Bezpośrednia kriosekcja głów Drosophila w celu wzmocnienia barwienia fluorescencyjnego mózgu i barwienia immunologicznego

Nasz zespół bada zaburzenia metaboliczne, sercowe, snu mięśniowego i starzenia się przy użyciu modelu Drosophila. Ten artykuł Jove szczegółowo opisywał uproszczony protokół przetwarzania tkanki mózgowej, w tym dekapitacji, fiksacji, kriosekcji, barwienia i obrazowania. Moja grupa badawcza była pionierem w rozwoju modelu Drosophila do badania kilku chorób i starzenia się ludzi.

Zbadaliśmy również interwencje, takie jak ograniczone czasowo karmienie i ćwiczenia. Wykorzystujemy uczenie maszynowe, omikę i podejście molekularne do badania czynników takich jak rytm okołodobowy i genetyka, aby ujawnić ich wpływ na integralność komórkową, fizjologię i zachowanie. Ten uproszczony protokół badań mózgu Drosophila pozwala uniknąć skomplikowanych sekcji, wymaga tylko wykonania jedną ręką i eliminuje potrzebę kosztownej mikroskopii konfokalnej, zwiększając dostępność i zmniejszając zależność od sprzętu.

Na początek zdobądź muchy w fiolkach do starzenia się, a następnie otwórz zawór na macie z dwutlenku węgla i szybko zrzuć muchy na matę, aby zapobiec ucieczce. Gdy muchy staną się w większości nieprzytomne, umieść je pod mikroskopem SZ61, przesuwając matę pod soczewką obiektywu. Dostosuj powiększenie i ostrość, aż muchy będą wyraźnie widoczne i wygodne do ścięcia.

Używając nożyczek sprężynowych, umieść ostrza między klatką piersiową a głową muchy i mocno ściśnij, aby odciąć głowę od pięciu do 10 głów much na grupę eksperymentalną. Umieść wszystkie i zużyte muchy z powrotem w ich starzejącej się fiolce. Za pomocą pędzla delikatnie przenieś odcięte główki muchy do oznaczonych 1,5 mililitrowych tubek umieszczonych na lodzie.

Po wyjęciu probówek z lodu, należy wlać pipetę do każdej probówki 100 mikrolitrów 4% paraformaldehydu i PBS, upewniając się, że wszystkie główki muchy są całkowicie zanurzone. Jeśli główki przylegają do ścianek rurki, delikatnie popchnij je w dół za pomocą szczotki lub lekko postukaj rurką o poziomą powierzchnię, aby zapewnić prawidłowy kontakt z roztworem. Następnie inkubować probówki przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej w średnim ustawieniu.

Wyrzuć roztwór paraformaldehydu i zastąp go PBS, upewniając się, że wszystkie głowy muchy są zanurzone. Po ostatnim umyciu przenieś główki muchy do 10% roztworu sacharozy w PBS, upewniając się, że są zanurzone w probówce. Napełnij oznakowaną formę do około 50% pojemności optymalną temperaturą cięcia lub związkiem OCT, pozwalając mu rozprzestrzenić się na wszystkie cztery rogi formy.

Za pomocą pędzla ostrożnie umieść zebrane stałe głowice muchowe na powierzchni związku OCT w formie. Za pomocą końcówki kleszczy delikatnie dociśnij każdą głowę do dna formy, upewniając się, że oczy są skierowane w dół, aby przeciąć płaszczyznę koronalną. Ostrożnie wyrównaj wszystkie głowice w wymiarach X, Y i Z, aby upewnić się, że wszystkie sekcje będą zawierać wszystkie grupy eksperymentalne jednocześnie.

Po odpowiednim ustawieniu głowic ostrożnie umieść foremki bezpośrednio w zamrażarce ustawionej na minus 20 stopni Celsjusza do zamrożenia. Gdy forma w większości zamarznie, wypełnij pozostałą przestrzeń związkiem OCT. W przypadku kriosekcji formy nałóż dużą ilość związku OCT na wierzch formy, aby przymocować wiertło do formy.

Umieść wiertło płasko na wierzchu i pozwól mu całkowicie zamarznąć w kriostacie, co zwykle zajmuje pięć minut. Następnie odłącz wiertło i blok OCT od formy. Umieść blok w uchwycie, upewniając się, że zachowana jest prawidłowa orientacja od góry do dołu i dokręć klucz do uchwytu, aż blok zostanie bezpiecznie zamocowany na swoim miejscu.

Za pomocą pokręteł regulacyjnych i regulatorów głębokości uchwytu wyrównaj blok z ostrzem. Ustaw szerokość sekcji kriostatu na 20 mikrometrów i pokrój każdy plasterek powolnym, spójnym ruchem, pozwalając jednocześnie szkłu anty-tocznemu uchwycić każdy plasterek. Następnie uchwyć sekcje za pomocą ciepłych slajdów, dotykając zjeżdżalni do bliższej krawędzi sekcji i pozwalając sekcji unieść się na slajdzie.

Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż godzinę. Weź kriowycięte głowy muchy Drosophila i użyj żyletki, aby usunąć wszelkie pozostałości związku OCT z krawędzi szkiełka, pozostawiając miejsce na hydrofobową obwódkę. Następnie użyj markera hydrofobowego, aby narysować obwódkę wokół każdego szkiełka i pozostaw do wyschnięcia na pięć minut.

Umyć wszystkie szkiełka trzy razy przez pięć minut za pomocą PBS, delikatnie pipetując szkiełko. Po umyciu szkiełek należy odpipetować 3% BSA w buforowym roztworze blokującym sól fizjologiczną Tris na szkiełka i inkubować przez 30 minut do jednej godziny. Następnie wyrzucić roztwór blokujący i odpipetować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała na szkiełka.

Inkubuj przeciwciało przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przez godzinę w temperaturze pokojowej, używając wilgotnych chusteczek higienicznych, aby zapobiec wysuszeniu. Odrzucić roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć szkiełka trzy razy przez pięć minut za pomocą PBS. Następnie dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała do szkiełek i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Po trzykrotnym umyciu szkiełek PBS, na szkiełku należy pozostawić tylko niewielką ilość PBS. Następnie, za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, równomiernie dodaj trzy do pięciu kropli utwardzającego podłoża montażowego zawierającego DAPI na szkiełku. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku, upewniając się, że podczas umieszczania nie tworzą się pęcherzyki powietrza.

Ostrożnie obchodź się ze świeżo zamontowanymi prowadnicami i przechowuj je płasko, aż nośniki montażowe całkowicie wyschną. Jeśli konieczne jest długotrwałe przechowywanie, uszczelnij krawędzie szkiełek. Rób zdjęcia slajdów tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować zanik fluorescencji.

Podczas pozyskiwania obrazu skoncentruj się na każdym unikalnym obiekcie w tym samym kanale, aby zachować spójność we wszystkich grupach eksperymentalnych. Skalibruj ekspozycje dla każdego kanału, aby uniknąć prześwietlenia we wszystkich wybranych kanałach. Upewnij się, że wybrane ekspozycje pozostają stałe i są odpowiednie dla wszystkich badanych, zwłaszcza między różnymi grupami eksperymentalnymi.

Ekspresja znacznika przeciwciała ApoE była wyraźnie zlokalizowana w regionach mózgu próbek Elav+ i Elav-ApoE4. Na akumulację lipidów wskazywało czerwone zabarwienie Nilu, które było widoczne w obszarach mózgu w obu genotypach.