Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania
28 marca 2025
To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.
Zakres naszych badań polega na ustaleniu wydajnego i powtarzalnego protokołu generowania trójwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu innowacyjnego systemu mikrostudzienek krokowych w formach agarozowych. Naszym celem jest znalezienie odpowiedzi na pytanie, jak stworzyć uproszczone, kontrolowane środowisko, które promuje jednolite, wysokiej jakości kultury 3D do testowania leków, inżynierii genetycznej i powiązanych zastosowań. Najnowsze postępy w systemach hodowli komórkowych 3D poprawiają interakcje międzykomórkowe i tworzą więcej środowisk podobnych do in vivo.
Takie podejście usprawnia tworzenie organoidów sferoidalnych, co czyni je obiecującym narzędziem do badań biomedycznych. Obecne technologie hodowli komórkowych 3D obejmują wiszące krople, rotacyjną hodowlę komórkową, tworzywa sztuczne o niskim stopniu przylegania, płytki ze stożkowymi dołkami, rusztowania mikroporowate, kulki magnetyczne i hydrożele bez rusztowań. Metody te umożliwiają tworzenie struktur komórkowych 3D, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia.
Nasz protokół jest odpowiedzią na wyzwanie generowania jednolitych sferoidów i organoidów 3D o stałym rozmiarze i jakości na dużą skalę. Rozwiązuje problemy związane z żywotnością i gęstością komórek, trudnościami w obsłudze i niestabilnością podczas procesu, stanowiąc opłacalne, powtarzalne rozwiązanie dla wiarygodnych badań nad kulturami komórkowymi 3D. Jesteśmy zaangażowani w dążenie do doskonalenia narzędzi badawczych, generowania sferoidowych organoidów komórek beta wytwarzających insulinę do analizy in vitro i enkapsulacji w biopolimerach, mając na celu odwrócenie cukrzycy typu I i generowanie organoidów sferoidowych z potrójnie ujemnych ludzkich komórek raka piersi jako platformę badań przesiewowych leków przed leczeniem pacjenta.
Zaprojektuj urządzenie stemplujące przy użyciu określonego oprogramowania. Umyj wykonany na zamówienie stempel gąbką z miękkim włosiem i wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości. Wystaw czysty stempel na działanie światła ultrafioletowego przez pięć do 10 minut, aby zapewnić sterylność.
Aby przygotować 1 do 2% roztworu agarozy, zważ wymaganą ilość czystego proszku agarozy i rozpuść ją w PBS. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Następnie odpipetuj około trzech mililitrów roztworu agarozy o temperaturze 40 stopni Celsjusza do każdej studzienki sześciodołkowej płytki.
Umieść stempel na środku studzienki i pozwól agarozie zestalić się przez 5 do 10 minut. Po zestaleniu usuń stempel delikatnymi ruchami w przód iw tył, aby uwolnić próżnię bez uszkadzania mikrostudzienek. Umyj mikrostudzienki trzykrotnie PBS, aby usunąć pozostałości.
Wystaw płytkę na działanie światła ultrafioletowego przez 10 minut, aby wyeliminować zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Dodaj trzy mililitry pożywki hodowlanej do każdego dołka na sześciodołkowej płytce i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla. Aby uzyskać jednorodną zawiesinę wysp trzustkowych świni, należy dodać trypsynę do dwuwymiarowej hodowli komórkowej w celu dysocjacji komórek.
Następnie policz komórki i dostosuj stężenie, aby osiągnąć pożądaną liczbę komórek na mikrodołku na płytce sześciodołkowej. Odpipetować trzy mililitry zawiesiny komórek na mikrodołkach agarozy i zakręcić płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Pozwól komórkom osiąść grawitacyjnie przez 10 do 15 minut.
Następnie obserwuj osadzone komórki pod mikroskopem. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Co dwa do trzech dni zastąp 50% starego lub zużytego podłoża świeżym.
Kontynuuj hodowlę, aż w pełni uformują się zwarte, trójwymiarowe struktury. Aby zebrać sferoidy lub organoidy, usuń pożywkę hodowlaną i za pomocą przeciętej końcówki pipety zbierz trójwymiarowe struktury za pomocą energicznego pipetowania. Zwarte trójwymiarowe struktury udało się uformować po 48 godzinach hodowli w mikrostudzienkach agarozy, co zaobserwowano za pomocą zależnej od czasu agregacji komórek.
Żywotne trójwymiarowe struktury zostały zachowane po usunięciu z mikrostudzienek agarozowych z zielonym zabarwieniem wskazującym na żywe komórki w strukturach, potwierdzając żywotność i stabilność komórek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia kosztowo efektywną metodologię generowania trójwymiarowych struktur komórkowych przy użyciu systemu mikrootworów opartego na stemplach w formach z agarozy. Podejście to usprawnia tworzenie sferoidów i organoidów, poprawiając interakcje międzykomórkowe oraz zmniejszając zmienność eksperymentalną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kultura komórek
- Inżynieria tkankowa
- Testowanie leków
Wstęp
- Systemy trójwymiarowych (3D) kultur komórkowych lepiej odwzorowują środowisko in vivo.
- Obecne technologie obejmują metodę wiszących kropel oraz hydrożele bez rusztowania.
- Każda z tych metod posiada swoje zalety i ograniczenia.
- Jednorodne, wysokiej jakości kultury 3D są niezbędne w badaniach biomedycznych.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnego protokołu dla trójwymiarowych (3D) kultur komórkowych.
- Stworzenie kontrolowanego środowiska do testowania leków i inżynierii genetycznej.
- Zintensyfikowanie procesu tworzenia sferoidów i organoidów.
Zastosowane metody
- System oparty na stemplach do tworzenia mikrootworów.
- Formy z agarozy do hodowli komórkowych.
- Ocena oddziaływań komórkowych i tworzenia sferoidów.
- Porównanie z istniejącymi technologiami hodowli 3D.
Główne wyniki
- Skuteczne formowanie jednorodnych sferoidów/organoidów.
- Zmniejszona zmienność eksperymentalna w hodowlach komórkowych.
- Poprawione oddziaływania międzykomórkowe w środowiskach 3D.
- Potencjalne zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.
Wnioski
- System mikroprzestrzeni oparty na stemplach jest skuteczny w 3D hodowli komórkowej.
- Niniejsza metodologia wspiera postępy w badaniach biomedycznych.
- Przyszłe badania mogą zgłębić dalsze zastosowania w różnych dziedzinach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Standaryzowane generowanie sferoidów i organoidów 3D ma kluczowe znaczenie dla prognostycznych testów leków oraz translacyjnej inżynierii tkankowej. Nowatorski system mikrowyrobników oparty na stemplach umożliwia skalowalne i powtarzalne tworzenie jednolitych struktur komórkowych 3D, bezpośrednio rozwiązując problemy związane ze zmiennością i przepustowością w procesach wczesnego odkrywania oraz badaniach przedklinicznych. Platforma ta wspiera rzetelne modelowanie in vitro, zwiększając wiarygodność późniejszych badań przesiewowych i analiz mechanistycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Umożliwia tworzenie fizjologicznie istotnych trójwymiarowych modeli komórkowych do weryfikacji stawianych hipotez.
- Zmniejsza zmienność biologiczną, wspierając funkcjonalną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego.
- Ułatwia selekcję portfolio poprzez dostarczanie spójnych, wysokiej jakości danych z jednorodnych sferoidów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zestandaryzowane trójwymiarowe (3D) układy biologiczne do wysokoprzepustowego screeningu leków oraz oceny związków.
- Poprawia powtarzalność analizy i wyniki ilościowe poprzez minimalizację zmienności rozmiaru i jakości.
- Wspiera skalowalne przepływy pracy o wysokiej gęstości mikrowydzieleń, umożliwiając równoległe testowanie i ponowne wykorzystanie platformy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia istotne w kontekście chorób modele 3D do translacyjnych badań nad biomarkerami oraz walidacji przedklinicznej.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po ocenę przedkliniczną poprzez utrzymanie spójnych warunków hodowli.
- Minimalizuje ryzyko przy podejmowaniu decyzji o dalszym rozwoju dzięki generowaniu solidnych, powtarzalnych danych in vitro, zgodnych z istotnością in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda hodowli 3D w mikroszczelinach integruje etapy od wczesnego odkrywania, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po badania przedkliniczne, wspierając zarówno walidację celów, jak i punkty zwrotne w procesie screeningu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych z wykorzystaniem jednolitych modeli 3D.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki umożliwiające wiarygodne porównywanie związków.
- Analityka: Umożliwia spójny pomiar tworzenia sferoidów, ich żywotności oraz odpowiedzi na interwencje.
- Badania translacyjne: Dostosowuje modele in vitro do biologii istotnej dla danej choroby w celu prowadzenia badań nad biomarkerami i skutecznością.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, kosztowo efektywną platformę, którą można adaptować do różnych typów komórek i programów badawczych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach na wczesnym etapie.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje generowanie kultur 3D, poprawiając ich powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez minimalizację zmienności eksperymentalnej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój kandydatów posiadających wiarygodne dane in vitro.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie hodowli komórkowych 3D oraz pracy z pierwotnymi lub zmodyfikowanymi typami komórek.
- Wymagany dostęp do specjalistycznych urządzeń stemplujących, form agarozy oraz standardowej infrastruktury do hodowli komórkowych.
- Wymaga standaryzacji protokołów wysiewania komórek, przygotowania mikrosieci oraz monitorowania w ramach zespołu.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych źródeł komórek, jednak dla różnych typów tkanek może być konieczna optymalizacja.
- Ograniczenia obejmują potencjalną potrzebę adaptacji dla konkretnych linii komórkowych oraz ograniczenia przepustowości wynikające z formatu płytki.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:20
Fabrication of the Stamp Device
2:44
Preparation of Agarose Microwells for 3-Dimensional Cell Culture Studies
3:54
Cell Seeding, Maintenance, and Characterization of 3D Structures in Agarose Microwells
5:07
Representative Results
