Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy

Badania te koncentrowały się na opracowaniu systemu hodowli 3D do wzrostu pęcherzyków in vitro i dojrzewania oocytów. Stworzenie takiego systemu przy użyciu składników natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej komórki usprawni rozwój pęcherzyków. Największym wyzwaniem jest zastosowanie wiedzy z modeli zwierzęcych do hodowli mieszków włosowych u ludzi.

Dostęp do ludzkiej tkanki jajnika jest ograniczony. A ludzkie pęcherzyki wymagają znacznie dłuższego czasu w hodowli, aby osiągnąć dojrzałość oocytów. Model hodowli 3D opracowany w tym badaniu może być szczególnie przydatny do hodowli ludzkich pęcherzyków jajnikowych, umożliwiając zachowanie architektury 3D przez dłuższy czas potrzebny w hodowli do dojrzewania oocytów.

Na początek należy pobrać jajniki od 10 do 14 dniowych młodych myszy B6D2F1 do zabiegu. Odpipetować 6 mililitrów wstępnie zbilansowanej pożywki do hodowli pęcherzyków (FCM) do dwóch 60-milimetrowych szalek i nałożyć na olej mineralny, a następnie inkubować. Odpipetować 1 mililitr kolagenazy do środkowej studzienki naczynia i 3 mililitry tkanki jajnikowej lub pożywki OT do zewnętrznej studzienki.

Przenieś jajniki do roztworu kolagenazy. Pod koniec inkubacji kolagenazy przenieś jajniki poddane kolagenazie do zewnętrznego dołka w celu wypłukania. Wymień mikropipety i przenieś jajniki do świeżego naczynia wypełnionego pożywką OT.

Aby pobrać mieszki włosowe, należy wielokrotnie odsysać i wydalać tkankę jajnikową potraktowaną enzymem przez końcówki pipet przycięte do różnych rozmiarów. Mechanicznie drażnić tkankę za pomocą igieł o rozmiarze 27 do ośmiu uwolnień mieszków włosowych. Zbadaj pod mikroskopem preparacyjnym przy 40-krotnym powiększeniu i wybierz wtórne pęcherzyki przedantralne z centralnie umieszczonym oocytem zamkniętym w nienaruszonej błonie podstawnej do świeżej naczynia OT.

Umieść szalkę FCM2 w inkubatorze na 60 minut przed rozpoczęciem procesu zatapiania. Przygotuj dwie 25 mikrolitrowe krople żelu HA bez nadtlenku wodoru na pokrywce do spłukania. Przenieś mieszki włosowe lub klastry mieszków włosowych, które mają być osadzone, z naczynia FCM do kropli kwasu hialuronowego lub żelu HA, aby spłukać z pożywki hodowlanej.

Umieść naczynie FCM z powrotem pod bełkotką, aby zagazować. Aby osadzić mieszki włosowe, umieść 1 mikrolitr kropli 0,03% nadtlenku wodoru na pokrywce 60-milimetrowego naczynia. Teraz dodaj 25 mikrolitrów 3 miligramów na mililitr żelu HA i wymieszaj.

Odpipetować około ośmiu do 10 mikrolitrów mieszaniny nadtlenku wodoru HA do dwóch oddzielnych dołków ośmiodołkowej szalki hodowlanej. I szybko przenieś mieszki włosowe, klastry mieszków włosowych lub fragmenty tkanki jajnikowej do środka każdej kropli. Upewnij się, że w kropli nie ma pęcherzyków.

Po trzech minutach dodaj 100 mikrolitrów wstępnie zrównoważonej pożywki do hodowli mieszków włosowych do każdej studzienki. Pokryj ciepłym, wstępnie zrównoważonym olejem mineralnym i inkubuj naczynie. Przygotować sprzęt i roztwory wymagane do procesu witryfikacji.

Umieść nośnik RI w gnieździe w kriopojemniku zawierającym ciekły azot. Umieść dwie krople podgrzanego roztworu do witryfikacji 1 lub VS1 obok siebie na pokrywce 60-milimetrowego naczynia w pobliżu góry. Teraz umieść dwa mieszki włosowe w pierwszej kropli, spłucz i szybko przenieś je do drugiej kropli VS1 na pięciominutową inkubację.

Podczas inkubacji pęcherzyków wykonaj trzy krople VS2 tuż poniżej kropli VS1. Następnie szybko przesuwaj mieszki włosowe sekwencyjnie przez trzy krople VS2 w ciągu 60 sekund. W celu witryfikacji podnieś mieszki włosowe z VS2.

Wyświetl nośnik RI w zakresie analizy. I dostosuj ostrość, aby zwizualizować mały otwór w plastikowym patyczku. Umieść mieszki włosowe z minimalną ilością płynu w otworze.

Wrzuć plastikowy patyczek do wstępnie schłodzonej słomki zewnętrznej. I użyj zgrzewarki ultradźwiękowej, aby zamknąć słomkę. Umieść słomkę w kielichu przymocowanym do trzciny kriogenicznej.

Przykryj trzcinę plastikową tuleją ochronną i zanurz ją w ciekłym azocie. W przypadku witryfikacji otwartego nośnika należy przygotować nośnik, wkładając metalowy trzpień CL do namagnesowanej nasadki fiolki, zapewniając mocne trzymanie. Umieść stojak w pudełku kriogenicznym, aby pomieścić fiolki kriogeniczne, upewniając się, że ciekły azot znajduje się poniżej górnej części fiolek.

Napełnij namagnesowaną, wynalezioną fiolkę kriogeniczną ciekłym azotem i umieść w stojaku. Chwyć otwarty nośnik CL za dołączoną nasadkę magnetyczną za pomocą różdżki magnetycznej. Zanurz nośnik CL w osobnej kropli VS2, aby utworzyć film krioprotektantowy.

Zbierz wszystkie mieszki włosowe lub skupiska mieszków włosowych i umieść je na folii z minimalną ilością płynu. Natychmiast zanurzyć CL w fiolce kriogenicznej wypełnionej ciekłym azotem w celu zeszklenia próbki. Umieść fiolkę krio na trzcinie kriogenicznej, a następnie przykryj plastikową tuleją.

Zanurz trzcinę w zbiorniku na ciekły azot. Przygotuj naczynie ze studzienką środkową z 3 mililitrami wstępnie zrównoważonego FCM w studzience zewnętrznej i 1 mililitrem w studzience środkowej. Po nałożeniu podłoża na olej, umieść naczynie pod bełkotką do gazowania.

Umieść 0,5 mililitra roztworów rozgrzewających WS1 i WS2 wstępnie zrównoważonych do 37 stopni Celsjusza w dwóch oznaczonych środkowych naczyniach. Przenieś laski kriogeniczne z próbkami ze zbiornika magazynowego do kriopojemnika wypełnionego ciekłym azotem. Najpierw zdejmij plastikową osłonę trzciny.

Następnie, trzymając słomkę zanurzoną, wyjmij ją z kielicha i wsuń do szczeliny w pojemniku kriogenicznym. Przetnij zewnętrzną słomkę tuż nad czarną kropką. Wyjmij wewnętrzny plastikowy patyczek z zewnętrznej słomki i szybko zanurz patyczek w WS1, delikatnie obracając, aby rozładować mieszki włosowe w ciągu 10 sekund.

Po dwóch minutach w WS1 użyj mikropipety, aby przenieść pęcherzyki lub klastry pęcherzyków do WS2 na trzyminutową inkubację. Następnie przenieś je do naczynia FCM i inkubuj mieszki włosowe przez jedną do dwóch godzin w środku na długo przed osadzeniem, W celu podgrzania CL otwartego nośnika powtórz przygotowanie naczynia FCM i WS. Przenieś trzcinę kriogeniczną do pudełka kriogenicznego i zdejmij plastikową osłonę trzciny.

Użyj różdżki magnetycznej, aby podnieść nasadkę fiolki kriogenicznej, aż metalowy trzpień CL będzie widoczny. Chwyć nasadkę za pomocą dołączonego nośnika CL za pomocą różdżki magnetycznej. I szybko zanurz CL w WS1, obracając się, aby rozładować mieszki włosowe w ciągu 10 sekund.

Wzrost pęcherzyków przedantralnych utrzymano w trójwymiarowej kulturze żelu hialuronowego, zachowując natywną architekturę pęcherzyków z antrum widocznym po 12 dniu. Pęcherzyki zamknięte w żelu hialuronowym wykazywały ekspansję promieniową w wyniku proliferacji komórek ziarnistości, przy czym średnica pęcherzyków wzrosła z około 139,8 mikrometra do 385,6 mikrometra w okresie hodowli. Owulowane oocyty metafazy drugiej znaleziono w pobliżu pęcherzyka po wyzwalaczu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej.

Oocyty miały średnicę około 84,8 mikrometra. W przypadku świeżych jajników zarówno pojedyncze pęcherzyki, jak i skupiska mieszków włosowych wykazywały dobre tempo dojrzewania. Skupiska pęcherzyków z kriokonserwowanych jajników wykazywały niższe tempo dojrzewania, co prowadziło do przedwczesnej ekstruzji oocytów.

Izolowana kriokonserwacja pęcherzyków była bardziej skuteczna niż konserwacja całego jajnika. Witryfikacja pęcherzyków na obu nośnikach osiągnęła wysokie tempo dojrzewania, niezależnie od różnic w szybkości chłodzenia. System otwartego nośnika CL pozwolił na skuteczną kriokonserwację wielu mieszków włosowych, skracając czas przetwarzania.