Name: Skuteczna metoda ekstrakcji nabłonka ludzkiego jajowodu do analiz pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę izolacji nabłonka jajowodu do badań nad rakiem jajnika z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i mechanicznego. Technika ta umożliwia uzyskanie żywych komórek o wysokiej czystości do analizy pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy: Ruegg L, James-Allan LB i DiBernardo G są częściowo wspierani przez projekty Greater Los Angeles Veterans Association 1I01BX006019-01A2 i I01BX006411-01 do Memarzadeh S. Autor Ochoa C jest wspierany przez UCLA Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Rose Hills Foundation Graduate Scholarship Training Program. Pragniemy podziękować Laboratorium Patologii Translacyjnej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles, a w szczególności Ko Kiehle i Chloe Yin za pomoc w pobieraniu tkanek. Chcemy również podziękować Kenowi Yamauchi i rdzeniowi BSCRC Microscopy za ich pomoc w obrazowaniu. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com (numer umowy JL27QWDYNT). Na koniec chcielibyśmy podziękować Felicii Cordea i rdzeniowi cytometrii przepływowej BSCRC za pomoc w cytometrii przepływowej.

Ten protokół został zaadaptowany z opisanej wcześniej metody izolacji komórek nabłonka macicy13,14. Świeże próbki pozbawionych identyfikacji jajowodów zostały pobrane za pomocą zatwierdzonego przez IRB protokołu #10-0727 Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles (UCLA) i strawione do zawiesiny jednokomórkowej w ciągu około 4-6 godzin.
1. Pobieranie i przygotowanie jajowodów 
<ol>
	<li>Zbierz świeże ludzkie jajowody (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A) w pożywkach dysocjacyjnych (DMEM [4,5 g / L D-glukozy] zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml L-glutaminy i 5 ml penicyliny / streptomycyny) w probówkach o pojemności 15 ml lub 50 ml i transportuj na lodzie do laboratorium.</li>
	<li>Przenieś jajowody na sterylną szalkę Petriego zawierającą świeże podłoże dysocjacyjne. </li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wypreparuj tłuszcz, tkankę łączną i wszelkie naczynia otaczające rurki za pomocą cienkich kleszczyków punktowych i nożyczek Vannas Tubingen (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przeciąć nożyczkami płaszczyznę koronalną jajowodów, aby utworzyć małe cylindry o średnicy ~3–5 mm każdy (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1C), używając cienkich kleszczyków punktowych do stabilizacji tkanki.</li>
</ol>
2. Izolacja i dysocjacja komórek nabłonkowych
<ol>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę dysocjacyjną z naczynia.</li>
	<li>Umyj kawałki chusteczki 2x zimną 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), delikatnie pipetując ~2 ml, aby przykryć kawałki i lekko obracając płytkę.</li>
	<li>Odessać końcowe 1x PBS przepłukać, inkubować kawałki tkanek przez 5 minut w zimnym 5 mM kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w temperaturze pokojowej i powtórzyć w sumie dwie inkubacje. Odessać 5mM EDTA po każdej inkubacji.</li>
	<li>Zawiesić fragmenty tkanek w zimnym 1% roztworze trypsyny/zrównoważonej soli Hanksa (HBSS) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 40 minut (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Odessać 1% trypsyny/HBSS i umyć kawałki tkanki 2x w zimnym podłożu dysocjacyjnym, aby dezaktywować trypsynę.</li>
	<li>Inkubować fragmenty tkanek w 2 ml pożywki dysocjacyjnej z 0,4 mg DNazy przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Może być konieczny dłuższy okres inkubacji, ale nie należy przekraczać 45 minut przed rozpoczęciem kroku 2.7.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym, jeszcze w pożywce z DNazą, przytrzymaj fragment jajowodu, światło równoległe do dna naczynia, na miejscu za pomocą kleszczy. Drugą ręką kilkakrotnie naciskaj kleszczami na fragment jajowodu, aby usunąć komórki nabłonkowe ze światła jajowodu. Upewnij się, że wokół tkanki widoczna jest aureola komórek, gdy komórki są uwalniane ze światła probówki. Powtórz dla każdego fragmentu jajowodu w naczyniu (<silna klasa="xfig">Ryc. 1E).</li>
	<li>Przenieść pożywkę zawierającą komórki do sterylnej probówki o pojemności 15 ml, przemyć szalkę Petriego pożywką dysocjacyjną co najmniej 2 razy i połączyć popłuczyny z probówką o pojemności 15 ml. Wyrzuć fragmenty rurki zrębu.</li>
	<li>Zbierać komórki przez odwirowanie w stężeniu 500 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki dysocjującej.</li>
	<li>Policz komórki, dzieląc 10 μl zawiesiny komórek i mieszając 1:1 z błękitem trypanowym. Odpipetować 10 μl mieszaniny do szkiełka zliczającego w komorze i włożyć ją do licznika komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F).</li>
</ol>
3. Trawienie do zawiesiny jednokomórkowej 
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 9 ml pożywki dysocjującej, 1 ml kolagenazy 8 mg/ml (typ 1) i 0,4 mg DNazy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30–45 minut w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G).</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 500 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki dysocjacyjnej w celu zmycia kolagenazy.</li>
	<li>Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 100 μm do probówki o pojemności 50 ml (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H).</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 500 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Jeśli osad komórkowy wydaje się czerwony, przeprowadź lizę czerwonych krwinek (RBC) zgodnie z opisem w krokach 3.6–3.8. Jeśli osad ogniwa nie jest czerwony, przejdź do kroku 3.9.</li>
	<li>Rozcieńczyć 500 μl buforu do lizy RBC w 4,5 ml ultraczystej wody.</li>
	<li>Odessać pożywkę, dodać 5 ml rozcieńczonego buforu do lizy RBC i inkubować na lodzie przez 3 minuty.</li>
	<li>Aby zatrzymać lizę RBC, dodaj 45 ml 1x PBS do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 500 × g przez 5 minut.</li>
	<li>Policz komórki, podając 10 μl zawiesiny komórek i mieszając ją 1:1 z błękitem trypanowym. Odpipetować 10 μl mieszaniny do szkiełka zliczającego w komorze i włożyć ją do licznika komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I).</li>
</ol>
4. Barwienie metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Podzielić 250 000 komórek na dwie oddzielne probówki z okrągłym dnem polistyrenu o pojemności 5 ml do pierwotnego sprzężonego przeciwciała i kontroli izotypu do wykorzystania w cytometrii przepływowej ze znacznikiem powierzchniowym. 
	UWAGA: Można użyć mniejszej liczby komórek, aby dostosować się do liczby komórek i liczby komórek potrzebnych do dalszej analizy. Aby osiągnąć optymalne wyniki przepływu, analiza powinna obejmować co najmniej 50 000 komórek.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało (np. anty-ludzkie EpCAM i CD10) i izotyp zgodnie z zalecanym przez producenta rozcieńczeniem w 1x PBS. Obejmują utrwalany barwnik żywotności (e506) i sprzężone przeciwciało anty-ludzkie CD45 w celu wyeliminowania żywych ludzkich komórek odpornościowych. Przygotować wystarczającą ilość mieszaniny przeciwciał na co najmniej 50 μl na probówkę. Pozostaw w ciemności na lodzie do kroku 4.4.</li>
	<li>Umyj komórki 1 ml 1x PBS. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zassać 1x PBS. Zawiesić osad w panelu przeciwciał lub izotypów i inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut w ciemności.</li>
	<li>Po inkubacji rozcieńczyć w 1 ml 1 x PBS i zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać 1x PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μL 1x PBS.</li>
</ol>
5. Zbieranie danych z cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Zaloguj się do komputera FACS. 
	UWAGA: Przedstawiamy protokół z wykorzystaniem referencyjnego cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów). W przypadku innych cytometrów przepływowych należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Ustawienie napięcia cytometru przepływowego zostało wstępnie skonfigurowane w celu uzyskania optymalnej wydajności z ludzkimi PBMC, eliminując potrzebę regulacji napięcia przed każdym uruchomieniem FACS.</li>
	<li>Jeśli urządzenie jest w trybie akwizycji, przejdź do kroku 5.3. Jeśli urządzenie jest w trybie analizy danych, przejdź do trybu akwizycji, naciskając przycisk zasilania w prawym górnym rogu. Gdy wyświetli się wyskakujące okienko, naciśnij przycisk z napisem tryb akwizycji.</li>
	<li>W lewym dolnym rogu, jeśli na urządzeniu pojawi się komunikat Wymagana kalibracja, przejdź do kroku 5.3.1. Jeśli urządzenie odczytuje Kalibracja ok, przejdź do kroku 5.4.
	<ol>
		<li>Aby skalibrować urządzenie, wyjmij koraliki kalibracyjne z lodówki o temperaturze 4 °C i odwiruj.</li>
		<li>Umieść 1 kroplę koralików kalibracyjnych w probówce z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polistyrenu i umieść probówkę w pojedynczym uchwycie na probówkę.</li>
		<li>Naciśnij przycisk kodu kreskowego w prawym górnym rogu i zeskanuj butelkę z koralikami kalibracyjnymi. Pojawi się wyskakujące okienko. Jeśli wszystko jest skonfigurowane, kliknij przycisk Tak | OK i pozwól kalibracji działać.</li>
		<li>Jeśli kalibracja się powiedzie, wyloguj się i zaloguj ponownie do trybu akwizycji. Przejdź do kroku 5.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij pozycję Otwórz | nowy obszar roboczy w lewym górnym rogu.</li>
	<li>Wybierz stojak Chill 5; wybierz trzy studnie. Wybierz pierwszą studnię i oznacz ją (np. FTX Ab). Wybierz następną studnię i nadaj jej unikalny opis (np. FTX Iso). Wybierz ostatnią studzienkę i nadaj jej opis bleach. 
	UWAGA: Zawsze dołączaj próbkę wybielacza po każdych 4-5 próbkach eksperymentalnych, aby zapewnić terminowe czyszczenie próbek komórek.</li>
	<li>Wybierz wszystkie studnie i ustaw warunki eksperymentalne w następujący sposób: ustawienia instrumentu: ludzkie PBMC; Natężenie przepływu: wysokie; Wymieszaj próbkę: delikatne mieszanie; Tryb: standardowy; całkowita objętość próbki 200 μl; Wychwyt próbki 150 μl; Adnotacja: przeciwciała wejściowe i ich znakowanie fluoroforowe.</li>
	<li>Wybierz edytuj | opcje i nadaj plikowi nazwę w polu description| apply | ok.</li>
	<li>Wyjmij ruszt z lodówki i umieść go na tacy z kodem kreskowym skierowanym w stronę urządzenia. Umieść probówki z próbkami w stojaku, aby odzwierciedlić kolejność próbek na ekranie i naciśnij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć eksperyment.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentu podłącz USB, wybierz Plik | Kopiuj, rozwiń folder prywatny, wybierz eksperyment i kliknij przycisk kopiuj i wysuń.</li>
	<li>Po zebraniu danych użyj oprogramowania do analizy arkusza danych.</li>
	<li>Zacznij od kontroli izotypu. Użyj narzędzia wielokąta, aby zaznaczyć komórki na wykresie rozproszenia do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC).</li>
	<li>Wyeliminowanie martwych komórek poprzez zmianę osi Y na e506 i osi X na FSC. Użyj narzędzia wielokąta, aby wybrać populację żywych komórek z ujemnym wynikiem e506.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie wybraną populację. Zmień oś Y na ludzką CD45. Użyj narzędzia Wielokąt, aby zaznaczyć populację komórek. Jest to ludzka populacja komórek CD45-ujemnych.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie populację komórek CD45-ujemnych. Zmień oś Y na histogram i oś X na ludzki EpCAM. Użyj narzędzia do zaznaczania zakresu, aby kliknąć na końcu histogramu i zaznaczyć puste miejsce aż do końca wykresu. Reprezentuje to populację EpCAM-dodatnią. Powtórz dla ludzkiego barwienia CD10.</li>
	<li>Przeciągnij bramkowanie izotypu pod obszar roboczy przeciwciała. Komórki CD45-dodatnie zostaną bramkowane, a populacje EpCAM-dodatnie i CD10-dodatnie zostaną wybrane.</li>
	<li>Aby utworzyć reprezentatywne histogramy, wybierz edytor układu. Przeciągnij żądane histogramy na stronę układu. Aby porównać barwienie izotypu i przeciwciała, nałóż histogram izotypu na histogram przeciwciała. Bramka komórek dodatnich na podstawie kontroli izotypu.</li>
</ol>
6. Immunocytochemia
<ol>
	<li>Hodowla komórek po ostatnim etapie izolacji w żądanej komorze szklanej szkiełkuje do zlewania się.</li>
	<li>Aby utrwalić komórki, dodaj 500 μl zimnego 4% paraformaldehydu (PFA) Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Odessać 4% PFA i przemyć 3x 1x PBS.</li>
	<li>Aby przepuszczalność komórek, dodaj co najmniej 200 μl 0,25% Triton-X do PBS i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Podczas przepuszczalności należy przygotować bufor blokujący (4% normalna surowica kozia [NGS] dla przeciwciał niewytwarzanych u kóz).</li>
	<li>Odessać 0,25% Triton-X i przemyć 3x 1x PBS.</li>
	<li>Dodać co najmniej 200 μl buforu blokującego (4% NGS w PBS). Blokuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować pierwszorzędowe rozcieńczenia przeciwciał w 1% NGS w 1x PBS zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Po zablokowaniu dodać co najmniej 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny 
	UWAGA: Niektóre przeciwciała pierwszorzędowe mogą preferować inkubację w temperaturze 4 °C przez noc; Sprawdź kartę charakterystyki przeciwciał.</li>
	<li>Przygotować drugorzędowe roztwory przeciwciał w 1% NGS w 1x PBS. Zawiń probówki w folię aluminiową i przygotuj roztwory w ciemności, ponieważ przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło. Przechowywać w ciemności, aż będzie gotowy.</li>
	<li>Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemyć 3x 1x PBS.</li>
	<li>Dodać co najmniej 200 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 h. 
	UWAGA: Podczas poniższych kroków staraj się, aby slajd był jak najbardziej w ciemności.</li>
	<li>Po wtórnej inkubacji przeciwciał przemyć 3x 1x PBS.</li>
	<li>Wyjmij komory, po prostu wyjmując je ręcznie lub używając narzędzia dołączonego do prowadnic. Postępuj zgodnie ze wskazówkami wydrukowanymi na opakowaniu szkiełka komory w celu wyjęcia.</li>
	<li>Dodaj kroplę 4',6-diamidyno-2-fenyloindolowej surowicy (DAPI) i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Ogranicz liczbę pęcherzyków i upewnij się, że wszystkie komórki są zakryte. Opcjonalny krok: użyj lakieru do paznokci wokół krawędzi, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Położyć szkiełko płasko w pudełku na szkiełka do wyschnięcia i umieścić w temperaturze 4 °C do momentu wykonania obrazu.</li>
	<li>Obraz na mikroskopie wyposażonym w prawidłową fluorescencję opartą na wtórnej koniugacji przeciwciał w celu zapewnienia czystego obrazu.</li>
</ol>

<ol><li>Crow, J., Amso, N. N., Lewin, J., Shaw, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+ultrastructure+of+fallopian+tube+epithelium+at+different+stages+of+the+menstrual+cycle+and+menopause%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Morphology and ultrastructure of fallopian tube epithelium at different stages of the menstrual cycle and menopause.</a> Hum Reprod. 9 (12), 2224-2233 (1994).</li>
<li>Patek, E., Nilsson, L., Johannisson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopic+study+of+the+human+fallopian+tube.+Report+II.+Fetal+life%2C+reproductive+life%2C+and+postmenopause%5BTitle%5D)+AND+%22Fert+Steril%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopic study of the human fallopian tube. Report II. Fetal life, reproductive life, and postmenopause.</a> Fert Steril. 23 (10), 719-733 (1972).</li>
<li>Coan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+role+of+fallopian+ciliated+cells+in+the+pathogenesis+of+high-grade+serous+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploring the role of fallopian ciliated cells in the pathogenesis of high-grade serous ovarian cancer.</a> Int J Mol Sci. 19 (9), 2512(2018).</li>
<li>Leese, H., Tay, J., Reischl, J., Downing, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+fallopian+tubal+fluid%3A+role+of+a+neglected+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation of fallopian tubal fluid: role of a neglected epithelium.</a> Reproduction. 121 (3), 339-346 (2001).</li>
<li>Donnez, J., Casanas-Roux, F., Ferin, J., Thomas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+ciliation+and+cell+height+in+human+tubal+epithelium+in+the+fertile+and+post-fertile+years%5BTitle%5D)+AND+%22Maturitas%22%5BJournal%5D)">Changes in ciliation and cell height in human tubal epithelium in the fertile and post-fertile years.</a> Maturitas. 5 (1), 39-45 (1983).</li>
<li>Lengyel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+atlas+of+the+human+postmenopausal+fallopian+tube+and+ovary+from+single-cell+RNA+and+ATAC+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A molecular atlas of the human postmenopausal fallopian tube and ovary from single-cell RNA and ATAC sequencing.</a> Cell Rep. 41 (12), 111838-111838 (2022).</li>
<li>Tao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+tubal+ciliated+cells+as+a+risk+for+%26%2334%3Bovarian%26%2334%3B+or+pelvic+serous+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of tubal ciliated cells as a risk for &#34;ovarian&#34; or pelvic serous carcinoma.</a> Am J Cancer Res. 10 (11), 3815(2020).</li>
<li>Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+serous+carcinoma%3A+recent+concepts+on+its+origin+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis.</a> J Hematol Oncol. 5 (1), 8(2012).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repertoire+of+serous+ovarian+cancer+non-genetic+heterogeneity+revealed+by+single-cell+sequencing+of+normal+fallopian+tube+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The repertoire of serous ovarian cancer non-genetic heterogeneity revealed by single-cell sequencing of normal fallopian tube epithelial cells.</a> Cancer Cell. 37 (2), 226-242.e7 (2020).</li>
<li>Dinh, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+identifies+gene+expression+networks+driving+differentiation+and+tumorigenesis+in+the+human+fallopian+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics identifies gene expression networks driving differentiation and tumorigenesis in the human fallopian tube.</a> Cell Rep. 35 (2), 108978(2021).</li>
<li>Ulrich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+of+human+fallopian+tubes+in+normal+and+hydrosalpinx+disease+states+identified+using+scRNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity of human fallopian tubes in normal and hydrosalpinx disease states identified using scRNA-seq.</a> Dev Cell. 57 (7), 914-929.e7 (2022).</li>
<li>Brand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fallopian+tube+single+cell+analysis+reveals+myeloid+cell+alterations+in+high-grade+serous+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Fallopian tube single cell analysis reveals myeloid cell alterations in high-grade serous ovarian cancer.</a> iScience. 27 (3), 108990-108990 (2024).</li>
<li>Memarzadeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+activation+of+the+PI3-kinase+pathway+initiates+endometrial+cancer+from+adult+uterine+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous activation of the PI3-kinase pathway initiates endometrial cancer from adult uterine epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (40), 17298-17303 (2010).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+induction+and+specification+of+morphogenesis+and+cytodifferentiation+of+the+epithelia+of+the+mullerian+ducts+and+urogenital+sinus+during+development+of+the+uterus+and+vagina+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Stromal induction and specification of morphogenesis and cytodifferentiation of the epithelia of the mullerian ducts and urogenital sinus during development of the uterus and vagina in mice.</a> J Exp Zool. 196 (3), 361-369 (1976).</li>
<li>Xie, Y., Park, E. -S., Xiang, D., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+organoid+culture+reveals+enrichment+of+organoid-forming+epithelial+cells+in+the+fimbrial+portion+of+mouse+fallopian+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term organoid culture reveals enrichment of organoid-forming epithelial cells in the fimbrial portion of mouse fallopian tube.</a> Stem Cell Res. 32 (1873-5061), 51-60 (2018).</li>
<li>Karst, A. M., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+immortalization+of+human+fallopian+tube+secretory+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture and immortalization of human fallopian tube secretory epithelial cells.</a> Nat Protoc. 7 (9), 1755-1764 (2012).</li>
<li>Ford, M. J., Harwalkar, K., Yamanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+generate+mouse+oviduct+epithelial+organoids+for+viral+transduction+and+whole-mount+3D+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol to generate mouse oviduct epithelial organoids for viral transduction and whole-mount 3D imaging.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101164(2022).</li>
<li>Radecki, K. C., Lorenson, M. Y., Carter, D. G., Walker, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+and+dissociation+of+the+murine+oviduct%3A+Individual+segment+identification+and+single+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microdissection and dissociation of the murine oviduct: Individual segment identification and single cell isolation.</a> J Vis Exp. (177), e63168(2021).</li>
<li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+detection+of+organoid-initiating+cell+activity+in+patient-derived+single+fallopian+tube+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Protocol for the detection of organoid-initiating cell activity in patient-derived single fallopian tube epithelial cells.</a> Methods Mol Bio. 2429, 445-454 (2022).</li>
<li>Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+and+Wnt+pathways+regulate+stemness+and+differentiation+in+human+fallopian+tube+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids.</a> Nat Commun. 6 (1), 8989(2015).</li>
<li>Fotheringham, S., Levanon, K., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+primary+human+fallopian+tube+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells.</a> J Vis Exp. (51), e2728(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Istnieje duże zainteresowanie badaniem nabłonka jajowodów, ponieważ jajowody odgrywają znaczącą rolę w reprodukcji i są miejscem pochodzenia większości HGSOC. W tym celu wielu badaczy opisało protokoły izolacji komórek jajowodu zarówno w modelach ludzkich, jak i mysich 10,11,12,15,16,17,18,19,20,21. Opisana przez nas metoda ekstrakcji i wzbogacania komórek nabłonka jajowodu uzupełnia istniejące protokoły izolacji komórek jajowodu. Chociaż w ramach tych protokołów istnieją nakładające się na siebie metody, istnieją dwa ogólne typy metod zgłaszane u myszy i ludzi. Pierwszy polega na rozdrobnieniu i enzymatycznym trawieniu całego jajowodu, co daje całkowitą zawiesinę komórkową 10,12,15,16,17. Drugi polega na złuszczaniu się z mieszaniem lub skrobaniem, w wyniku czego powstają arkusze tkanki 11,18,19,20,21. Obie metody umożliwiają analizę komórek nabłonkowych za pomocą dalszych eksperymentów, takich jak cytometria przepływowa, sekwencjonowanie i hodowla in vitro. Główną zaletą naszej metody jest to, że protokół daje populację komórek jajowodu, które są już wzbogacone o komórki nabłonkowe poprzez trawienie enzymatyczne i mechaniczne etapy pchania. Ta populacja wzbogacona o nabłonek może być dalej trawiona, w wyniku czego powstaje zawiesina jednokomórkowa, która może być wykorzystywana do wielu zastosowań, takich jak cytometria przepływowa, hodowla 2D, immunocytochemia i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek.
Kluczowe kroki, które według nas wpływają na wydajność komórek, obejmują czas, przez jaki fragmenty jajowodu inkubują się w 1% trypsyny/HBSS i DMEM/DNazie. Nadmierna inkubacja w którymkolwiek roztworze spowoduje degradację komórek i znacznie zmniejszy ich żywotność. Jednak niewystarczający czas inkubacji zahamuje zdolność badacza do wypchnięcia wielu komórek nabłonkowych podczas kroku 2.6 protokołu, ponieważ będą one nadal przylegać do siebie. Ważne jest również, aby stosować 1% roztwór trypsyny, ponieważ zarówno niższe, jak i wyższe stężenia roztworów trypsyny zmniejszały wydajność żywotnych komórek nabłonka jajowodów. Łącząc izolację chemiczną i mechaniczną oraz etap trawienia (krok protokołu 3.1), możemy wykładniczo skrócić czas potrzebny na przejście od zawiesiny tkankowej do jednokomórkowej. Zapewnia to dobrą rentowność i czas na przeprowadzenie dalszej analizy tego samego dnia.
W kroku 1.4 protokołu bardzo ważne jest, aby upewnić się, że kawałki przeciętego jajowodu mają grubość 3-5 mm. Jeśli kawałki są zbyt duże, trudno będzie wykonać krok protokołu 2.7 i ostatecznie zmniejszyć wydajność komórek, ponieważ konieczny będzie dłuższy czas inkubacji w DMEM/DNazie.
Chociaż zawiesina komórkowa jest wzbogacona o komórki nabłonkowe, zanieczyszczenie komórek zrębu jest nieuniknione. Jeśli preparat ma być czysto nabłonkowy, można przeprowadzić sortowanie za pomocą cytometrii przepływowej i opisanych przez nas markerów w celu wyizolowania komórek nabłonka i zubożenia komórek zrębu.
W badaniu wykorzystano jajowody po menopauzie. Jednak metoda ta została z powodzeniem zastosowana w naszym laboratorium na jajowodach przed menopauzą. Główną różnicą między jajowodami przed i po menopauzie jest skład komórek nabłonka rzęskowego i wydzielniczego1. Protokół ten działa na wszystkich etapach rozrodu.
Ten skuteczny protokół ułatwi badanie typów komórek nabłonka jajowodu, w tym nakreślenie linii komórkowych, ich dynamicznych zmian podczas cykli rozrodczych, a także po menopauzie oraz ich rolę w inicjowaniu surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości.

Jajowody są zbudowane z wielu części. Od jajnika do macicy jajowód składa się z fimbrii, bańki, przesmyku i części śródściennej. Fimbie rozciągają się od końca jajowodu, gdzie chwytają komórkę jajową uwolnioną przez jajnik. Komórka jajowa następnie przemieszcza się przez bańkę, gdzie najprawdopodobniej zostanie zapłodniona, do przesmyku, a na koniec jest przenoszona do macicy przez część śródścienną1. Najbardziej wewnętrzna błona śluzowa jajowodu, która ułatwia transport komórki jajowej, składa się z warstwy nabłonka światła, w tym komórek rzęskowych i wydzielniczych. Komórki rzęskowe są zwykle bardziej skoncentrowane w fimbriach2. Odgrywają integralną rolę w fizycznym przemieszczaniu komórki jajowej przez jajowód z jajnika do macicy. Ich przydatki pozwalają komórkom rzęskowym nie tylko przesuwać komórkę jajową, ale także usuwać stres genotoksyczny po owulacji3.
Komórki nabłonkowe jajowodu wydzielają płyn, który pomaga w odżywianiu i tworzeniu gamet4. Proporcja komórek rzęskowych i wydzielniczych wzdłuż nabłonka jajowodu różni się w stanie pomenopauzalnym wraz ze spadkiem liczby komórek rzęskowych, ponieważ jajowód nie pełni już krytycznej funkcji w transporcie5. Ponadto, w przypadku braku estrogenu, uważa się, że jajowody stają się szczątkowe1,6. Zakłada się, że ta utrata komórek rzęskowych w jajowodzie zwiększa ryzyko rozwoju raka surowiczego7. Ponadto uważa się, że komórki nabłonka wydzielniczego jajowodu powodują zmiany w surowiczym raku śródnabłonkowym jajowodów (STIC), dobrze znanym prekursorze najbardziej agresywnego podtypu raka jajnika jajowodowego, raka surowiczego o wysokim stopniu złośliwości7,8.
Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek nabłonkowych z ludzkich jajowodów i rozdzielenie ich na zawiesiny jednokomórkowe. Protokół ten pozwala uzyskać wzbogaconą populację nabłonka pojedynczych komórek, którą można wykorzystać do wielu analiz. Jak pokazano w tym manuskrypcie, przeprowadziliśmy analizę cytometrii przepływowej i posialiśmy komórki w 2D po izolacji. Analiza cytometrii przepływowej wykazuje obecność pojedynczych komórek, które są w większości żywotne i mają charakter nabłonkowy. W tych analizach uwzględniliśmy cztery markery: e506 dla żywotności, EpCAM dla komórek nabłonkowych, CD45 dla komórek odpornościowych i CD10 dla komórek zrębu. Martwe komórki wykluczono za pomocą markera żywotności e506, a komórki odpornościowe bramkowano za pomocą CD45. Możliwe jest, że zawiesina ma populację komórek odpornościowych; jednakże, aby uzyskać stosunkowo czystą populację komórek nabłonkowych, komórki CD45-dodatnie można zubożyć za pomocą zestawu do zubożenia CD45. Co więcej, po posianiu w hodowli komórki CD45-dodatnie często nie namnażają się. Komórki wyizolowane tą metodą i wyhodowane w 2D wykazują przylegające populacje nabłonka przypominające bruk. Metoda ta może być wykorzystana do generowania preparatów komórkowych, które można przekształcić w jednokomórkowe biblioteki RNA.
Badania mające na celu określenie linii komórkowej nabłonka jajowodu, zmian w tych liniach podczas różnych faz życia reprodukcyjnego oraz wywoływania zdarzeń prowadzących do złośliwej transformacji i genezy stały się bardziej widoczne w ciągu ostatnich czterech lat6,9,10,11,12. Protokół ten przyniesie znaczne korzyści badaniom w tej dziedzinie, zapewniając skuteczny sposób izolowania nabłonka jajowodów i przetwarzania ich w pojedyncze komórki.

<table><tbody><tr><td>1% trypsyna&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>J63993.09</td><td></td></tr><tr><td>100 &mikro; m Sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>5 mL probówki z okrągłym dnem</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>60 mm płytka do hodowli komórkowej</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS430589-500EA</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD10</td><td>BioLegend</td><td>312212</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD326 (Ep-CAM)</td><td>BioLegend</td><td>324218</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD45&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCAM</td><td>Abcam</td><td>ab223582</td><td></td></tr><tr><td>Anty-IgG2a PerCP&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>400250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAX8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>363M-15</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vimentin</td><td>Agilent Technologies</td><td>M072501-2</td><td></td></tr><tr><td>System prowadnic komorowych</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>154917PK</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>17100017</tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Naukowy&nbsp;</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3690</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 506</td><td>Invitrogen</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce punktowe&nbsp;</td><td>VWR</td><td>102091-526</td><td>Dowolne kleszcze precyzyjne, które wybierzesz, będą działać</td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye eFluor 506</td><td>Invitrogen</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Wersja oprogramowania FlowJo 9&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy MACSQuant Analyzer 10&nbsp;</td><td>Kulki kalibracyjne Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-607</td><td></td></tr><tr><td>Mammocult&nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5620</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI31873</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomiocyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PerCP Sprzężony CD45</td><td>BioLegend</td><td>304026</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek&nbsp;</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>TNB-4300-L100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Naukowy&nbsp;</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas-Tubingen&nbsp;</td><td>Narzędzia Fine Science</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD z DAPI</td><td>Fisher Scientific NC9524612</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczna metoda ekstrakcji nabłonka ludzkiego jajowodu do analiz pojedynczych komórek

An Efficient Method for Extracting Human Fallopian Tube Epithelia for Single-cell Analyses

Ludzkie jajowody są nieodłącznym elementem reprodukcji. Zadaniem jajowodów jest umożliwienie tranzytu plemników, komórki jajowej, a jeśli zapłodnienie się powiedzie, zarodka. Komórki nabłonkowe, które wyściełają wewnętrzną powierzchnię jajowodów, są integralną częścią zarówno prawidłowych, jak i nieprawidłowych procesów jajowodowych, w tym inicjacji choroby. Po menopauzie jajowody przestają odgrywać znaczącą rolę w organizmie, a skład komórek śródnabłonkowych ulega zmianie. Opisujemy metodę, w której te komórki nabłonkowe można wyizolować ze świeżych jajowodów przy minimalnym zanieczyszczeniu komórek zrębu do zawiesiny jednokomórkowej. Komórki te mogą być hodowane w hodowli lub wykorzystywane do dalszych analiz, takich jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek. Ten protokół izolacji można osiągnąć w ciągu 4-6 godzin i daje żywe komórki, które można wykorzystać do natychmiastowej dalszej analizy. Ten skuteczny protokół ułatwia izolację komórek nabłonka jajowodów ze wzbogaconą populacją nabłonka.

Uwzględniliśmy siedem próbek jajowodów, z których wyizolowano wzbogaconą populację komórek nabłonkowych (Rycina 2A oraz Rycina dodatkowa S1A). W celu oceny żywotności oraz stopnia wzbogacenia zawiesiny jednokomórkowej w komórki nabłonkowe przeprowadzono cytometrię przepływową. Aby zmierzyć żywotność komórek, barwiono je markerem żywotności e506. Pozwoliło to również na wykluczenie z analizy wszystkich zanieczyszczeń oraz martwych komórek poprzez odpowiednie bramkowanie.
Aby określić skład komórek wyizolowanych za pomocą tej metody, próbki zabarwiono markerem komórek nabłonkowych (EpCAM), markerem komórek zrębu (CD10) oraz markerem komórek odpornościowych (CD45). Jak widać na Rysunku 2B, wyizolowano żywą i wzbogaconą populację komórek nabłonkowych z tkanki jajowodu. Żywotność próbek wynosiła średnio 82%. We wszystkich próbkach, po odrzuceniu komórek CD45-dodatnich, zaobserwowano wzbogaconą populację komórek nabłonkowych, w której komórki EpCAM-dodatnie stanowiły średnio 80% próbki. Wystąpiła pewna kontaminacja komórkami zrębu, jednak wynosiła ona średnio jedynie 7,8%. Rysunek 2C przedstawia wyizolowane komórki w hodowli 2D 4–6 dni po wysianiu. Wyraźnie widać, że wyizolowano komórki nabłonkowe, ponieważ tworzyły one spójne, przylegające skupiska o wyglądzie brukowym. Na dodatkowym Rysunku S1B komórki wysiano po izolacji i hodowano przez 2–6 dni. Do charakterystyki komórek rosnących w hodowli wykorzystano immunocytochemię. Większość komórek w hodowli była dodatnia pod kątem EpCAM oraz markera komórek wydzielniczych, PAX8. Tylko kilka komórek zidentyfikowano jako vimentin-dodatnie. Komórki rzęskowe zaobserwowano w hodowli, co zarejestrowano na nagraniu w dodatkowym Filmie S1.
<img alt="Analiza histologiczna, konfiguracja mikroskopu sekcyjnego, ekstrakcja tkanki, schemat, badanie komórkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67753/67753fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat doświadczalny. (A) Pobranie jajowodów. (B) Usunięcie nadmiaru tkanki tłuszczowej i łącznej. (C) Podział jajowodów na fragmenty o długości ~3-5 mm. (D) Przemycie fragmentów w PBS, następnie inkubacja w EDTA 2x przez 5 min oraz inkubacja w 1% trypsynie przez 40 min w temperaturze 4 ˚C. (E) Przy użyciu dwóch par pęset (jednej do trzymania, drugiej do przesuwania) usunięcie komórek nabłonka z fragmentów jajowodu. (F) Przeniesienie komórek do probówki 15 mL, wirowanie i zliczenie. (G) Resuspensja w DMEM, kolagenazie i DNazie. Trawienie przez 30-45 min. (H) Przefiltrowanie przez sito 100 µm. (I) Zbiór poprzez wirowanie i zliczenie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67753/67753fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza żywotności pacjentów i biomarkerów; wykresy dla EpCAM, CD10; obrazy z mikroskopu hodowli komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67753/67753fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Charakterystyka wyizolowanych komórek nabłonkowych. (A) Tabela z informacjami klinicznymi pacjentów i wynikami cytometrii przepływowej. (B) Cytometrię przepływową przeprowadzono po izolacji, aby wykazać, że wyizolowano wzbogaconą populację komórek nabłonkowych (EpCAM-dodatnich). Kontrola negatywna izotypowa zaznaczona jest na czarno, a wynik eksperymentalny na różowo. (C) Komórki zostały wysiane po izolacji. Zdjęcia wykonano 4–6 dni po wysianiu. Paski skali = 100 µm. Skróty: AUB = abnormalne krwawienia z macicy; EIN = wewnątrznabłonkowa neoplazja endometrium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67753/67753fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Dodatkowa Rycina S1: Dodatkowa charakterystyka wyizolowanych komórek nabłonkowych w hodowli. (A) Tabela z informacjami klinicznymi pacjentek. (B) Wyizolowane komórki hodowano i barwiono na EpCAM, marker komórek wydzielniczych (PAX8) oraz marker komórek zrębowych (Wimentyna) od 2 do 6 dni po wysianiu w celu określenia typu komórek w hodowli. Paski skali = 50 µm. Skróty: EIN: endometrialna neoplazja wewnątrznabłonkowa; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67753/67753_Supplemental%20Figure%201%20(2).pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.</a>
Wideo uzupełniające S1: Nagranie bijących komórek rzęskowych wykonane przy 30-krotnym powiększeniu w celu zademonstrowania komórek rzęskowych w kulturze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67753/Supplemental%20Video%201%20FT4.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Ten protokół opisuje jednodniową metodę izolacji komórek nabłonka ludzkiego jajowodu. Izolowane komórki nabłonkowe można siać w hodowli dwuwymiarowej (2D) lub dysocjować do zawiesin jednokomórkowych i wykorzystywać w dalszych eksperymentach, w tym cytometrii przepływowej i sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki.

Skuteczna metoda ekstrakcji nabłonka ludzkiego jajowodu do analiz pojedynczych komórek

Human fallopian tubes are intrinsic to reproduction. The purpose of the fallopian tubes is to allow for the transit of sperm, the ovum, and if ...

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu i zwalczaniu oporności na chemioterapię w raku jajnika. Naszym celem jest odkrycie mechanizmów i subpopulacji komórkowych napędzających oporność oraz nowych celów w celu wyeliminowania tych agresywnych populacji.Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki ułatwia charakterystykę subpopulacji w heterogennych nowotworach jajnika. Wykorzystujemy nienowotworowe komórki nabłonka jajowodu jako komórkę normalnego pochodzenia do analiz raka jajnika.Skuteczna izolacja komórek nabłonka jajowodu we wzbogaconej zawiesinie pojedynczej komórki pomoże w lepszym zrozumieniu inicjacji surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości. Ta mechaniczna i enzymatyczna technika trawienia oferuje bardziej wydajny proces ekstrakcji wzbogaconej zawiesiny jednokomórkowej żywotnych komórek nabłonka jajowodu.[Narrator] Na początek zbierz świeże ludzkie jajowody do 15 lub 50-mililitrowej probówki zawierającej pożywkę dysocjacyjną i umieść rurkę na lodzie. Przenieść jajowody na sterylną szalkę Petriego zawierającą świeże podłoże dysocjacyjne i umieścić próbkę pod mikroskopem preparacyjnym. Teraz za pomocą cienkich kleszczyków punktowych i nożyczek Vannas-Tubingen wypreparuj tłuszcz, tkankę łączną i wszelkie naczynia otaczające rurki. Następnie przeciąć nożyczkami płaszczyznę koronalną jajowodów, aby utworzyć małe cylindry o średnicy od trzech do pięciu milimetrów. Użyj cienkich = punktowych kleszczy, aby ustabilizować tkankę podczas cięcia. Ostrożnie odessać pożywkę dysocjacyjną z naczynia zawierającego kawałki tkanki. Umyj kawałki chusteczki dwa razy dwoma mililitrami zimnego 1x PBS i lekko obróć płytkę. Po odessaniu PBS inkubować fragmenty tkanki przez pięć minut w zimnym pięciomilimolowym EDTA w temperaturze pokojowej. Zawiesić fragmenty tkanek w zimnym 1% zrównoważonym roztworze soli trypsyny Hanksa i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 40 minut. Odessać 1% zrównoważony roztwór soli trypsyny Hanksa i dwukrotnie umyć kawałki tkanki w zimnym podłożu dysocjacyjnym, aby dezaktywować trypsynę. Inkubować fragmenty tkanek w dwóch mililitrach pożywki dysocjacyjnej z 0,4 miligrama DNazy przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod mikroskopem preparacyjnym, będąc jeszcze w pożywce DNazy, przytrzymaj fragment jajowodu za pomocą kleszczyków tak, aby światło było równoległe do dna naczynia. Użyj kleszczy, aby wielokrotnie naciskać na tkankę, aby usunąć komórki nabłonka ze światła. Potwierdź uwolnienie aureoli komórek wokół tkanki. Przenieś komórki zawierające pożywkę do sterylnej 15-mililitrowej probówki. Umyć szalkę Petriego dwukrotnie pożywką dysocjacyjną i połączyć popłuczyny w tej samej probówce. Wyrzuć pozostałe fragmenty rurki zrębu. Aby zebrać komórki, odwiruj je z natężeniem 500 g przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki dysocjującej. Teraz wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej z równą objętością błękitu trypanowego. Odpipetować 10 mikrolitrów mieszaniny do szkiełka zliczającego w komorze i włożyć ją do licznika komórek, aby określić liczbę komórek. Ponownie zawiesić komórki w dziewięciu mililitrach pożywki dysocjacyjnej zawierającej kolagenazę typu pierwszego i DNazę. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 45 minut w wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 200 obr./min. Aby zebrać komórki, odwiruj z prędkością 500 g przez pięć minut. Po zaessaniu supernatantu ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki dysocjującej, aby zmyć kolagenazę. Przepuścić zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki i odwirować filtrat o masie 500 g przez pięć minut. Jeśli osad komórkowy wydaje się czerwony, przygotuj bufor do lizy RBC, aby zlizować czerwone krwinki. Odessać pożywkę z osadu, dodać pięć mililitrów rozcieńczonego buforu do lizy RBC i inkubować próbkę na lodzie przez trzy minuty. Aby zatrzymać lizę RBC, dodaj 45 mililitrów 1x PBS do probówki. Odwirować probówkę o masie 500 g przez pięć minut. Po zebraniu i ponownym zawieszeniu komórek w jednym mililitrze pożywki dysocjacyjnej wymieszać 10 mikrolitrów zawiesiny komórek z równą objętością błękitu trypanowego. Odpipetować 10 mikrolitrów mieszaniny do szkiełka zliczającego w komorze i włożyć ją do licznika komórek. Analiza cytometrii przepływowej potwierdziła wyizolowanie żywotnej i wzbogaconej populacji komórek nabłonkowych z tkanki jajowodu o średniej żywotności 82%. Po wydostaniu się komórek odpornościowych CD45-dodatnich, komórki nabłonkowe EpCAM dodatnie stanowiły średnio 80% próbki, podczas gdy zanieczyszczenie komórek zrębu CD10 dodatnie było minimalne i wynosiło 7,8%. Wyizolowane komórki nabłonkowe utworzyły przylegające skupiska przypominające kostkę brukową w hodowli 2D po czterech do sześciu dniach posiewu, potwierdzając tożsamość nabłonka. Immunochemia wykazała, że większość hodowanych komórek wykazywała ekspresję EpCAM i PAX8 przy zaledwie kilku komórkach dodatnich pod względem wimentyny. Komórki rzęskowe były obecne w hodowli.

an-efficient-method-for-extracting-human-fallopian-tube-epithelia-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Jajowód (FT) wyłania się jako alternatywne miejsce pochodzenia surowiczego raka jajnika (SOC). Niniejszy protokół opisuje nową metodę izolacji i hodowli ex vivo komórek nabłonkowych jajowodu. System ten odwzorowuje nabłonek in vivo i umożliwia badanie patogenezy SOC.

Kultura ex vivo pierwotnych ludzkich komórek nabłonkowych jajowodu

W tym filmie demonstrujemy zmodyfikowany protokół barwienia Papanicolaou do badania cytologii jajowodów. Technika ta może być wykorzystana do wizualizacji cech cytologicznych złośliwych i niezłośliwych komórek nabłonka jajowodów.

Barwienie papanicolaou: technika wizualizacji cech cytologicznych komórek jajowodów

Zbadaliśmy metodę cytologiczną jajowodów, pobierając próbki jajowodu bezpośrednio po chirurgicznym wycięciu jako narzędzie do wczesnego wykrywania raka jajnika. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół pobierania komórek jajowodu ze świeżo pobranych wycinków chirurgicznych.

Cytologia jajowodów jako obiecujące narzędzie do wczesnego wykrywania raka jajnika

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Przedstawiono metodę mikrodysekcji jajowodu myszy, która pozwala na pobranie poszczególnych segmentów przy zachowaniu integralności RNA. Ponadto opisano nieenzymatyczną procedurę dysocjacji komórek jajowodowych. Metody te są odpowiednie do późniejszej analizy genów i białek funkcjonalnie różnych segmentów jajowodów i zdysocjowanych komórek jajowodowych.

Mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji i oczyszczania komórek jajnika z pęcherzyków antralnych. Omawiamy metody przetwarzania całych jajników w celu kriokonserwacji pasków korowych, a także zbierania nienaruszonych pęcherzyków antralnych, które są traktowane enzymatycznie w celu uwolnienia wielu typów komórek rezydujących w pęcherzykach, w tym ziarnistości, osłonki, śródbłonka, komórek krwiotwórczych i zrębowych.

Ekstrakcja, znakowanie i oczyszczanie komórek specyficznych dla linii z ludzkich pęcherzyków antralnych

Protokół ten szczegółowo opisuje opracowanie wysokostopieńskich modeli mysich raka surowicy (HGSOC) in vitro oraz in vivo. Od wyprowadzenia myszych jajowodów, ich modyfikacji genetycznej w celu powtórzenia genetyki ludzkiego HGSOC, aż po ich wprowadzenie do kaletki jajnikowej myszy syngenetycznych w celu in vivo rozwoju guzów.

Rozwój linii organoidalnych pochodzących z myszy z komórek nabłonkowych jajowodów do modelowania wysokopoziomowego surowiczego raka jajnika

Protokół ten określa ustandaryzowane metody izolacji i przetwarzania płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych oraz niedojrzałych oocytów z procedur IVF, umożliwiając wysokiej jakości analizy molekularne i komórkowe. Te podejścia wspierają badania translacyjne dotyczące płodności, starzenia się reprodukcyjnego i dysfunkcji jajników, wykorzystując materiały zwykle odrzucane w opiece klinicznej.

Pobieranie ludzkiego płynu pęcherzykowego, komórek somatycznych mieszków mieszkowych oraz niedojrzałych oocytów od osób poddawanych zapłodnieniu in vitro

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę izolacji nabłonka żeńskiej moczowodu myszy do analiz wtórnych, w tym cytometrii przepływowej, immunobarwienia i hodowli organoidalnej. Metody dały wzbogacone, żywe komórki nabłonkowe cewki moczowej, co potwierdzono za pomocą analizy cytometrii przepływowej, pełnego obrazowania i wydajnego tworzenia organoidów.

Zoptymalizowana metoda izolacji nabłonka cewki moczowej żeńskiej myszy do analizy pojedynczych komórek i immunofluorescencji

Ten manuskrypt zawiera szczegółową procedurę wstrzykiwania do tętnicy biodrowej (IIA), techniki dostarczania komórek rakowych specyficznie do tkanek kończyn tylnych, w tym kości, w celu ustalenia eksperymentalnych przerzutów do kości. Chociaż początkowo ustalono go na podstawie modeli guzów piersi, protokół ten można łatwo rozszerzyć na inne typy raka.

Iniekcja do tętnicy biodrowej w celu skutecznego i selektywnego modelowania mikroskopijnych przerzutów do kości

Poznaj metodę izolacji nabłonka jajowodu do badań nad rakiem jajnika z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i mechanicznego. Technika ta umożliwia uzyskanie żywych komórek o wysokiej czystości do analizy pojedynczych komórek.

Skuteczna metoda ekstrakcji nabłonka ludzkiego jajowodu do analiz pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów