Name: Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych myszy w hydrożelu hialuronowym oraz techniki kriokonserwacji. To podejście wspiera dojrzewanie oocytów i zachowanie architektury tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować całemu zespołowi embriologicznemu w Cleveland Clinic za ich pomoc, a także działowi REI, a w szczególności dr Falcone za wsparcie. Projekt ten został sfinansowany z funduszu badawczego w Cleveland Clinic.

<ol><li>Telfer, E. E., Andersen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+and+maturation+of+primordial+follicles+and+immature+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">In vitro growth and maturation of primordial follicles and immature oocytes.</a> Fertil Steril. 115 (5), 1116-1125 (2021).</li>
<li>Telfer, E. E., McLaughlin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Natural history of the mammalian oocyte.</a> Reprod Biomed Online. 15 (3), 288-295 (2007).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+follicle+growth+supports+human+oocyte+meiotic+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation.</a> Sci Rep. 5, 17323(2015).</li>
<li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Dev Biol. 226 (2), 167-179 (2000).</li>
<li>Diaz, F. J., Wigglesworth, K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+are+required+for+the+preantral+granulosa+cell+to+cumulus+cell+transition+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocytes are required for the preantral granulosa cell to cumulus cell transition in mice.</a> Dev Biol. 305 (1), 300-311 (2007).</li>
<li>Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+oocytes+regulate+metabolic+cooperativity+between+granulosa+cells+and+oocytes%3A+amino+acid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport.</a> Biol Reprod. 73 (2), 351-357 (2005).</li>
<li>Dadashzadeh, A., Moghassemi, S., Shavandi, A., Amorim, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+biomaterials+for+ovarian+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">A review on biomaterials for ovarian tissue engineering.</a> Acta Biomater. 135, 48-63 (2021).</li>
<li>Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ovarian+follicle+growth%3A+a+comprehensive+analysis+of+key+protocol+variablesdagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro ovarian follicle growth: a comprehensive analysis of key protocol variablesdagger.</a> Biol Reprod. 103 (3), 455-470 (2020).</li>
<li>Belli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+3D+culture+of+mouse+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a 3D culture of mouse ovarian follicles.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 931-937 (2012).</li>
<li>Berkholtz, C. B., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+functions+in+follicle+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Reprod+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix functions in follicle maturation.</a> Semin Reprod Med. 24 (4), 262-269 (2006).</li>
<li>Desai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+follicle+growth%3A+overview+of+culture+models%2C+biomaterials%2C+design+parameters+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro follicle growth: overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions.</a> Reprod Biol Endocrinol. 8, 119(2010).</li>
<li>Shea, L. D., Woodruff, T. K., Shikanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+the+ovarian+follicle+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioengineering the ovarian follicle microenvironment.</a> Annu Rev Biomed Eng. 16, 29-52 (2014).</li>
<li>Paulini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+human+preantral+follicles+after+cryopreservation+of+ovarian+tissue%2C+follicle+isolation+and+short-term+xenografting%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of human preantral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicle isolation and short-term xenografting.</a> Reprod Biomed Online. 33 (3), 425-432 (2016).</li>
<li>West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+alginate+hydrogels+and+their+effects+on+in+vitro+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development.</a> Biomaterials. 28 (30), 4439-4448 (2007).</li>
<li>Joo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+collagen+hydrogel+on+3D+culture+of+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">The effect of collagen hydrogel on 3D culture of ovarian follicles.</a> Biomed Mater. 11 (6), 065009(2016).</li>
<li>Telfer, E., Torrance, C., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+study+of+cultured+preantral+ovarian+follicles+of+mice+after+transplantation+under+the+kidney+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Morphological study of cultured preantral ovarian follicles of mice after transplantation under the kidney capsule.</a> J Reprod Fertil. 89 (2), 565-571 (1990).</li>
<li>Torrance, C., Telfer, E., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+the+development+of+isolated+mouse+pre-antral+follicles+in+collagen+gel+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of the development of isolated mouse pre-antral follicles in collagen gel culture.</a> J Reprod Fertil. 87 (1), 367-374 (1989).</li>
<li>Dong, C., Yonggang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+collagen+scaffold+in+tissue+engineering%3A+recent+advances+and+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Application of collagen scaffold in tissue engineering: recent advances and new perspectives.</a> Polymers. 8 (2), 42(2016).</li>
<li>Le, B. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose-based+3D+culture+improved+the+developmental+competence+of+oocyte-granulosa+complex+isolated+from+porcine+preantral+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Agarose-based 3D culture improved the developmental competence of oocyte-granulosa complex isolated from porcine preantral follicle.</a> Theriogenology. 223, 11-21 (2024).</li>
<li>Park, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+on+an+agarose+matrix+improves+the+developmental+competence+of+porcine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation on an agarose matrix improves the developmental competence of porcine oocytes.</a> Theriogenology. 157, 7-17 (2020).</li>
<li>Zaniker, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensionally+printed+agarose+Micromold+supports+scaffold-free+mouse+ex+vivo+follicle+growth%2C+ovulation%2C+and+luteinization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensionally printed agarose Micromold supports scaffold-free mouse ex vivo follicle growth, ovulation, and luteinization.</a> Bioengineering. 11 (7), 719(2024).</li>
<li>Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+for+the+three-dimensional+culture+of+granulosa+cell-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes.</a> Tissue Eng. 9 (5), 1013-1021 (2003).</li>
<li>West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+follicle+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Reprod+Med%22%5BJournal%5D)">Engineering the follicle microenvironment.</a> Semin Reprod Med. 25 (4), 287-299 (2007).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+growth%2C+and+maturation+of+secondary+follicles+from+prepubertal%2C+young%2C+and+older+adult+rhesus+monkeys+during+encapsulated+three-dimensional+culture%3A+effects+of+gonadotropins+and+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Survival, growth, and maturation of secondary follicles from prepubertal, young, and older adult rhesus monkeys during encapsulated three-dimensional culture: effects of gonadotropins and insulin.</a> Reproduction. 140 (5), 685-697 (2010).</li>
<li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+follicles+produce+live%2C+fertile+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).</li>
<li>Amorim, C. A., Van Langendonckt, A., David, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+human+pre-antral+follicles+after+cryopreservation+of+ovarian+tissue%2C+follicular+isolation+and+in+vitro+culture+in+a+calcium+alginate+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix.</a> Hum Reprod. 24 (1), 92-99 (2009).</li>
<li>Converse, A., Zaniker, E. J., Amargant, F., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+folliculogenesis+and+oogenesis+outside+the+body%3A+encapsulated+in+vitro+follicle+growth+dagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Recapitulating folliculogenesis and oogenesis outside the body: encapsulated in vitro follicle growth dagger.</a> Biol Reprod. 108 (1), 5-22 (2023).</li>
<li>Mainigi, M. A., Ord, T., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+and+developmental+competence+in+mice+are+compromised+following+follicle+development+in+vitro+using+an+alginate-based+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Meiotic and developmental competence in mice are compromised following follicle development in vitro using an alginate-based culture system.</a> Biol Reprod. 85 (2), 269-276 (2011).</li>
<li>Kreeger, P. K., Deck, J. W., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+regulation+of+ovarian+follicle+development+using+alginate-extracellular+matrix+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The in vitro regulation of ovarian follicle development using alginate-extracellular matrix gels.</a> Biomaterials. 27 (5), 714-723 (2006).</li>
<li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+fibrin-alginate+matrices+for+in+vitro+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development.</a> Biomaterials. 30 (29), 5476-5485 (2009).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Irving-Rodgers, H. F., Rodgers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+of+the+developing+ovarian+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Reprod+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix of the developing ovarian follicle.</a> Semin Reprod Med. 24 (4), 195-203 (2006).</li>
<li>Salustri, A., Camaioni, A., Di Giacomo, M., Fulop, C., Hascall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+and+proteoglycans+in+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan and proteoglycans in ovarian follicles.</a> Hum Reprod Update. 5, 293(1999).</li>
<li>Rashki Ghaleno, L., Cristian, P. P., Shahverdi, A., Dardmeh, F., Alipour, H., Valojerd, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+role+of+hyaluronic+acid+in+reproductive+biology+and+beyond%3A+Applications+in+assisted+reproduction+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring the role of hyaluronic acid in reproductive biology and beyond: Applications in assisted reproduction and tissue engineering.</a> Adv. Biology. 8 (6), e202300621(2024).</li>
<li>Desai, N. N., Goldberg, J. M., Austin, C., Falcone, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+Rapid-i+carrier+is+an+effective+system+for+human+embryo+vitrification+at+both+the+blastocyst+and+cleavage+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The new Rapid-i carrier is an effective system for human embryo vitrification at both the blastocyst and cleavage stage.</a> Reprod Biol Endocrinol. 11, 41(2013).</li>
<li>Desai, N., Abdelhafez, F., Calabro, A., Falcone, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+culture+of+fresh+and+vitrified+mouse+pre-antral+follicles+in+a+hyaluronan-based+hydrogel%3A+a+preliminary+investigation+of+a+novel+biomaterial+for+in+vitro+follicle+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Three dimensional culture of fresh and vitrified mouse pre-antral follicles in a hyaluronan-based hydrogel: a preliminary investigation of a novel biomaterial for in vitro follicle maturation.</a> Reprod Biol Endocrinol. 10 (1), 29(2012).</li>
<li>Desai, N., Spangler, M., Nanavaty, V., Gishto, A., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+hyaluronan-based+biomatrix+for+3-D+follicle+culture+yields+functionally+competent+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">New hyaluronan-based biomatrix for 3-D follicle culture yields functionally competent oocytes.</a> Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 148(2022).</li>
<li>Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+antral+oocytes+based+on+nucleolar+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar chromatin organization.</a> J Vis Exp. (107), e53616(2016).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+ovarian+tissue+by+solid-surface+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Obstet+Gynecol+Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human ovarian tissue by solid-surface vitrification.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 139 (2), 193-198 (2008).</li>
<li>Chan, J., Darr, A., Alam, D., Calabro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+a+novel+cross-linked+hyaluronan+hydrogel+for+use+as+a+soft-tissue+filler%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cosmetic+Sur%22%5BJournal%5D)">Investigation of a novel cross-linked hyaluronan hydrogel for use as a soft-tissue filler.</a> Am J Cosmetic Sur. 22, 105-108 (2005).</li>
<li>Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+ovarian+follicle+encapsulation+and+culture+in+a+proteolytically+degradable+3-dimensional+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system.</a> J Vis Exp. (49), e2695(2011).</li>
<li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biol Reprod. 75 (6), 916-923 (2006).</li>
<li>West-Farrell, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+follicle+microenvironment+regulates+antrum+formation+and+steroid+production%3A+alterations+in+gene+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">The mouse follicle microenvironment regulates antrum formation and steroid production: alterations in gene expression profiles.</a> Biol Reprod. 80 (3), 432-439 (2009).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+three-dimensional+culture+supports+development+of+nonhuman+primate+secondary+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Encapsulated three-dimensional culture supports development of nonhuman primate secondary follicles.</a> Biol Reprod. 81 (3), 587-594 (2009).</li>
<li>Wu, J., Nayudu, P. L., Kiesel, P. S., Michelmann, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteinizing+hormone+has+a+stage-limited+effect+on+preantral+follicle+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Luteinizing hormone has a stage-limited effect on preantral follicle development in vitro.</a> Biol Reprod. 63 (1), 320-327 (2000).</li>
</ol>

Brak konfliktów interesów i ujawniania informacji.

Możliwość kontrolowania właściwości mechanicznych i biodegradowalności hydrożelu HA związanego z tyraminą oferuje wiele korzyści w zastosowaniach inżynierii tkankowej. Nasze laboratorium jest pierwszym, które stosuje ten specyficzny żel HA do wzrostu pęcherzyków jajnikowych. Ten opatentowany żel hialuronianu sodu podstawiony tyraminą (TS-NAHY) to nowatorski system hydrożelowy na bazie kwasu hialuronowego opracowany w Cleveland Clinic. Sieciowanie żelu odbywa się poprzez wystawienie peroksydazy w aktywowanej mieszaninie żelu na działanie środka utleniającego. Można to zrobić zarówno in vitro , jak i in vivo. Uformowane hydrożele TS-NAHY wykazują szerokie spektrum właściwości od słabego żelu, pasty do kruchego ciała stałego, w zależności od stężenia żelu40.
Rozczarowujący postęp w zakresie posiewu pęcherzyków jajnikowych podkreśla potrzebę opracowania nowych modeli hodowli. Bardziej korzystnym podejściem może być stworzenie systemu hodowli opartego wyłącznie na natywnych składnikach macierzy zewnątrzkomórkowej. Opisany model hodowli HA jest łatwy w użyciu w sposób fizjologiczny i nie wymaga stosowania dodatkowych komponentów ECM. Żel jest przezroczysty, co pozwala na szczegółową wizualizację mieszków włosowych. Lepkosprężyste właściwości żelu HA ułatwiają regulację sztywności, a także podatności na formowanie. Ta cecha zwiększa wszechstronność tej biomatrycy. Sztywność biomatrycy może wpływać na proliferację komórek ziarnistych i tworzenie antrum 30,41,42. Doniesiono, że pęcherzyki pochodzące ze środowisk hodowlanych sprzyjających tworzeniu antrum mają inne profile ekspresji genów niż te w niewspierającym systemie hodowli43. Wydaje się, że pęcherzyki naczelnych wymagają sztywniejszej macierzy44. Dostosowanie biomatrycy do wymagań różnych gatunków zwierząt, w tym ludzi, będzie prawdopodobnie ważne dla pomyślnego dojrzewania in vitro.
W przypadku wzrostu pęcherzyków przedantralnych myszy przetestowaliśmy stężenia żelu w zakresie 2-5 mg/ml36. Tempo dojrzewania oocytów wahało się od 44% do 58%. Wyższe stężenia żelu HA pozwoliły na większą podatność na formowanie i zachowanie struktury 3D, ale miało to wpływ na ekspansję mieszków włosowych. Niższe stężenia kwasu hialuronowego pozwalały na bardziej promieniową ekspansję pęcherzyka, ale zwiększały ryzyko spontanicznego wytłaczania pęcherzyka przed końcem IVC. Stężenie 3-3,5 mg/ml HA działało najlepiej w przypadku mysich pęcherzyków przedantralnych. Utrzymanie małej kropli żelu było niezbędne do tworzenia kulek żelu HA o wystarczającej głębokości, aby utrzymać mieszki włosowe w konfiguracji 3D przez cały IVC. Większe krople spłaszczają się, co skutkuje opadaniem mieszków włosowych przez żel i przyczepianiem się do powierzchni płytki. Jednym z ograniczeń stosowania tego biomateriału do zatapiania jest niezwykle szybki czas żelowania. Utrudnia to wysiew więcej niż dwóch kulek żelowych HA na raz. Zwiększenie efektywności wysiewu mieszków włosowych do żelu HA to jeden z obszarów, w którym staramy się poprawić.
Hodowla klastrów mieszków włosowych w środowisku 3D z wykorzystaniem HA ma ogromny potencjał. Normalna architektura jajników jest zachowana, z pęcherzykami o różnej wielkości stykającymi się ze sobą i podścieliskiem. LH może pomóc we wzroście mniejszych pęcherzyków przedantralnych w FL-C poprzez indukowanie zmian we wczesnych różnicujących się komórkach oponowych, dlatego został włączony do pożywki FCM45. Kontynuowanie hodowli FL-C przez ostatnie 12 dni, aby sprawdzić, czy nowa fala wzrostu może zostać zainicjowana w którymkolwiek z mniejszych pęcherzyków nadal osadzonych po wyzwalaczu hCG, wymaga dalszych badań. Dalsza optymalizacja środowiska hodowlanego może być warunkiem wstępnym hodowli pęcherzyków o różnych zakresach wielkości we fragmencie tkanki. Zaletą tego 3-D modelu hodowli HA z FL-C jest to, że umożliwia on dokładne naśladowanie układu pęcherzyków i interakcji in vivo . Inną ważną cechą jest to, że w przeciwieństwie do alginianu wapnia i innych systemów polimerowych, owulacja i dojrzewanie mogą być indukowane bez fizycznego usuwania pęcherzyków z tkanki lub matrycy żelowej.
Czas potrzebny na hodowlę pęcherzyków in vitro i uzyskanie dojrzałych oocytów do zamrożenia jest długi, zwłaszcza u dużych ssaków. Zdolność do kriokonserwacji pobranych mieszków włosowych lub skupisk mieszków włosowych stanowi sposób na opóźnienie tego kroku na późniejszy i prawdopodobnie bardziej korzystny czas. Jeśli taka technologia będzie mogła pewnego dnia zostać zastosowana do ludzkich pęcherzyków podczas pobierania jajników, może to być korzystne. Kriokonserwacja całych jajników w celu zachowania płodności jest obecnie jedyną opcją dla pacjentek. Ale czy jest to rzeczywiście najlepsza metoda, pozostaje do ustalenia. W tym artykule przedstawiamy metodologię witryfikacji kriokonserwacji pęcherzyków przedantralnych, która zapewnia doskonałe wskaźniki przeżycia i dojrzewania po ociepleniu po hodowli 3D.
Podsumowując, opisaliśmy nowy model hodowli 3D z wykorzystaniem hialuronianu, składnika natywnego ECM. Technika enkapsulacji kwasu hialuronowego pozwala na zatrzymanie czynników troficznych w bliskiej odległości od rozwijających się pęcherzyków. Metodologia enkapsulacji w biomatrycy jest prosta i może pomieścić izolowane pęcherzyki, a także klastry mieszków włosowych. To ostatnie może otworzyć nowe ścieżki badań i zapewnić wgląd w podstawową biologię folikulogenezy i jej regulacji. Wykazano, że oocyty z pęcherzyków otoczonych HA są funkcjonalnie kompetentne37. Oocyty te mogą być zapładniane, tworzyć blastocysty in vitro i zagnieżdżać się po przeniesieniu do myszy w pseudociąży. Dane te potwierdzają słuszność stosowania kwasu hialuronowego sprzężonego z tyraminą jako biomatrycy do hodowli pęcherzyków 3D i dojrzewania oocytów in vitro. Protokół ten może być potencjalnie zastosowany do hodowli pęcherzyków jajnikowych w innych modelach zwierzęcych, w tym u ludzi. Innymi możliwymi zastosowaniami tego systemu żelu 3-D HA mogą być ciało zarodkowe i hodowla organoidów.

Folikulogeneza u ludzi in vitro pozostaje wyzwaniem nawet cztery dekady po pierwszym porodzie z zapłodnienia in vitro. Do tej pory nadal brakuje metodologii hodowli ludzkich pęcherzyków jajnikowych, która wspierałaby produkcję zdolnego do życia zarodka, w wyniku którego urodziłoby się zdrowedziecko1. Optymalne właściwości fizyczne niezbędne do wzrostu ludzkich mieszków włosowych in vitro nie zostały jeszcze określone. Nienaruszony jajnik jest wypełniony tysiącami pęcherzyków na różnych etapach rozwoju, a regulacja ich wzrostu jest złożonym procesem (ryc. 1)2. Oocyty w stadium pęcherzyków rozrodczych (GV) z ludzkich pęcherzyków przedantralnych potrzebują nawet 30 dni w hodowli, aby osiągnąć dojrzałość mejotyczną i osiągnąć metafazę II etap3. Dwukierunkowa komunikacja między oocytem a otaczającymi komórkami ziarnistymi poprzez połączenia szczelinowe ma kluczowe znaczenie dla dojrzewania cytoplazmatycznego i jądrowego 4,5,6.
Konwencjonalne systemy hodowli 2D nie są idealne do hodowli pęcherzyków, zwłaszcza w większych modelach ssaków, które wymagają dłuższego czasu w hodowli. Pęcherzyki przyczepiają się do naczynia, a połączenie między komórkami ziarnistymi a oocytem staje się słabsze, gdy komórki ziarniste migrują. Trójwymiarowe (3-D) systemy hodowli mieszków włosowych pojawiły się zatem jako sposób na ściślejsze naśladowanie fizjologii in vivo 7,8.
Enkapsulacja pęcherzyków w macierzy w celu promowania wzrostu 3D była jednym z podejść do zachowania architektury pęcherzyków podczas hodowli in vitro (IVC). Biomatryce z polimerów naturalnych (takich jak kolagen, agaroza, fibryna, alginian i kwas hialuronowy), a także polimerów syntetycznych (takich jak glikol polietylenowy, alkohol poliwinylowy i kwas poliglikolowy), zostały przetestowane 7,9,10,11,12,13 . Wykazano, że właściwości mechaniczne biomatrycy wpływają na dyfuzję składników odżywczych, różnicowanie komórek nabłonkowych, tworzenie antrum, a także wydzielanie hormonów14. Kolagen, jako część naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej komórki (ECM), jest jedną z najwcześniejszych testowanych matryc i początkowo był obiecujący 15,16,17. Jednak logistyka standaryzacji preparatów kolagenu, słabe właściwości mechaniczne i stabilność ograniczyły jego zastosowanie18. Agaroza została przetestowana na kompleksach wzgórek-oocyty (COC) uwalnianych z pęcherzyków antralnych, a także pęcherzyków pierwotnych19,20. Niedawno wydrukowana trójwymiarowa forma agarozowa okazała się obiecująca dla hodowli mieszków włosowych bez rusztowań21. Kapsułkowanie alginianem wapnia, po raz pierwszy zgłoszone w 2003 roku, było do tej pory najszerzej badanym systemem dla IVC22. Został przetestowany na pęcherzykach myszy, bydła, małp i ludzi 23,24,25,26,27. W przypadku alginianu wapnia mieszki włosowe są pojedynczo ładowane do mikrokropel polimeru i wystawiane na działanie chlorku wapnia w celu wytworzenia kulki żelu. Ekstrakcja mieszków włosowych ze stopki wymaga leczenia środkiem chelatującym. Ta matryca ma jednak pewne wady. Alginian jest polisacharydem wyizolowanym z glonów i chociaż zapewnia wsparcie, nie jest częścią naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej pęcherzyka. Dane wskazują na większą częstość występowania wad wrzeciona po IVC w alginianie28. Późniejsze modyfikacje systemu poprzez połączenie alginianu z fibryną lub innymi składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) pomogły uczynić system alginianu wapnia bardziej efektywnym29,30.
Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że macierz zewnątrzkomórkowa jest kluczowym modulatorem wzrostu komórek 10,31,32 . Nie tylko zapewnia wsparcie, ale odgrywa kluczową rolę w przyczepianiu, funkcjonowaniu, wzroście i komunikacji komórek. Jednym z głównych składników ECM jest hialuronian, naturalnie występujący glikozaminoglikan. W pęcherzyku jajnikowym hialuronian jest wytwarzany przez komórki ziarniste i przyczynia się do integralności strukturalnej i funkcji rozwijającego się pęcherzyka33,34. Włączenie hialuronianu do modelu hodowli pęcherzyków może zatem pomóc w stworzeniu bardziej fizjologicznego środowiska i zwiększeniu produkcji funkcjonalnie kompetentnych komórek jajowych.
W pracy opisano nowatorskie zastosowanie kwasu hialuronowego sprzężonego z tyraminą jako biomatrycy do hodowli świeżych i mrożonych pęcherzyków jajnikowych oraz dojrzewania komórek jajowych in vitro (IVM). Szczegółowo opisujemy również techniki kriokonserwacji mieszków włosowych przez witryfikację na dwóch typach urządzeń. Jedna metoda polega na bezpośrednim zanurzeniu w ciekłym azocie, podczas gdy w drugiej metodzie mieszki włosowe są zamykane w słomce przed zanurzeniem. Głównym celem jest wykazanie, że pomimo różnic, zarówno metodologie, jak i urządzenia mogą być niezawodnie wykorzystywane do kriokonserwacji mieszków włosowych.

<table><tbody><tr><td>Oznakowane anty-alfa tubuliną-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2168 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Z oznaczeniem anty-beta tubuliny-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał F2043</td><td></td></tr><tr><td>BZ-X700</td><td>Klucz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Środkowa studnia miska</td><td>Fisher Naukowy</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Korporacja Biochemiczna Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka z odpowietrzeniem Crycap</td><td>Badania Hampton</td><td>HR4-904 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Kriopętla</td><td>Badania Hampton</td><td>HR4-974 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Kryształowa nakrętka</td><td>Badania Hampton</td><td>Przekaźnik HR4-733</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane 60mm</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał D2650</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>R & Systemy D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy (EG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>293237</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca inaktywowana termicznie</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Hormon folikulotropowy (FSH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał F4021</td><td></td></tr><tr><td>Global-Hepes&nbsp; Średni</td><td>Bednarz Chirurgiczny</td><td>LGGH-100 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 powiedział:</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał B2261</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG10 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej</td><td>Bednarz Chirurgiczny</td><td>GHSA-125 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidazy</td><td>Bednarz Chirurgiczny</td><td>ART-4007-A</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>CVS Apteka Inc.</td><td>372441</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-transferyna-selen (ITS)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz medium (L-15)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Hormon luteinizujący</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9773</td><td></td></tr><tr><td>Różdżka magnetyczna</td><td>Badania Hampton</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety (1000 i mikro; m)</td><td>Minitube</td><td>19025/0050</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety (175 , 200 i 275 i mikro; m)</td><td>Bednarz Chirurgiczny</td><td>MXL3-175, MXL3-200, MXL3-275</td><td></td></tr><tr><td>Millex GV filtr 0,22 &mikro; m</td><td>Milipory</td><td>SLGU033RS</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Bednarz Chirurgiczny</td><td>LGOL-500 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Minimalna niezbędna pożywka alfa (MEM)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>32561-037</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania oocytów-Spindleview</td><td>Hamiltona Thorne'a</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał P4170</td><td></td></tr><tr><td>Szybki i</td><td>Życie in vitro</td><td>14406</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka SmartBox</td><td>Życie in vitro</td><td>14423</td><td></td></tr><tr><td>Syntetyczny substytut białka (SPS)</td><td>Bednarz Chirurgiczny</td><td>ART-3011</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw biohydrożelu hialuronowego połączonego z tyraminą&nbsp;</td><td>Rdzeń życia</td><td>POL-00151</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewarka ultradźwiękowa</td><td>Życie in vitro</td><td>14415</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalna miska do hodowli GPS 8x 100 &mikro; l studnie</td><td>Bednarz Chirurgiczny</td><td>UGPS-010 powiedział:</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy

Application of a Novel Hyaluronan Hydrogel for Three-Dimensional Follicle Culture and Methodology for Mouse Ovarian Follicle Cryopreservation

Trójwymiarowa architektura pęcherzyka jajnikowego i złożone interakcje między składnikami komórek somatycznych a oocytem, które są niezbędne do dojrzewania cytoplazmatycznego i jądrowego, są trudne do utrzymania w konwencjonalnych dwuwymiarowych (2-D) systemach hodowli. Opisujemy nowatorski model hodowli 3D wykorzystujący hydrożel hialuronowy połączony z tyraminą do enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych myszy. Technika enkapsulacji kwasu hialuronowego umożliwia trójwymiarowy wzrost mieszków włosowych i zatrzymanie czynników troficznych w bliskiej odległości od rozwijających się mieszków włosowych. Ten hydrożel jest bardzo wszechstronny i może być stosowany zarówno do izolowanych pęcherzyków, jak i fragmentów tkanki jajnikowej. Właściwości lepkosprężyste żelu HA umożliwiają regulację sztywności i podatności na formowanie w oparciu o stężenie żelu. Pęcherzyki przedantralne rozwijające się w tym modelu hodowli są w stanie zakończyć dojrzewanie mejotyczne w ciągu 10-12 dni od hodowli i owulować oocyt metafazy II po wywołaniu hCG. W artykule tym opisano również dwa podejścia do kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych poprzez witryfikację.

W artykule szczegółowo opisano metodologię stosowania nowego żelu hialuronowego związanego z tyraminą do hodowli in vitro pęcherzyków preantralnych myszy36,37. Rycina 6 ilustruje różnice między wzrostem pęcherzyków przedantralnych po umieszczeniu w konwencjonalnym systemie hodowli 2D a pojedynczym pęcherzykiem zamkniętym w żelu HA do hodowli 3D. Natywna architektura mieszków włosowych jest utrzymywana przez 12 dni hodowli z antrum wyraźnie widocznym w ostatnim dniu wzrostu.
Żel HA jest bardzo wszechstronny, umożliwiając wzrost izolowanych pęcherzyków pojedynczo lub w grupach, a także tkanka jajnika jest mechanicznie rozbijana na małe skupiska mieszków włosowych. Żel jest przezroczysty, dzięki czemu możliwe jest uwidocznienie mieszków włosowych, nawet jeśli znajdują się na różnych głębokościach. Zamknięte pęcherzyki i FL-C wykazują promienistą ekspansję w wyniku ciągłej proliferacji komórek ziarnistych (ryc. 7). Początkowe średnice pęcherzyków wynoszą średnio 139,8 ± 28 μm, a średnica oocytów GV wynosi 63,5 ± 4,6 μm. W pojedynczo hodowanych pęcherzykach końcowe średnice wynoszą około 385,6 ± 36,7 μm, co stanowi około 3-krotny wzrost wielkości. Owulowane oocyty metafazy II mierzą około 84,8 ± 3,8 μm. W obrębie hodowanych klastrów FL wielkość pęcherzyków jest dość zróżnicowana (ryc. 5, ryc. 7). Owulowane oocyty po wyzwoleniu hCG znajdują się w pobliżu pęcherzyka (ryc. 8). Większość oocytów metafazy II zostanie pobrana z owulowanych COC. Pęcherzyki nadal osadzone po wyzwoleniu zwykle zawierają oocyty GV i metafazy I.
Tabela 1 porównuje tempo dojrzewania między izolowanymi pęcherzykami a klastrami FL ze świeżych lub mrożonych jajników. FL-C z kriokonserwowanych jajników miał znacznie niższe tempo dojrzewania. Obserwacje mikroskopowe wykazały, że często mają złamaną blaszkę podstawną, co czyni je dość podatnymi na przedwczesną ekstruzję oocytów. Delikatna natura skupisk mieszków włosowych została w pewnym stopniu zniwelowana przez enkapsulację. Unikano leczenia krioprezerwowanych jajników kolagenazą, ponieważ było ono szczególnie szkodliwe przy niskiej przeżywalności i niskiej wydajności nienaruszonych pęcherzyków.
Kriokonserwacja izolowanych pęcherzyków jest znacznie skuteczniejsza niż konserwacja całych jajników. Wysokie tempo dojrzewania można osiągnąć przy użyciu obu badanych metod witryfikacji (tabela 2). Pomimo dużych różnic w szybkości chłodzenia, dojrzewanie oocytów po IVC nie różniło się. Otwarte nośniki CL pozwalają na większą wydajność, ponieważ na jednym otwartym nośniku CL można załadować do dziesięciu mieszków włosowych. Skraca to również całkowity czas odzyskiwania wielu kriokonserwowanych mieszków włosowych. Jednak w przypadku ewentualnego klinicznego zastosowania witryfikacji mieszków włosowych u ludzi preferowany może być zamknięty, zamknięty system.
Ułożenie chromatyny wokół jąderka oocytu GV można wykorzystać do identyfikacji oocytów, które najprawdopodobniej zapłodnią się po owulacji i rozwiną się w blastocysty38. Rycina 9 ilustruje barwienie oocytów na żywo w celu wizualizacji wzorca dystrybucji chromatyny.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig01.jpg"> 
Rycina 1: Schemat wzrostu pęcherzyków. Ten diagram ilustruje różne etapy rozwoju pęcherzyka od pęcherzyka pierwotnego do drugorzędowego stadium przedantralnego i wreszcie do w pełni dojrzałego pęcherzyka trzeciorzędowego gotowego do owulacji. Pokazany jest również obraz mikroskopowy typowego pęcherzyka przedantralnego z jego różnymi cechami morfologicznymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig02.jpg"> 
Rysunek 2: Schemat metody enkapsulacji HA. Struktura żelu hialuronowego i różne etapy osadzania mieszków włosowych są zilustrowane na tym schemacie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig03.jpg"> 
Rycina 3: Izolacja i enkapsulacja pęcherzyków. (A, B) Pęcherzyk przedantralny wybrany do osadzenia w powiększeniu 40x i 200x. (C) Pęcherzyk apoptotyczny jest pokazany ze zdrowym pęcherzykiem przedantralnym z oocytem nie do końca centralnym. (D) Obraz kulki żelu HA wysianej pęcherzykami i (E) z dwoma FL-C. Zdjęcia wykonane mikroskopem stereoskopowym, aby pokazać całą kulkę żelu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig04.jpg"> 
Rycina 4: Urządzenia do kriokonserwacji izolowanych pęcherzyków. W przypadku urządzenia CL z otwartym nośnikiem etap witryfikacji odbywa się poprzez bezpośrednie zanurzenie mieszków włosowych w ciekłym azocie. Szybkość chłodzenia jest zatem niezwykle wysoka i wynosi ponad -20 000 °C/min. W przeciwieństwie do tego, w przypadku zamkniętego nośnika RI, mieszki włosowe są ładowane na wewnętrzny plastikowy patyczek i wrzucane do zewnętrznej słomki zanurzonej w ciekłym azocie. Ta zamknięta metoda witryfikacji pozwala uniknąć bezpośredniego kontaktu z ciekłym azotem. Jednak szybkość chłodzenia jest znacznie niższa i wynosi -1220 °C/min. Ładowanie i odzyskiwanie mieszków włosowych z dowolnego nośnika jest łatwe. Otwarta nośna CL mogła pomieścić do dziesięciu mieszków włosowych na urządzenie, w porównaniu do zaledwie dwóch w przypadku zamkniętego nośnika RI. Liczba ta została zmodyfikowana z35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig05.jpg"> 
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy napotkanych problemów. (A) Klaster pęcherzyków z wytłaczanym oocytem. (B) Izolowane pęcherzyki z pękniętą błoną blaszki podstawnej i jeden z wytłoczonym oocytem. (C) Pęcherzyk osadzony pod pęcherzykiem w żelu. (D) Skupisko mieszków włosowych, które pozostało w żelu (po lewej) w porównaniu z klastrem osadzonym zbyt głęboko, który ostatecznie przyczepił się do naczynia. Szeroki zakres rozmiarów mieszków włosowych w FL-C jest wyraźnie widoczny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig06.jpg"> 
Rycina 6: Porównanie wzrostu pęcherzyków w hodowli 2-D i 3-D w HA. Przy wzroście 2D spłaszczenie pęcherzyka i przyłączenie komórek ziarnistych do naczynia do hodowli tkankowej zaobserwowano do 4 dnia, pozostawiając oocyt podatny na migrację komórek ziarnistych, przerwanie połączeń szczelinowych i przedwczesną ekstruzję oocytów. Pęcherzyk otoczony HA pozostał nieprzyczepiony przez cały okres hodowli. Ekspansja komórek ziarnistych zachodziła we wszystkich kierunkach, otaczając oocyt i zachowując architekturę 3D. Liczba ta została zmodyfikowana z36. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig07.jpg"> 
Rycina 7: Reprezentatywne obrazy pęcherzyków zamkniętych w żelu hialuronowym połączonym z tyraminą. (A) Pęcherzyk przedantralny pobrany po trawieniu kolagenazą świeżego jajnika w dniu 1. (B) Kropla żelu z czterema pęcherzykami przedantralnymi zobrazowanymi w dniu 1 i (C) dniu 4 hodowli, (D) skupisku pęcherzyków ze świeżego jajnika w dniu 2 (E) w dniu 6 i (F) w dniu 9 hodowli. (G) Skupisko pęcherzyków mechanicznie wypreparowane z zeszklonego całego jajnika pokazane w 2. dniu i (H) w 6. dniu hodowli. (I) Pęcherzyk z tworzeniem się antrum jest wyraźnie widoczny w 9 dniu hodowli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig08.jpg"> 
Rycina 8: Owulacja oocytów. (A, B) Owulowany kompleks wzgórko-oocytowy (COC) pokazany obok kulki HA-żelu. (C) Oocyty zobrazowano po enzymatycznym traktowaniu COC hialuronidazą w celu usunięcia otaczających komórek wzgórka. Liczne oocyty metafazy II. (D) Oocyt metafazy II z wydatnym ciałem polarnym. Powiększenie 400x. (E) Obrazowanie na żywo oocytu metafazy II przy użyciu światła spolaryzowanego i systemu obrazowania do wizualizacji wrzeciona mejotycznego i oceny organizacji, wykonane zgodnie z opisem w37. Powiększenie 400x. Widoczne normalne wrzeciono dwójłomne. (F) Oocyt metafazy II utrwalony i wybarwiony anty-alfa / beta-tubuliną i jodkiem propidyny w celu uwidocznienia organizacji wrzeciona mejozycznego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67786/67786fig09.jpg"> 
Rycina 9: Reorganizacja chromatyny w oocytach GV. Układ chromatyny w oocytach GV po utworzeniu antrum badano poprzez barwienie DNA preparatem Hoechst 33342 (50 ng/ml). Reprezentatywne pęcherzyki pobrano z kulek HA za pomocą delikatnego pipetowania. Komórki ziarniste usunięto za pomocą hialuronidazy. Oocyty GV były następnie barwione przez 15 minut (patrz protokół Monti i wsp.38). Zdjęcia zostały wykonane w 40-krotnym powiększeniu. (A) oocyt GV pokazany w dniu 1 podczas inicjacji hodowli, wykazujący wzór barwienia chromatyną bez otoczenia (NSN). (B) Oocyt GV z rosnącego pęcherzyka z antrum widocznym w dniu wyzwolenia hCG. Chromatyna skondensowała się i utworzyła pierścień okołojądrowy wokół jąderka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67786/67786fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr</td>
			<td colspan="2">Świeży jajnik</td>
			<td>Zamrożony jajnik</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Izolowany FL</td>
			<td>Klaster FL</td>
			<td>Klaster FL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pęcherzyki zaobserwowane podczas IVC</td>
			<td>130</td>
			<td>154</td>
			<td>69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Owulacja po HCG (%)</td>
			<td>71%</td>
			<td>66%</td>
			<td>93%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> (92/130)</td>
			<td> (101/154)</td>
			<td>(64/69)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dopuszczalna wartość brutto (%)</td>
			<td>30%</td>
			<td>28%</td>
			<td>52%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> (28/92)</td>
			<td> (28/101)</td>
			<td>(33/64)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tworzenie komórek jajowych MII (%)</td>
			<td>59%</td>
			<td>55%</td>
			<td>*34%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(54//92)</td>
			<td>(56/101)</td>
			<td>(22/64)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wyniki z pęcherzykami osadzonymi w HA ze świeżych i zeszklonych jajników. Pęcherzyki jajnikowe i FL-C ze świeżych jajników dojrzewały in vitro po enkapsulacji w żelu HA. Żel HA testowano również na pęcherzykach z jajników zeszklonych przy użyciu protokołu EG/DMSO39. W przypadku świeżych jajników po strawieniu kolagenazy pobrano zarówno pojedyncze pęcherzyki (FL), jak i klastry pęcherzyków (FL-C). W przypadku zeszklonych jajników narażenie na kolagenazę było w rzeczywistości szkodliwe dla pęcherzyków. Najlepszym podejściem w przypadku kriokonserwowanych jajników było wyizolowanie klastrów FL, a nie pojedynczych pęcherzyków i zastosowanie wyłącznie mechanicznego rozwarstwienia za pomocą igieł. Tabela porównuje wyniki między kulkami HA zasianymi z pęcherzykami w grupach 4-6 w porównaniu z kulkami z pojedynczym FL-C zawierającym 6-10 pęcherzyków. *Tempo dojrzewania FL-C z kriokonserwowanych jajników było istotnie niższe (p = 0,008; Analiza chi-kwadrat w celu sprawdzenia istotności).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Przewoźnik</td>
			<td>RI</td>
			<td>CL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Zamknięte)</td>
			<td>(Otwórz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeżycie (%)</td>
			<td>100% (24/24)</td>
			<td>100% (41/41)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tworzenie Antrum* (%)</td>
			<td>25.0% (6/24)</td>
			<td>75.6% (31/41)*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Częstość owulacji (%)</td>
			<td>66.7% (16/24)</td>
			<td>87.8% (36/41)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wskaźnik dojrzewania (% MIIs)</td>
			<td>81.3% (13/16)</td>
			<td>69.4% (25/36)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Wyniki po kriokonserwacji izolowanych pęcherzyków na dwóch różnych urządzeniach do witryfikacji. Wysokie tempo dojrzewania osiągnięto zarówno przy użyciu otwartego urządzenia CL, jak i zamkniętego nośnika RI, przy niższym współczynniku chłodzenia. Tworzenie się Antrum było jedyną miarą wyniku, którą zaobserwowano jako istotną, ale nie wpływała na ogólne tempo dojrzewania (p &lt; 0,05; Analiza chi-kwadrat w celu sprawdzenia istotności).

Protokół ten opisuje nowatorski trójwymiarowy (3-D) model hodowli wykorzystujący hydrożel hialuronowy połączony z tyraminą do enkapsulacji i hodowli pęcherzyków preantralnych z jajnika myszy. Szczegółowo opisujemy również dwa podejścia do kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przez witryfikację.

Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy

The 3-D architecture of the ovarian follicle and the complex interactions between somatic cell components and the oocyte that are necessary for ...

Badania te koncentrowały się na opracowaniu systemu hodowli 3D do wzrostu pęcherzyków in vitro i dojrzewania oocytów. Stworzenie takiego systemu przy użyciu składników natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej komórki usprawni rozwój pęcherzyków. Największym wyzwaniem jest zastosowanie wiedzy z modeli zwierzęcych do hodowli mieszków włosowych u ludzi.Dostęp do ludzkiej tkanki jajnika jest ograniczony. A ludzkie pęcherzyki wymagają znacznie dłuższego czasu w hodowli, aby osiągnąć dojrzałość oocytów. Model hodowli 3D opracowany w tym badaniu może być szczególnie przydatny do hodowli ludzkich pęcherzyków jajnikowych, umożliwiając zachowanie architektury 3D przez dłuższy czas potrzebny w hodowli do dojrzewania oocytów.Na początek należy pobrać jajniki od 10 do 14 dniowych młodych myszy B6D2F1 do zabiegu. Odpipetować 6 mililitrów wstępnie zbilansowanej pożywki do hodowli pęcherzyków (FCM) do dwóch 60-milimetrowych szalek i nałożyć na olej mineralny, a następnie inkubować. Odpipetować 1 mililitr kolagenazy do środkowej studzienki naczynia i 3 mililitry tkanki jajnikowej lub pożywki OT do zewnętrznej studzienki.Przenieś jajniki do roztworu kolagenazy. Pod koniec inkubacji kolagenazy przenieś jajniki poddane kolagenazie do zewnętrznego dołka w celu wypłukania. Wymień mikropipety i przenieś jajniki do świeżego naczynia wypełnionego pożywką OT.Aby pobrać mieszki włosowe, należy wielokrotnie odsysać i wydalać tkankę jajnikową potraktowaną enzymem przez końcówki pipet przycięte do różnych rozmiarów. Mechanicznie drażnić tkankę za pomocą igieł o rozmiarze 27 do ośmiu uwolnień mieszków włosowych. Zbadaj pod mikroskopem preparacyjnym przy 40-krotnym powiększeniu i wybierz wtórne pęcherzyki przedantralne z centralnie umieszczonym oocytem zamkniętym w nienaruszonej błonie podstawnej do świeżej naczynia OT.Umieść szalkę FCM2 w inkubatorze na 60 minut przed rozpoczęciem procesu zatapiania. Przygotuj dwie 25 mikrolitrowe krople żelu HA bez nadtlenku wodoru na pokrywce do spłukania. Przenieś mieszki włosowe lub klastry mieszków włosowych, które mają być osadzone, z naczynia FCM do kropli kwasu hialuronowego lub żelu HA, aby spłukać z pożywki hodowlanej.Umieść naczynie FCM z powrotem pod bełkotką, aby zagazować. Aby osadzić mieszki włosowe, umieść 1 mikrolitr kropli 0,03% nadtlenku wodoru na pokrywce 60-milimetrowego naczynia. Teraz dodaj 25 mikrolitrów 3 miligramów na mililitr żelu HA i wymieszaj.Odpipetować około ośmiu do 10 mikrolitrów mieszaniny nadtlenku wodoru HA do dwóch oddzielnych dołków ośmiodołkowej szalki hodowlanej. I szybko przenieś mieszki włosowe, klastry mieszków włosowych lub fragmenty tkanki jajnikowej do środka każdej kropli. Upewnij się, że w kropli nie ma pęcherzyków.Po trzech minutach dodaj 100 mikrolitrów wstępnie zrównoważonej pożywki do hodowli mieszków włosowych do każdej studzienki. Pokryj ciepłym, wstępnie zrównoważonym olejem mineralnym i inkubuj naczynie. Przygotować sprzęt i roztwory wymagane do procesu witryfikacji.Umieść nośnik RI w gnieździe w kriopojemniku zawierającym ciekły azot. Umieść dwie krople podgrzanego roztworu do witryfikacji 1 lub VS1 obok siebie na pokrywce 60-milimetrowego naczynia w pobliżu góry. Teraz umieść dwa mieszki włosowe w pierwszej kropli, spłucz i szybko przenieś je do drugiej kropli VS1 na pięciominutową inkubację.Podczas inkubacji pęcherzyków wykonaj trzy krople VS2 tuż poniżej kropli VS1. Następnie szybko przesuwaj mieszki włosowe sekwencyjnie przez trzy krople VS2 w ciągu 60 sekund. W celu witryfikacji podnieś mieszki włosowe z VS2.Wyświetl nośnik RI w zakresie analizy. I dostosuj ostrość, aby zwizualizować mały otwór w plastikowym patyczku. Umieść mieszki włosowe z minimalną ilością płynu w otworze.Wrzuć plastikowy patyczek do wstępnie schłodzonej słomki zewnętrznej. I użyj zgrzewarki ultradźwiękowej, aby zamknąć słomkę. Umieść słomkę w kielichu przymocowanym do trzciny kriogenicznej.Przykryj trzcinę plastikową tuleją ochronną i zanurz ją w ciekłym azocie. W przypadku witryfikacji otwartego nośnika należy przygotować nośnik, wkładając metalowy trzpień CL do namagnesowanej nasadki fiolki, zapewniając mocne trzymanie. Umieść stojak w pudełku kriogenicznym, aby pomieścić fiolki kriogeniczne, upewniając się, że ciekły azot znajduje się poniżej górnej części fiolek.Napełnij namagnesowaną, wynalezioną fiolkę kriogeniczną ciekłym azotem i umieść w stojaku. Chwyć otwarty nośnik CL za dołączoną nasadkę magnetyczną za pomocą różdżki magnetycznej. Zanurz nośnik CL w osobnej kropli VS2, aby utworzyć film krioprotektantowy.Zbierz wszystkie mieszki włosowe lub skupiska mieszków włosowych i umieść je na folii z minimalną ilością płynu. Natychmiast zanurzyć CL w fiolce kriogenicznej wypełnionej ciekłym azotem w celu zeszklenia próbki. Umieść fiolkę krio na trzcinie kriogenicznej, a następnie przykryj plastikową tuleją.Zanurz trzcinę w zbiorniku na ciekły azot. Przygotuj naczynie ze studzienką środkową z 3 mililitrami wstępnie zrównoważonego FCM w studzience zewnętrznej i 1 mililitrem w studzience środkowej. Po nałożeniu podłoża na olej, umieść naczynie pod bełkotką do gazowania.Umieść 0,5 mililitra roztworów rozgrzewających WS1 i WS2 wstępnie zrównoważonych do 37 stopni Celsjusza w dwóch oznaczonych środkowych naczyniach. Przenieś laski kriogeniczne z próbkami ze zbiornika magazynowego do kriopojemnika wypełnionego ciekłym azotem. Najpierw zdejmij plastikową osłonę trzciny.Następnie, trzymając słomkę zanurzoną, wyjmij ją z kielicha i wsuń do szczeliny w pojemniku kriogenicznym. Przetnij zewnętrzną słomkę tuż nad czarną kropką. Wyjmij wewnętrzny plastikowy patyczek z zewnętrznej słomki i szybko zanurz patyczek w WS1, delikatnie obracając, aby rozładować mieszki włosowe w ciągu 10 sekund.Po dwóch minutach w WS1 użyj mikropipety, aby przenieść pęcherzyki lub klastry pęcherzyków do WS2 na trzyminutową inkubację. Następnie przenieś je do naczynia FCM i inkubuj mieszki włosowe przez jedną do dwóch godzin w środku na długo przed osadzeniem, W celu podgrzania CL otwartego nośnika powtórz przygotowanie naczynia FCM i WS. Przenieś trzcinę kriogeniczną do pudełka kriogenicznego i zdejmij plastikową osłonę trzciny.Użyj różdżki magnetycznej, aby podnieść nasadkę fiolki kriogenicznej, aż metalowy trzpień CL będzie widoczny. Chwyć nasadkę za pomocą dołączonego nośnika CL za pomocą różdżki magnetycznej. I szybko zanurz CL w WS1, obracając się, aby rozładować mieszki włosowe w ciągu 10 sekund.Wzrost pęcherzyków przedantralnych utrzymano w trójwymiarowej kulturze żelu hialuronowego, zachowując natywną architekturę pęcherzyków z antrum widocznym po 12 dniu. Pęcherzyki zamknięte w żelu hialuronowym wykazywały ekspansję promieniową w wyniku proliferacji komórek ziarnistości, przy czym średnica pęcherzyków wzrosła z około 139,8 mikrometra do 385,6 mikrometra w okresie hodowli. Owulowane oocyty metafazy drugiej znaleziono w pobliżu pęcherzyka po wyzwalaczu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej.Oocyty miały średnicę około 84,8 mikrometra. W przypadku świeżych jajników zarówno pojedyncze pęcherzyki, jak i skupiska mieszków włosowych wykazywały dobre tempo dojrzewania. Skupiska pęcherzyków z kriokonserwowanych jajników wykazywały niższe tempo dojrzewania, co prowadziło do przedwczesnej ekstruzji oocytów.Izolowana kriokonserwacja pęcherzyków była bardziej skuteczna niż konserwacja całego jajnika. Witryfikacja pęcherzyków na obu nośnikach osiągnęła wysokie tempo dojrzewania, niezależnie od różnic w szybkości chłodzenia. System otwartego nośnika CL pozwolił na skuteczną kriokonserwację wielu mieszków włosowych, skracając czas przetwarzania.

application-novel-hyaluronan-hydrogel-for-three-dimensional-follicle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano nową metodę enkapsulacji pęcherzyków jajnikowych w trójwymiarowej sieci interpenetrującej z fibryny i alginianu. System ten łączy wsparcie strukturalne z degradacją proteolityczną, aby wspierać rozwój niedojrzałych pęcherzyków w celu wytworzenia dojrzałych oocytów. Metoda ta może być stosowana do hodowli agregatów komórkowych w celu utrzymania kontaktów międzykomórkowych bez ograniczania ekspansji.

Metoda enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych w proteolitycznie degradowalnym systemie trójwymiarowym

Hodowla prawidłowych komórek w kontekście trójwymiarowym stanowi alternatywną metodę badania wczesnych zdarzeń niezbędnych do transformacji komórkowej i tumorigenezji. Metoda ta jest wykorzystywana do hodowli prawidłowych komórek jajnika i jajowodów w celu zbadania wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Wysoce obiecującą techniką generowania konstruktów tkankowych bez użycia matrycy jest hodowla komórek w symulowanych warunkach mikrograwitacji. Korzystając z systemu hodowli rotacyjnej, zbadaliśmy wzrost pęcherzyków jajnikowych i dojrzewanie oocytów pod kątem przeżycia pęcherzyków, morfologii, wzrostu i funkcji oocytów w symulowanych warunkach mikrograwitacji.

In vitro Wzrost pęcherzyków przedantralnych myszy w symulowanej mikrograwitacji

Hodowle tkanek jajnikowych mogą być używane jako modele rozwoju pęcherzyków, owulacji i atrezji pęcherzyków oraz wskazują mechanizmy regulacyjne dynamicznych procesów jajnikowych.

Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

Przedstawione tutaj są dwa protokoły enkapsulacji oocytów świń w warunkach hodowli 3D. W pierwszym kompleksy wzgórko-oocyty (COC) są zamknięte w kulkach fibrynowo-alginianowych. W drugim są one otoczone cząstkami fluorowanego proszku etylenu i propylenu (mikrobioreaktory). Oba systemy zapewniają optymalne warunki do utrzymania ich organizacji 3D.

Hydrożele alginianowe zdegradowane proteolitycznie i mikrobioreaktory hydrofobowe do enkapsulacji oocytów świń

Tutaj opisujemy protokół opisujący, jak izolować ludzkie pęcherzyki jajnikowe z zamrożonej i rozmrożonej tkanki korowej w celu przeprowadzenia analiz ekspresji genów.

Analizy ekspresji genów w ludzkich pęcherzykach

Opisujemy metody hodowli pęcherzyków jajników w nowej, wolnej od rusztowania agarozowej pleśni, które uzupełniają gametogenezę in vitro .

Produkcja i stosowanie konfigurowalnych form agarozowych do hodowli pęcherzyków jajników myszy wolnych od rusztowania

Opisujemy platformę opartą na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek w mikrobioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 Mio. komórek, które mogą być hodowane w precyzyjnie określonych warunkach pod kątem przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. w sterylnym, zamkniętym obiegu.

Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Przedstawiamy dwa procesy mikrofabrykacji porowatych polimerowych chipów do trójwymiarowej hodowli komórek. Pierwszy z nich to tłoczenie na gorąco w połączeniu z procesem spawania oparami rozpuszczalnika. Drugi wykorzystuje niedawno opracowany proces mikrotermoformowania w połączeniu z technologią śladów jonowych, co prowadzi do znacznego uproszczenia produkcji.

Mikrofabrykacja rusztowań w skali chipa do trójwymiarowej hodowli komórek

Poznaj metodę trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych myszy w hydrożelu hialuronowym oraz techniki kriokonserwacji. To podejście wspiera dojrzewanie oocytów i zachowanie architektury tkanek.

Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy

Przeglądaj więcej filmów