Name: Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Poznaj metodę anizotropii fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej do badania lokalnej elastyczności i dynamiki pojedynczych cząsteczek biomolekularnych. Protokół umożliwia szczegółową analizę zachowania białek na poziomie pojedynczej cząsteczki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez FONDECYT przyznaje 11200729 i FONDEQUIP EQM200202 dla E.M., NIH R15CA280699 R01GM151334 i NSF CAREER MCB 1749778 nagrody dla HS. NK podziękował za wsparcie ze strony programu stypendiów podoktoranckich Uniwersytetu Clemson.

UWAGA: Wybór odpowiedniego fluoroforu jest niezbędny do eksperymentów z smFA. Biomolekuły mogą być znakowane w pozycjach specyficznych dla danego miejsca poprzez modyfikację aminokwasów w białkach lub zasad nukleotydowych w kwasach nukleinowych za pomocą markerów fluorescencyjnych, w zależności od dostępnych grup reaktywnych. Wśród barwników organicznych52, rodziny Alexa Fluor, Cy, BODIPY i Janelia Farms są najpopularniejszym wyborem dla smFA, dzięki ich długiemu okresowi życia fluorescencji, fotostabilności i wysokiej wydajności kwantowej. BODIPY-FL jest często preferowany ze względu na wydłużoną żywotność fluorescencji, doskonałą wydajność kwantową i krótki łącznik łączący. Dodatkowo, alternatywne fluorofory są powszechnie stosowane w badaniach przesiewowych leków, gdzie preferowane są techniki masowe53. Chimeryczne białka fluorescencyjne mogą być również wykorzystywane do eksperymentów z anizotropią żywych komórek i obrazowania, chociaż istnieje ograniczenie w postaci niższego zakresu dynamiki.
1. Przygotowanie bufora
UWAGA: Noś rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny podczas przeprowadzania eksperymentów laboratoryjnych.
<ol>
	<li>Bufor wzorcowy (20 mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy [HEPES], pH 7,8, 150 mM NaCl): Rozpuścić 2,38 g HEPES, 4,38 g NaCl w 400 ml ultraczystej wody, dostosować pH do 7,8 i uzupełnić końcową objętość do 500 ml.</li>
	<li>Bufor do lizy (20 mM HEPES, pH 7,8, 150 mM NaCl, 0,1 mM fluorku fenylometylosulfonylu [PMSF], 10 μg/ml DNAzy): Rozpuścić 2,38 g HEPES, 4,38 g NaCl i 8,71 mg PMSF i końcowe stężenie 10 μg/ml DNAzy w 400 ml ultraczystej wody, dostosować pH do 7,8 i doprowadzić końcową objętość do 500 ml.</li>
	<li>Bufor równowagowy (50 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanem [PBS], 150 mM NaCl i 10 mM Imidazolu; pH 7,4): Rozpuścić 5,05 g Na2HPO4, 0,85 g NaH2PO4, 4,38 g NaCl i 0,34 g Imidazolu w 400 ml ultraczystej wody, dostosować pH do 7,4 i doprowadzić końcową objętość do 500 ml.</li>
	<li>Bufor płuczący (50 mM PBS, 150 mM NaCl i 30 mM Imidazol; pH 7,4): Rozpuść 5,05 g Na2HPO4, 0,85 g NaH2PO4, 4,38 g NaCl i 1,02 g Imidazolu w 400 ml ultraczystej wody, dostosuj pH do 7,4 i uzupełnij końcową objętość do 500 ml.</li>
	<li>Bufor elucyjny (50 mM PBS, 150 mM NaCl i 250 mM Imidazol; pH 7,4): Rozpuścić 5,05 g Na2HPO4, 0,85 g NaH2PO4, 4,38 g NaCl i 8,5 g Imidazolu w 400 ml ultraczystej wody, dostosować pH do 7,4 i doprowadzić końcową objętość do 500 ml.</li>
	<li>Bufor PBS (50 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanem sodu, 150 mM NaCl, pH 7,4). Rozpuść 5,05 g Na2HPO4, 0,85 g NaH2PO4 i 4,38 g NaCl w 400 ml ultraczystej wody, dostosuj pH do 7,4 i uzupełnij końcową objętość do 500 ml.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie, filtrując roztwór za pomocą filtrów o wielkości porów 0,22 μm i przechowuj w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przefiltruj standardowy bufor za pomocą filtra węglowego do akwizycji pojedynczych cząsteczek.</li>
</ol>
2. Sondy fluorescencyjne
<ol>
	<li>BODIPY-FL: Rozpuścić fiolkę 5 mg zawierającą BODIPY-FL, dodając końcową objętość 1,29 ml świeżo otwartego sulfotlenku dimetylu (DMSO), aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM BODIPY-FL.</li>
	<li>Rodamina 110: Rozpuść 3,67 mg Rhodamine 110, dodając końcową objętość 1 ml świeżo otwartego DMSO, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM Rhodamine 110, 
	UWAGA: Należy unikać sond fluorescencyjnych wystawionych na działanie światła. Zawsze używaj światłoczułej tubki (kolor bursztynowy) i owiń ją folią aluminiową. Jeśli DMSO jest już otwarty, musi być przechowywany w eksykatorze, aby wydłużyć jego okres przydatności do spożycia.</li>
	<li>Przygotować porcje o małej objętości przygotowanej sondy fluorescencyjnej i przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. 
	UWAGA: Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania, aby poprawić wydajność etykietowania.</li>
</ol>
3. Pomiary kalibracyjne
<ol>
	<li>Wykonuj eksperymenty z wieloparametrową detekcją fluorescencji (MFD) na domowej konfiguracji z rozdzielczością polaryzacji z 4 kanałami detekcji i 2 laserami impulsowymi (niebieski 485 nm i czerwony 640 nm)54. Jednak do pomiarów anizotropii należy użyć niebieskiego lasera i dwóch kanałów detektora.</li>
	<li>Włącz kanały detektora (równoległe i prostopadłe) oraz moc niebieskiego lasera.</li>
	<li>Upewnij się, że moc lasera jest ustawiona na 60 μW i otwórz panel sterowania zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych czasowo (TCSPC)36.</li>
	<li>Zmieszać 1 μl 100 nM Rhodamine 110 i 49 μL wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 2 nM Rhodamine 110. Dodaj 50 μl 2 nM Rhodamine 110 do środka szkła nakrywkowego w celu przeprowadzenia pomiarów kalibracyjnych.</li>
	<li>Następnie dodaj kroplę płynu immersyjnego (oleju lub wody, ale uważając, aby mieć ten sam współczynnik załamania światła) na wierzch soczewki obiektywu mikroskopu, aby zwiększyć zdolność rozdzielczą mikroskopu.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na soczewce obiektywu i upewnij się, że kropla wody znajduje się w środku obiektywu mikroskopu.</li>
	<li>Dostosuj płaszczyznę obrazu tak, aby znajdowała się wewnątrz roztworu i nad powierzchnią szkła.</li>
	<li>Wyreguluj pokrętło, aby znaleźć drugi jasny punkt ogniskowy i obróć do półtora punktu. Skoncentruj laser na granicy faz szkła i cieczy.</li>
	<li>Zmaksymalizuj liczbę wykrywanych fotonów, dostosowując pozycję otworka (70 μm) przy jednoczesnym monitorowaniu szybkości zliczania fotonów.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie w panelu trybu TTTR lub T3 (TTTR lub T3) z oznaczeniem czasowym i kliknij przycisk Start. Zapisz szybkość zliczania przez 120 s i zapisz format pliku Rhodamine 110.ptu za pomocą oprogramowania do akwizycji. Ten czas akwizycji powinien wystarczyć, biorąc pod uwagę stężenie (2 nM).</li>
	<li>W celu pomiaru tła dodaj 50 μl wody destylowanej do środka szkła nakrywkowego i powtórz kroki 3.5-3.10. Należy jednak zapisać szybkość zliczania fotonów przez 300 s i zapisać plik water.ptu.</li>
	<li>W przypadku innych pomiarów tła dodać 50 μl buforu wzorcowego na środek szkła nakrywkowego i powtórzyć kroki 3.5-3.10. Zapisuj szybkość zliczania fotonów przez 300 s i zapisz standardowy plik buffer.ptu. Następnie przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy czasu życia fluorescencji z integracją impulsów (BIFL).</li>
</ol>
4. Kalibracja i analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie BIFL i kliknij potwierdź konfigurację w oknie automatycznym. Następnie kliknij pobierz parametry z pliku, a następnie OK.</li>
	<li>Aby przeanalizować pomiar, kliknij tablicę ścieżek danych i wybierz ją.</li>
	<li>Następnie załaduj plik water.ptu do pomiaru wody dla tablic takich jak zielone rozproszenie. Podobnie wybierz standardowy plik buffer.ptu dla Zielone tło. W polu Zielony gruby wybierz Rhodamine 110.ptu.</li>
	<li>Pod parametrami wyboru pojedynczej cząsteczki kliknij przycisk Dalej, a następnie Dostosuj, aby wyświetlić nowe okno podręczne. Kliknij próg, aby zmienić czas nadejścia międzyfotonu i wybierz czas zdarzenia pojedynczej cząsteczki jako średni czas przybycia między fotonami (dt). Następnie kliknij min. #, aby wybrać minimalną liczbę fotonów na zdarzenie pojedynczej cząsteczki, a następnie zamknij wyskakujące okienko, klikając Return. Następnie kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Następnie kliknij opcję Parametry dopasowania koloru, aby dostosować początkowy czas życia fluorescencji dla koloru zielonego, kolorów generowanych z parametrami zaniku fluorescencji. Dostosuj wartości monitu i opóźnienia, modyfikując wartości Od i Do. Następnie zamknij wyskakujące okienko, klikając Powrót. Następnie kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Kliknij przycisk Zapisz, aby przetworzyć pliki ASCII i zapisać je w wybranym folderze. Następnie przetwórz dane pod kątem czasowo-rozdzielczego zaniku anizotropii fluorescencji za pomocą ChiSurf22, Photon Distribution Analysis55,56, or Burst Variance Analysis57,58. 
	UWAGA: Przykładowe dane i opisy krok po kroku dotyczące korzystania z ChiSurf, PDA i BVA są dostępne odpowiednio w github.com/Fluorescence-Tools/chisurf, github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib, www.mpc.hhu.de/en/software/mfd-fcs-and-mfis i github.com/SMB-Lab/feda_tools. Dane eksperymentalne są dostępne na stronie Zenodo (10.5281/zenodo.13371503).</li>
</ol>
5. Preparat białka FoxP1
<ol>
	<li>Rekombinowana nadekspresja bakterii FoxP1
	<ol>
		<li>Przeprowadź transformację w komórki bakteryjne E. coli C41 po szybkiej zmianie mutagenezy łańcuchowej polimerazy skierowanej do miejsca (PCR).</li>
		<li>Przygotuj podłoże LB i autoklaw, aby je wysterylizować.</li>
		<li>Wstępnie zaszczepić pojedynczą kolonię E. coli C41, dodając do 5 ml pożywki LB zawierającej 5 μl (100 μg/ml) ampicyliny. Pozostawić na noc do inkubacji w temperaturze 37 °C na wytrząsarce inkubatora.</li>
		<li>Następnego dnia zaszczepij kulturę bakteryjną na dużą skalę, dodając pre-inokulum na noc do 500 ml pożywki LB z dodatkiem wstępnie dodanego antybiotyku w stosunku 1:500.</li>
		<li>Monitorować wzrost kultury, mierząc absorbancję kultury przy 600 nm.</li>
		<li>Gdy gęstość optyczna osiągnie zakres ~0,5-0,7, indukuj ekspresję białka, dodając końcowe stężenie 0,5 mM izopropylo-β-d-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i utrzymuj kulturę w temperaturze 15 °C na wytrząsarce inkubatora przez noc.</li>
		<li>Po osiągnięciu gęstości optycznej (600 nm) w zakresie 1,4-1,6, zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie w stężeniu 3000 g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przechowywać osad w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie rekombinowanego FoxP1
	<ol>
		<li>Lizuj komórki E. coli C41, dodając bufor do lizy przy użyciu dowolnych metod lizy, takich jak sonikacja, homogenizacja cieczy, prasa francuska itp.</li>
		<li>Odwirować lizat w temperaturze 14000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W przypadku białek znakowanychprzez niego 6 należy przemyć kolumnę powinowactwa Ni2 + -NTA i zrównoważyć z NiSO4 za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC).</li>
		<li>Załaduj białko FoxP1 znakowane przez His 6 do zrównoważonej kolumny powinowactwa Ni2 + -NTA.</li>
		<li>Eluować białko FoxP1 z kolumny Ni2+-NTA przy użyciu liniowego gradientu buforu elucyjnego.</li>
		<li>Po wymyciu białka należy przeprowadzić dializę w celu wymiany buforu. Dodać białko do buforu równowagowego bez imidazolu i dializować przez noc za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Jeśli białko jest oczyszczane inną metodą, należy odpowiednio przeprowadzić wymianę buforu.</li>
		<li>Aby usunąć znacznik He6, dodaj proteazę wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) (stosunek TEV:FoxP1 1:100) do dializy przez noc. 
		UWAGA: Jego 6-znacznikowe trawienie można również przeprowadzić, dodając trawienie proteazy TEV na kolumnie. Ten krok poprawiłby wydajność białka będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
		<li>Następnego dnia powtórz kroki z 5.2.3-5.2.5. Jednak tym razem należy wymyć białko w buforze do płukania, a nie w buforze elucyjnym.</li>
		<li>Zagęścić białko do odpowiedniej objętości przez dodanie buforu PBS i określić ilościowo białko, stosując absorbancję przy długości fali 280 nm, biorąc pod uwagę współczynnik ekstynkcji białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie rekombinowanego FoxP1
	<ol>
		<li>Inkubować 50-100 μM białka FoxP1 z 10-krotnym nadmiarem molowym ditiotreitolu (DTT) lub tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) z końcową objętością 500 μl w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
		<li>Przeprowadzić wymianę buforu za pomocą kolumn odsalających PD 10. Umieść kolumnę PD10 w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą adaptera kolumny.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę PD10, dodając 5 ml buforu PBS i odwirować przy 1000 × g przez 2 minuty. Powtórzyć ten krok 3 razy.</li>
		<li>Umieść kolumnę PD10 w świeżej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 2 ml buforu PBS do kolumny. Następnie dodaj 500 μl białka FoxP1 z kroku 1 do kolumny. Rozpuść białko przez odwirowanie 1000 × g przez 2 minuty i zbierz białko.</li>
		<li>Zagęścić białko, dodając je do ultra filtrów odśrodkowych (10 kDa MWCO), odwirować przy 7500 × g przez 10 minut i zebrać elucję.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie białka, dodać BODIPY z 30% równowartościowym stężeniem cysteiny w białku i umieścić na rotatorze na 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przeprowadzić wymianę buforu i zagęścić białko zgodnie z opisem w krokach 5.3.2-5.3.5.</li>
		<li>Sprawdzić stężenie białka za pomocą spektrofotometru lub testu kolorymetrycznego, takiego jak metoda Bradforda lub Lowry'ego, oraz stężenie barwnika przez absorbancję przy 500 nm.</li>
		<li>Zmierz stopień oznakowania za pomocą następującego wzoru: 
		(Barwnik A/ε barwnik)/(masa cząsteczkowa białka/miligram białka na mililitr) = mole barwnika/mole białka 
		GdzieBarwnik A iε Barwnik są odpowiednio wartością absorbancji barwnika i molowym współczynnikiem ekstynkcji barwnika przy maksymalnej długości fali absorbancji59. Przy pomiarze przy długości fali 280 nm rzeczywistą absorbancję białka należy skorygować za pomocą następującego wzoru: 
		Białko A = A280-(Barwnik A·CF280) 
		Gdzie CF280 jest współczynnikiem korygującym dla określonego barwnika, biorąc pod uwagę jego wewnętrzną absorbancję przy 280 nm59. 
		UWAGA: Podczas gdy skupiamy się na ekspresji i oczyszczaniu białka modyfikowanego cysteiną, należy dokładnie rozważyć strategiczne wprowadzenie reszt cysteiny do białka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przygotowanie komory na próbki mikroskopu
<ol>
	<li>Dodaj 495 μl ultraczystej wody i 5 μl (0,01% v/v stężenie końcowe) Tween-20 (niejonowy środek powierzchniowo czynny) do studzienki szkiełka komorowego i wymieszaj. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie umyj komorę dwukrotnie ultra czystą wodą i wysusz ją. 
	UWAGA: Komora jest gotowa do użycia na potrzeby eksperymentu.</li>
</ol>
7. Eksperyment z anizotropią fluorescencji pojedynczej cząsteczki
<ol>
	<li>Najpierw skalibruj przyrząd smFA. Określić funkcję odpowiedzi przyrządu, albo poprzez pomiar światła rozproszonego Ramana, albo przez pomiar fluorescencji barwnika o krótkim czasie życia i odpowiednim widmie emisyjnym (np. Erytrozyna lub zieleń malachitowa) dodatkowo stłumionego nasyconym roztworem jodku potasu, KI.</li>
	<li>Aby skorygować fluorescencję tła, należy wykonać pomiary roztworu buforowego. Skalibruj względną czułość detektorów równoległych i prostopadłych (współczynnik G), pozyskując dane z szybko rotującego barwnika. W tym przypadku do kalibracji detektorów użyto 2 nM Rhodamine 11060.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów smFA na monomerycznym FoxP1 dodaj 100 pM FoxP1 znakowanego BODIPY i 100 nM nieznakowanego FoxP1 do 500 μl standardowego buforu (20 mM HEPES, 20 mM NaCl, pH 7,8) w szkiełku komorowym.</li>
	<li>Do testu miareczkowania z DNA i monomerycznym FoxP1 dodać 400 nM DNA do 100 pM znakowanej BODIPY/100 nM mieszanki białek nieznakowanych i inkubować w RT przez 10 minut.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów smFA na dimerycznym FoxP1 dodaj 500 nM nieznakowanego FoxP1 do 100 pM FoxP1 znakowanego BODIPY w standardowym buforze. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Do testu miareczkowania z DNA i dimerycznym FoxP1 dodać 2000 nM DNA do 100 pM mieszanki białek znakowanych BODIPY/500 nM nieznakowanych i inkubować w RT przez 10 minut.</li>
	<li>Rozpocznij pomiary i sprawdź w oprogramowaniu BIFL, czy liczba impulsów w rekordzie 30 s mieści się w przedziale 60-90. Jeżeli próbka jest bardziej skoncentrowana, należy ją rozcieńczyć, aż osiągnie tę wartość. Ten krok zapewnia warunki jednocząsteczkowe.</li>
	<li>Rozpocznij smFA każdy pomiar dla monomerycznego FoxP1 lub dimerycznego FoxP1 w przypadku braku lub obecności DNA przez co najmniej 4 godziny.</li>
	<li>Przeanalizuj pomiary smFA zgodnie z opisem w sekcji 4.</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych w stosunku do treści tego artykułu.

W przypadku eksperymentów z anizotropią fluorescencji pojedynczych cząsteczek kluczowe jest dokładne rozważenie właściwości fotofizycznych wybranego fluoroforu. Właściwości te obejmują długość fali emisyjnej, która musi być zgodna z systemem detekcji, oraz długość fali wzbudzenia, która powinna być kompatybilna z dostępnymi laserami impulsowymi. Aby zoptymalizować zakres dynamiki, fluorofor powinien mieć długi czas trwania fluorescencji w stosunku do czasu dyfuzji rotacyjnej cząsteczki. Ma to kluczowe znaczenie dla śledzenia dynamiki rotacji i wiązania/orientacji dipola fluoroforu względem biomolekuły będącej przedmiotem zainteresowania. Ponadto jasność, fotostabilność i wydajność kwantowa są niezbędne do wytwarzania silnych sygnałów o stabilnym stosunku sygnału do szumu. Z tych powodów BODIPY-FL został wybrany jako fluorofor w kilku badaniach 39,40,42.
Badania przesiewowe dynamiki szkieletu biomolekuł często wymagają znakowania białek, zwykle osiąganego poprzez znakowanie specyficzne dla miejsca. Zwykle odbywa się to poprzez wprowadzenie pozostałości do ukierunkowanej modyfikacji chemicznej. Najczęstszym podejściem jest wprowadzanie cystein w interesujące ich miejsca, gdzie ich tiolowe łańcuchy boczne mogą być selektywnie modyfikowane za pomocą odczynników, takich jak maleimidy lub jodoacetamidy. Rzadziej halogenki benzylowe i ketony bromometylowe są używane do tworzenia wiązań tioeterowych. Inne łańcuchy boczne aminokwasów również mogą być celowane, ale ich obfitość w białkach jest rzadziej stosowana. Można jednak również stosować alternatywne podejścia, takie jak nienaturalne aminokwasy73. Właściwy wybór miejsca do znakowania ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania ingerencji w badaną biomolekułę i należy wprowadzić odpowiednie kontrole. Na przykład, jeśli znakowana cząsteczka jest używana w testach wiązania, uzupełniające metody bezznacznikowe powinny sprawdzić, czy fluorofory nie wpływają na powinowactwo wiązania. 
Po zidentyfikowaniu odpowiedniej próbki i wdrożeniu optymalnej strategii znakowania, następnym krokiem jest upewnienie się, że mikroskop konfokalny jest prawidłowo ustawiony i skalibrowany do eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami. W protokole opisano, w jaki sposób określić wymagany współczynnik do dalszej analizy. Po skalibrowaniu przyrządu następnym krokiem jest zmierzenie próbki i przetworzenie danych w celu wydobycia jak największej ilości informacji z wykrytych fotonów. Kluczowe parametry, takie jak mikroczas, makroczas i typ kanału, jak pokazano na rysunku 2, mogą być wykorzystane do dalszej analizy i wizualizacji przy użyciu typowej elektroniki TCSPC.
Najnowsze osiągnięcia w spektroskopii fluorescencji pojedynczych cząsteczek mogą być szeroko wykorzystywane do badania informacji strukturalnych z heterogenicznych zespołów biomolekuł. Jednak stosunkowo niewiele badań wykorzystuje spostrzeżenia dostarczane przez anizotropię fluorescencji, a do uzyskania dynamiki strukturalnej biomolekuł wymagany jest kompletny model białkowy. W związku z tym rozwikłanie dynamiki interakcji międzydomenowych i białko-białko kilku czynników transkrypcyjnych jest wyzwaniem.
Podsumowując, eksperymenty z anizotropią fluorescencji pojedynczych cząsteczek dostarczają uzupełniających informacji na temat lokalnych i globalnych ruchów szkieletu biomolekularnego, które mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia jego funkcji.

Aktywność funkcjonalna biomolekuł zależy od ich elastyczności molekularnej i dynamiki strukturalnej1,2,3. Naturalnie, biomolekuły doświadczają ciągłych wahań termicznych, od gwałtownych ruchów po długotrwałe zmiany konformacyjne wpływające na ich funkcję (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)4. W biomolekułach lokalne ruchy kręgosłupa przyczyniają się do globalnych ruchów na większą skalę, w tym zginania zawiasów u enzymów i znaczących zmian konformacyjnych w białkach motorycznych. Metody określania struktury, takie jak magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)5, krystalografia rentgenowska6 i kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM)7 ujawniły wiele konformacji w różnych biomolekułach. Niemniej jednak powiązanie lokalnych fluktuacji z dużą dynamiką konformacyjną biomolekuł i ich rolą w funkcji jest w większości niezbadane. Powiązanie dynamiki i struktury może być trudne, szczególnie w przypadku białek wewnętrznie nieuporządkowanych (IDPs)8,9,10. W przeciwieństwie do białek strukturalnych, IDP nie utrzymują stabilnej struktury trzeciorzędowej. Zamiast tego przechodzą rozległe zmiany konformacyjne o podobnych poziomach energii swobodnej, umożliwiając szeroki zakres aktywności biologicznej11,12.
Zastosowano kilka podejść eksperymentalnych do zbadania dynamiki konformacyjnej białek poprzez badanie ich elastyczności molekularnej1,13,14,15,16. Wśród nich NMR wyróżnia się zdolnością do zapewniania rozdzielczości na poziomie atomowym w różnych skalach czasowych, od dziesiątek pikosekund do kilku godzin12. Jednak określenie elastyczności makromolekularnej pozostaje wyzwaniem ze względu na wysokie stopnie swobody i w przypadku białek o dużych rozmiarach; w związku z tym NMR często ogranicza się do badania biomolekuł o masie około 100 kDa17.
Biorąc pod uwagę złożoność strukturalną wysoce dynamicznych białek, takich jak IDP, opracowano dodatkowe postępy metodologiczne w celu zbadania lokalnej i długoterminowej przestrzeni konformacyjnej w celu zrozumienia ich funkcji11. Wieloparametrowa spektroskopia fluorescencyjna jednocząsteczkowa (smMFS)18,19,20,21,22 oferuje obszerne informacje na temat biomolekuł, dostarczając kluczowych informacji na temat ich funkcji, dynamiki konformacji, stanów wiązania i stechiometrii. Jednak interpretacja ogromnej ilości danych strukturalnych uzyskanych z biomolekuł jest trudna, a czynniki takie jak dynamika molekularna, zachowanie fluoroforów i złożone zachowanie cząsteczek mogą jeszcze bardziej skomplikować analizę danych23,24,25,26,27,28.
Używamy anizotropii fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFA) jako solidnej metody oceny lokalnej i globalnej dynamiki wzdłuż szkieletu biomolekuł (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Anizotropia fluorescencji, po raz pierwszy opisana przez Perrin29 i wprowadzona przez Weber30,31 jako narzędzie bioanalityczne32, została później zaadaptowana do badań pojedynczych cząsteczek wraz z pojawieniem się technik fluorescencji czasowo-rozdzielczej i zwiększeniem czułości detektorów33,34,35,36,37. smFA obejmuje szeroki zakres skal czasowych - od pikosekund do kilku godzin - i uzupełnia dane uzyskane z eksperymentów z transferem energii rezonansu Förstera (smFRET) na pojedynczej cząsteczce38.
smFA może być wizualizowane w różnych formatach, aby wydobyć kluczowe informacje o dynamice biomolekularnej (Rysunek 1B). Czasowo-rozdzielcze rozpady anizotropii fluorescencji to jednowymiarowe histogramy, które rejestrują dynamikę w skali od pikosekundy do nanosekundy39,40. Dwuwymiarowe histogramy pojedynczych cząsteczek, które korelują czas życia fluorescencji z anizotropią dla poszczególnych cząsteczek, mogą ujawnić niejednorodność stanu anizotropii i zapewnić wizualny wgląd w potencjalną dynamikę w czasie obserwacji w eksperymentach konfokalnych (~ms)41,42. Do badania dynamiki submilisekundowej można wykorzystać analizę dynamicznego rozkładu fotonów anizotropii (daPDA), podczas gdy analiza wariancji impulsu anizotropii w czasie (traBVA) oferuje solidną metodę potwierdzania określonej dynamiki wokół milisekund43 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).
Te metody uzupełniają bardziej tradycyjne narzędzia, takie jak spektroskopia korelacji fluorescencji z rozdzielczością polaryzacji (pFCS), która ma szersze spektrum44,45,46,47. Ogólnie rzecz biorąc, wiele narzędzi do analizy danych dla smFA ułatwia identyfikację lokalnych i globalnych zmian konformacyjnych, pod warunkiem, że weźmie się pod uwagę odpowiednią kalibrację.
Tutaj stosujemy smFA do badania wiązania DNA ludzkiego czynnika transkrypcyjnego FoxP148,49,50,51. Białko to przyjmuje dimer zamieniony domeną ze względu na wewnętrznie nieuporządkowany charakter jego łańcucha polipeptydowego, który jest wyraźnie dotknięty w zależności od czwartorzędowego stanu białka i obecności DNA. Wygenerowaliśmy różne mutanty pojedynczej cysteiny do znakowania za pomocą BODIPY-FL, przeprowadziliśmy eksperymenty smFA i zastosowaliśmy daPDA i trBVAa. Takie podejście pozwoliło nam powiązać dynamikę i heterogeniczność z dimeryzacją FoxP1 i wiązaniem DNA, podkreślając złożony mechanizm działania, który charakteryzuje ten czynnik transkrypcyjny.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>A20100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, 10 kDa</td><td>MWCO Millipore Sigma</td><td>UFC901008</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010</td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Millipore Sigma</td><td>A0166-5G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166</td></tr><tr><td>BODIP FL Maleimid (BODIPY FL N-(2-aminoetylo))Maleimid))</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>B10250</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250</td></tr><tr><td>Jednorazowe kolumny odsalające PD 10</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE17-0851-01</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>10197777001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro</td></tr><tr><td>DMSO, bezwodny</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345 DNAse</td><td>Millipore Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001</td></tr><tr><td>E. coli Komórki bakteryjne C41&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foresigh Nuvi Ni-Charged IMAC, kolumna 5 ml</td><td>Bio-Rad</td><td>12004037</td><td>https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Millipore Sigma</td><td>288-32-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513</td></tr> Filtr membranowy <tr><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758 MCE IPTG</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>, 0,22 &mu; m Wielkość porów</td><td>Millipore Sigma GSWP02500</td><td></td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014</td></tr><tr><td>System prowadnic komorowych Nunc Lab-Tek II</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>154534</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534</td></tr><tr><td>OverExpress C41(DE3) Chemicznie Kompetentne komórki</td><td>Millipore Sigma</td><td>CMC0017-20X40UL</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore Sigma</td><td>329-98-6</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830</td></tr><tr><td>Rodamina 110</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>419075000</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000</td></tr><tr><td>Sód fosforan dwuzasadowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>7558-79-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny</td><td>Milipore Sigma</td><td>13472-35-0</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505</td></tr><tr><td>TCEP, chlorowodorek, odczynnik klasy</td><td>Millipore Sigma</td><td>580567-5GM</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567</td></tr><tr><td>Animacja 20</td><td>milipore Sigma</td><td>11332465001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001</td></tr></tbody></table>

anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules for Characterizing Local Flexibility in Biomolecules

Opisujemy protokół przeprowadzania anizotropii fluorescencji rozdzielczej w czasie na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu zbadania lokalnej elastyczności i dynamiki domeny FKH czynnika transkrypcyjnego FoxP1 wiążącej kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA). FoxP1 dimeryzuje poprzez trójwymiarowy mechanizm zamiany domen (3D-DS), tworząc nieuporządkowany produkt pośredni z DNA lub bez. Ponieważ 3D-DS obejmuje wewnętrznie nieuporządkowany region, zrozumienie jego zachowania ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia strukturalnych i funkcjonalnych właściwości FoxP1. Korzystając z FoxP1 znakowanego pojedynczą cysteiną, przeprowadziliśmy eksperymenty anizotropii fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFA), stosując dynamiczną analizę rozkładu anizotropii fotonów (daPDA) i analizę wariancji impulsu anizotropii w czasie (traBVA) w celu zbadania lokalnej elastyczności i dynamiki. Protokół ten zawiera szczegółowy przewodnik krok po kroku dotyczący pomiarów smFA, kładąc nacisk na analizy czasowo-rozdzielcze, wariancję i techniki rozkładu prawdopodobieństwa w celu uchwycenia dynamiki strukturalnej w różnych skalach czasowych. Podejście to umożliwiło nam powiązanie dynamiki i heterogeniczności z dimeryzacją FoxP1 i wiązaniem DNA, podkreślając złożony mechanizm działania, który charakteryzuje ten czynnik transkrypcyjny.

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł za pomocą czasowo-rozdzielczej anizotropii fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie mikroskopii konfokalnej.

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

We describe a protocol for conducting time-resolved fluorescence anisotropy at the single-molecule level using confocal microscopy to investigate the ...

Badania te mają na celu zbadanie lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł na poziomie pojedynczej cząsteczki, z wykorzystaniem anizotropii fluorescencji rozdzielczej w czasie w trybie mikroskopii konfokalnej. Wykrywanie i lokalizacja pojedynczych cząsteczek umożliwiły obserwację biomolekuł, jednak uchwycenie ich dynamiki wymaga innych podejść. Metody fluorescencji czasowo-rozdzielczej pomagają wypełnić tę lukę.Typowe narzędzia do eksperymentalnego badania dynamiki biomolekularnej, w tym progi pojedynczej cząsteczki i NMR. Na poziomie pojedynczej cząsteczki różne analizy, procesy, foton przez emisję fluorescencyjną fotonów, Obejmują one analizę czasowo-rozdzielczą i analizę wariancji impulsów.Użycie wielu fluoroforów do eksperymentów smFRET może wprowadzić komplikacje w projekcie eksperymentu i w tworzeniu próbek o wystarczająco dobrej jakości. Użycie pojedynczego znacznika i anizotropii fluorescencji rozwiązuje niektóre z tych zawiłości.Odkryliśmy, że monomeryczna forma domeny widełkowej ludzkiego FoxP1 zachowuje się jak nieuporządkowane białko i zwiększa swoją populację fałdowania, gdy ulega dimeryzacji.[Instruktor] Na początek przefiltruj przygotowany wzorcowy roztwór buforowy przez filtr o wielkości porów 0,22 mikrometra. Następnie przefiltruj standardowy bufor przez filtr węglowy w celu akwizycji pojedynczej cząsteczki. W przypadku sond fluorescencyjnych należy przygotować porcje o małej objętości przygotowanego BODIPY Fluorescent Pro. Aby skalibrować konfigurację rozdzielczości polaryzacji, najpierw włącz równoległe i prostopadłe kanały detektora i włącz niebieski laser. Upewnij się, że moc lasera jest ustawiona na 60 mikrowatów i otwórz skorelowany czasowo panel sterowania zliczaniem pojedynczych fotonów lub oprogramowanie TCSPC. Następnie wymieszaj jeden mikrolitr 100 nanomolowych rodaminy 110 z 49 mikrolitrami wody destylowanej. Dodaj kroplę płynu zanurzeniowego na wierzch soczewki obiektywu mikroskopu. Umieść szkiełko nakrywkowe na obiektywie mikroskopu i upewnij się, że kropla wody jest wyśrodkowana na soczewce. Dodać 50 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu rodaminy 110 do środka szkła nakrywkowego w celu przeprowadzenia pomiarów kalibracyjnych. Dostosuj płaszczyznę obrazu tak, aby znajdowała się wewnątrz roztworu i nad powierzchnią szkła. Za pomocą pokrętła ostrości zlokalizuj drugi jasny punkt ostrości i ustaw go na 1 1/2 obrotu. Teraz otwórz oprogramowanie w trybie Time-Tagged Time-Resolved i kliknij przycisk START. Rejestruj szybkość zliczania przez 120 sekund. W celu pomiarów tła dodaj 50 mikrolitrów wody destylowanej do środka szkła nakrywkowego i powtórz akwizycję. Rejestruj szybkość zliczania fotonów przez 300 sekund i zapisz plik jako water.ptu. Aby uzyskać dodatkowe pomiary tła, dodaj 50 mikrolitrów standardowego buforu na środek szkła nakrywkowego. Rejestruj szybkość zliczania fotonów przez 300 sekund i zapisz plik jako standard_buffer.ptu. Teraz uruchom oprogramowanie analityczne Burst Integration Fluorescence Lifetime, BIFL i kliknij Potwierdź konfigurację w oknie automatycznym. Następnie kliknij Pobierz parametry z pliku, a następnie kliknij OK. Aby wybrać pomiar do analizy, kliknij pozycję Tablica ścieżek danych i wybierz odpowiedni zestaw danych. Teraz załaduj plik water.ptu pomiaru wody dla tablic, takich jak Green Scatter, plik standard_buffer.ptu dla zielonego tła i Rhodamine110.ptu dla zielonego grubego. pod parametrami wyboru pojedynczej cząsteczki kliknij Dalej, a następnie Dostosuj, aby otworzyć nowe wyskakujące okienko. Następnie naciśnij Próg, aby zmodyfikować czas nadejścia interfotonu i wybrać czas zdarzenia pojedynczej cząsteczki jako średni czas przybycia międzyfotonu. Teraz kliknij minimalną liczbę, aby ustawić minimalną liczbę fotonów na zdarzenie pojedynczej cząsteczki. Następnie zamknij wyskakujące okienko, klikając Return i OK. Kliknij Parametry dopasowania koloru, aby dostosować początkowy czas trwania fluorescencji dla zieleni i innych kolorów za pomocą parametrów zaniku fluorescencji. Modyfikuj, monituj i opóźniaj wartości, dostosowując wartości od i do, a następnie zamknij wyskakujące okienko. Na koniec naciśnij Zapisz, aby przetworzyć pliki ASCII i zapisać je w wybranym folderze. Przenieś nocny pre-inokulum Escherichia coli C41 do 500 mililitrów pożywki LB z dodatkiem wstępnie dodanego antybiotyku w stosunku rozcieńczenia 1:500. Zmierz absorbancję kultury przy 600 nanometrach, aby monitorować wzrost kultury. Gdy gęstość optyczna osiągnie od 0,5 do 0,7, dodaj IPTG do końcowego stężenia 0,5 milimola w celu indukcji ekspresji białka i inkubuj. Odwirować komórki bakteryjne w temperaturze 3000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, gdy kultura osiągnie gęstość optyczną od 1,4 do 1,6. Po wyrzuceniu supernatantu należy przechowywać osad w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do momentu użycia. Następnie dodaj od 50 do 100 mikromolowych białek FoxP1 do dziesięciokrotnego nadmiaru molowego DTT lub TCEP i inkubuj. Umieść kolumnę odsalającą PD-10 w 50-mililitrowej probówce wirówkowej za pomocą adaptera kolumny do wymiany buforu. Dodać pięć mililitrów buforu PBS do kolumny w celu zrównoważenia i odwirować go przy 1000 g przez dwie minuty. Przenieś kolumnę PD-10 do świeżej probówki o pojemności 50 mililitrów i dodaj dwa mililitry buforu PBS do kolumny. Teraz załaduj 500 mikrolitrów białka FoxP1 do kolumny. Eluować kolumnę, wirując przy 1 000 g przez dwie minuty, aby zebrać oczyszczone białko. Przenieś białko do ultra-odśrodkowego filtra o masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów. Po odwirowaniu przy 7 500 g przez 10 minut, zebrać skoncentrowany eluat. Zmierz stężenie białka. Następnie dodaj BODIPY i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny na rotatorze. Powtórzyć wymianę buforu i stężenie białka. Po określeniu stężenia białka zmierz stopień oznakowania za pomocą wzoru. Dodaj 495 mikrolitrów ultraczystej wody i pięć mikrolitrów Tween 20 do studzienki szkiełka komorowego i dobrze wymieszaj. Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej delikatnie umyj komorę dwukrotnie ultraczystą wodą i wysusz. Aby skorygować fluorescencję tła, należy wykonać pomiary roztworu buforowego. Skalibruj względną czułość detektorów równoległych i prostopadłych, uzyskując dane z szybko obracającego się barwnika W przypadku eksperymentów anizotropii fluorescencji pojedynczej cząsteczki na monomerycznym FoxP1 dodaj 100 pikomolarnych BODIPY znakowanych FoxP1 i 100 nanomolowych nieznakowanych FoxP1 do 500 mikrolitrów standardowego buforu w szkiełku komorowym. Rozpocznij pomiary i sprawdź w oprogramowaniu BIFL, czy liczba serii zarejestrowanych w ciągu 30 sekund wynosi od 60 do 90. Jeśli próbka jest bardziej zagęszczona, należy ją rozcieńczyć, aż liczba impulsów mieści się w tym zakresie. Na koniec przeanalizuj pomiary. Analiza czasu życia anizotropii fluorescencji pojedynczej cząsteczki ujawniła pojedynczy rozkład pochodzący z dwóch różnych czasów korelacji rotacyjnej w domenie wiążącej DNA FoxP1, co sugeruje współistnienie uporządkowanych i nieuporządkowanych zespołów strukturalnych. Analiza wariancji impulsów zidentyfikowała podzbiór cząsteczek FoxP1 wykazujących wysoką anizotropię i nadmiar wariantów, co sugeruje obecność dynamicznych zmian konformacyjnych. Analiza rozkładu fotonów różnicowała monomeryczne i dimeryczne stany FoxP1, wykazując wyraźne rozkłady anizotropii i szybkości wymiany. Dimeryzacja wpłynęła na lokalne i globalne ruchy w FoxP1, a pomiary nadmiernej wariancji wykazały znaczące zmiany anizotropowe w określonych miejscach znakowanych cysteiną. Analiza anizotropii dynamicznej wykazała, że FoxP1 ulega częściowemu rozwinięciu po dimeryzacji i wiązaniu DNA, zmieniając frakcję ustrukturyzowanych i nieuporządkowanych populacji.

time-resolved-fluorescence-anisotropy-from-single-molecules-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Przedstawiamy konfigurację i eksperymentalną procedurę uzyskiwania danych smFRET z dużych sieci donor-akceptor za pomocą mikroskopu TIRF. Analiza tych pomiarów krok po kroku za pomocą oprogramowania do wnioskowania bayesowskiego Fast-NPS pozwala uzyskać informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości dzięki zastosowaniu dostosowanych modeli barwników.

Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Prezentowany tutaj jest protokół do wykonywania transferu energii rezonansu Förstera dla pojedynczej cząsteczki w celu zbadania rozdzielczości HJ. Dwukolorowe wzbudzenie przemienne służy do wyznaczania stałych dysocjacji. Jednokolorowy smFRET poklatkowy jest następnie stosowany w testach rozszczepienia w czasie rzeczywistym w celu uzyskania rozkładu czasu przebywania przed rozdzielczością HJ.

Metody transferu energii rezonansu Förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza Hollidaya przez GEN1

Ten artykuł zawiera instrukcje krok po kroku, jak wykonać w pełni poprawione, dokładne pomiary FRET na indywidualnych, swobodnie dyfuzujących biomolekułach za pomocą niedrogiego smfBoxa o otwartym kodzie źródłowym, od włączenia, przez wyrównanie i skupienie, aż po zbieranie i analizę danych.

Wykonywanie precyzyjnych i dokładnych pomiarów fret pojedynczych cząsteczek za pomocą smfBox typu Open-Source

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Poznaj metodę anizotropii fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej do badania lokalnej elastyczności i dynamiki pojedynczych cząsteczek biomolekularnych. Protokół umożliwia szczegółową analizę zachowania białek na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach (Wideo) | JoVE Journal

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Przeglądaj więcej filmów