Strategia podwójnej interferencji CRISPR do celowania w syntetyczne śmiertelne interakcje między niekodującymi RNA w komórkach nowotworowych

Naszym celem jest systematyczna identyfikacja i terapeutyczne ukierunkowanie na krytyczne węzły sieciowe, ze szczególnym uwzględnieniem niekodujących RNA w nowotworach. Obecne wyzwanie eksperymentalne naszego podejścia polega na zdolności kombinatorycznej wymaganej do równoległego generowania i badania przesiewowego dużej liczby genów. Naszym celem jest utorowanie drogi do identyfikacji nowych kombinatorycznych niekodujących celów RNA lub struktur lekobratywnych w celu obejścia oporności i ucieczki terapeutycznej.

W przyszłości przełożymy to narzędzie potwierdzające słuszność koncepcji na zakrojone na szeroką skalę kombinatoryczne badania przesiewowe bibliotek, potencjalnie w połączeniu z białkami wiążącymi RNA, zarówno in vitro, jak i in vivo. Aby rozpocząć liczenie komórek Lenti-X 293T HEK za pomocą niebieskiego barwnika trypanowego w hemocytometrze. Płytka 4 razy 10 do potęgi 6 komórek Lenti-X 293T HEK na 10-centymetrową płytkę i inkubować, aby osiągnąć około 80% konfluencji następnego dnia.

Począwszy od tego etapu, pracuj w laboratorium klasy 2. Wymieszaj 500 mikrolitrów odpowiedniego podłoża transfekcyjnego z wektorem transferowym, plazmidem obwiedniowym i wektorem pPAX2. Inkubować mieszaninę przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

W osobnej probówce wymieszaj 500 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy z 36 mikrolitrami odczynnika PEI w stężeniu 1 miligram na mililitr. Inkubować mieszaninę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Połącz obie mieszaniny i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Teraz ostrożnie, kroplami, dodaj mieszaninę do pożywki komórkowej zawierającej sześć mililitrów i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Po 12 do 15 godzinach wyrzucić pożywkę do autoklawowalnej butelki na odpady za pomocą pipety serologicznej. Wypłucz materiały eksploatacyjne, w tym pipety serologiczne i końcówki do pipet, roztworem dezynfekującym przed wyrzuceniem ich do odpadów autoklawu.

Dodaj pięć mililitrów świeżego DMEM do transfekowanych komórek za pomocą nowej pipety. Aby pobrać lentiwirusy, przenieś supernatant za pomocą pipety serologicznej do 50-mililitrowej probówki kanonicznej, 48 godzin po transfekcji. Następnie dodaj 5 mililitrów świeżej pożywki do komórek i inkubuj je przez kolejne 24 godziny.

Przechowuj probówkę w lodówce. Po inkubacji powtórzyć pobieranie lentiwirusów i połączyć je z próbką pobraną wcześniej. Po trzecim zbiorze należy przechowywać połączone supernatanty ze wszystkich trzech zbiorów w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu filtracji i odwirowania.

Odwirować połączony supernatant przez 5 minut w temperaturze 500 G i 4 stopni Celsjusza w szczelnych pojemnikach aerozolowych i wirnikach zatwierdzonych dla organizmów grupy ryzyka 2, a następnie przefiltrować supernatant przez sterylne filtry strzykawkowe o wielkości 0,2 mikrometra. Stężyć przefiltrowany supernatant w temperaturze 1000 G i czterech stopniach Celsjusza za pomocą odśrodkowego zespołu filtrującego z granicą masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów do około 500 mikrolitrów. Porcje wirusa należy przechowywać od 50 do 100 mikrolitrów w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia.

Umieść komórki 501-mel w sześciodołkowej płytce 2 razy 10 do mocy 5 komórek na studzienkę z końcową objętością kultury 2 mililitry na dzień przed transdukcją. Zastąp pożywkę hodowlaną 2 mililitrami wstępnie podgrzanego DMEM uzupełnionego polibrenem w stężeniu końcowym 6 mikrogramów na mililitr. Pracuj w laboratorium klasy 2 od tego kroku.

Dodać 50 mikrolitrów przygotowanych lentiwirusów SPD i SAD jednocześnie do komórek kroplami. Delikatnie potrząśnij płytką i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla. 16 godzin po transdukcji wyrzucić pożywkę do butelki nadającej się do sterylizacji w autoklawie za pomocą pipety serologicznej.

Dodaj 2 mililitry świeżej pożywki zawierającej 10 mikrogramów na mililitr blastycydyny i 2 mikrogramy na mililitr puromycyny. Powtórz etap wymiany pożywki po dwóch dniach i postępuj z transdukowanymi komórkami w warunkach S1 po siedmiu dniach po transdukcji. Zasiew 0,1 razy 10 do potęgi 5 komórek zawierających stabilny transfekowany SadCas9 KRAB i Sp-dCas9-KRAB siedem dni po transdukcji w 96-dołkowej płytce ze 100 mikrolitrami wstępnie podgrzanego DMEM.

W dniu transdukcji zastąp pożywkę 100 mikrolitrami podgrzanego DMEM uzupełnionego polibrenem w ilości 6 mikrogramów na mililitr. Dodać odpowiednią objętość lentiwirusów do komórek i inkubować płytkę. Po 16 godzinach zastąp pożywkę świeżą pożywką zawierającą zeoinę, blasticydynę i puromycynę.

Wykonaj detekcję luminescencji pięć dni po transdukcji za pomocą testu żywotności komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Zachodnia analiza krwi potwierdziła udaną ekspresję białek fuzyjnych SpdCas9 i SadCas9 w komórkach przetwornika 501-mel. Ilościowa analiza łańcuchowej reakcji polimerazy wykazała skuteczne knockdown pojedynczych długich niekodujących RNA RP11 i XLOC przy użyciu specyficznych przewodników RNA, ale tylko para XLOC-sa i RP11-sp skutecznie stłumiła oba cele jednocześnie.

Podwójna represja RP11 i XLOC przy użyciu pary GRNA XLOC-sa i RP11-sp znacznie zmniejszyła żywotność komórek 501-mel do 59% w porównaniu z kontrolą.