Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Badania te mają na celu zbadanie lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł na poziomie pojedynczej cząsteczki, z wykorzystaniem anizotropii fluorescencji rozdzielczej w czasie w trybie mikroskopii konfokalnej. Wykrywanie i lokalizacja pojedynczych cząsteczek umożliwiły obserwację biomolekuł, jednak uchwycenie ich dynamiki wymaga innych podejść. Metody fluorescencji czasowo-rozdzielczej pomagają wypełnić tę lukę.

Typowe narzędzia do eksperymentalnego badania dynamiki biomolekularnej, w tym progi pojedynczej cząsteczki i NMR. Na poziomie pojedynczej cząsteczki różne analizy, procesy, foton przez emisję fluorescencyjną fotonów, Obejmują one analizę czasowo-rozdzielczą i analizę wariancji impulsów.

Użycie wielu fluoroforów do eksperymentów smFRET może wprowadzić komplikacje w projekcie eksperymentu i w tworzeniu próbek o wystarczająco dobrej jakości. Użycie pojedynczego znacznika i anizotropii fluorescencji rozwiązuje niektóre z tych zawiłości.

Odkryliśmy, że monomeryczna forma domeny widełkowej ludzkiego FoxP1 zachowuje się jak nieuporządkowane białko i zwiększa swoją populację fałdowania, gdy ulega dimeryzacji.

[Instruktor] Na początek przefiltruj przygotowany wzorcowy roztwór buforowy przez filtr o wielkości porów 0,22 mikrometra. Następnie przefiltruj standardowy bufor przez filtr węglowy w celu akwizycji pojedynczej cząsteczki. W przypadku sond fluorescencyjnych należy przygotować porcje o małej objętości przygotowanego BODIPY Fluorescent Pro. Aby skalibrować konfigurację rozdzielczości polaryzacji, najpierw włącz równoległe i prostopadłe kanały detektora i włącz niebieski laser. Upewnij się, że moc lasera jest ustawiona na 60 mikrowatów i otwórz skorelowany czasowo panel sterowania zliczaniem pojedynczych fotonów lub oprogramowanie TCSPC. Następnie wymieszaj jeden mikrolitr 100 nanomolowych rodaminy 110 z 49 mikrolitrami wody destylowanej. Dodaj kroplę płynu zanurzeniowego na wierzch soczewki obiektywu mikroskopu. Umieść szkiełko nakrywkowe na obiektywie mikroskopu i upewnij się, że kropla wody jest wyśrodkowana na soczewce. Dodać 50 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu rodaminy 110 do środka szkła nakrywkowego w celu przeprowadzenia pomiarów kalibracyjnych. Dostosuj płaszczyznę obrazu tak, aby znajdowała się wewnątrz roztworu i nad powierzchnią szkła. Za pomocą pokrętła ostrości zlokalizuj drugi jasny punkt ostrości i ustaw go na 1 1/2 obrotu. Teraz otwórz oprogramowanie w trybie Time-Tagged Time-Resolved i kliknij przycisk START. Rejestruj szybkość zliczania przez 120 sekund. W celu pomiarów tła dodaj 50 mikrolitrów wody destylowanej do środka szkła nakrywkowego i powtórz akwizycję. Rejestruj szybkość zliczania fotonów przez 300 sekund i zapisz plik jako water.ptu. Aby uzyskać dodatkowe pomiary tła, dodaj 50 mikrolitrów standardowego buforu na środek szkła nakrywkowego. Rejestruj szybkość zliczania fotonów przez 300 sekund i zapisz plik jako standard_buffer.ptu. Teraz uruchom oprogramowanie analityczne Burst Integration Fluorescence Lifetime, BIFL i kliknij Potwierdź konfigurację w oknie automatycznym. Następnie kliknij Pobierz parametry z pliku, a następnie kliknij OK. Aby wybrać pomiar do analizy, kliknij pozycję Tablica ścieżek danych i wybierz odpowiedni zestaw danych. Teraz załaduj plik water.ptu pomiaru wody dla tablic, takich jak Green Scatter, plik standard_buffer.ptu dla zielonego tła i Rhodamine110.ptu dla zielonego grubego. pod parametrami wyboru pojedynczej cząsteczki kliknij Dalej, a następnie Dostosuj, aby otworzyć nowe wyskakujące okienko. Następnie naciśnij Próg, aby zmodyfikować czas nadejścia interfotonu i wybrać czas zdarzenia pojedynczej cząsteczki jako średni czas przybycia międzyfotonu. Teraz kliknij minimalną liczbę, aby ustawić minimalną liczbę fotonów na zdarzenie pojedynczej cząsteczki. Następnie zamknij wyskakujące okienko, klikając Return i OK. Kliknij Parametry dopasowania koloru, aby dostosować początkowy czas trwania fluorescencji dla zieleni i innych kolorów za pomocą parametrów zaniku fluorescencji. Modyfikuj, monituj i opóźniaj wartości, dostosowując wartości od i do, a następnie zamknij wyskakujące okienko. Na koniec naciśnij Zapisz, aby przetworzyć pliki ASCII i zapisać je w wybranym folderze. Przenieś nocny pre-inokulum Escherichia coli C41 do 500 mililitrów pożywki LB z dodatkiem wstępnie dodanego antybiotyku w stosunku rozcieńczenia 1:500. Zmierz absorbancję kultury przy 600 nanometrach, aby monitorować wzrost kultury. Gdy gęstość optyczna osiągnie od 0,5 do 0,7, dodaj IPTG do końcowego stężenia 0,5 milimola w celu indukcji ekspresji białka i inkubuj. Odwirować komórki bakteryjne w temperaturze 3000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, gdy kultura osiągnie gęstość optyczną od 1,4 do 1,6. Po wyrzuceniu supernatantu należy przechowywać osad w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do momentu użycia. Następnie dodaj od 50 do 100 mikromolowych białek FoxP1 do dziesięciokrotnego nadmiaru molowego DTT lub TCEP i inkubuj. Umieść kolumnę odsalającą PD-10 w 50-mililitrowej probówce wirówkowej za pomocą adaptera kolumny do wymiany buforu. Dodać pięć mililitrów buforu PBS do kolumny w celu zrównoważenia i odwirować go przy 1000 g przez dwie minuty. Przenieś kolumnę PD-10 do świeżej probówki o pojemności 50 mililitrów i dodaj dwa mililitry buforu PBS do kolumny. Teraz załaduj 500 mikrolitrów białka FoxP1 do kolumny. Eluować kolumnę, wirując przy 1 000 g przez dwie minuty, aby zebrać oczyszczone białko. Przenieś białko do ultra-odśrodkowego filtra o masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów. Po odwirowaniu przy 7 500 g przez 10 minut, zebrać skoncentrowany eluat. Zmierz stężenie białka. Następnie dodaj BODIPY i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny na rotatorze. Powtórzyć wymianę buforu i stężenie białka. Po określeniu stężenia białka zmierz stopień oznakowania za pomocą wzoru. Dodaj 495 mikrolitrów ultraczystej wody i pięć mikrolitrów Tween 20 do studzienki szkiełka komorowego i dobrze wymieszaj. Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej delikatnie umyj komorę dwukrotnie ultraczystą wodą i wysusz. Aby skorygować fluorescencję tła, należy wykonać pomiary roztworu buforowego. Skalibruj względną czułość detektorów równoległych i prostopadłych, uzyskując dane z szybko obracającego się barwnika W przypadku eksperymentów anizotropii fluorescencji pojedynczej cząsteczki na monomerycznym FoxP1 dodaj 100 pikomolarnych BODIPY znakowanych FoxP1 i 100 nanomolowych nieznakowanych FoxP1 do 500 mikrolitrów standardowego buforu w szkiełku komorowym. Rozpocznij pomiary i sprawdź w oprogramowaniu BIFL, czy liczba serii zarejestrowanych w ciągu 30 sekund wynosi od 60 do 90. Jeśli próbka jest bardziej zagęszczona, należy ją rozcieńczyć, aż liczba impulsów mieści się w tym zakresie. Na koniec przeanalizuj pomiary. Analiza czasu życia anizotropii fluorescencji pojedynczej cząsteczki ujawniła pojedynczy rozkład pochodzący z dwóch różnych czasów korelacji rotacyjnej w domenie wiążącej DNA FoxP1, co sugeruje współistnienie uporządkowanych i nieuporządkowanych zespołów strukturalnych. Analiza wariancji impulsów zidentyfikowała podzbiór cząsteczek FoxP1 wykazujących wysoką anizotropię i nadmiar wariantów, co sugeruje obecność dynamicznych zmian konformacyjnych. Analiza rozkładu fotonów różnicowała monomeryczne i dimeryczne stany FoxP1, wykazując wyraźne rozkłady anizotropii i szybkości wymiany. Dimeryzacja wpłynęła na lokalne i globalne ruchy w FoxP1, a pomiary nadmiernej wariancji wykazały znaczące zmiany anizotropowe w określonych miejscach znakowanych cysteiną. Analiza anizotropii dynamicznej wykazała, że FoxP1 ulega częściowemu rozwinięciu po dimeryzacji i wiązaniu DNA, zmieniając frakcję ustrukturyzowanych i nieuporządkowanych populacji.