Skuteczna metoda ekstrakcji nabłonka ludzkiego jajowodu do analiz pojedynczych komórek

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu i zwalczaniu oporności na chemioterapię w raku jajnika. Naszym celem jest odkrycie mechanizmów i subpopulacji komórkowych napędzających oporność oraz nowych celów w celu wyeliminowania tych agresywnych populacji.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki ułatwia charakterystykę subpopulacji w heterogennych nowotworach jajnika. Wykorzystujemy nienowotworowe komórki nabłonka jajowodu jako komórkę normalnego pochodzenia do analiz raka jajnika.

Skuteczna izolacja komórek nabłonka jajowodu we wzbogaconej zawiesinie pojedynczej komórki pomoże w lepszym zrozumieniu inicjacji surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości. Ta mechaniczna i enzymatyczna technika trawienia oferuje bardziej wydajny proces ekstrakcji wzbogaconej zawiesiny jednokomórkowej żywotnych komórek nabłonka jajowodu.

[Narrator] Na początek zbierz świeże ludzkie jajowody do 15 lub 50-mililitrowej probówki zawierającej pożywkę dysocjacyjną i umieść rurkę na lodzie. Przenieść jajowody na sterylną szalkę Petriego zawierającą świeże podłoże dysocjacyjne i umieścić próbkę pod mikroskopem preparacyjnym. Teraz za pomocą cienkich kleszczyków punktowych i nożyczek Vannas-Tubingen wypreparuj tłuszcz, tkankę łączną i wszelkie naczynia otaczające rurki. Następnie przeciąć nożyczkami płaszczyznę koronalną jajowodów, aby utworzyć małe cylindry o średnicy od trzech do pięciu milimetrów. Użyj cienkich = punktowych kleszczy, aby ustabilizować tkankę podczas cięcia. Ostrożnie odessać pożywkę dysocjacyjną z naczynia zawierającego kawałki tkanki. Umyj kawałki chusteczki dwa razy dwoma mililitrami zimnego 1x PBS i lekko obróć płytkę. Po odessaniu PBS inkubować fragmenty tkanki przez pięć minut w zimnym pięciomilimolowym EDTA w temperaturze pokojowej. Zawiesić fragmenty tkanek w zimnym 1% zrównoważonym roztworze soli trypsyny Hanksa i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 40 minut. Odessać 1% zrównoważony roztwór soli trypsyny Hanksa i dwukrotnie umyć kawałki tkanki w zimnym podłożu dysocjacyjnym, aby dezaktywować trypsynę. Inkubować fragmenty tkanek w dwóch mililitrach pożywki dysocjacyjnej z 0,4 miligrama DNazy przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod mikroskopem preparacyjnym, będąc jeszcze w pożywce DNazy, przytrzymaj fragment jajowodu za pomocą kleszczyków tak, aby światło było równoległe do dna naczynia. Użyj kleszczy, aby wielokrotnie naciskać na tkankę, aby usunąć komórki nabłonka ze światła. Potwierdź uwolnienie aureoli komórek wokół tkanki. Przenieś komórki zawierające pożywkę do sterylnej 15-mililitrowej probówki. Umyć szalkę Petriego dwukrotnie pożywką dysocjacyjną i połączyć popłuczyny w tej samej probówce. Wyrzuć pozostałe fragmenty rurki zrębu. Aby zebrać komórki, odwiruj je z natężeniem 500 g przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki dysocjującej. Teraz wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej z równą objętością błękitu trypanowego. Odpipetować 10 mikrolitrów mieszaniny do szkiełka zliczającego w komorze i włożyć ją do licznika komórek, aby określić liczbę komórek. Ponownie zawiesić komórki w dziewięciu mililitrach pożywki dysocjacyjnej zawierającej kolagenazę typu pierwszego i DNazę. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 45 minut w wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 200 obr./min. Aby zebrać komórki, odwiruj z prędkością 500 g przez pięć minut. Po zaessaniu supernatantu ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki dysocjującej, aby zmyć kolagenazę. Przepuścić zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki i odwirować filtrat o masie 500 g przez pięć minut. Jeśli osad komórkowy wydaje się czerwony, przygotuj bufor do lizy RBC, aby zlizować czerwone krwinki. Odessać pożywkę z osadu, dodać pięć mililitrów rozcieńczonego buforu do lizy RBC i inkubować próbkę na lodzie przez trzy minuty. Aby zatrzymać lizę RBC, dodaj 45 mililitrów 1x PBS do probówki. Odwirować probówkę o masie 500 g przez pięć minut. Po zebraniu i ponownym zawieszeniu komórek w jednym mililitrze pożywki dysocjacyjnej wymieszać 10 mikrolitrów zawiesiny komórek z równą objętością błękitu trypanowego. Odpipetować 10 mikrolitrów mieszaniny do szkiełka zliczającego w komorze i włożyć ją do licznika komórek. Analiza cytometrii przepływowej potwierdziła wyizolowanie żywotnej i wzbogaconej populacji komórek nabłonkowych z tkanki jajowodu o średniej żywotności 82%. Po wydostaniu się komórek odpornościowych CD45-dodatnich, komórki nabłonkowe EpCAM dodatnie stanowiły średnio 80% próbki, podczas gdy zanieczyszczenie komórek zrębu CD10 dodatnie było minimalne i wynosiło 7,8%. Wyizolowane komórki nabłonkowe utworzyły przylegające skupiska przypominające kostkę brukową w hodowli 2D po czterech do sześciu dniach posiewu, potwierdzając tożsamość nabłonka. Immunochemia wykazała, że większość hodowanych komórek wykazywała ekspresję EpCAM i PAX8 przy zaledwie kilku komórkach dodatnich pod względem wimentyny. Komórki rzęskowe były obecne w hodowli.