Name: Strategia podwójnej interferencji CRISPR do celowania w syntetyczne śmiertelne interakcje między niekodującymi RNA w komórkach nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj strategię podwójnej interferencji CRISPR do celowania w długie niekodujące RNA w komórkach czerniaka. Ta metoda umożliwia kombinatoryczne wyciszanie genów i identyfikację syntetycznych interakcji śmiertelnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Stefanowi Raunserowi (Instytut Fizjologii Molekularnej im. Maxa Plancka, Dortmund) za dostęp do przestrzeni laboratoryjnej poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2. Specjalne podziękowania dla Erica Wanga za jego wkład intelektualny oraz dla wszystkich byłych i obecnych członków laboratorium Imig za ich cenne dyskusje. Jochen Imig jest obecnie finansowany przez CGCIII przez firmę Pfizer Inc. w CGC III.

Ludzka linia komórkowa czerniaka 501-mel (RRID: CVCL_4633) została dzięki uprzejmości Laboratorium Aifantis (Uniwersytet Nowojorski). Linia komórkowa Lenti-X 293T HEK została zakupiona od Takara Bio. Te linie komórkowe hodowano w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w sterylnych warunkach. Komórki były pasażowane, aż osiągnęły 80%-90% konfluencji. Linie komórkowe były regularnie badane pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą.
1. Projektowanie gRNA za pomocą internetowej platformy do projektowania gRNA
<ol>
	<li>Zaprojektuj jedno gRNA specyficzne dla SpCas9 i jedno gRNA specyficzne dla SaCas9 dla każdego docelowego lncRNA, aby ocenić, który wariant daje lepsze wyniki knockdownu.</li>
	<li>Celuj w pożądane lncRNA, tutaj RP11-120D5.1 (RP11) i XLOC_030781 (XLOC), używając najbardziej wydajnego gRNA dla każdego S. pyogenes (gRNA-sp) Cas9 i S. aureus (gRNA-sa) Cas9. 
	UWAGA: GRNA S. pyogenes można wyekstrahować z Petroulia et al.28.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z zaleceniami specyficznymi dla lokalizacji, aby nadać priorytet najwyższej aktywności na celu, wyrażonej przez wysokie wyniki w zakresie celu, jednocześnie minimalizując dopasowania poza celem, zgodnie z sugestiami narzędzi do projektowania gRNA.
	<ol>
		<li>Wybierz genom GRCh38 (hg, Homo sapiens). Wybierz lokację PAM dla określonego SpCas9 (NGG) i SaCas9 (NNGRRT).</li>
		<li>Użyj metody punktacji off-target od Hsu et al.29. Umieść gRNA w oknie od -150 pz do +50 pz wokół miejsca rozpoczęcia transkrypcji, aby uzyskać optymalną wydajność.</li>
		<li>Wybierz gRNA z najwyższym wynikiem on-target i off-target (patrz Tabela uzupełniająca 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połącz niecelujące lub zaszyfrowane kontrolne gRNA, tutaj przeciwko Rosa26, z każdym docelowym gRNA, aby utworzyć podwójny wektor gRNA, ukierunkowany na jeden lncRNA. Połączenie docelowych gRNA w jednym plazmidzie umożliwia specyficzną dla miejsca modyfikację obu miejsc docelowych. 
	UWAGA: Podwójny wektor gRNA zawierający kontrolne gRNA i docelowe gRNA umożliwia knockdown jednego docelowego lncRNA, podczas gdy podwójne wektory gRNA zawierające gRNA skierowane do miejsc umożliwiają jednoczesne knockdown docelowych lncRNA.</li>
</ol>
2. klonowanie gRNA
<ol>
	<li>Wykonaj PCR z rozszerzeniem nakładania się przy użyciu dwóch fragmentów DNA zawierających sekwencję gRNA. Użyj startera do przodu U6 i startera wstecznego H1 (patrz Tabela Uzupełniająca 2) do amplifikacji, zgodnie z opisem Najm et al.27.
	<ol>
		<li>Przygotuj 50 μl reakcji PCR z 25 μl 2x wysokiej jakości mieszanki wzorcowej PCR z buforem HF i 1 μl każdego fragmentu DNA zawierającego gRNA S. pyogenes lub S. aureus. Reakcję należy przeprowadzić w następujących warunkach cyklicznych: początkowa denaturacja w temperaturze 98 °C przez 30 s, następnie 15 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 5 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 10 s i wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 15 s.</li>
		<li>Dodać 2,5 μl startera U6 i 2,5 μl startera odwrotnego H1 po zakończeniu początkowych 15 cykli i poddać reakcję dodatkowym 20 cyklom w tych samych warunkach, z końcowym przedłużeniem przez 5 minut w temperaturze 72 °C.</li>
		<li>Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Trawić 1 μg zmodyfikowanego plazmidu przy użyciu 1 μl enzymu restrykcyjnego BsmB1 i 1 μl 10x buforu przez 30 minut w temperaturze 37 °C w reakcji 10 μl.</li>
		<li>Sklonuj produkty PCR do strawionego plazmidu dual-gRNA-Zeo-GFP (patrz rysunek uzupełniający 1 i plik uzupełniający 1) przy użyciu protokołu reakcji składania DNA HiFi, jak opisano w innych30.</li>
		<li>Przekształć chemicznie kompetentne komórki E. coli, mieszając 50 μl kultury bakterii z 4 μl produktu montażowego zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Produkcja lentiwirusa
UWAGA: Z aktywnymi lentiwirusami należy radzić sobie na wszystkich etapach, przestrzegając odpowiednich wytycznych bezpieczeństwa. Zawsze wykonuj pracę z wirusami w szafie bezpieczeństwa klasy 2, aby zapobiec zagrożeniom związanym z nieuniknionym tworzeniem się aerozoli. Wszystkie prace poza szafą bezpieczeństwa, takie jak wirowanie, należy wykonywać w szczelnych pojemnikach aerozolowych i wirnikach zatwierdzonych do stosowania z organizmami grupy ryzyka 2. Przez cały czas przebywania w miejscu pracy należy nosić odpowiednią odzież ochronną, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice jednorazowe i okulary ochronne. Powierzchnie robocze muszą być potraktowane roztworem dezynfekującym, a inne odpady muszą być również potraktowane roztworem dezynfekującym, aby mogły pozostać w szczelnie zamkniętej szafce w świetle UV przez co najmniej 240 minut. Zużyte pipety serologiczne i końcówki do pipet należy przepłukać w roztworze dezynfekującym przed wyrzuceniem do butelek nadających się do sterylizacji w autoklawie. Następnie odpady należy wyrzucić do pojemnika na odpady S2. Odpady S2 zostaną dezaktywowane w autoklawie. Transdukowane linie komórkowe mogą być przetwarzane w warunkach S1 nie wcześniej niż 2 dni po transdukcji i tylko po co najmniej dwóch pełnych zmianach pożywki hodowlanej na pożywkę wolną od wirusa.
<ol>
	<li>Policz komórki Lenti-X 293T HEK mieszając 10 μl komórek z 10 μl roztworu błękitu trypanowego w hemocytometrze. Płytka 4 x 106 komórek Lenti-X 293T HEK na płytkę 10 cm, aby osiągnąć ~80% zbieżności następnego dnia.</li>
	<li>Pracuj w laboratorium klasy 2 od tego kroku. Zmieszać 500 μl odpowiedniego podłoża transfekcyjnego z wektorem transferowym 11,25 μg SpdCas9-KRAB-MeCP2 (patrz plik uzupełniający 2), plazmidem otoczkowym VSV-G o masie 5,5 μg i wektorem pPAX2 o grubości 16,5 μg. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dla drugiego wariantu dCas9 należy użyć wektora transferu SadCas9-KRAB-MeCP2 (patrz plik uzupełniający 3).</li>
	<li>W osobnej probówce zmieszać 500 μl pożywki o obniżonej surowicy z 36 μl odczynnika PEI (podstawówka: 1 mg/ml). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Połącz mieszaniny i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie dodawać mieszaninę kroplami do pożywki komórkowej (6 ml) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Upewnij się, że komórki pozostają połączone, aby uniknąć zmniejszenia wydajności lentiwirusa.</li>
	<li>Po 12-15 godzinach wyrzucić pożywkę do autoklawowalnej butelki na odpady za pomocą pipety serologicznej. Od teraz należy płukać materiały eksploatacyjne, w tym pipety serologiczne i końcówki do pipet, roztworem dezynfekującym przed wyrzuceniem ich do odpadów autoklawu. Dodać 5 ml świeżej pożywki DMEM do transfekowanych komórek za pomocą nowej pipety.</li>
	<li>Pobrać lentiwirusy, przenosząc supernatant za pomocą pipety serologicznej do probówki kanonicznej o pojemności 50 ml 48 godzin po transfekcji. Przechowuj probówkę kanoniczną w lodówce. Dodać 5 ml świeżej pożywki do komórek i inkubować komórki przez kolejne 24 godziny.</li>
	<li>Powtórzyć pobieranie lentiwirusów, przenosząc supernatant do tej samej probówki kanonicznej o pojemności 50 ml zawierającej pierwszy pobior. Ponownie dodać 5 ml świeżej pożywki, inkubować przez 24 godziny, a następnie przenieść supernatant do probówki kanonicznej o pojemności 50 ml. Połączone supernatanty z pierwszego, drugiego i trzeciego zbioru przechowywać w probówce kanonicznej o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C do czasu filtracji i odwirowania.</li>
	<li>Odwirować złożony sklarowany supernatant przez 5 minut w temperaturze 500 x g i temperaturze 4 °C w aerozolowych pojemnikach i wirnikach zatwierdzonych do stosowania z organizmami należącymi do grupy ryzyka 2 do osadzania oderwanych komórek i szczątków. Przefiltrować supernatant przez sterylne filtry strzykawkowe 0,2 μm do hodowli komórek.</li>
	<li>Stężyć przefiltrowany supernatant w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 4 °C, używając odśrodkowego zespołu filtrującego o odpowiedniej wartości granicznej masy cząsteczkowej od 100 kDa do około 500 μl. Przechowywać porcje wirusa o objętości 50-100 μl w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
4. Transdukcja lentiwirusa i selekcja stabilnych transfekowanych komórek
UWAGA: Zawsze wykonuj pracę z wirusami w szafie bezpieczeństwa klasy 2.
<ol>
	<li>Umieścić komórki 501-mel na płytce 6-dołkowej w proporcji 2 x 105 komórek/basenik z końcową objętością kultury 2 ml, 1 dzień przed transdukcją.</li>
	<li>Zastąp pożywkę hodowlaną 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM uzupełnionej polibrenem o końcowym stężeniu 6 μg/ml.</li>
	<li>Od teraz wymagana jest praca w laboratorium klasy 2. Dodać jednocześnie do komórek 50 μl lentiwirusów zawierających SpdCas9-KRAB-MeCP2 i SadCas9-KRAB-MeCP2 do komórek. Wypłucz materiały eksploatacyjne, w tym pipety serologiczne i końcówki do pipet, roztworem dezynfekującym przed wyrzuceniem ich do odpadów autoklawu. Delikatnie wstrząsnąć płytką i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 . </li>
	<li>Wylać pożywkę do butelki nadającej się do sterylizacji w autoklawie za pomocą pipety serologicznej i dodać 2 ml świeżej pożywki zawierającej blastycydynę (10 μg/ml) i puromycynę (2 μg/ml) 16 godzin po transdukcji.</li>
	<li>Kontynuuj selekcję, zastępując pożywkę świeżą pożywką o pojemności 2 ml zawierającą blasticydynę (10 μg/ml) i puromycynę (2 μg/ml) po 2 dniach. Z transdukowanymi komórkami należy obchodzić się w warunkach S1 po 7 dniach od transdukcji. 
	UWAGA: Selekcja antybiotyków musi być przeprowadzana do momentu, gdy wszystkie nietransdukowane komórki kontrolne umrą. Alternatywne strategie selekcji mogą być stosowane w zależności od kasety rezystancyjnej w wektorze przenoszenia. W razie potrzeby zoptymalizuj stężenia antybiotyków za pomocą krzywej zabijania. Szczegółowa selekcja klonów pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej lub seryjnego rozcieńczania i posiewu, a następnie kwantyfikacja białek, może być wymagana w celu uzyskania populacji komórek, które wyrażają fuzje dCas9 na wystarczających poziomach.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja białek i analiza Western blot
<ol>
	<li>Policz stabilne transfekowane komórki 501-mel, mieszając 10 μl komórek z 10 μl roztworu błękitu trypanowego w hemocytometrze. Odwirować 1 x 106 komórek przez 5 minut w temperaturze 500 x g i 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 μl buforu RIPA zawierającego inhibitory proteazy. Inkubować na lodzie przez 15 minut i usuwać resztki komórek przez odwirowywanie w temperaturze 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przechowywać supernatant w temperaturze -20 °C lub natychmiast użyć do ilościowego oznaczania białka, zgodnie z opisem innych31.</li>
	<li>Wymieszaj 10 μg białka z 4 x buforem LDS, 50 mM DTT i napełnij do 20 μl wodą destylowaną. Oddziel białka na 10% żelu separacyjnym za pomocą SDS-PAGE na bazie Tris/glicyny pod napięciem 135 V przez 1 godzinę, jak opisano wcześniej32. Przenieś białka do membrany PVDF pod napięciem 90 V przez 90 minut z transferem w mokrym zbiorniku.</li>
	<li>Inkubować błonę w buforze blokującym (5% beztłuszczowego mleka w TBS-T) przez 1 godzinę przy 180 obr./min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać mysie przeciwciało monoklonalne anty-GAPDH w proporcji 1:10 000 do bufora blokującego jako kontrolę wewnętrzną. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało anty-Cas9 (S. pyogenes) lub anty-Cas9 (S. aureus) w rozcieńczeniu 1:1000 do buforu blokującego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Przemyć membranę 3x buforem TBST przez 10 min każdy. Inkubować z drugorzędowym przeciwciałem anty-mysim HRP (1:10 000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myć 3x buforem TBST przez 10 min każdy. Wykrywanie sygnałów za pomocą substratu ECL i systemu obrazowania.</li>
</ol>
6. Test żywotności podwójnej represji LncRNA
UWAGA: Zawsze wykonuj pracę z wirusami w szafie bezpieczeństwa klasy 2.
<ol>
	<li>Nasiona 0,1 x 105 komórek zawierających stabilne transfekowane SadCas9-KRAB i SpdCas9-KRAB 7 dni po transdukcji na 96-dołkowej płytce w 100 μl wstępnie podgrzanego podłoża DMEM 1 dzień przed transdukcją.</li>
	<li>W dniu transdukcji zastąpić pożywkę hodowlaną 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki DMEM uzupełnionej polibrenem o końcowym stężeniu 6 μg/ml. Od teraz wymagana jest praca w laboratorium klasy 2. Dodać odpowiednią ilość lentiwirusów do komórek. 
	UWAGA: Objętość lentiwirusów zawierających podwójny wektor gRNA musi być zbadana za pomocą GFP w celu wygenerowania krzywej liniowej poprzez miareczkowanie lentiwirusów.</li>
	<li>Zastąp pożywkę świeżą pożywką zawierającą 500 μg/ml zeocyny, 5 μg/ml blasticydyny i 1 μg/ml puromycyny 16 godzin po transdukcji.</li>
	<li>Wykonaj detekcję luminescencji 5 dni po transdukcji za pomocą testu żywotności komórek zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Szcześniak, M. W., Wanowska, E., Mukherjee, N., Ohler, U., Makałowska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+deeper+annotation+of+human+lncRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Gene+Regul+Mech%22%5BJournal%5D)">Towards a deeper annotation of human lncRNAs.</a> Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 1863 (4), 194385(2020).</li>
<li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NONCODEV5%3A+a+comprehensive+annotation+database+for+long+non-coding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs.</a> Nucl Acids Res. 46 (D1), D308-D314 (2018).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+lncRNAs+contributed+critically+to+human+evolution+by+distinctly+regulating+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human-specific lncRNAs contributed critically to human evolution by distinctly regulating gene expression.</a> eLife. 12, RP89001.2(2023).</li>
<li>Sarropoulos, I., Marin, R., Cardoso-Moreira, M., Kaessmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+dynamics+of+lncRNAs+across+mammalian+organs+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental dynamics of lncRNAs across mammalian organs and species.</a> Nature. 571 (7766), 510-514 (2019).</li>
<li>Melé, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genomics.+The+human+transcriptome+across+tissues+and+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human genomics. The human transcriptome across tissues and individuals.</a> Science. 348 (6235), 660-665 (2015).</li>
<li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li>
<li>Liu, S. J., Dang, H. X., Lim, D. A., Feng, F. Y., Maher, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs in cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 21 (7), 446-460 (2021).</li>
<li>Ahmad, M., Weiswald, L. B., Poulain, L., Denoyelle, C., Meryet-Figuiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+lncRNAs+in+cancer+cells+migration%2C+invasion+and+metastasis%3A+cytoskeleton+and+ECM+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of lncRNAs in cancer cells migration, invasion and metastasis: cytoskeleton and ECM crosstalk.</a> J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 173(2023).</li>
<li>Jain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncPRESS1+Is+a+p53-Regulated+LncRNA+that+Safeguards+Pluripotency+by+Disrupting+SIRT6-Mediated+De-acetylation+of+Histone+H3K56%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">LncPRESS1 Is a p53-Regulated LncRNA that Safeguards Pluripotency by Disrupting SIRT6-Mediated De-acetylation of Histone H3K56.</a> Mol Cell. 64 (5), 967-981 (2016).</li>
<li>Bergmann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+ESC+transcriptome+by+nuclear+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of the ESC transcriptome by nuclear long noncoding RNAs.</a> Genome Res. 25 (9), 1336-1346 (2015).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LincRNA-p21+suppresses+target+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">LincRNA-p21 suppresses target mRNA translation.</a> Mol Cell. 47 (4), 648-655 (2012).</li>
<li>Huarte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+lncRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging role of lncRNAs in cancer.</a> Nat Med. 21 (11), 1253-1261 (2015).</li>
<li>Badowski, C., He, B., Garmire, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-derived+lncRNAs+as+biomarkers+for+cancer+diagnosis%3A+the+Good%2C+the+Bad+and+the+Beauty%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precis+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blood-derived lncRNAs as biomarkers for cancer diagnosis: the Good, the Bad and the Beauty.</a> NPJ Precis Oncol. 6 (1), 40(2022).</li>
<li>Zong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+nuclear-retained+long+noncoding+RNAs+using+modified+DNA+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Knockdown of nuclear-retained long noncoding RNAs using modified DNA antisense oligonucleotides.</a> Meth Mol Biol. 1262, 321-331 (2015).</li>
<li>Gagnon, K. T., Li, L., Chu, Y., Janowski, B. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+factors+are+present+and+active+in+human+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">RNAi factors are present and active in human cell nuclei.</a> Cell Rep. 6 (1), 211-221 (2014).</li>
<li>Zeng, Y., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+human+cells+is+restricted+to+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm.</a> RNA. 8 (7), 855-860 (2002).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+noncoding+RNA+editing+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated noncoding RNA editing in human cancers.</a> RNA Biol. 15 (1), 35-43 (2018).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+noncoding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells.</a> Science. 355 (6320), aah7111(2017).</li>
<li>Tsung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi+screen+of+long+non-coding+RNAs+identifies+LINC03045+regulating+glioblastoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">CRISPRi screen of long non-coding RNAs identifies LINC03045 regulating glioblastoma invasion.</a> PLoS Genet. 20 (6), e1011314(2024).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+tool+for+the+job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the right tool for the job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).</li>
<li>Yeo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+CRISPR+repressor+for+targeted+mammalian+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation.</a> Nat Meth. 15 (8), 611-616 (2018).</li>
<li>Parrish, P. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+synthetic+lethal+and+tumor+suppressor+paralog+pairs+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Discovery of synthetic lethal and tumor suppressor paralog pairs in the human genome.</a> Cell Rep. 36 (9), 109597(2021).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthologous+CRISPR-Cas9+enzymes+for+combinatorial+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Orthologous CRISPR-Cas9 enzymes for combinatorial genetic screens.</a> Nat Biotechnol. 36 (2), 179-189 (2018).</li>
<li>Petroulia, S., et al. CRISPR-inhibition screen for lncRNAs linked to melanoma growth and metastasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetroulia%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>New England Biolabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NEBuilder+HiFi+DNA+Assembly+Reaction+%28E2621%29+v2%22">NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction (E2621) v2</a>. , (2020).</li>
<li>Cortés-Ríos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quantification+by+bicinchoninic+acid+%28BCA%29+assay+follows+complex+kinetics+and+can+be+performed+at+short+incubation+times%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times.</a> Anal Biochem. 608, 113904(2020).</li>
<li>Junior, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJunior%2C+N+%22Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+%28SDS-PAGE%29+v1%22">Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) v1</a>. , (2019).</li>
<li>Chen, X., Liu, J., Janssen, J. M., Gonçalves, M. A. F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+structure+differentially+impacts+high-specificity+CRISPR-Cas9+Nuclease+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">The chromatin structure differentially impacts high-specificity CRISPR-Cas9 Nuclease strategies.</a> Mol Ther Nucl Acids. 8, 558-563 (2017).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230.e10 (2021).</li>
<li>Daer, R. M., Cutts, J. P., Brafman, D. A., Haynes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+chromatin+dynamics+on+Cas9-Mediated+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Syn+Biol%22%5BJournal%5D)">The impact of chromatin dynamics on Cas9-Mediated genome editing in human cells.</a> ACS Syn Biol. 6 (3), 428-438 (2017).</li>
<li>Chavez, M., Rane, D. A., Chen, X., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+of+large+transgenes+via+the+knock-in+of+an+integrase-deficient+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Stable expression of large transgenes via the knock-in of an integrase-deficient lentivirus.</a> Nat Biomed Eng. 7 (5), 661-671 (2023).</li>
<li>Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+and+variegation+of+gammaretrovirus+and+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Silencing and variegation of gammaretrovirus and lentivirus vectors.</a> Human Gene Ther. 16 (11), 1241-1246 (2005).</li>
<li>Shrestha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+epigenetics+guided+identification+of+tissue-specific+genomic+safe+harbors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomics and epigenetics guided identification of tissue-specific genomic safe harbors.</a> Genome Biol. 23 (1), 199(2022).</li>
<li>Chu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfection+and+induction+of+apoptosis+in+melanoma+cells+by+branched+poly%28%CE%B2-amino+ester%29s+with+uniformly+distributed+branching+units%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfection and induction of apoptosis in melanoma cells by branched poly(β-amino ester)s with uniformly distributed branching units.</a> J Control Release. 367, 197-208 (2024).</li>
<li>Han, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+is+a+highly+effective+gene+transfer+techfnique+for+human+melanoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Nucleofection is a highly effective gene transfer techfnique for human melanoma cell lines.</a> Exp Dermatol. 17 (5), 405-411 (2008).</li>
</ol>

Jochen Imig jest obecnie finansowany przez CGCIII przez Pfizer Inc. CGCIII jest sponsorowany przez Pfizer Inc., Merck KGaA i AstraZeneca PLC. Sponsorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu, wykonywaniu, interpretacji ani pisaniu badania. Wszyscy autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym badaniu wdrożyliśmy strategię celowania w podwójny lncRNA w komórkach czerniaka przy użyciu CRISPRi na bazie dCas9-KRAB-MeCP2 z dwóch ortogonalnych gatunków. Wykorzystując ten system, udało nam się stłumić syntetyczną śmiertelną parę lncRNA, RP11 i XLOC, co doprowadziło do zwiększonej śmierci komórki, w przeciwieństwie do sytuacji, gdy były one tłumione indywidualnie. Jednak systemy CRISPRi niosą ze sobą ryzyko represji genów poza celem, co może mieć wpływ na interpretację wyników. Chociaż walidacja eksperymentalna nie została przeprowadzona, zminimalizowaliśmy potencjalne efekty poza celem podczas projektowania gRNA in silico.
Zmienność wydajności transdukcji może mieć wpływ na odtwarzalność. W związku z tym zoptymalizowaliśmy transdukcję, stosując równe ilości lentiwirusów, określone za pomocą standardowej kalibracji krzywej przy użyciu różnych stężeń lentiwirusa. Jednak zwiększony rozmiar ładunku nowo zaprojektowanego wektora może nakładać ograniczenia na wydajność pakowania lentiwirusa, potencjalnie zmniejszając wydajność transdukcji, szczególnie w trudnych do transdukcji liniach komórkowych. W rezultacie, osiągnięcie wystarczającej transdukcji i silnej ekspresji dCas9 może w niektórych przypadkach wymagać wysokich mian wirusa. Dodatkowo, niewystarczający knockdown można obejść poprzez częste monitorowanie poziomów białka dCas9-KRAB-MeCP2 i ekspresji RNA docelowych lncRNA. Alternatywnie dostępne są wersje dCas9 z tylko jednym systemem represorów, aby przezwyciężyć to ograniczenie, jednak kosztem zmniejszonej wydajności25.
Tylko kombinacja XLOC-sa-RP11-sp wykazała udaną aktywność, podczas gdy odwrotna konfiguracja XLOC-sp-RP11-sa była nieskuteczna. Prawdopodobnym wyjaśnieniem tej różnicy w skuteczności knockdown jest wzajemne oddziaływanie między swoistością PAM a dostępnością chromatyny33. Biorąc pod uwagę, że SaCas9 i SpCas9 rozpoznają odrębne sekwencje PAM, miejsce docelowe dla SpCas9 w orientacji XLOC-sp-RP11-sa może nie mieć optymalnego PAM, zmniejszając w ten sposób jego powinowactwo wiązania i późniejszą aktywność. Co więcej, przestrzenne rozmieszczenie dwóch wariantów białka fuzyjnego dCas9 może wpływać na architekturę i dostępność chromatyny34,35, potencjalnie ograniczając rekrutację maszynerii transkrypcyjnej lub powiązanych czynników regulacyjnych w konfiguracji XLOC-sp-RP11-sa. Odkrycia te sugerują, że względne umiejscowienie SaCas9 i SpCas9 w danym kontekście genomowym może krytycznie wpłynąć na ich skuteczność funkcjonalną, co uzasadnia dalsze badania nad zoptymalizowanymi strategiami modulacji opartymi na CRISPR.
Opracowany protokół można dostosować do celowania lub badania przesiewowego innych syntetycznych letalnych niekodujących par RNA poprzez modyfikację podwójnego wektora gRNA. Gdy interesująca nas linia komórkowa stabilnie wyraża oba warianty dCas9, możliwe stają się różne podejścia. Podczas gdy RNAi, ASO i shRNA mogą być wykorzystywane do wyciszania genów, CRISPRi oferuje prostszą metodologię badań przesiewowych, a jego połączenie z małymi związkami chemicznymi lub inhibitorami jest również możliwe. Zastępując podwójny wektor gRNA podwójną biblioteką gRNA, protokół ten pozwala na systematyczne badania przesiewowe syntetycznych par letalnych lub innych zależności genetycznych w komórkach nowotworowych, zwiększając w ten sposób precyzję celowania w komórki rakowe.
Chociaż udało nam się osiągnąć integrację wariantów dCas9-KRAB-MeCP2 poprzez transdukcję lentiwirusową, alternatywne metody stabilnej transfekcji można również zastosować do włączenia pożądanych enzymów do komórek 501-mel. Jest to szczególnie istotne, ponieważ z naszego doświadczenia wynika, że wyciszenie dużych konstruktów, takich jak dCas9-KRAB-MeCP2, może nastąpić w czasie36,37. Alternatywnie, dCas9-KRAB okazał się być mniejszą alternatywą23. Z naszego doświadczenia wynika, że transdukcja mniejszymi białkami fuzyjnymi dCas9-KRAB pochodzącymi z ortologów Cas9 doprowadziła do zmniejszenia ekspresji białka podczas długotrwałej hodowli (patrz rysunek uzupełniający 2). W związku z tym stała ekspresja białka powinna być regularnie monitorowana w powtarzających się punktach czasowych. Dodatkowo, transdukcja dwóch dużych białek fuzyjnych wraz z markerami selekcyjnymi i podwójnymi kasetami ekspresji gRNA może indukować stres komórkowy lub może osiągnąć zdolność pakowania lentiwirusa.
Osiągnięcie 100% skuteczności knockdown w podwójnym CRISPRi może być wyzwaniem ze względu na nieoptymalną konstrukcję gRNA lub niewystarczającą ekspresję dCas9. Aby temu zaradzić, należy przetestować wiele gRNA na cel przy użyciu zaawansowanych narzędzi projektowych w celu zidentyfikowania najskuteczniejszych sekwencji. Ponadto optymalizacja ekspresji dCas9-KRAB-MeCP2 poprzez ulepszone projektowanie wektorów i charakterystykę klonalnych linii komórkowych może zwiększyć skuteczność knockdownu.
Alternatywne strategie integracji systemu CRISPRi obejmują wykorzystanie wektorów transpozazy lub integracji kierowanej przez CRISPR w celu osiągnięcia stabilnej insercji do miejsc genomowych "bezpiecznej przystani", które są znane z utrzymywania stabilnej ekspresji w czasie38. Jednak wiele typów komórek, w tym komórki czerniaka, jest trudnych do transfekcji39, co sprawia, że transdukcja lentiwirusowa jest preferowaną metodą. Elektroporacja enzymów opartych na transpozazie lub Cas może stanowić alternatywny sposób integracji konstruktów dCas9-KRAB-MeCP2 z komórkami czerniaka40. Wdrożenie indukowalnego systemu nokautu byłoby korzystne dla aktywacji ekspresji dCas9-KRAB-MeCP2 w razie potrzeby, a nie ekspresji konstytutywnej w celu zminimalizowania stresu komórkowego.
Wreszcie, opracowane podejście nie ogranicza się do komórek czerniaka, ale może zostać rozszerzone na dowolny typ komórek, w których badana jest syntetyczna śmiertelność. Podejście to ma być wyraźnie skalowane w kierunku metody badań przesiewowych biblioteki gRNA. Jednak ze względu na zwiększoną złożoność kombinatoryczną, np. z więcej niż trzema gRNA na parę genów, w tym kontrolą i co najmniej 300-krotnym pokryciem, tylko subtranskryptomiczna frakcja ekspresji lncRNA może być praktycznie ukierunkowana. Dlatego użytkownicy muszą starannie wybrać kandydatów, biorąc pod uwagę takie czynniki, jak poziomy ekspresji lncRNA i ich znane znaczenie w określonych kontekstach komórkowych przed przystąpieniem do badań przesiewowych w bibliotece. Niemniej jednak kombinatoryczna wszechstronność tego podejścia sprawia, że jest ono cennym narzędziem do badania syntetycznych śmiertelnych interakcji i innych zależności genetycznych lncRNA w różnych typach nowotworów i potencjalnie innych chorobach. Rozszerza to obecnie dostępny zestaw narzędzi do badania tych interakcji sieciowych w komórkach.

Choć mniej niż 3% ludzkiego genomu koduje białka, około 80% genomu ulega transkrypcji1,2. Wśród niekodujących jednostek transkrypcyjnych dziesiątki tysięcy są klasyfikowane jako długie niekodujące RNA (lncRNA) przekraczające 200 nukleotydów, a całkowita liczba ludzkich lncRNA jest szacowana na ponad 100 0003,4. W przeciwieństwie do genów kodujących, lncRNA są mniej konserwatywne między gatunkami. Biorąc pod uwagę, że ludzie dzielą 99% swojego genomu z naczelnymi, takimi jak szympansy, wysunięto hipotezę, że lncRNA mają znacznie większy wpływ na ewolucję fenotypową5,6. Wyniki te wskazują na istotne funkcje komórkowe lncRNA. Choć regulacja lncRNA oraz ich oddziaływania z białkami wiążącymi RNA i innymi cząsteczkami RNA pozostają nie w pełni poznane, a wiele lncRNA nie zostało jeszcze w pełni adnotowanych, jasne jest, że lncRNA wykazują specyficzne dla komórek i tkanek wzorce ekspresji w stanie zdrowia oraz w chorobach, takich jak nowotwory7,8,9,10. Są one zaangażowane w różnorodne funkcje, w tym regulację transkrypcji genów, udział w oddziaływaniach z chromatyną11, przetwarzanie RNA12, stabilizację RNA13 oraz regulację translacji14.
W nowotworach wysoce zróżnicowane, specyficzne dla typów komórek lncRNA wpływają na rozwój i przerzutowanie guza poprzez regulację ekspresji genów, co podkreśla ich potencjał jako cennych celów terapeutycznych15. Poza wykrywaniem lncRNA jako biomarkerów w próbkach nowotworowych16, celowanie w specyficzne dla guza lncRNA w celu zaburzenia ich funkcji downstream wykazuje znaczący potencjał zarówno w zastosowaniach klinicznych, jak i w badaniach podstawowych. Podejścia oparte na RNA służące do wyjaśniania roli lncRNA obejmują oligosonukleotydy antysensowne (ASO), krótkie RNA spinki (shRNA) oraz małe interferujące RNA (siRNA)17,18. Podczas gdy siRNA jest powszechnie wykorzystywane do przesiewów wyciszania genów, wyciszenie oparte na siRNA jest ograniczone do cytoplazmy19. Tymczasem lncRNA często operują w obrębie jądra komórkowego.
Alternatywnie, do inhibicji lncRNA w nowotworach ludzkich można wykorzystać interferencję opartą na krótkich palindromicznych powtórzeniach grupowanych i regularnie rozmieszczonych (CRISPRi)20. Co więcej, całogenomowe przesiewy CRISPRi można łatwo zaprogramować, aby celowały w szeroki zakres genów kodujących i niekodujących w celu zbadania ich wpływu funkcjonalnego21,22. W systemie CRISPRi katalitycznie nieaktywne białko Cas9 (dCas9) jest połączone z domeną represora transkrypcyjnego, taką jak domena Krüppel-associated box (KRAB)23. Represja genu przez dCas9-KRAB jest kierowana do regionu zainteresowania za pomocą przewodniego RNA (gRNA). CRISPRi kontroluje geny na poziomie DNA, co prowadzi do wyższej wydajności i pożądanego fenotypu utraty funkcji w przeciwieństwie do interferencji RNA, która działa na poziomie potranskrypcyjnym24. W odpowiedzi na ograniczoną skuteczność KRAB w wyciszaniu celów, jako bardziej efektywną strategię represji wprowadzono fuzję KRAB i MeCP2 z dCas925.
Chociaż wyciszenie pojedynczego genu może wpływać na żywotność komórek nowotworowych, syntetyczne podwójne lub wielokrotne interakcje letalne mogą chronić komórki nowotworowe przed śmiercią komórkową26. Letalność syntetyczna obejmuje dwa lub więcej genów, z których każdy może rekompensować funkcję pozostałych. Aby rozwiązać problemy związane z przesiewami wyciszania pojedynczych genów, obiecującym podejściem są strategie dualnego CRISPR celujące w letalne pary genów kodujących białka27.
W niniejszej pracy przedstawiamy protokół kombinacyjnego wykorzystania ortogonalnego targetowania opartego na CRISPRi par lncRNA lub innych niekodujących RNA z użyciem dCas9 z Staphylococcus aureus oraz Streptococcus pyogenes połączonych z KRAB-MeCP2 w ludzkich komórkach czerniaka (patrz Rysunek 1). Protokół ten może być stosowany do kombinacyjnego, klasycznego wyciszania genów metodą CRISPR lub do przesiewania par syntetycznie letalnych w nowotworach w oparciu o CRISPRi. Zastosowanie dwóch różnych gatunków dCas9, SpCas9 i SaCas9, w podejściu CRISPRi pozwala na niezależne targetowanie odrębnych loci genomicznych przy minimalnej reaktywności krzyżowej, co zwiększa swoistość i elastyczność, zapewniając jednocześnie wysoką selektywność on-target. Wykorzystywane są różne motywy PAM (protospacer adjacent motifs): NGG dla SpCas9 oraz NNGRRT dla SaCas9. Podwójny system dCas9 rozwiązuje problemy takie jak ograniczona kompatybilność sgRNA, umożliwiając precyzyjną, symultaniczną modulację i redukując konkurencję o kompleksy sgRNA-RNP, która występuje przy użyciu jednego typu dCas9. Innowacja ta zwiększa odporność i wszechstronność przesiewania bibliotek podwójnych sgRNA. Podsumowując, dostarczamy w pełni funkcjonalny podwójny system CRISPRi w komórkach czerniaka jako modelu nowotworu.
<img alt="Schemat edycji genów z rozszerzeniem nakładającym się, transdukcją lentiwirusową, podwójnymi gRNA i letalnością syntetyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat podwójnego systemu CRISPRi służącego do celowania w oddziaływania letalne syntetycznie niekodujących RNA. (A) Procedura klonowania wektora z podwójnym gRNA. (B) Komórki HEK293 przetransfekowano plazmidem otoczki VSV-G, plazmidem pakującym PAX2 oraz wektorem transferowym w celu produkcji lentiwirusów do późniejszej transdukcji komórek 501-mel. Lentiwirusy zawierające informacje genetyczne dla SpdCas9-KRAB-MeCP2 (niebieski) oraz SadCas9-KRAB-MeCP2 (czerwony) zostały zintegrowane z komórkami 501-mel jednocześnie. Po selekcji antybiotykowej przeprowadzono drugą transdukcję lentiwirusową w celu integracji wybranych podwójnych gRNA (oliwkowy). (C) Komórki 501-mel wykazujące ekspresję wariantów dCas9 oddziałują z odpowiadającymi im gRNA, aby wyciszyć ekspresję genów docelowych, co prowadzi do śmierci komórek nowotworowych. Stworzone przy użyciu BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, 100 kDa</td><td>MWCO Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>mysie przeciwciało monoklonalne anty-Cas9 (S. aureus) (6H4)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>48989</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-Cas9 (S. pyogenes) (7A9-3A3)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>14697</td><td></td></tr><tr><td>mysie przeciwciało monoklonalne anty-GAPDH&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (cała cząsteczka)&ndash; Przeciwciało peroksydazy wytwarzane w króliku</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9044</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek blastycydyny S</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Test żywotności komórek luminescencyjnych CellTiter-Glo</td> Wirówka <td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wirówka Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klarowność Western Podłoże ECL, 500 ml</td><td>Inkubator CO2 Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>Model CB 170</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Inhibitor proteazy Koktajl</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I (BsmB1) Enzym restrykcyjny</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 ml Piper serologiczny</td><td>Corning</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25 ml pipeta serologiczna</td><td>Corning</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml pipeta serologiczna</td><td>Corning</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9665-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s pożywka (DMEM), wysoka zawartość glukozy, pirogronian</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka linia komórkowa czerniaka 501-mel</td><td>została uprzejmie dostarczona przez Aifantis Lab (New York University)</td><td>RRID: CVCL_4633</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon -P PVDF Membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 293T HEK Cell</td> System <td>Takara Bio</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Handcast System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi Reakcja montażu DNA&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku&nbsp;</td><td>Biomol</td><td>54650</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Bufor do próbek (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl Chemicznie kompetentny E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowane podłoże surowicy</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>probówki PCR 0,5 ml (płaska nakrętka)</td><td>VWR International</td><td>732-3207</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Corning</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531L</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Zestaw do oznaczania białek&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleninina, rozgałęziona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek Puromycyny</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-108071A</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek SafeSeal 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu, 5 M roztwór wodny, wolny od RNaz</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60434.AE</td><td></td></tr><tr><td>dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy PES 33mm 0,2 &mu; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>TC Naczynie 100, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td></td></tr><tr><td>TC Talerz 6 dołków, standard, F</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,20,005</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

strategia podwójnej interferencji crispr do celowania w syntetyczne śmiertelne interakcje między niekodującymi rna w komórkach nowotworowych

Dual CRISPR-Interference Strategy for Targeting Synthetic Lethal Interactions Between Non-Coding RNAs in Cancer Cells

Długie niekodujące RNA (lncRNA) reprezentują rozległą i funkcjonalnie zróżnicowaną klasę cząsteczek RNA, z ponad 100 000 przewidywanymi w ludzkim genomie. Chociaż lncRNA są mniej konserwatywne u różnych gatunków w porównaniu z genami kodującymi białka, odgrywają kluczową rolę w regulacji genów, interakcjach chromatyny i progresji raka. Ich udział w leczeniu nowotworów sprawia, że są obiecującymi celami terapeutycznymi. Interferencja CRISPR (CRISPRi), wykorzystująca katalitycznie nieaktywny Cas9 połączony z represorem transkrypcji, takim jak KRAB-MeCP2, oferuje precyzyjną metodę celowania w jądrowe lncRNA i oceny ich funkcji. Badanie to wprowadza podwójny system CRISPRi wykorzystujący ortogonalne technologie CRISPRi ze Staphylococcus aureus i Streptococcus pyogenes oparte na dCas9-KRAB-MeCP2, zoptymalizowane pod kątem kombinatorycznego celowania lncRNA w ludzkich komórkach czerniaka. Protokół ułatwia kombinatoryczne knockdown genów lub syntetyczne letalne badania przesiewowe par lncRNA, zapewniając nowatorskie narzędzie do badań nad rakiem. Badając syntetyczną letalność między lncRNA, podejście to może pomóc w identyfikacji interakcji lncRNA krytycznych dla przeżycia komórek nowotworowych, oferując nowe strategie terapeutyczne. Zademonstrowano funkcjonalność systemu dualnego, podkreślając jego potencjał w identyfikowaniu krytycznych interakcji lncRNA specyficznych dla nowotworu.

Kasety ekspresyjne SadCas9-KRAB-MeCP2 oraz SpdCas9-KRAB-MeCP2 zostały zintegrowane z komórkami 501-mel jednocześnie poprzez transdukcję równymi ilościami lentiwirusów. Ponieważ niniejszy protokół CRISPRi opiera się na ekspresji wariantów dCas9-KRAB-MeCP2, analiza Western blot jest idealna do potwierdzenia ich obecności na poziomie białka. Po wzbogaceniu populacji komórek pozytywnie przetransfekowanych pobrano próbki do analizy Western blot w celu potwierdzenia obecności ortologów dCas9-KRAB-MeCP2. Po udanej transdukcji, przy użyciu przeciwciał specyficznych dla odpowiednich ortologów Cas9, oczekiwany był i potwierdzony pojedynczy prążek odpowiadający białku fuzyjnemu SpdCas9-KRAB-MeCP2 (202 kDa) oraz białku fuzyjnemu SadCas9-KRAB-MeCP2 (170 kDa), co przedstawiono na Rycynie 2A. Jeśli jednak analiza Western blot nie jest możliwa, do weryfikacji białek fuzyjnych na poziomie mRNA można zastosować qPCR.
Po wygenerowaniu komórek 501-mel stabilnie wykazujących ekspresję funkcjonalnych represorów, przeprowadzono drugą transdukcję lentiwirusową przy użyciu wektora z podwójnym gRNA. Wcześniej wykazano, że RP11 i XLOC są upregulowane w krótkoterminowych hodowlach czerniaka z przerzutami, a indywidualne celowanie CRISPRi wykazało ich wpływ na proliferację i przeżywalność komórek28. W związku z tym wybraliśmy tę parę lncRNA do oceny jako syntetyczną letalną kombinację niekodujących RNA w ramach dowodu koncepcji, przewidując kumulatywny, łatwo obserwowalny fenotyp wzrostu w zmodyfikowanych komórkach.
Aby zbadać wpływ podwójnego CRISPRi na komórki nowotworowe za pomocą testów żywotności, oba docelowe lncRNA muszą zostać skutecznie zrepresowane. qPCR jest najodpowiedniejszą metodą potwierdzenia tej represji poprzez pomiar poziomów ich transkryptów. Oceńiliśmy funkcjonalność opracowanego protokołu podwójnego CRISPRi, określając poziomy RNA i badając żywotność komórek podczas targetowania potencjalnie letalnej pary RP11 i XLOC. W związku z tym wprowadzono różne gRNA celujące w RP11 i XLOC, aby obniżyć poziomy docelowego RNA. Represję RNA badano przy użyciu gRNA specyficznych dla celu dla SadCas9-KRAB-MeCP2 lub SpdCas9-KRAB-MeCP2, testowanych pojedynczo i w kombinacji wraz z kontrolnym gRNA celującym w Rosa26 (patrz Rysunek 2B). Chociaż gRNA celujące indywidualnie w XLOC lub RP11 skutecznie tłumiły ich odpowiednie cele, jednoczesny knock-down zarówno XLOC, jak i RP11 osiągnięto jedynie przy użyciu pary XLOC-sa/RP11-sp.
Ponieważ poziom RNA zarówno XLOC, jak i RP11 został skutecznie obniżony w linii komórkowej 501-mel przy użyciu wybranej pary gRNA XLOC-sa/RP11-sp, przeprowadzono test żywotności przy podwójnej represji lncRNA (patrz Rysunek 2C). Po 5 dniach żywotność komórek wynosiła odpowiednio 81% i 89% w stosunku do kontroli Rosa26, gdy docelowe gRNA były stosowane pojedynczo. Połączenie RP11-sp i XLOC-sa doprowadziło do dalszego istotnego spadku w porównaniu do samego RP11-sp, a żywotność komórek wyniosła 59% w stosunku do kontroli Rosa26.
<img alt="Western blot i wykresy słupkowe przedstawiające ekspresję RNA i luminescencję w analizie edycji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Funkcjonalność podwójnego systemu represji lncRNA. (A) Analizę Western blot przeprowadzono w celu wykrycia wariantów dCas9-KRAB-MeCP2 w zmodyfikowanych komórkach 501-mel przy użyciu przeciwciał anty-Cas9. Jako kontrolę wykorzystano komórki 501-mel typu dzikiego (WT) bez transdukcji (patrz Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6 w celu obejrzenia surowych blotów). (B) Analiza poziomu RNA RP11 i XLOC metodą qPCR względem komórek kontrolnych Rosa26 po transdukcji podwójnych gRNA do zmodyfikowanych komórek 501-mel. Jako gen referencyjny wykorzystano GAPDH. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. (C) Test żywotności przy podwójnej represji lncRNA przeprowadzono po zintegrowaniu podwójnych gRNA w zmodyfikowanych komórkach 501-mel w trzech niezależnych transdukcjach. Wartości luminescencji znormalizowano do kontroli Rosa26. Wyniki żywotności przedstawiono jako średnią (n = 3) ± SEM. Przeprowadzono niesparowany test t. Gwiazdka (*) oznacza istotną różnicę przy p &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Mapa plazmidu. Mapa została stworzona za pomocą programu Benchling (https://benchling.com/). Plazmidy wykorzystane w protokole zostały zmodyfikowane na podstawie Addgene #96921 oraz #110824. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%201.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Analiza Western blot ekspresji 
dCas9-KRAB. (A) Ekspresja SadCas9-KRAB w komórkach 501-mel 6 dni po transfekcji. (B) Sekwencyjna transdukcja SadCas9-KRAB i SpdCas9-KRAB w komórkach 501-mel doprowadziła do zmniejszenia ekspresji SadCas9-KRAB 3 tygodnie po transfekcji. (C) Symultaniczna transdukcja SadCas9-KRAB i SpdCas9-KRAB w komórkach 501-mel spowodowała zmniejszenie ekspresji SadCas9-KRAB 3 tygodnie po transfekcji. (D) Ekspresję SpdCas9-KRAB można było zaobserwować po symultanicznej transdukcji SadCas9-KRAB i SpdCas9-KRAB. LV. Objętość użytych lentiwirusów w µL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%202.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 3: Surowe dane Western blot dla SaCas9-KRAB​. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%203_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 4: Surowe dane z analizy Western blot dla SpCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%204_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 5: Surowe dane dla GAPDH_SpCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%205_GAPDH_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 6: Surowe dane GAPDH_SaCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%206_GAPDH_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Wykorzystane sekwencje przewodniego RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Wykorzystane sekwencje DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%202_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: plik FASTA dla dual-grna-zeo-gfp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%201_dual-grna-zeo-gfp.fasta" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: plik FASTA dla dSpCas9-krab-mecp2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%202_dSpCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Plik FASTA dSaCas9-krab-mecp2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%203_dSaCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

To badanie przedstawia podwójny system CRISPRi ukierunkowany na długie, niekodujące RNA w komórkach czerniaka. Umożliwia kombinatoryczne knockdown genów i syntetyczne badania przesiewowe ze skutkiem śmiertelnym, identyfikując interakcje lncRNA specyficzne dla raka dla potencjalnych strategii terapeutycznych.

Strategia podwójnej interferencji CRISPR do celowania w syntetyczne śmiertelne interakcje między niekodującymi RNA w komórkach nowotworowych

Long non-coding RNAs (lncRNAs) represent a vast and functionally diverse class of RNA molecules, with over 100,000 predicted in the human genome. Although ...

Naszym celem jest systematyczna identyfikacja i terapeutyczne ukierunkowanie na krytyczne węzły sieciowe, ze szczególnym uwzględnieniem niekodujących RNA w nowotworach. Obecne wyzwanie eksperymentalne naszego podejścia polega na zdolności kombinatorycznej wymaganej do równoległego generowania i badania przesiewowego dużej liczby genów. Naszym celem jest utorowanie drogi do identyfikacji nowych kombinatorycznych niekodujących celów RNA lub struktur lekobratywnych w celu obejścia oporności i ucieczki terapeutycznej.W przyszłości przełożymy to narzędzie potwierdzające słuszność koncepcji na zakrojone na szeroką skalę kombinatoryczne badania przesiewowe bibliotek, potencjalnie w połączeniu z białkami wiążącymi RNA, zarówno in vitro, jak i in vivo. Aby rozpocząć liczenie komórek Lenti-X 293T HEK za pomocą niebieskiego barwnika trypanowego w hemocytometrze. Płytka 4 razy 10 do potęgi 6 komórek Lenti-X 293T HEK na 10-centymetrową płytkę i inkubować, aby osiągnąć około 80% konfluencji następnego dnia.Począwszy od tego etapu, pracuj w laboratorium klasy 2. Wymieszaj 500 mikrolitrów odpowiedniego podłoża transfekcyjnego z wektorem transferowym, plazmidem obwiedniowym i wektorem pPAX2. Inkubować mieszaninę przez pięć minut w temperaturze pokojowej.W osobnej probówce wymieszaj 500 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy z 36 mikrolitrami odczynnika PEI w stężeniu 1 miligram na mililitr. Inkubować mieszaninę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Połącz obie mieszaniny i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Teraz ostrożnie, kroplami, dodaj mieszaninę do pożywki komórkowej zawierającej sześć mililitrów i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Po 12 do 15 godzinach wyrzucić pożywkę do autoklawowalnej butelki na odpady za pomocą pipety serologicznej. Wypłucz materiały eksploatacyjne, w tym pipety serologiczne i końcówki do pipet, roztworem dezynfekującym przed wyrzuceniem ich do odpadów autoklawu.Dodaj pięć mililitrów świeżego DMEM do transfekowanych komórek za pomocą nowej pipety. Aby pobrać lentiwirusy, przenieś supernatant za pomocą pipety serologicznej do 50-mililitrowej probówki kanonicznej, 48 godzin po transfekcji. Następnie dodaj 5 mililitrów świeżej pożywki do komórek i inkubuj je przez kolejne 24 godziny.Przechowuj probówkę w lodówce. Po inkubacji powtórzyć pobieranie lentiwirusów i połączyć je z próbką pobraną wcześniej. Po trzecim zbiorze należy przechowywać połączone supernatanty ze wszystkich trzech zbiorów w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu filtracji i odwirowania.Odwirować połączony supernatant przez 5 minut w temperaturze 500 G i 4 stopni Celsjusza w szczelnych pojemnikach aerozolowych i wirnikach zatwierdzonych dla organizmów grupy ryzyka 2, a następnie przefiltrować supernatant przez sterylne filtry strzykawkowe o wielkości 0,2 mikrometra. Stężyć przefiltrowany supernatant w temperaturze 1000 G i czterech stopniach Celsjusza za pomocą odśrodkowego zespołu filtrującego z granicą masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów do około 500 mikrolitrów. Porcje wirusa należy przechowywać od 50 do 100 mikrolitrów w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia.Umieść komórki 501-mel w sześciodołkowej płytce 2 razy 10 do mocy 5 komórek na studzienkę z końcową objętością kultury 2 mililitry na dzień przed transdukcją. Zastąp pożywkę hodowlaną 2 mililitrami wstępnie podgrzanego DMEM uzupełnionego polibrenem w stężeniu końcowym 6 mikrogramów na mililitr. Pracuj w laboratorium klasy 2 od tego kroku.Dodać 50 mikrolitrów przygotowanych lentiwirusów SPD i SAD jednocześnie do komórek kroplami. Delikatnie potrząśnij płytką i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla. 16 godzin po transdukcji wyrzucić pożywkę do butelki nadającej się do sterylizacji w autoklawie za pomocą pipety serologicznej.Dodaj 2 mililitry świeżej pożywki zawierającej 10 mikrogramów na mililitr blastycydyny i 2 mikrogramy na mililitr puromycyny. Powtórz etap wymiany pożywki po dwóch dniach i postępuj z transdukowanymi komórkami w warunkach S1 po siedmiu dniach po transdukcji. Zasiew 0,1 razy 10 do potęgi 5 komórek zawierających stabilny transfekowany SadCas9 KRAB i Sp-dCas9-KRAB siedem dni po transdukcji w 96-dołkowej płytce ze 100 mikrolitrami wstępnie podgrzanego DMEM.W dniu transdukcji zastąp pożywkę 100 mikrolitrami podgrzanego DMEM uzupełnionego polibrenem w ilości 6 mikrogramów na mililitr. Dodać odpowiednią objętość lentiwirusów do komórek i inkubować płytkę. Po 16 godzinach zastąp pożywkę świeżą pożywką zawierającą zeoinę, blasticydynę i puromycynę.Wykonaj detekcję luminescencji pięć dni po transdukcji za pomocą testu żywotności komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Zachodnia analiza krwi potwierdziła udaną ekspresję białek fuzyjnych SpdCas9 i SadCas9 w komórkach przetwornika 501-mel. Ilościowa analiza łańcuchowej reakcji polimerazy wykazała skuteczne knockdown pojedynczych długich niekodujących RNA RP11 i XLOC przy użyciu specyficznych przewodników RNA, ale tylko para XLOC-sa i RP11-sp skutecznie stłumiła oba cele jednocześnie.Podwójna represja RP11 i XLOC przy użyciu pary GRNA XLOC-sa i RP11-sp znacznie zmniejszyła żywotność komórek 501-mel do 59% w porównaniu z kontrolą.

dual-crispr-interference-strategy-for-targeting-synthetic-lethal

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Bezpośrednie dostarczanie wstępnie złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/przewodnikowego RNA to szybki i skuteczny sposób na edycję genomu w komórkach krwiotwórczych. Tutaj wykorzystujemy to podejście do usunięcia tłumika intronowego RUNX1 i zbadania odpowiedzi transkrypcyjnych w komórkach białaczkowych OCI-AML3.

Badanie transkrypcyjnej roli tłumika intronowego RUNX1 przez rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9 w komórkach ostrej białaczki szpikowej

Duże badania genetyczne w organizmach modelowych doprowadziły do identyfikacji negatywnych interakcji genetycznych. W tym miejscu opisujemy proces integracji danych z wykorzystaniem danych z badań genetycznych w organizmach modelowych w celu wyznaczenia kombinacji leków ukierunkowanych na syntetyczne śmiertelne interakcje w raku.

Przepływ pracy integracji danych w celu identyfikacji kombinacji leków ukierunkowanych na syntetyczne interakcje śmiertelne

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Skrupulatne i ustrukturyzowane podejście jest stosowane do selekcji odpornych i wrażliwych genów promieniowania poprzez zastosowanie metody przesiewowej CRISPR/Cas9 obejmującej cały genom. Protokół ten ma również potencjał, aby służyć jako wszechstronne ramy dla innych przedsięwzięć badawczych badających mechanizmy oporności na klinicznie podawane leki chemiczne.

Badanie przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom do odkrywania genów radiowrażliwych i odpornych na promieniowanie

Poznaj strategię podwójnej interferencji CRISPR do celowania w długie niekodujące RNA w komórkach czerniaka. Ta metoda umożliwia kombinatoryczne wyciszanie genów i identyfikację syntetycznych interakcji śmiertelnych.

Strategia podwójnej interferencji CRISPR do celowania w syntetyczne śmiertelne interakcje między niekodującymi RNA w komórkach nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal

Strategia podwójnej interferencji CRISPR do celowania w syntetyczne śmiertelne interakcje między niekodującymi RNA w komórkach nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów