Name: Krzyżówki płciowe z Mucoromycete Phycomyces blakesleeanus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T13:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Poznaj protokół krzyżówek płciowych u grzyba Phycomyces blakesleeanus w celu badania ekspresji genów podczas rozmnażania płciowego. Ta metoda umożliwia izolację RNA z konkretnych typów komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Komitetowi Wykonawczemu Nauk Przyrodniczych Colorado College, Wydziałowi Biologii i Ekologii Organizmów oraz Funduszowi Rodzinnemu Hevey na rzecz Badań Studenckich za sfinansowanie tej pracy. Wyrażamy również naszą wdzięczność Alice Keller i Tii Hutchens za ich wsparcie techniczne.

1. Przygotowanie mediów
<ol>
	<li>Zawiesić sproszkowany agar z mąki kukurydzianej (CMA) lub agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) w wodzie dejonizowanej. W przypadku 100% CMA lub PDA postępuj zgodnie z instrukcjami producenta i zawieś 17 g CMA w 1 l wody dejonizowanej lub 39 g PDA w 1 l wody dejonizowanej. W przypadku N% CMA lub PDA zawiesić 1/N ilości zalecanej przez producenta i uzupełnić dodatkowym agarem, aby osiągnąć stężenie agaru 7,5% (w/v). 
	UWAGA: Krok opcjonalny: Przed autoklawowaniem dodaj 25 μg/ml chloramfenikolu, jeśli istnieje problem zanieczyszczenia bakteryjnego.</li>
	<li>Sterylizować pożywkę w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min.</li>
	<li>Schłodzić podłoże do temperatury ~60 °C, umieszczając je na 30 minut w łaźni wodnej nastawionej na 60 °C. 
	UWAGA: Jeśli ciepłą butelkę z podłożem można trzymać przez 6 sekund z niewielkim lub żadnym dyskomfortem, oznacza to, że jest gotowa do nalewania.</li>
	<li>Płytki należy wlać w warunkach aseptycznych do okapu z przepływem laminarnym lub komory bezpieczeństwa biologicznego. Przechyl butelkę z podłożem na otwartą, pustą szalkę Petriego i wlej tylko tyle, aby całkowicie pokryć dno.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, użyć szklanej pipety serologicznej i odpipetować 20 ml pożywki do każdej płytki. 
		UWAGA: Takie podejście wydłuża czas, w którym butelka z podłożem ma niższą temperaturę i zwiększa ryzyko przedwczesnego zestalenia agaru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poczekaj, aż podłoże ponownie się zestali. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C, jeśli nie zostaną natychmiast użyte.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zarodników lub tkanek grzybów
<ol>
	<li>Uzyskać kultury każdego typu krycia P. blakesleeanus (np. NRRL 1555 (-), NRRL 1554 (+), NRRL 1464 (-) i NRRL 1465 (+)). Aby zaszczepić krzyżówki zarodnikami, najpierw wyhoduj każdy typ krycia w czystej kulturze na 100% CMA lub PDA</li>
	<li>Wytnij porcję wiodącej grzybni z istniejących kultur i umieść wyciętą grzybnię na 100% talerzu CMA/PDA. Inkubować czyste kultury przez 1 tydzień w temperaturze 27 °C w 12-godzinnym cyklu świetlnym.</li>
	<li>Gdy sporangiofory są obecne, zalej zarodnikującą czystą kulturę 0,01% Tween 20 w wysterylizowanej, dejonizowanej wodzie przy użyciu techniki aseptycznej. Za pomocą mikropipety P1000 pobrać 1,0 ml mieszaniny 20 zarodników Tween z płytki do probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Wirować w mini wirówce przez 30 s, a następnie zdekantować supernatant.
	<ol>
		<li>Jeśli potrzeba więcej zarodników, kontynuuj dodawanie 1,0 ml mieszaniny zarodników Tween 20 do tej samej probówki do mikrowirówki i powtórz krok 2.4. Po uzyskaniu odpowiedniej ilości zarodników należy zdekantować supernatant i zastąpić go 500 μL sterylnej wody dejonizowanej.</li>
		<li>Opcjonalnie: Użyj hemacytometru, aby oszacować stężenie zarodników, który poinformuje go, czy należy dodać więcej wody, czy też zarodniki należy ponownie odwirować.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, zaszczepić krzyżówki najnowocześniejszą grzybnią z czystych kultur.
	<ol>
		<li>Użyj wysterylizowanej żyletki lub świdra do otworów korkowych, aby wyciąć tkankę i natychmiast pokryć inokulum.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw krzyże jako krzyże 2-kierunkowe, 4-kierunkowe lub 8-kierunkowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Jeśli krzyże są ustawiane do prac transkryptomicznych, zaleca się ustawienie 1-2 dodatkowych płytek na warunek/nośnik, które będą służyć jako płytki wskaźnikowe. Płytki wskaźnikowe pozwalają badaczom ograniczyć ekspozycję na światło na płytki eksperymentalne, ponieważ światło hamuje rozmnażanie płciowe u P. blakesleeanus.
	<ol>
		<li>W przypadku krzyżówki 2-kierunkowej umieść komplementarne typy krycia naprzeciwko siebie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
		<ol>
			<li>Umieścić grzybnię typu (-) godowego, NRRL 1555 lub NRRL 1464, w odległości co najmniej 1 cm od krawędzi szalki Petriego na PDA lub CMA.</li>
			<li>Na tej samej tabliczce, naprzeciwko miejsca, w którym umieszczono typ krycia (-) i w odległości 1 cm od krawędzi szalki Petriego, umieść typ krycia (+), NRRL 1554 lub NRRL1465 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
			UWAGA: Odległość między uzupełniającymi się typami krycia będzie miała wpływ na wielkość tkanki uczestniczącej w cyklu płciowym. Typy krycia bardziej oddalone od siebie pozwalają grzybni na większą ekspansję, co zwiększy liczbę interakcji seksualnych między dwoma partnerami.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku krzyżówki 4-kierunkowej umieść podobne typy krycia naprzeciwko siebie, ale sąsiadujące z komplementarnym typem krycia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).
		<ol>
			<li>Umieść zarodniki lub grzybnię typu kojarzenia (-), NRRL 1555 i NRRL 1464, naprzeciwko siebie w odległości co najmniej 1 cm od krawędzi szalki Petriego na PDA lub CMA.</li>
			<li>Na tej samej płytce wybierz miejsce pomiędzy dwoma (-) typami krycia i co najmniej 1 cm od krawędzi płytki i zaszczep miejsce zarodnikami lub grzybnią typu krycia (+), NRRL 1554 lub 1465.</li>
			<li>Na tej samej szalce, naprzeciwko miejsca, w którym zaszczepiono pierwszy (+) typ krycia i w odległości co najmniej 1 cm od płytki, umieść drugi (+) typ krycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku krzyżówki 8-kierunkowej, naprzemiennie krzyżuj typy wzdłuż obrzeża szalki Petriego, z czterema z każdego typu krycia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zaszczepieniu zamknąć płytki parafilmem lub (pozostawić je nieszczelne) i umieścić je w pojemniku wtórnym przed inkubacją w temperaturze 22 °C w ciemności. Obserwuj płytki codziennie pod kątem dowodów krycia, podczas których rób zdjęcia spod płytki i śledź grzybnię w miarę wzrostu kultur. 
	UWAGA: Po 24 godzinach od zaszczepienia, spodziewaj się, że grzybnia rozprzestrzeni się na wszystkie typy pożywek, ale na tym etapie osoby prawdopodobnie nie będą miały z nią kontaktu.</li>
	<li>W zależności od rodzaju podłoża (PDA lub CMA) i preparatu (25%, 50%, 100%), jeśli grzybnia zaczyna nawiązywać kontakt, należy sprawdzić grzybnię komplementarnych typów kojarzenia, które są w kontakcie pod kątem zakresu preparacyjnego, pod kątem śladów krycia. Rób zdjęcia wchodzącej w interakcję grzybni za pomocą aparatu lub smartfona zamontowanego na lunecie sekcyjnej.
	<ol>
		<li>Zdobądź obrazy grzybni i zszyj je ze sobą (np. za pomocą aplikacji Panorama Stitcher). Użyj ImageJ, aby oszacować obszar grzybni (zobacz samouczki online).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>NaranjoOrtiz, M. A., Gabaldón, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+evolution%3A+diversity%2C+taxonomy+and+phylogeny+of+the+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">Fungal evolution: diversity, taxonomy and phylogeny of the fungi.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (6), 2101-2137 (2019).</li>
<li>Idnurm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+determination+in+the+firstdescribed+sexual+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Sex determination in the firstdescribed sexual fungus.</a> Eukaryot Cell. 10 (11), 1485-1491 (2011).</li>
<li>Spatafora, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylumlevel+phylogenetic+classification+of+zygomycete+fungi+based+on+genomescale+data%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">A phylumlevel phylogenetic classification of zygomycete fungi based on genomescale data.</a> Mycologia. 108 (5), 1028-1046 (2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+evolution+of+early+terrestrial+fungi+reveals+the+evolution+of+mucormycosis+pathogenicity+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Divergent evolution of early terrestrial fungi reveals the evolution of mucormycosis pathogenicity factors.</a> Genome Biol Evol. 15 (4), evad046(2023).</li>
<li>Gryganskyi, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+the+genomes+of+the+first+terrestrial+fungal+lineages%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Sequencing the genomes of the first terrestrial fungal lineages: what have we learned.</a> Microorganisms. 11 (7), 1830(2023).</li>
<li>Peña, J. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPe%C3%B1a%2C+JF+%22The+evolutionary+developmental+biology+of+Mucoromycotina+%5BDoctoral+dissertation%5D%22">The evolutionary developmental biology of Mucoromycotina [Doctoral dissertation]</a>. , University of California, Riverside. (2022).</li>
<li>Wetzel, J., Burmester, A., Kolbe, M., Wöstemeyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+matingrelated+loci+sexM+and+sexP+of+the+zygomycetous+fungus+Mucor+mucedo+and+their+transcriptional+regulation+by+trisporoid+pheromones%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">The matingrelated loci sexM and sexP of the zygomycetous fungus Mucor mucedo and their transcriptional regulation by trisporoid pheromones.</a> Microbiology (Reading). 158 (Pt 4), 1016-1021 (2012).</li>
<li>Camino, L. P., Idnurm, A., CerdáOlmedo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+ecology%2C+and+evolution+in+Phycomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Biol%22%5BJournal%5D)">Diversity, ecology, and evolution in Phycomyces.</a> Fungal Biol. 119 (11), 1007-1021 (2015).</li>
<li>Gryganskyi, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+phylogeny+of+the+mating+locus+in+the+Rhizopus+oryzae+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and phylogeny of the mating locus in the Rhizopus oryzae complex.</a> PLoS One. 5 (12), e15273(2010).</li>
<li>Blakeslee, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+reproduction+in+the+Mucorineae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Acad+Arts+Sci%22%5BJournal%5D)">Sexual reproduction in the Mucorineae.</a> Proc Am Acad Arts Sci. 40, 205-319 (1904).</li>
<li>Sutter, R. P., Grandin, A. B., Dye, B. D., Moore, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28-%29+mating+typespecific+mutants+of+Phycomyces+defective+in+sex+pheromone+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">(-) mating typespecific mutants of Phycomyces defective in sex pheromone biosynthesis.</a> Fungal Genet Biol. 20 (4), 268-279 (1996).</li>
<li>Sahadevan, Y., RichterFecken, M., Kaerger, K., Voigt, K., Boland, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+and+late+trisporoids+differentially+regulate+%CE%B2carotene+production+and+gene+transcript+levels+in+the+mucoralean+fungi+Blakeslea+trispora+and+Mucor+mucedo%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Early and late trisporoids differentially regulate βcarotene production and gene transcript levels in the mucoralean fungi Blakeslea trispora and Mucor mucedo.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (23), 7466-7475 (2013).</li>
<li>Gooday, G. W., Carlile, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+of+fungal+sex+hormones%3A+III.+Trisporic+acid+and+its+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologist%22%5BJournal%5D)">The discovery of fungal sex hormones: III. Trisporic acid and its precursors.</a> Mycologist. 11 (3), 126-130 (1997).</li>
<li>Banbury, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processes+controlling+zygophore+formation+and+zygotropism+in+Mucor+mucedo+Brefeld%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Processes controlling zygophore formation and zygotropism in Mucor mucedo Brefeld.</a> Nature. 173, 499-500 (1954).</li>
<li>Sutter, R. P., Whitaker, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygophorestimulating+precursors+%28pheromones%29+of+trisporic+acids+active+in+%28-%29Phycomyces+blakesleeanus.+Acidcatalyzed+anhydro+derivatives+of+methyl+4dihydrotrisporateC+and+4dihydrotrisporateC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Zygophorestimulating precursors (pheromones) of trisporic acids active in (-)Phycomyces blakesleeanus. Acidcatalyzed anhydro derivatives of methyl 4dihydrotrisporateC and 4dihydrotrisporateC.</a> J Biol Chem. 256 (5), 2334-2341 (1981).</li>
<li>Gooday, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+trisporic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Functions of trisporic acid.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 284, 509-520 (1978).</li>
<li>Bergman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phycomyces.</a> Bacteriol Rev. 33 (1), 99-157 (1969).</li>
<li>O'Donnell, K. L., Hooper, G. R., Fields, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygosporogenesis+in+Phycomyces+blakesleeanus%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Zygosporogenesis in Phycomyces blakesleeanus.</a> Can J Bot. 54, 2573-2586 (1976).</li>
<li>Delbrück, M., Reichardt, W. I. System analysis for the light growth reactions of Phycomyces. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDelbr%C3%BCck%2C+M+%22Cellular+Mechanics+in+Differentiation+and+Growth%22">Cellular Mechanics in Differentiation and Growth</a>. Rudnick, D. , Princeton University Press. 3-44 (1957).</li>
<li>Idnurm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phycomyces+madA+gene+encodes+a+bluelight+photoreceptor+for+phototropism+and+other+light+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The Phycomyces madA gene encodes a bluelight photoreceptor for phototropism and other light responses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (12), 4546-4551 (2006).</li>
<li>Shakya, V. P. S., Idnurm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibition+of+mating+in+Phycomyces+blakesleeanus+by+light+is+dependent+on+the+MadAMadB+complex+that+acts+in+a+sexspecific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">The inhibition of mating in Phycomyces blakesleeanus by light is dependent on the MadAMadB complex that acts in a sexspecific manner.</a> Fungal Genet Biol. 101, 20-30 (2017).</li>
<li>Yamazaki, Y., Miyazaki, A., Kataoka, H., Ootaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chemical+components+and+nitrogen+sources+on+zygospore+development+in+Phycomyces+blakesleeanus%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoscience%22%5BJournal%5D)">Effects of chemical components and nitrogen sources on zygospore development in Phycomyces blakesleeanus.</a> Mycoscience. 42 (1), 11-17 (2001).</li>
<li>Idnurm, A., Walton, F. J., Floyd, A., Heitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+sex+genes+in+an+early+diverged+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the sex genes in an early diverged fungus.</a> Nature. 451 (7175), 193-196 (2008).</li>
<li>Agrios, G. N. Plant pathogens and disease: general introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+GN+%22Encyclopedia+of+Microbiology%22">Encyclopedia of Microbiology</a>. Schaecter, M. , Elsevier. 613-646 (2009).</li>
<li>Valle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+water+activity+on+the+radial+growth+of+fungi+in+a+dairy+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Impact of water activity on the radial growth of fungi in a dairy environment.</a> Food Res Int. 157, 111247(2022).</li>
<li>Heo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+filamentous+fungi+producing+safe%2C+functional+watersoluble+pigments%5BTitle%5D)+AND+%22Mycobiology%22%5BJournal%5D)">Investigation of filamentous fungi producing safe, functional watersoluble pigments.</a> Mycobiology. 46 (3), 269-277 (2018).</li>
<li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22ggplot2+elegant+graphics+for+data+analysis%22">ggplot2 elegant graphics for data analysis</a>. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2016).</li>
<li>Lubkowitz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizosaccharomyces+pombe+isp4+encodes+a+transporter+representing+a+novel+family+of+oligopeptide+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Schizosaccharomyces pombe isp4 encodes a transporter representing a novel family of oligopeptide transporters.</a> Mol Microbiol. 28 (4), 729-741 (1998).</li>
<li>Nelson, M. A., Metzenberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+development+genes+of+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sexual development genes of Neurospora crassa.</a> Genetics. 132 (1), 149-162 (1992).</li>
<li>Sato, S., Suzuki, H., Widyastuti, U., Hotta, Y., Tabata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+genes+induced+during+sexual+differentiation+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of genes induced during sexual differentiation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Curr Genet. 26 (1), 31-37 (1994).</li>
<li>Grishkan, I., Korol, A. B., Nevo, E., Wasser, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+stress+and+sex+evolution+in+soil+microfungi%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Ecological stress and sex evolution in soil microfungi.</a> Proc Biol Sci. 270 (1510), 13-18 (2003).</li>
<li>Bernstein, H., Byers, G. S., Michod, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+sexual+reproduction%3A+importance+of+DNA+repair%2C+complementation%2C+and+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Nat%22%5BJournal%5D)">Evolution of sexual reproduction: importance of DNA repair, complementation, and variation.</a> Am Nat. 117 (4), 537-549 (1981).</li>
<li>Heitman, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeitman%2C+J+%22The+fungal+kingdom%22">The fungal kingdom</a>. , ASM Press. (2017).</li>
<li>Heitman, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeitman%2C+J+%22Sex+in+fungi+molecular+determination+and+evolutionary+implications%22">Sex in fungi molecular determination and evolutionary implications</a>. , ASM Press. (2007).</li>
<li>Wang, Z., LópezGiráldez, F., Wang, J., Trail, F., Townsend, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+activity+of+mating+loci%2C+environmentally+responsive+genes%2C+and+secondary+metabolism+pathways+during+sexual+development+of+Chaetomium+globosum%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Integrative activity of mating loci, environmentally responsive genes, and secondary metabolism pathways during sexual development of Chaetomium globosum.</a> mBio. 10, (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Przedstawiono tutaj prosty protokół indukowania rozmnażania płciowego u P. blakesleeanus w warunkach laboratoryjnych. Jednym z najważniejszych czynników związanych z tym protokołem jest ograniczenie składników odżywczych. Przypuszcza się, że grzyby dokooptowały rozmnażanie płciowe w odpowiedzi na trudne warunki środowiskowe, takie jak ograniczenie składników odżywczych 6,28,29,30,31,32.</sup...

Indukcja krycia w systemach grzybowych w warunkach laboratoryjnych pogłębiła zrozumienie genetyki eukariotycznej, biologii komórki, biologii ewolucyjnej i biotechnologii. Grzyby dikarian, w szczególności Ascomycota, charakteryzują się najobszerniejszą wiedzą na temat indukcji krycia w warunkach laboratoryjnych1. Co ciekawe, pierwszy grzyb, u którego zaproponowano rozmnażanie płciowe, Syzygites megalocarpus, nie jest członkiem Ascomycota, ale raczej członkiem gromady Mucoromycota2. Gromada Mucoromycota to wcześnie rozchodząca się grupa, wcześniej klasyfikowana jako "Zygomycota", ale obecnie uważana za siostrzaną dla linii Dikaryan 3,4. Mucoromycota, wraz z Zoopagomycota, są ewolucyjnie znaczące, ponieważ te typy reprezentują przejście grzybów do ekosystemów lądowych4,5. Podobnie jak inne grzyby, Mucoromycetes używają bezpłciowych i płciowych strategii reprodukcyjnych w odpowiedzi na swoje środowisko3,6. W warunkach ograniczonej ilości składników odżywczych mucoromycetes rozpoczną cykl płciowy6. Mucoromycetes wykazują zarówno homotaliczne, jak i heterotalliczne mechanizmy kojarzenia, gdzie zgodność jest określana przez geny typu kojarzeniowego sexM i sexP, oznaczone odpowiednio jako (-) i (+)7,8,9.
Blakeslee10 podkreślił wrażliwość cyklu płciowego mucoromycete na warunki zewnętrzne, zauważając, że wilgoć jest krytyczna dla ich powstawania i że dostępność składników odżywczych w podłożu odgrywa znaczącą rolę. Komplementarne typy kojarzenia rozpoczynają cykl płciowy poprzez kooperatywną syntezę kwasów trisporowych (TA) przy użyciu beta-karotenu jako prekursora11,12,13. Po wykryciu TA reagujące strzępki wegetatywne gęstnieją i stają się silnie rozgałęzionymi zygoforami14,15,16. Zygofory kontynuują produkcję TA i wzajemnie chemoprzyciągają. U P. blakesleeanus zygofory różnicują się w podłożu i nie są łatwo widoczne na stałych podłożach agarowych17. Po nawiązaniu kontaktu zygofory przeplatają się i stają się zygoforami powietrznymi.
W miarę trwania cyklu płciowego, końcówki zygoforów przyczepiają się, a środek komórek wypycha się, tworząc strukturę podobną do pierścienia z koralowym obrzękiem u podstawy, kończąc przejście do progametangium. Końcówki komórek tworzących progametangium zaczynają się łączyć i przekształcać w gametangium. Na etapie gametangii zygofory wykazują ornamentykę przypominającą kolce. Ściana komórkowa na końcach rozpuszcza się i pojawiają się przegrody przybyszowe, wyznaczające obszar, w którym utworzy się zygospora, a zygofory działają jak szczypce przypominające suspensory18. Zygospora zostanie zabarwiona, gdy jej ściana komórkowa pogrubi się i uzyska dodatkową ozdobę przypominającą ciernie17,18. Po uformowaniu zygospora wejdzie w okres spoczynku przed ponownym rozpoczęciem cyklu wzrostu.
Phycomyces blakesleeanus to heterotaliczny mucoromycete wyróżniający się dużymi komórkami i reagującymi na środowisko sporangioforami6,8,18. Organizm ten jest łatwy do wyhodowania w laboratorium, a części cyklu płciowego prowadzące do powstania zygospor można zaobserwować w ciągu 8-10 dni. Jako model, P. blakesleeanus został przebadany pod kątem jego zdolności do wykrywania światła w swoim otoczeniu17,19. Łatwość uprawy i zdolność do wywoływania krycia sprawiły, że był to idealny model do badania mechanizmu stojącego za jego zdolnością do postrzegania światła20; Odkrycia te zwróciły również uwagę na ewolucyjne zachowanie mechanizmów wykrywania światła u grzybów. Wykazano, że u P. blakesleeanus światło hamuje rozmnażanie płciowe poprzez te konserwatywne białka wyczuwające światło21. Ostatnie ewolucyjne badania rozwojowe miały na celu zrozumienie, jakie geny przyczyniają się do różnicowania komórek podczas cyklu płciowego P. blakesleeanus6. Korelacja morfogenezy z określonymi genami wymagałaby wyizolowania wystarczającej ilości tkanek o tych samych typach komórek do przeprowadzenia badań ekspresji genów.
Chociaż protokoły indukowania krycia P. blakesleeanus w warunkach laboratoryjnych zostały już wcześniej opisane, niektóre wspominają tylko o rodzaju pożywki do użycia i odpowiednich szczepach18. Niektóre opisy protokołów nie zawierają konkretnych formuł pożywki, ale opisują, gdzie umieścić przypuszczalne komplementarne typy kojarzenia na płycie10. Nowsze protokoły pozwalają na zwiększoną produkcję zygospor poprzez mieszanie zarodników każdego typu kojarzenia i zaszczepianie mieszaną zawiesiną zarodników21 lub umieszczanie typów kojarzących w pewnej odległości od siebie i pozostawianie kultury do inkubacji przez 20 dni22. Podejścia te są przydatne do generowania amp zróżnicowanych komórek, w szczególności zygospor, ale mogą nie być odpowiednie do obserwacji przebiegu rozwoju w czasie lub selekcji struktur płciowych, które tworzą się przed zygosporami do transkryptomiki pojedynczej komórki. Inne prace zajęły się tym problemem, umieszczając komplementarne typy kojarzenia w pewnej odległości od siebie na pożywkach stałych, aby umożliwić obserwację szeregowych przejść morfologicznych w miarę rozpoczynania się cyklu płciowego6,22,23. Podobnie jak w przypadku innych grzybów, grzybnia P. blakesleeanus rozszerza się promieniście24,25. Dlatego, gdy komplementarne typy krycia są uprawiane na tej samej szali, różne części ich grzybni będą się stykać w różnym czasie. Ponieważ kontakt między grzybnią jest jednym z pierwszych kroków w cyklu płciowym P. blakesleeanus, oznacza to, że różne części grzybni oddziałującej na siebie będą na różnych etapach cyklu płciowego. Ta asynchroniczność może mieć wpływ na wynik badania ekspresji genów, tak że jeśli zróżnicowane typy komórek są mieszane i mają różne programy ekspresji genów, trudno byłoby przypisać rolę genu jednej konkretnej strukturze.
Oprócz wartości P. blakesleeanus jako modelu do badania genów zaangażowanych w morfogenezę podczas cyklu płciowego, jego energiczny wzrost i zdolność do różnicowania się w ciągu kilku dni sprawiają, że jest to idealny grzyb do szkolenia studentów zainteresowanych wczesnymi rozchodzącymi się grzybami strzępkowymi oraz do wykorzystania w klasie licencjackiej, aby dowiedzieć się o różnorodności grzybów i ich procesach rozwojowych. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje trzy stężenia dwóch różnych typów pożywek w celu zademonstrowania wpływu dostępności składników odżywczych na pojawienie się grzybni, indukcję krycia i wzbogacenie dla określonych struktur płciowych, zarówno do oceny ilościowej, obserwacji, jak i potencjalnej transkryptomiki pojedynczej komórki.

<table><tbody><tr><td>Agar w proszku</td><td>ThermoFisher</td><td>3453PK</td><td></td></tr><tr><td>chloramfenikol</td><td>FisherSci</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>Agar z mąki kukurydzianej</td><td>Carolina</td><td>742460</td><td></td></tr><tr><td>Panorama Stitcher</td><td>Apple App Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phycomyces blakesleeanus (-) NRRL 1555</td><td>Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych - Służba Badań Rolniczych</td><td>1555</td><td>USDA-ARS będzie wysyłany tylko do naukowców akademickich; poniżej znajdują się alternatywy</td></tr><tr><td>Phycomyces blakesleeanus (-) NRRL 1564</td><td>Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych - Służba Badań Rolniczych</td><td>1564</td><td>USDA-ARS będzie wysyłany tylko do naukowców akademickich; poniżej znajdują się alternatywy</td></tr><tr><td>Phycomyces blakesleeanus (-) Hodowla probówkowa</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>156183</td><td>Kultura klasy edukacyjnej dostępna do zakupu; NRRL 1555</td></tr><tr><td>Phycomyces blakesleeanus (+) NRRL 1554</td><td>Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych - Służba Badań Rolniczych</td><td>1554</td><td>USDA-ARS będzie wysyłać tylko do naukowców akademickich; patrz poniżej alternatywy</td></tr><tr><td>Phycomyces blakesleeanus (+) NRRL 1565</td><td>Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych - Służba Badań Rolniczych</td><td>1565</td><td>USDA-ARS będzie wysyłany tylko do naukowców akademickich; poniżej znajdują się alternatywy</td></tr><tr><td>Phycomyces blakesleeanus (+) Kultura rurkowa</td><td>Carolina</td><td>156182</td><td>Kultura klasy edukacyjnej dostępna do zakupu; NRRL 1554</td></tr><tr><td>Agar z dekstrozą ziemniaczaną</td><td>FisherSci</td><td>DF0013-17-6</td><td></td></tr><tr><td>Kiełki Plus Mini wirówka</td><td>Heathrow Scientific</td><td>SKU 120610</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6585-10ML</td><td></td></tr></tbody></table>

krzyżówki płciowe z mucoromycete phycomyces blakesleeanus

Sexual Crosses with the Mucoromycete Phycomyces blakesleeanus

Phycomyces blakesleeanus, nitkowaty grzyb z gromady Mucoromycota, wyróżnia się niezwykłą zdolnością do percepcji otoczenia i reakcji adaptacyjnych. Podczas gdy wcześniejsze prace wykazały, że bodźce środowiskowe, w tym grawitacja, światło, wilgoć i dostępność składników odżywczych, wpływają na dynamikę wzrostu i strategie reprodukcyjne, mechanizmy leżące u ich podstaw pozostają głównym obszarem badań. Sygnały środowiskowe wyzwalają rozmnażanie płciowe lub bezpłciowe. Rozmnażanie płciowe rozpoczyna się od sygnalizacji feromonowej, która wyzwala chemoprzyciąganie strzępek, ostatecznie prowadząc do seryjnych przemian morfologicznych zakończonych powstaniem zygospory. 
W warunkach laboratoryjnych, krzyżówki P. blakesleeanus skutkują komplementarną grzybnią przechodzącą cykl płciowy na różnych etapach. Nasza praca ma na celu sprawdzenie, czy sygnały środowiskowe mogą wywołać krycie w grzybni P. blakesleeanus. Krzyżówki P. blakesleeanuuprawiane na pożywkach o ograniczonej zawartości składników odżywczych zostaną poddane działaniu agaru o ograniczonej zawartości składników odżywczych w celu wywołania reakcji płciowej zgodnie z niedoborem składników odżywczych. Pomyślne wywołanie krycia u P. blakesleeanus ułatwi przyszłe badania, które wymagają dużej ilości grzybni rozmnażającej się płciowo w określonych stadiach. Wyniki tych badań jeszcze bardziej pogłębią naszą wiedzę na temat wpływu czynników środowiskowych na mechanizmy rozrodcze P. blakesleeanus, przyczyniając się do poszerzenia bazy wiedzy na temat rozmnażania płciowego grzybów strzępkowych.

Po krzyżówce czterokierunkowej każdy szczep wykazywał niewielkie różnice w tempie wzrostu, określone na podstawie zmiany powierzchni grzybni (Ryc. 2). Choć nie było to statystycznie istotne, szczep NRRL 1555 wykazywał szybszą zmianę powierzchni przy wysiewie na 25% CMA, 25% PDA lub 100% PDA. Podobnie NRRL 1465 charakteryzował się większą zmianą powierzchni podczas wzrostu na 50% PDA lub CMA. Najszybszy przyrost powierzchni odnotowano dla szczepu NRRL 1464 hodowanego na 100% CMA. Po 24 h (1 D...

Tutaj prezentujemy podstawowy protokół indukcji krycia P. blakesleeanus.

Krzyżówki płciowe z Mucoromycete Phycomyces blakesleeanus

Phycomyces blakesleeanus, a filamentous fungus within the Mucoromycota phylum, is distinguished by its remarkable capacity for environmental perception ...

Nasze laboratorium jest zainteresowane badaniem ewolucji programów rozwojowych u grzybów strzępkowych. Jesteśmy ciekawi, jakie geny uczestniczą w tych seryjnych przejściach morfologicznych, które zachodziły podczas rozmnażania płciowego.Ponieważ grzybnia rozszerza się promieniście, różne części grzybni stykają się w różnym czasie i doświadczają asynchronicznego rozmnażania płciowego. Może to skomplikować badania nad ekspresją genów, które mają na celu powiązanie ekspresji genów z określonym typem komórek płciowych. Nasz protokół pozwala nam ograniczyć liczbę oddziałujących komórek i potencjalnie zapewnić wyraźny sygnał ekspresji genów.Nasz protokół ułatwi ekstrakcję RNA z określonych komórek podczas rozmnażania płciowego, co pozwoli nam powiązać funkcję genu z określoną zmianą morfologiczną.[Narrator] Na początek zdobądź kultury każdego typu godowego Phycomyces blakesleeanus. Za pomocą skalpela odetnij część grzybni krawędziowej z istniejących kultur i umieść wyciętą grzybnię na świeżym 100% agarze z mąki kukurydzianej lub akautowie z dekstrozy ziemniaczanej. Inkubuj czyste kultury przez tydzień w temperaturze 27 stopni Celsjusza w 12-godzinnym cyklu świetlnym. Gdy zarodniki są obecne, zalej zarodnikującą czystą płytkę hodowlaną 0,01% Tween 20 w wysterylizowanej wodzie dejonizowanej przy użyciu techniki aseptycznej. Następnie za pomocą mikropipety P1000 pobrać jeden mililitr mieszaniny zarodników Tween 20 z płytki do probówki do mikrowirówki. Odwiruj probówkę mikrowirówki w mini wirówce przez 30 sekund i ostrożnie zdekantuj supernatant bez naruszania osadu. Jeśli potrzeba więcej zarodników, dodaj kolejny mililitr mieszanki zarodników Tween 20 do tej samej probówki mikrowirówki i powtórz wirowanie. Po uzyskaniu odpowiedniej ilości zarodników należy zdekantować supernatant i zastąpić go 500 mikrolitrami sterylnej wody dejonizowanej. Użyj hemocytometru, aby oszacować stężenie zarodników. Ustaw krzyże jako skrzyżowania dwukierunkowe, czterokierunkowe lub ośmiokierunkowe, zgodnie z potrzebami. Alternatywnie, użyj skalpela do zaszczepienia krzyżówek bezpośrednio grzybnią krawędzi natarcia z czystych kultur. Następnie, używając wysterylizowanej żyletki lub otworu korkowego, wyciąć część tkanki i natychmiast nałożyć wycięte inokulum na świeżą pożywkę. W przypadku krzyżówki czterokierunkowej umieść podobne typy krycia naprzeciwko siebie, sąsiadując z uzupełniającym typem krycia. Teraz umieść zarodniki lub grzybnię ujemnych typów kojarzenia naprzeciwko siebie, w odległości co najmniej jednego centymetra od krawędzi szalki Petriego zawierającej agar z dekstrozą ziemniaczaną lub agar z mąki kukurydzianej. Po zaszczepieniu uszczelnij płytki Parafilmem. Umieść talerze w dodatkowym pojemniku. Inkubuj płytki w temperaturze 22 stopni Celsjusza w ciemności. Codziennie obserwuj płytki pod kątem dowodów na kojarzenie się i rób zdjęcia spod płytki podczas wzrostu kultury. Śledź rosnącą grzybnię w czasie. W zależności od rodzaju pożywki i preparatu, jeśli grzybnia zacznie się ze sobą stykać, należy sprawdzić oddziałujące uzupełniające typy kojarzenia pod kątem badań pod kątem śladów krycia. Zrób zdjęcia oddziałującej grzybni za pomocą aparatu lub smartfona zamontowanego na lunecie sekcyjnej. W ciągu jednego dnia po inokulacji szczepy wyhodowane na agarze z dekstrozą ziemniaczaną wykazywały większą żółtą pigmentację w porównaniu ze szczepami wyhodowanymi na agarze z mąki kukurydzianej. Po dwóch dniach od inokulacji zaobserwowano struktury godowe na 100% agarze z dekstrozą ziemniaczaną, ale nie na płytkach agarowych z mąki kukurydzianej. Po trzech dniach od inokulacji wszystkie preparaty agaru z dekstrozą ziemniaczaną wspierały kojarzenie o różnej gęstości zróżnicowanych typów komórek. Cztery dni po inokulacji szczepy na płytkach agaru z dekstrozą ziemniaczaną wykazywały zarówno reakcje godowe, jak i tworzenie bezpłciowych sporangioforów. Szczepy na agarze z mąki kukurydzianej wykazywały bardziej rozproszoną grzybnię i mniej sporangioforów w porównaniu z agarem z dekstrozą ziemniaczaną. Na agarze ze 100% dekstrozą ziemniaczaną, po czterech dniach od inokulacji, struktury powietrzne pojawiły się jako masa niezróżnicowanych komórek. Na 25% agarze z dekstrozą ziemniaczaną komórki w miejscu krycia wydawały się łatwe do odróżnienia i przeważnie w podobnych stadiach rozwojowych. Na 50% agarze z dekstrozą ziemniaczaną zaobserwowano mieszankę zygospor powietrznych i rozwijającą się progametangię.

sexual-crosses-with-the-mucoromycete-phycomyces-blakesleeanus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Krzyżowanie genetyczne pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez podanie dwóch genetycznie odmiennych pasożytów komarom. Potomstwo rekombinacyjne jest klonowane z krwi mysiej po tym, jak komary ukąsiły zainfekowane myszy. Niniejszy film pokazuje, jak przeprowadzić krzyżowanie genetyczne Plasmodium yoelii; metoda ta ma zastosowanie również do innych pasożytów malarii gryzoni.

Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Krzyżowania seksualne i izolacja potomstwa rekombinowanego są ważnymi narzędziami badawczymi w przypadku grzyba nitkowatego Fusarium graminearum. Przedstawiono techniki niezbędne do pomyślnego przeprowadzenia tych procesów.

Rozwój płciowy i wyrzut ascospor u Fusarium graminearum

Opracowaliśmy metodologię przeprowadzania krzyżówek w Setaria viridis (S. viridis).  Metoda polega na przycięciu wiechy przed zabiegiem gorącej wody w celu zabicia żywotnego pyłku.  Krzyżówki są wykonywane zgodnie z dobrze kontrolowanym reżimem wzrostu i zazwyczaj skutkują odzyskaniem od 1 do 7 nasion zapylonych krzyżowo na wiechę.

Metody wykonywania krzyżówek w Setaria viridis, nowym systemie modelowym dla traw

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Opisujemy solidną strategię wymiany genów w celu genetycznego manipulowania grzybem Ustilago maydis. Ten protokół wyjaśnia, jak generować mutanty delecji w celu zbadania fenotypów infekcji. Można go rozszerzyć o modyfikację genów w dowolny sposób, np. poprzez dodanie sekwencji kodującej znacznik białka fluorescencyjnego.

Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych

Ta praca opisuje klonowanie szczepu konia trojańskiego Ustilago maydis w celu dostarczania in situ wydzielanych białek kukurydzy do trzech różnych typów tkanek kukurydzy.

Wykorzystanie Ustilago maydis jako konia trojańskiego do dostarczania białek kukurydzianych in situ

Galleria mellonella służy jako model bezkręgowców dla rozsianej kandydozy. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół infekcji i podajemy dane pomocnicze dotyczące skuteczności modelu.

Model zakażenia robakiem woskowym Galleria mellonella dla rozsianej kandydozy

Dictyostelium discoideum to popularny organizm modelowy do badania złożonych procesów komórkowych, takich jak migracja komórek, endocytoza i rozwój. Użyteczność organizmu zależy od wykonalności manipulacji genetycznej. W tym miejscu przedstawiamy metody transfekcji komórek Dictyostelium discoideum, które przezwyciężają istniejące ograniczenia hodowli komórek w płynnych pożywkach.

Inżynieria genetyczna komórek Dictyostelium discoideum oparta na selekcji i wzroście bakterii

System edycji genomu CRISPR-Cas9 to łatwy w użyciu edytor genomu, który był używany w gatunkach modelowych i niemodelowych. Tutaj prezentujemy białkową wersję tego systemu, która została wykorzystana do wprowadzenia przedwczesnego kodonu stop do genu kojarzenia niemodelowego nitkowatego grzyba workowca.

Edycja genomu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 u nitkowatego workowca Huntiella omanensis

W celu oceny nowych terapii komórkami macierzystymi istotne jest nieinwazyjne śledzenie wstrzykniętych komórek in vivo. W tym filmie dowiedzą się Państwo, jak znakować ludzkie mezenchymalne i embrionalne komórki macierzyste za pomocą środków kontrastowych opartych na tlenku żelaza w celu późniejszego obrazowania MR in vivo.

Znakowanie hESC i hMSC nanocząsteczkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR

Poznaj protokół krzyżówek płciowych u grzyba Phycomyces blakesleeanus w celu badania ekspresji genów podczas rozmnażania płciowego. Ta metoda umożliwia izolację RNA z konkretnych typów komórek.

Krzyżówki płciowe z Mucoromycete Phycomyces blakesleeanus

Przeglądaj więcej filmów