Stworzenie trójwymiarowego modułu kokultury komórek nabłonkowych z wykorzystaniem błon nanowłóknistych

Nasza grupa badawcza wykorzystuje membrany nanowłókniste z polialkoholu winylowego, PVA i poliepsilon-kaprolaktonu, PCL, do opracowania systemu kokultury 3D. Jego celem jest znalezienie odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób błony wspierają komórki nabłonkowe i fibroblasty, naśladują środowisko tkankowe oraz ułatwiają badanie wzorców sygnalizacji i interakcji komórkowych. Pokażemy, że porowate elektrowłókniste błony nanowłókniste umożliwiają komórkom nabłonkowym tworzenie tkanki nabłonkowej, umożliwiając wzrost wielu warstw i fibroblastów w każdej dodatkowej macierzy.

Metody te podkreślają, w jaki sposób rozszerzony system 3D może zapewnić rosnącym tkankom lepsze środowisko w porównaniu z tradycyjnymi hodowlami 2D. Oferujemy system kokultury wykorzystujący zróżnicowane komórki nabłonkowe. Organizowanie przy użyciu komórek macierzystych wymaga złożonej procedury różnicowania, ale nasz model ma zalety w prostocie i oszczędności czasu przy opracowywaniu systemu kokultury 3D.

Koncentrujemy się na przezwyciężeniu ograniczeń rusztowań nanowłóknistych poprzez połączenie membran nanowłóknistych z hydrożelami warstwowymi w kokulturach. Na początek dodaj 0,02 grama kwasu poliakrylowego i jeden gram PVA do czystej szklanej butelki zawierającej pręt magnetyczny. Dodaj 7,8 mililitra wody destylowanej do butelki, a następnie umieść butelkę na mieszadle talerzowym.

Gdy butelka ostygnie do temperatury pokojowej, dodaj do niej 0,2 mililitra aldehydu glutarowego i umieść go z powrotem na mieszadle talerzowym z prędkością 500 obr./min na 30 minut w temperaturze pokojowej. Użyj pięciomililitrowej strzykawki do wirowania elektrycznego. Oddziel tłoki od luf i wyczyść małe plastikowe zanieczyszczenia wewnątrz luf i końcówek tłoków.

Następnie użyj igieł, aby zablokować przepływ płynu i wlej roztwór PVA do każdego cylindra strzykawki. Zamontuj tłoki w beczkach i wyjmij igły. Po złożeniu nowej metalowej igły o grubości 27 umieść ją w przędzarce elektrycznej.

Owiń kolektor szczelnie folią aluminiową. Gdy panel wtryskiwaczy powróci do swojej pierwotnej pozycji, ustaw wirówkę elektryczną na objętość wtrysku wynoszącą dwa mililitry, szybkość wtrysku sześć mikrolitrów na minutę, prędkość rolki 100 obr./min i odległość od końcówki do kolektora 14 centymetrów. Sprawdź przepływ cieczy dla każdej pompy, a następnie uruchom wirówkę elektryczną o potencjale elektrycznym około 12 kilowoltów.

Po zakończeniu procesu elektrowirowania należy oderwać folię zawierającą matę włóknistą od kolektora. Przechowuj matę z nanowłókien w środku osuszającym pod próżnią. Dodaj 1,5 grama PCL i 8,5 mililitra chloroformu do czystej szklanej butelki.

Umieścić butelkę na mieszadle talerzowym i rozpuścić PCL w chloroformie przez 12 godzin w temperaturze pokojowej. Wytnij mały kawałek membrany z nanowłókien, pokryj kawałki cienką warstwą złota, korzystając z procesu automatycznego napylania przez pięć minut. Aby rozpocząć, pokrój spreparowaną matę z nanowłókna PVA na kawałki o pożądanym rozmiarze dla wkładu transwell.

Przygotuj małe naczynie zawierające 1,5 mililitra czystego kwasu solnego. Umieść naczynie z kwasem solnym i kawałkami nanowłókien w komorze próżniowej i zamknij pokrywkę. Następnie otwórz zawór podłączony do pompy próżniowej i odczekaj 10 sekund, aż uniosą się opary kwasu solnego.

Zamknij zawór i traktuj membrany oparami kwasu solnego przez dwie minuty. Po obróbce kwasem solnym dodaj krople wody destylowanej do membran. Umieść membrany na szkiełku podstawowym i zdejmij je z folii.

Użyj automatycznego napylacza, aby pokryć membrany na taśmie węglowej cienką warstwą złota. Następnie umyj nanomembrany PVA usieciowane trzykrotnie kwasem solnym za pomocą PBS i zanurz je w pożywce hodowlanej. Po namoczeniu sprawdź pH, aby potwierdzić brak pozostałości kwasu solnego.

Na początek pokrój maty z nanowłókien na okrągłe kawałki o średnicy 10 milimetrów w przypadku nanomembran PVA i 13 milimetrów w przypadku nanomembran PCL. Wymieszaj bazę SYLGARD 184 i utwardzacz w stosunku masowym 10 do jednego w plastikowym kubku. Użyj czystego szkiełka szkiełkowego, aby energicznie mieszać roztwór polidimetylosiloksanu lub PDMS przez dwie do trzech minut, aż utworzą się bąbelki.

Rozprowadź PDMS równomiernie na szkiełku podstawowym. Zanurz lekko dolną krawędź wkładki w PDMS. Następnie umieść wkładkę do góry nogami na podgrzewaczu do szkiełek na 10 do 15 minut, aż PDMS stwardnieje.

Sprawdź PDMS za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby upewnić się, że nie jest już lepki. Teraz delikatnie dociśnij wkładkę do elementu membrany nano PVA, tak aby spód wkładki był skierowany w stronę membrany z nanowłókien. Dodaj kroplę wody destylowanej do środka studzienki i za pomocą kleszczy ostrożnie usuń folię.

Następnie umieść wkładkę w nowej płytce 24-dołkowej i pozostaw membranę do wyschnięcia. Podczas mocowania elementu nanomembrany zanurz końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów w mieszaninie PDMS i umieść ją dokładnie w czterech rogach i środku studzienki. Umieść płytkę na podgrzewaczu do szkiełek i pozwól PDMS stwardnieć przez pięć do siedmiu minut.

Następnie umieść kawałek nanomembrany PCL w studzience zawierającej PDMS ze stroną z nanowłókien przymocowaną do PDMS. Użyj małej, czystej szczoteczki, aby lekko docisnąć foliową stronę membrany, aby uzyskać pełne mocowanie. Następnie dodaj 0,2 mililitra 70% etanolu do studzienki, aby ułatwić usunięcie folii.

Wysterylizuj wkładkę i dno dobrze w ustawieniu transwell w świetle ultrafioletowym przez noc. Następnego dnia dobrze umyj wkładkę i dno, dodając 200 mikrolitrów PBS do wkładki i 500 mikrolitrów do studzienki dolnej przez trzy cykle po 10 minut każdy. Gdy komórki osiągną zlewność od 70 do 80%, umyj je 10 mililitrami PBS i dodaj dwa mililitry 0,05% trypsyny EDTA, aby je wytrypsynować.

Delikatnie postukaj w naczynie, aby usunąć komórki z dna. Dodaj osiem mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej, aby zneutralizować enzym trypsyny, a następnie przenieś zawiesinę komórkową do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować probówkę o sile 400G przez pięć minut.

Po wyrzuceniu nadnatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach kompletnego DMEM z podłożem F12. Następnie napełnij dolną studzienkę 500 mikrolitrami kompletnego podłoża DMEM F12. Przenieś wkładkę dołączoną do membrany nanowłóknistej PVA do transwella i dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny komórek MLE-12.

Następnie dobrze wypełnij dolną membranę nanowłóknistą PCL 500 mikrolitrami zawiesiny komórek NIH3T3. Po inkubacji komórek przez dwie godziny, złóż komórkę MLE-12 zawierającą wkładkę i komórkę NIH3T3 zawierającą dolną studzienkę w układzie transwell, Rozkład przestrzenny komórek NIH3T3 i komórek MLE-12 w systemie kokultury był wyraźnie rozróżnialny, z zielonymi komórkami NIH3T3 rozproszonymi na różnych głębokościach i czerwonymi komórkami MLE-12 tworzącymi warstwy. Komórki NIH3T3 infiltrują błonę nanowłóknistą PCL i rozciągają się wzdłuż osi nanowłókien, podczas gdy komórki MLE-12 przylegają do powierzchni błony nanowłóknistej PDA i wykazują agregację.