Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania
March 28th, 2025
To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.
Zakres naszych badań polega na ustaleniu wydajnego i powtarzalnego protokołu generowania trójwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu innowacyjnego systemu mikrostudzienek krokowych w formach agarozowych. Naszym celem jest znalezienie odpowiedzi na pytanie, jak stworzyć uproszczone, kontrolowane środowisko, które promuje jednolite, wysokiej jakości kultury 3D do testowania leków, inżynierii genetycznej i powiązanych zastosowań. Najnowsze postępy w systemach hodowli komórkowych 3D poprawiają interakcje międzykomórkowe i tworzą więcej środowisk podobnych do in vivo.
Takie podejście usprawnia tworzenie organoidów sferoidalnych, co czyni je obiecującym narzędziem do badań biomedycznych. Obecne technologie hodowli komórkowych 3D obejmują wiszące krople, rotacyjną hodowlę komórkową, tworzywa sztuczne o niskim stopniu przylegania, płytki ze stożkowymi dołkami, rusztowania mikroporowate, kulki magnetyczne i hydrożele bez rusztowań. Metody te umożliwiają tworzenie struktur komórkowych 3D, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia.
Nasz protokół jest odpowiedzią na wyzwanie generowania jednolitych sferoidów i organoidów 3D o stałym rozmiarze i jakości na dużą skalę. Rozwiązuje problemy związane z żywotnością i gęstością komórek, trudnościami w obsłudze i niestabilnością podczas procesu, stanowiąc opłacalne, powtarzalne rozwiązanie dla wiarygodnych badań nad kulturami komórkowymi 3D. Jesteśmy zaangażowani w dążenie do doskonalenia narzędzi badawczych, generowania sferoidowych organoidów komórek beta wytwarzających insulinę do analizy in vitro i enkapsulacji w biopolimerach, mając na celu odwrócenie cukrzycy typu I i generowanie organoidów sferoidowych z potrójnie ujemnych ludzkich komórek raka piersi jako platformę badań przesiewowych leków przed leczeniem pacjenta.
Zaprojektuj urządzenie stemplujące przy użyciu określonego oprogramowania. Umyj wykonany na zamówienie stempel gąbką z miękkim włosiem i wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości. Wystaw czysty stempel na działanie światła ultrafioletowego przez pięć do 10 minut, aby zapewnić sterylność.
Aby przygotować 1 do 2% roztworu agarozy, zważ wymaganą ilość czystego proszku agarozy i rozpuść ją w PBS. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Następnie odpipetuj około trzech mililitrów roztworu agarozy o temperaturze 40 stopni Celsjusza do każdej studzienki sześciodołkowej płytki.
Umieść stempel na środku studzienki i pozwól agarozie zestalić się przez 5 do 10 minut. Po zestaleniu usuń stempel delikatnymi ruchami w przód iw tył, aby uwolnić próżnię bez uszkadzania mikrostudzienek. Umyj mikrostudzienki trzykrotnie PBS, aby usunąć pozostałości.
Wystaw płytkę na działanie światła ultrafioletowego przez 10 minut, aby wyeliminować zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Dodaj trzy mililitry pożywki hodowlanej do każdego dołka na sześciodołkowej płytce i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla. Aby uzyskać jednorodną zawiesinę wysp trzustkowych świni, należy dodać trypsynę do dwuwymiarowej hodowli komórkowej w celu dysocjacji komórek.
Następnie policz komórki i dostosuj stężenie, aby osiągnąć pożądaną liczbę komórek na mikrodołku na płytce sześciodołkowej. Odpipetować trzy mililitry zawiesiny komórek na mikrodołkach agarozy i zakręcić płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Pozwól komórkom osiąść grawitacyjnie przez 10 do 15 minut.
Następnie obserwuj osadzone komórki pod mikroskopem. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Co dwa do trzech dni zastąp 50% starego lub zużytego podłoża świeżym.
Kontynuuj hodowlę, aż w pełni uformują się zwarte, trójwymiarowe struktury. Aby zebrać sferoidy lub organoidy, usuń pożywkę hodowlaną i za pomocą przeciętej końcówki pipety zbierz trójwymiarowe struktury za pomocą energicznego pipetowania. Zwarte trójwymiarowe struktury udało się uformować po 48 godzinach hodowli w mikrostudzienkach agarozy, co zaobserwowano za pomocą zależnej od czasu agregacji komórek.
Żywotne trójwymiarowe struktury zostały zachowane po usunięciu z mikrostudzienek agarozowych z zielonym zabarwieniem wskazującym na żywe komórki w strukturach, potwierdzając żywotność i stabilność komórek.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia opłacalną metodologię generowania 3D struktur komórkowych przy użyciu opartego na stemplu systemu mikrodołków w formach agarozowych. To podejście poprawia tworzenie sferoidyna i organoidalnych struktur, poprawiając interakcje komórkowe i zmniejszając zmienność eksperymentalną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hodowla komórek
- Inżynieria tkankowa
- Testowanie leków
Tło
- Systemy 3D hodowli komórkowej poprawiają środowiska przypominające in vivo.
- Obecne technologie obejmują wiszące krople i bezszkieletowe żele hydrofilowe.
- Każda metoda ma swoje zalety i ograniczenia.
- Jednolite, wysokiej jakości 3D kultury są niezbędne do badań biomedycznych.
Cel badania
- Ustanowienie reprodukowalnego protokołu dla 3D kultur komórkowych.
- Stworzenie kontrolowanego środowiska dla testowania leków i inżynierii genetycznej.
- Poprawa tworzenia sferoidyna i organoidalnych struktur.
Stosowane metody
- System oparty na stemplach do tworzenia mikrodołków.
- Formy agarozowe do hodowli komórek.
- Ocenianie interakcji komórkowych i tworzenia sferoidyna.
- Porównanie z istniejącymi technologiami 3D kultur.
Główne wyniki
- Udane tworzenie jednolitych sferoidyna/organoidalnych struktur.
- Zmniejszona zmienność eksperymentalna w kulturach komórkowych.
- Poprawione interakcje komórkowe w środowiskach 3D.
- Potencjalne zastosowania w teście leków i inżynierii tkankowej.
Wnioski
- System mikrodołków oparty na stemplach jest skuteczny w 3D hodowli komórek.
- Ta metodologia wspiera postęp w badaniach biomedycznych.
- Przyszłe badania mogą eksplorować dalsze zastosowania w różnych dziedzinach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized 3D spheroid and organoid generation is critical for predictive drug testing and translational tissue engineering. The novel stamp-based microwell system enables scalable, reproducible formation of uniform 3D cell structures, directly addressing variability and throughput challenges in early discovery and preclinical workflows. This platform supports robust in vitro modeling, enhancing confidence in downstream screening and mechanistic studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables formation of physiologically relevant 3D cell models for hypothesis-driven interrogation.
- Reduces biological variability, supporting functional target validation and mechanistic de-risking.
- Facilitates portfolio triage by providing consistent, high-quality data from uniform spheroids.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized 3D biological systems for high-content drug screening and compound evaluation.
- Improves assay reproducibility and quantitative output by minimizing size and quality variability.
- Supports scalable workflows with high microwell density, enabling parallelized testing and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant 3D models for translational biomarker studies and preclinical validation.
- Ensures continuity from discovery through preclinical assessment by maintaining consistent culture conditions.
- De-risks advancement decisions by generating robust, reproducible in vitro data aligned with in vivo relevance.
Pipeline & Workflow Integration
This microwell-based 3D culture method integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting both target validation and screening inflection points.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification using uniform 3D models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for reliable compound comparison.
- Analytics: Enables consistent measurement of spheroid formation, viability, and response to interventions.
- Translational Research: Aligns in vitro models with disease-relevant biology for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform adaptable across cell types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Standardizes 3D culture generation, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with robust in vitro data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture and handling of primary or engineered cell types.
- Needs access to custom stamp devices, agarose molds, and standard cell culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell seeding, microwell preparation, and monitoring protocols.
- Adaptable to various cell sources, but optimization may be needed for different tissue types.
- Limitations include potential adaptation for specific cell lines and throughput constraints based on plate format.
