Name: Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Poznaj metodę generowania trójwymiarowych sferoidów i organoidów z użyciem nowatorskiego systemu stemplującego w formach agarozowych. To podejście poprawia interakcje komórkowe i zmniejsza zmienność eksperymentalną w badaniach biomedycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy szczególnie wdzięczni za doskonałą pomoc techniczną świadczoną przez Zizi de Mendonça (Szkoła Medyczna, Uniwersytet w São Paulo, Brazylia). Prace te były wspierane przez granty następujących brazylijskich agencji badawczych: BNDES 09.2.1066.1, CAPES (numer procesu PVE 88881.068070/2014-01), CNPq (granty o numerach 457601/2013-2, 401430/2013-8 oraz INCT-Regenera o numerze 465656/2014-5), FAPESP (numer projektu tematycznego 2016/05311-2), FINEP 01.08.06.05 oraz Ministerstwa Nauki i Technologii (MCTI) oraz Zdrowia (MS-DECIT).

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Komisji Etyki Badań Naukowych na Ludziach naszej instytucji CEUA-FMUSP: 1699/2021, zatwierdzonym 8 września 2021 r. -"Izolacja i enkapsulacja wysp trzustkowych świni" i jest częścią Projektu Tematycznego naszej Grupy Terapii Komórkowej i Molekularnej NUCEL (www.usp.br/nucel), Grant FAPESP nr 2016/05311-2, zatytułowany: "Medycyna regeneracyjna mająca na celu terapię chorób przewlekło-zwyrodnieniowych (rak i cukrzyca)".
1. Produkcja urządzenia stemplującego
UWAGA: Ten znaczek jest wykonany na zamówienie przez grupę NUCEL (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/). Urządzenie do stemplowania zostało opracowane przy użyciu referencyjnego oprogramowania, powszechnie znanego ze swojej precyzji i zaawansowanych możliwości modelowania trójwymiarowego. 
<ol>
	<li>Upewnij się, że zaprojektowane prototypy zawierają 663 mikropiny rozmieszczone w taki sposób, aby umożliwić wygenerowanie równoważnej liczby trójwymiarowych kultur, takich jak sferoidy lub organoidy. Aby zapewnić stabilność stempla na powierzchniach tacy T6, należy strategicznie ustawić pięć punktów podparcia wzdłuż obwodu urządzenia.</li>
	<li>Upewnij się, że mikroszpilki mają stożkową konstrukcję z regulowanymi wymiarami, w zakresie od 1 do 3 mm długości. Średnica podstawy stożka waha się od 0,7 do 1,5 mm, a kąt stożka waha się od 5° do 10°.</li>
	<li>Upewnij się, że struktura "ogranicznika" urządzenia, która określa głębokość mikroszpilek, ma regulowaną długość od 10 do 19 mm i średnicę od 20 do 40 mm, z mikroszpilkami równomiernie rozmieszczonymi na jego powierzchni.</li>
	<li>Dodatkowo zaprojektuj urządzenie tak, aby miało ergonomiczny uchwyt, odpowiedni do obsługi jedną ręką, aby zwiększyć praktyczność i precyzję podczas użytkowania. 
	UWAGA: Aby ułatwić produkcję urządzenia na dużą skalę, dostarczany jest plik cyfrowy w formacie .stl, który jest niezbędny w procesie drukowania 3D.</li>
	<li>Wystarczy pokroić go w plastry za pomocą odpowiedniego oprogramowania i wydrukować na kompatybilnej drukarce 3D. Użyj następujących wymiarów wydruku: X - 68 mm; Y - 120 mm; Z - 150 mm, zapewniając idealną równowagę między funkcjonalnością a jakością konstrukcji.</li>
	<li>Do produkcji urządzenia należy użyć fotoutwardzalnej drukarki 3D, która jest kompatybilna z żywicą polimerową utwardzaną promieniami UV, która musi mieć wysoką rozdzielczość i jednolite wykończenie powierzchni, co jest niezbędne dla optymalnej wydajności urządzenia.</li>
	<li>Pokrój model cyfrowy do druku za pomocą oprogramowania kompatybilnego z wybraną drukarką 3D.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikrostudzienek agarozowych
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór agarozy.
	<ol>
		<li>Zważyć czysty proszek agarozy i rozpuścić go w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), aby uzyskać końcowe stężenie 1-2% (w/v).</li>
		<li>Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej lub łaźni wodnej aż do całkowitego rozpuszczenia, upewniając się, że jest jednorodny i przezroczysty. 
		UWAGA: Unikaj przegrzania lub nadmiernego podgrzewania, ponieważ może to spowodować degradację agarozy. Nie należy przygotowywać dużych objętości roztworu podstawowego.</li>
		<li>Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury ~40 °C, idealnej do pipetowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pieczątkę na zamówienie.
	<ol>
		<li>Umyj stempel gąbką o miękkim włosiu i wodą destylowaną, aby usunąć pozostałości.</li>
		<li>Wystawiony na działanie oczyszczonego stempla należy wystawić na działanie promieniowania UV przez 5-10 minut, aby zapewnić sterylność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uformuj mikrodołki.
	<ol>
		<li>Wlać/pipetować ~3 ml roztworu agarozy o temperaturze 40 °C do każdego dołka na płytce 6-dołkowej, zapewniając jednolitą głębokość 2-3 mm.</li>
		<li>Umieść wykonany na zamówienie stempel na środku studzienki, gdy agaroza jest jeszcze ciepła. 
		UWAGA: Stempel posiada boczne podpory, które zapewniają wyrównanie i stabilność, eliminując potrzebę ręcznego podparcia. Każdy stempel tworzy ~663 mikrodołki (~2 mm wysokości) na studzienkę. Upewnij się, że na mikroszpilkach nie ma pęcherzyków; Jeśli utworzą się bąbelki, delikatnie przesuń stempel, aby je wyeliminować.</li>
		<li>Pozostaw agarozę do zestalenia się na 5-10 minut w temperaturze pokojowej bez przesuwania płytki. 
		UWAGA: Nie należy naruszać agarozy podczas krzepnięcia, aby uniknąć zmian w strukturze mikrostudzienki.</li>
		<li>Usuń stempel delikatnymi ruchami w przód iw tył, aby uwolnić próżnię bez uszkadzania mikrostudzienek. 
		UWAGA: Ten ruch ułatwia dopływ powietrza, umożliwiając płynne usuwanie stempla bez deformacji żelu. Mikrostudzienki muszą pozostać nienaruszone.</li>
		<li>Umyj mikrostudzienki 3x roztworem PBS, aby usunąć pozostałości.</li>
		<li>Wystaw płytkę na działanie światła UV przez 10 minut, aby wyeliminować zanieczyszczenie mikrobiologiczne.</li>
		<li>Dodać 3 ml pożywki hodowlanej i inkubować płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez noc. 
		UWAGA: Ta inkubacja sprawdza brak zanieczyszczenia przed wysiewem komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Umieszczanie komórek w mikrostudzienkach
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę komórkową.
	<ol>
		<li>Zebrać komórki za pomocą trypsynizacji lub innej metody dysocjacji, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.</li>
		<li>Policz komórki i dostosuj stężenie zgodnie z żądaną liczbą na mikrostudzienkę. 
		UWAGA: Aby wysadzić 5,000 komórek na mikrostudzienkę w 663 mikrostudzienkach, przygotuj zawiesinę zawierającą co najmniej 3,315 × 106 komórek ogółem. Zoptymalizuj stężenie komórek, aby zapobiec centralnej martwicy i zapewnić odpowiednią dyfuzję składników odżywczych i tlenu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zasiej komórki.
	<ol>
		<li>Odpipetować ~3 ml przygotowanej zawiesiny komórek nad mikrodołkami, zapewniając równomierne rozprowadzenie poprzez delikatne obracanie płytki.</li>
		<li>Pozwól komórkom osiąść grawitacyjnie (~10-15 min) lub wykonaj delikatne wirowanie przy 100 × g przez 5 min. 
		UWAGA: Można zastosować wirowanie, aby zapewnić koncentrację komórek w mikrostudzienkach.</li>
		<li>Przenieść płytkę do inkubatora CO2 w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Utrzymanie hodowli komórkowych 3D
<ol>
	<li>Wymień pożywkę hodowlaną.
	<ol>
		<li>Zmieniaj podłoże co 2-3 dni, usuwając 50% starego podłoża i dodając świeże podłoże. 
		UWAGA: Upewnij się, że mikrostudzienki pozostają zanurzone przez cały okres hodowli, aby zapobiec odwodnieniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitoruj tworzenie kultur 3D.
	<ol>
		<li>Kontynuuj hodowlę, aż struktury 3D będą w pełni uformowane i zwarte (np. 2-3 dni w przypadku pierwotnych kultur wysp trzustkowych). 
		UWAGA: W przypadku kultur wymagających dłuższego czasu formowania należy wykonywać częściowe zmiany podłoża co 2-3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Zbieranie i charakteryzacja struktur 3D
<ol>
	<li>Zbierz sferoidy/organoidy.
	<ol>
		<li>Usuń stare podłoże i zbierz struktury 3D za pomocą energicznego pipetowania za pomocą końcówki do pipet o dużej średnicy lub naciętej, aby zapobiec ściskaniu lub dezagregacji. 
		UWAGA: Energiczne pipetowanie musi być kontrolowane, aby usunąć kruszywa bez ich deformacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj się do analizy.
	<ol>
		<li>Zebrane sferoidy/organoidy należy natychmiast wykorzystać lub naprawić je do przyszłej analizy. 
		UWAGA: Asocjacja i stabilność sferoid zależą od typu komórki, czasu tworzenia i warunków hodowli. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć dysocjacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lian, J., Yue, Y., Yu, W., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosenescence%3A+a+key+player+in+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Immunosenescence: a key player in cancer development.</a> J Hematol Oncol. 13 (1), 151(2020).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+between+beta1-integrin+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+three-dimensional+basement+membrane+breast+cultures%3A+a+different+perspective+in+epithelial+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95 (25), 14821-14826 (1998).</li>
<li>Dzobo, K., Dandara, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+its+composition%2C+function%2C+remodeling%2C+and+role+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomimetics%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: its composition, function, remodeling, and role in tumorigenesis.</a> Biomimetics. 8 (2), 146(2023).</li>
<li>Sutherland, R. M., McCredie, J. A., Inch, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+multicell+spheroids+in+tissue+culture+as+a+model+of+nodular+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas.</a> J Natl Cancer Inst. 46 (1), 113-120 (1971).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Bialkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Milowska, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+as+a+type+of+three-dimensional+cell+cultures-examples+of+methods+of+preparation+and+the+most+important+application%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application.</a> Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).</li>
<li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+numbers+of+size-controlled+tumor+spheroids+using+microwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates.</a> J Vis Exp. (81), e50665(2013).</li>
<li>Andersen, T., Auk-Emblem, P., Dornish, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Cell+culture+in+alginate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">3D Cell culture in alginate hydrogels.</a> Microarrays (Basel). 4 (2), 133-161 (2015).</li>
<li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+development+of+primary+pancreatic+organoid+tumor+models+for+high-throughput+phenotypic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Advanced development of primary pancreatic organoid tumor models for high-throughput phenotypic drug screening.</a> SLAS Discov. 23 (6), 574-584 (2018).</li>
<li>Napolitano, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+three-dimensional+cell+culture+utilizing+micromolded+nonadhesive+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).</li>
<li>Maria-Engler, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+of+nestin+and+insulin+and+expression+of+islet+cell+markers+in+long-term+human+pancreatic+nestin-positive+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Co-localization of nestin and insulin and expression of islet cell markers in long-term human pancreatic nestin-positive cell cultures.</a> J Endocrinol. 183 (3), 455-467 (2004).</li>
<li>Mantovani, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+primary+cultures+of+insulin-releasing+human+pancreatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Immobilization of primary cultures of insulin-releasing human pancreatic cells.</a> Islets. 1 (3), 224-231 (2009).</li>
<li>Wassmer, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+primary+pancreatic+islet+cell+spheroids+for+three-dimensional+culture+or+transplantation%3A+a+methodological+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Engineering of primary pancreatic islet cell spheroids for three-dimensional culture or transplantation: a methodological comparative study.</a> Cell Transplant. 29, 963689720937292(2020).</li>
<li>Stuart, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+low-cost+scaffold-free+cartilage+tissue+engineering+using+human+cartilage+progenitor+cell+spheroids+formed+by+micromolded+nonadhesive+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Successful low-cost scaffold-free cartilage tissue engineering using human cartilage progenitor cell spheroids formed by micromolded nonadhesive hydrogel.</a> Stem Cells Int. 2017, 7053465(2017).</li>
<li>Charelli, L. E., Dernowsek, J. A., Balbino, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tissue+spheroids+via+a+3D+printed+stamp-like+device%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of tissue spheroids via a 3D printed stamp-like device.</a> J Vis Exp. (188), e63814(2022).</li>
<li>Micromold for the production of cellular spheroids and use. , Patent BR 10 2019 027360 7 A2 (2019).</li>
<li>Riffle, S., Pandey, R. N., Albert, M., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+hypoxia%2C+DNA+damage+and+proliferation+in+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Linking hypoxia, DNA damage and proliferation in multicellular tumor spheroids.</a> BMC Cancer. 17, 338(2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Chociaż w literaturze istnieją różne protokoły hodowli 3D, w badaniu przeprowadzonym przez Wassmer i wsp.13 przetestowano kilka metodologii generowania struktur 3D przy użyciu wysp trzustkowych. Autorzy zaobserwowali, że rodzime wysepki i samozagregowane sferoidy wykazywały znaczną niejednorodność pod względem wielkości i kształtu oraz były większe niż te uzyskane innymi metodami. Na podstawie swoich ustaleń doszli do wniosku, że sferoidy mogą być generowane przy użyciu różnych technik, z których ...

W ciągu ostatnich 50 lat, liczne badania biologii komórki wykazały, że dwuwymiarowe (2D) hodowle nie są w stanie dokładnie odtworzyć warunków in vivo obserwowanych w modelach zwierzęcych1. Strukturalnie hodowle komórkowe 2D nie pozwalają komórkom organizować się trójwymiarowo i replikować sytuacji obserwowanej w systemach in vivo. Co więcej, komórkowe szlaki sygnałowe są zmienione w hodowlach 2D w porównaniu z kulturami trójwymiarowymi (3D), co może prawdopodobnie wyjaśniać, dlaczego niektóre rodzaje badań przesiewowych leków przy użyciu kultur 2D są tak rozbieżne2. Znaczący postęp w technikach hodowli komórkowych nastąpił wraz z wprowadzeniem systemów hodowli 3D. Systemy 3D różnią się znacznie pod względem złożoności w zależności od składu komórkowego i cytoarchitektury. Ogólnie rzecz biorąc, generowane są dwa rodzaje struktur, a mianowicie: sferoidy i organoidy. Sferoidy są opisywane jako proste skupiska komórek uzyskanych z tkanek normalnych lub nowotworowych, ciał embrionalnych i linii komórkowych. Na tworzenie struktur 3D wpływają różne czynniki, w tym interakcje komórka-komórka i szlaki sygnałowe, w których pośredniczą składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które zapewniają wsparcie strukturalne i sygnały biochemiczne. Elementy te regulują interakcje, które przyczyniają się do organizacji i funkcji tkanek3. System hodowli sferoidalnych został po raz pierwszy opisany na początku lat siedemdziesiątych XX wieku, przy użyciu linii komórkowych płuc chomika chińskiego V79 jako modelu raków guzkowych, rosnących w warunkach nieprzylegających i tworzących idealne kule4. Organoidy są opisywane jako klastry specyficznych dla narządów typów komórek pochodzących z komórek macierzystych lub progenitorowych, które samoorganizują się poprzez procesy, takie jak sortowanie komórek i specyfikacja linii, w sposób ograniczony przestrzennie, odzwierciedlając in vivo development5.
Kilka dostępnych metod i materiałów jest dostępnych do hodowli komórek w warunkach 3D. Główne metody stosowane obecnie do generowania kultur 3D to: 1) wiszące krople; 2) rotacyjna hodowla komórkowa i tworzywa sztuczne o niskim stopniu przylegania; 3) płyty ostrosłupowe zawierające stożkowe studnie; 4) rusztowania makroporowate; 5) koraliki magnetyczne; oraz 6) hydrożele niedostępne na rusztowaniach.
Wiszące krople to metoda używana do uzyskiwania kultur 3D bez rusztowań. Metoda ta wiąże się z pewnymi ograniczeniami, w tym koniecznością intensywnego przenoszenia, niską wydajnością produkcji, geometrią sferyczną i narażeniem na duże siły ścinające. Co więcej, określone procedury, takie jak wymiana pożywki lub dodanie mieszanki, mogą być trudne i mogą skutkować stratami materialnymi. Co więcej, doniesienia literaturowe wskazują, że niektóre linie komórkowe nie wytwarzają ciasno upakowanych sferoid przy zastosowaniu tego podejścia6.
Rotacyjne hodowle komórkowe i tworzywa sztuczne o niskim przyleganiu są używane, aby zapobiec przyczepianiu się komórek do podłoża, powodując ich agregację i tworzenie sferoid. Proces ten wymaga specjalnych kolb i/lub mieszania/rotacji. Chociaż jest to jedno z najprostszych podejść do produkcji sferoidów lub organoidów na dużą skalę, nie jest pozbawione wad, takich jak potrzeba specjalnego sprzętu, niska trwałość hodowli, różnice w wielkości sferoid, mechaniczne uszkodzenia komórek i niska wydajność6.
Płyty piramidalne zawierające stożkowe studnie są dostępne na rynku, co wpływa na koszty, oprócz faktu, że niektóre manipulacje mogą utrudniać tworzenie sferoidów/organoidów7.
Makroporowate rusztowania są również wykorzystywane do hodowli 3D; jednak główną przeszkodą jest osiągnięcie efektywnego zasiewu komórek i równomiernego rozmieszczenia. Ten problem pojawia się, ponieważ rozmiary porów mogą być albo zbyt małe, aby przeniknąć do komórek, albo zbyt duże, aby bezpiecznie zatrzymać komórki. Aby rozwiązać ten problem, zbadano kilka strategii8, które mają bezpośredni wpływ na złożoność i koszt tej techniki.
Metodologia kulek magnetycznych generuje niewielką liczbę sferoidów/organoidów, jest kosztowna i może pozostawiać pozostałości nanocząsteczek wewnątrz komórek9.
Wśród systemów do hodowli sferoid dostępne są nieadhezyjne hydrożele agarozowe, stanowiące hydrożel bez rusztowań. Takie podejście oferuje znaczące korzyści, takie jak precyzyjna kontrola nad rozmiarem struktur 3D i zdolność do generowania znacznej liczby tych struktur na płytę. W tej metodzie komórki są wprowadzane do hydrożelu z wstępnie uformowanymi studzienkami, w których toną i samoorganizują się w sferoidy 3D10.
W tym badaniu prezentujemy urządzenie i metodologię generowania mikrostudzienek agarozowych za pomocą formy mikrowzorcowej w prosty, wydajny, powtarzalny i tani sposób.
Użycie tego stempla jako formy do generowania mikrostudzienek w agarozie, wspomaganych grawitacyjnie, ma na celu zwiększenie interakcji komórek w mikrostudzience i organizacji komórkowej, generując struktury 3D (sferoidy/organoidy) in vitro w prosty, wydajny, powtarzalny i tani sposób, oszczędzając w ten sposób czas badań i zasoby laboratoryjne.

<table><tbody><tr><td>31L Kuchenka mikrofalowa</td><td>Electrolux</td><td>78965840 6699 9</td><td>Sprzęt służący do podgrzewania roztworu agarozy, ułatwiający jego rozpuszczenie i zapewniający większą jednorodność. Pozwala to roztworowi osiągnąć idealny stan ciekły do powstania studzienek.</td></tr><tr><td>3DFila Szara nieprzezroczysta światłoczuła żywica 3D z żywicy</td><td></td><td></td><td>polimerowej utwardzanej promieniami UV</td></tr><tr><td>- Creality Halot One</td> Drukarka 3D <td>Creality</td><td>N/A</td><td>używana do drukowania urządzenia do stemplowania</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>UNISCIENCE</td><td>UNI-R10111</td><td>Aby utworzyć żel, rozpuść 1 do 2% w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) lub odpowiednim podłożu.</td></tr><tr><td>Autodesk Fusion 360</td><td></td><td></td><td>Modelowanie 3D</td></tr><tr><td>BB15 Inkubator CO2</td><td>Thermo Fisher</td><td>51023121</td><td>Sprzęt używany do inkubacji hodowanych komórek w odpowiednim i kontrolowanym środowisku.</td></tr><tr><td>Chitubox</td><td>Chitubox</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie służące do krojenia części do druku</td></tr><tr><td>Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego klasy II</td><td>Grupo VECO</td><td>N/A</td><td>Zapewnia sterylne środowisko do przeprowadzania hodowli komórkowych zgodnie z ustalonymi parametrami i protokołami.</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td>hodowlana USBiological/Life Sciences</td><td>C5900-03A</td><td>Zawiera dodatki do prawidłowej hodowli komórek.</td></tr><tr><td>Płytki hodowlane (P6)</td><td>SARSTEDT</td><td>1023221</td><td>Służy do kształtowania agarozy i hodowli komórek.</td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera (25 mL)</td><td>Laborglas</td><td>91 216 14</td><td>Pojemnik służący do rozpuszczenia 1&ndash; 2% agarozy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub innym odpowiednim podłożu, zwykle podgrzewanym w kuchence mikrofalowej.</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Polistyrenowa probówka</td> wirówkowa <td>Corning</td><td>352099</td><td>Służy do utrzymywania komórek w zawiesinie i wykonywania ewentualnych rozcieńczeń.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Vitrocell Embriolife</td><td>005/19</td><td>Dodatek do pożywki hodowlanej.</td></tr><tr><td>Roztwór PBS (bufor fosforanowy soli fizjologicznej)</td> <td>Lab wykonany</td> N<td>/A</td><td>Rozcieńczony 1x ultraczystą wodą MiliQ. Służy do rozpuszczania agarozy od 1 do 2% i do mycia już wyprodukowanych studzienek.</td></tr><tr><td>Butelka z odczynnikiem z niebieską nakrętką - Schott</td><td>Laborglas</td><td>21801545</td><td>Służy do przygotowania i przechowywania pożywki hodowlanej.</td></tr><tr><td>Stamp device</td><td>NUCEL Group</td><td>N/A</td><td>Link- To łącze zapewnia dostęp do pliku .stl urządzenia stemplowego. Wystarczy pokroić go w plastry za pomocą odpowiedniego oprogramowania i wydrukować na kompatybilnej drukarce 3D. https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK EChKS3Qns0rOA?usp=udostępnianie</td></tr><tr><td>Kolba hodowlana poddana działaniu z filtrem 25 cm&sup2;</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Służy do hodowli i utrzymania przylegających komórek.</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Merck</td><td>07-07-9002</td><td>Do dysocjacji komórek przed siewem.</td></tr><tr><td>Światło ultrafioletowe (UV)</td> <td>NIE</td> DOTYCZY NIE <td>DOTYCZY</td><td>Służy do sterylizacji stempla i płytek.</td></tr></tbody></table>

generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Generation of Three-Dimensional Spheroids/Organoids from Two-Dimensional Cell Cultures Using a Novel Stamp Device

Trójwymiarowe (3D) hodowle komórkowe zapewniają dokładniejsze odwzorowanie mikrośrodowiska in vivo niż konwencjonalne dwuwymiarowe (2D) hodowle, ponieważ promują wzmocnione interakcje między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową. To badanie miało na celu opracowanie wydajnej, opłacalnej i powtarzalnej metodologii generowania struktur komórkowych 3D (sferoidy/organoidy) przy użyciu innowacyjnego systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. Nowatorski stempel wykorzystano do wyprodukowania 663 mikrodołków na studzienkę na płytkę 6-dołkową, zapewniając idealne środowisko do agregacji komórek. Pierwotne komórki wysp trzustkowych trzustki świni zostały wysiane w tych mikrodołkach, gdzie agregowały się, tworząc sferoidy/organoidy. Kultury inkubowano w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 , a pożywkę wymieniano co 3 dni. Powstawanie sferoid było okresowo monitorowane i pobierano próbki do charakterystyki. Metoda ta z powodzeniem pozwoliła na uzyskanie jednolitych i wysokiej jakości sferoid, zmniejszając zmienność eksperymentalną, minimalizując manipulacje i wzmacniając interakcje międzykomórkowe. Zastosowanie form do mikrowzorów na bazie agarozy zapewniło uproszczone, kontrolowane środowisko dla kultur 3D, oferując ustandaryzowane i opłacalne rozwiązanie. Metodologia ta wspiera aplikacje do testowania leków i inżynierii tkankowej, oferując praktyczną i skalowalną platformę dla modeli 3D hodowli komórkowych, które można łatwo wdrożyć w różnych warunkach laboratoryjnych.

Kultura komórkowa wykorzystana w tej badaniu została wyhodowana z wysp trzustkowych świń. Preparat wysp zastosowany w tym badaniu charakteryzował się czystością na poziomie 80 ± 5% na podstawie barwienia ditiizonem oraz żywotnością komórek wysp &gt;80% na podstawie detekcji diacetylanu fluoresceiny w komórkach żywych lub jodku propidyny w komórkach martwych (fluorescencyjna metoda Live/Dead). Należy upewnić się, że preparat wysp trzustkowych świni wykazuje co najmniej 80% czystości (np. poprzez barwienie ditiizonem) i &g...

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Three-dimensional (3D) cell cultures provide a more accurate representation of the in vivo microenvironment than conventional two-dimensional (2D) ...

Zakres naszych badań polega na ustaleniu wydajnego i powtarzalnego protokołu generowania trójwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu innowacyjnego systemu mikrostudzienek krokowych w formach agarozowych. Naszym celem jest znalezienie odpowiedzi na pytanie, jak stworzyć uproszczone, kontrolowane środowisko, które promuje jednolite, wysokiej jakości kultury 3D do testowania leków, inżynierii genetycznej i powiązanych zastosowań. Najnowsze postępy w systemach hodowli komórkowych 3D poprawiają interakcje międzykomórkowe i tworzą więcej środowisk podobnych do in vivo.Takie podejście usprawnia tworzenie organoidów sferoidalnych, co czyni je obiecującym narzędziem do badań biomedycznych. Obecne technologie hodowli komórkowych 3D obejmują wiszące krople, rotacyjną hodowlę komórkową, tworzywa sztuczne o niskim stopniu przylegania, płytki ze stożkowymi dołkami, rusztowania mikroporowate, kulki magnetyczne i hydrożele bez rusztowań. Metody te umożliwiają tworzenie struktur komórkowych 3D, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia.Nasz protokół jest odpowiedzią na wyzwanie generowania jednolitych sferoidów i organoidów 3D o stałym rozmiarze i jakości na dużą skalę. Rozwiązuje problemy związane z żywotnością i gęstością komórek, trudnościami w obsłudze i niestabilnością podczas procesu, stanowiąc opłacalne, powtarzalne rozwiązanie dla wiarygodnych badań nad kulturami komórkowymi 3D. Jesteśmy zaangażowani w dążenie do doskonalenia narzędzi badawczych, generowania sferoidowych organoidów komórek beta wytwarzających insulinę do analizy in vitro i enkapsulacji w biopolimerach, mając na celu odwrócenie cukrzycy typu I i generowanie organoidów sferoidowych z potrójnie ujemnych ludzkich komórek raka piersi jako platformę badań przesiewowych leków przed leczeniem pacjenta.Zaprojektuj urządzenie stemplujące przy użyciu określonego oprogramowania. Umyj wykonany na zamówienie stempel gąbką z miękkim włosiem i wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości. Wystaw czysty stempel na działanie światła ultrafioletowego przez pięć do 10 minut, aby zapewnić sterylność.Aby przygotować 1 do 2% roztworu agarozy, zważ wymaganą ilość czystego proszku agarozy i rozpuść ją w PBS. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Następnie odpipetuj około trzech mililitrów roztworu agarozy o temperaturze 40 stopni Celsjusza do każdej studzienki sześciodołkowej płytki.Umieść stempel na środku studzienki i pozwól agarozie zestalić się przez 5 do 10 minut. Po zestaleniu usuń stempel delikatnymi ruchami w przód iw tył, aby uwolnić próżnię bez uszkadzania mikrostudzienek. Umyj mikrostudzienki trzykrotnie PBS, aby usunąć pozostałości.Wystaw płytkę na działanie światła ultrafioletowego przez 10 minut, aby wyeliminować zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Dodaj trzy mililitry pożywki hodowlanej do każdego dołka na sześciodołkowej płytce i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla. Aby uzyskać jednorodną zawiesinę wysp trzustkowych świni, należy dodać trypsynę do dwuwymiarowej hodowli komórkowej w celu dysocjacji komórek.Następnie policz komórki i dostosuj stężenie, aby osiągnąć pożądaną liczbę komórek na mikrodołku na płytce sześciodołkowej. Odpipetować trzy mililitry zawiesiny komórek na mikrodołkach agarozy i zakręcić płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Pozwól komórkom osiąść grawitacyjnie przez 10 do 15 minut.Następnie obserwuj osadzone komórki pod mikroskopem. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Co dwa do trzech dni zastąp 50% starego lub zużytego podłoża świeżym.Kontynuuj hodowlę, aż w pełni uformują się zwarte, trójwymiarowe struktury. Aby zebrać sferoidy lub organoidy, usuń pożywkę hodowlaną i za pomocą przeciętej końcówki pipety zbierz trójwymiarowe struktury za pomocą energicznego pipetowania. Zwarte trójwymiarowe struktury udało się uformować po 48 godzinach hodowli w mikrostudzienkach agarozy, co zaobserwowano za pomocą zależnej od czasu agregacji komórek.Żywotne trójwymiarowe struktury zostały zachowane po usunięciu z mikrostudzienek agarozowych z zielonym zabarwieniem wskazującym na żywe komórki w strukturach, potwierdzając żywotność i stabilność komórek.

generation-three-dimensional-spheroidsorganoids-from-two-dimensional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Ten film pokazuje transformację ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w sferyczne organoidy mózgu. Stosując specyficzne inhibitory, hPSC są kierowane do różnicowania się w kierunku linii neuronalnej, tworząc kolonie neuroektodermalne. Następnie wprowadzane są specjalne czynniki wzrostu, które sprzyjają samoorganizacji i proliferacji kolonii, co ostatecznie prowadzi do powstania sferycznych organoidów mózgowych.

Generowanie sferoid z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentujemy napędzane silnikiem odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe, które może hodować sferoidy komórek. Za pomocą tego urządzenia sferoidy jednego lub wielu typów komórek mogą być łatwo hodowane w warunkach wysokiej grawitacji.

Platforma lab-on-a-CD do generowania wielokomórkowych trójwymiarowych sferoid

Tutaj udostępniamy szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów, umożliwiając w ten sposób wizualizację ich morfologii, składu typu komórki i interakcji.

Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Tutaj opisujemy produkcję na dużą skalę sferoidów zrębu/komórek macierzystych (ASC) pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu automatycznego systemu pipetowania do zasiewania zawiesiny komórkowej, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Te sferoidy ASC mogą być używane jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nowego typu substratu hodowlanego z setkami mikropojemników namm2, w których organoidy mogą być hodowane i obserwowane za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Szczegółowo opisano również protokoły wysiewu komórek i barwienia immunologicznego.

Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

Niniejsze badanie opisuje metodologie hodowli, zamrażania, rozmrażania, przetwarzania, barwienia, etykietowania i badania całych sferoid i organoidów pod różnymi mikroskopami, podczas gdy pozostają one nienaruszone w hydrożelu w wielofunkcyjnym urządzeniu.

Hodowla, zamrażanie, przetwarzanie i obrazowanie całych organoidów i sferoidów jeszcze w hydrożelu

Poznaj metodę generowania trójwymiarowych sferoidów i organoidów z użyciem nowatorskiego systemu stemplującego w formach agarozowych. To podejście poprawia interakcje komórkowe i zmniejsza zmienność eksperymentalną w badaniach biomedycznych.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Przeglądaj więcej filmów