym. Protokół ten opisuje prostą i potężną metodę analizy nienaruszonych altan dendrytycznych i związanych z nimi kolców.

Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek w ramach projektu CLARITY

Ten protokół opisuje skuteczne i powtarzalne podejście do badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzję, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montowanie tkanek i obrazowanie.

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Poznaj protokół ekstrakcji i oczyszczania tkanek rdzenia kręgowego myszy z zachowaniem sygnałów fluorescencyjnych. Ta metoda umożliwia szczegółowe mapowanie struktur nerwowych w badaniach neuroimmunologicznych.

Ekstrakcja i oczyszczanie tkanek Przygotowanie próbek mysiego rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów