Fine Adjustment of <em>Caenorhabditis elegans</em> Orientation on Channeled Agar Pads for Imaging Neuroregeneration

Tina Thuy N. Nguyen Hoang; Chirayu P. Sanganeria; Samuel H. Chung

doi:10.3791/67811

Precyzyjna regulacja orientacji Caenorhabditis elegans na kanałowych podkładkach agarowy...

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Free Access.

JoVE Journal Neuroscience

Fine Adjustment of Caenorhabditis elegans Orientation on Channeled Agar Pads for Imaging Neuroregeneration

Precyzyjna regulacja orientacji Caenorhabditis elegans na kanałowych podkładkach agarowych do obrazowania neuroregeneracji

Full Text

833 Views

05:12 min

January 31, 2025

DOI: 10.3791/67811-v

Tina Thuy N. Nguyen Hoang¹, Chirayu P. Sanganeria¹, Samuel H. Chung¹

¹Department of Bioengineering,Northeastern University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a protocol for creating channeled agar pads using PDMS molds from vinyl records. The aim is to better orient Caenorhabditis elegans for enhanced imaging contrast, specifically in neuroregeneration research. The approach addresses challenges associated with imaging adult C. elegans by maintaining their orientation and reducing stress during observation.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Neuroregeneration
Imaging Techniques

Background

The laboratory focuses on mechanisms of mammalian central nervous system regeneration.
C. elegans serves as a model organism for studying neuronal regeneration.
Challenges include air bubbles and inconsistent mold thickness in PDMS creation.
Adult C. elegans have issues with imaging due to size and pigmentation.

Purpose of Study

To fabricate molds that allow for precise orientation of C. elegans.
To improve imaging quality of neuronal structures during regeneration.
To facilitate better cell targeting through controlled animal placement.

Methods Used

Use of PDMS molds for creating channeled agar pads.
C. elegans serves as the biological model organism.
The method allows the reuse of PDMS molds and includes important preparation steps for consistent results.
Critical steps include thorough mixing, vacuum desiccation, and careful pouring of solutions.

Main Results

Channeled agar pads improved the orientation of C. elegans, aligning crucial anatomical landmarks.
Fluorescent imaging validated proper orientation and enhanced visibility of neuronal structures.
Regenerated neuron fibers were positioned closer to the imaging objective, minimizing scattering.

Conclusions

This study demonstrates a New methodology for enhancing imaging of C. elegans in neuroregeneration studies.
The use of channeled agar aids in maintaining physiological relevance and improving visualization.
These advancements facilitate better understanding of neuronal regeneration mechanisms.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using channeled agar pads?

Channeled agar pads enhance the imaging quality of C. elegans by ensuring proper orientation and reducing stress on the animals, which promotes consistent physiological conditions.

How are PDMS molds created?

PDMS molds are made by mixing a fast cure agent with the base, followed by careful vacuum desiccation and curing at high temperatures to ensure uniform thickness.

What imaging techniques are utilized in this study?

Fluorescent dissecting and inverted microscopy are used to verify the orientation and enhance the visibility of neuronal structures within C. elegans.

What challenges are addressed by this protocol?

The protocol addresses issues such as air bubble formation and maintaining consistent mold thickness, which can hinder accurate imaging of C. elegans.

Can the PDMS molds be reused?

Yes, once created, the PDMS molds can be reused multiple times for creating channeled agar pads, making the process efficient.

How does this method contribute to understanding neuroregeneration?

By improving imaging techniques, this method allows for a better analysis of neuronal regeneration processes in C. elegans, providing insights into mammalian CNS regeneration mechanisms.

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania kanalizowanych padów agarowych przy użyciu form PDMS utworzonych z płyt winylowych. Kanały umożliwiają użytkownikom precyzyjną orientację Caenorhabditis elegans w celu poprawy kontrastu obrazowania i ułatwienia porównywania struktur. Zdolności te są szczególnie przydatne w badaniach nad neuroregeneracją.

Głównym celem naszego laboratorium jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw regeneracji ośrodkowego układu nerwowego ssaków przy użyciu organizmu modelowego C.elegans. Badamy regenerację wielu neuronów i poszukujemy tożsamości sygnału warunkowania, który prowadzi do zwiększonej regeneracji ośrodkowego układu nerwowego. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują wprowadzenie pęcherzyków powietrza podczas wymiany szklanej płyty na płycie winylowej i uzyskanie jednolitej grubości formy.

Jednak po utworzeniu formy PDMS można ją ponownie wykorzystać do szczęk. Luka badawcza, którą się zajmujemy, to ograniczona kontrola nad orientacją dorosłych zwierząt. Dorosłe zwierzęta mają większą średnicę i są bardziej pigmentowane, co powoduje problemy z obrazowaniem w głębszych płaszczyznach Z.

Dodatkowo wprowadzenie szkiełek nakrywkowych zmienia również początkową orientację. Kanały pomagają utrzymać orientację zwierząt po wprowadzeniu szkiełka nakrywkowego, dzięki czemu komórki docelowe znajdują się bliżej celu obrazowania. Kanały zmniejszają również stres u zwierząt, promując normalną fizjologię, zachęcając do liniowej konfiguracji zwierząt i zapewniając spójność podczas obrazowania u wielu zwierząt.

Na początek wlej od jednego do 10 proporcji środka szybkoutwardzającego do podstawy do jednorazowego naczynia wagowego. Dokładnie mieszaj nieutwardzony płyn przez 45 sekund, aż będzie całkowicie zintegrowany i wypełniony bąbelkami. Następnie umieścić tackę zawierającą nieutwardzoną mieszaninę PDMS w eksykatorze próżniowym pod kątem.

Trzykrotnie zwiększ ciśnienie w zakresie od minus 0.09 kg paskala do minus 0.1 kg paskala, aby pęcherzyki powietrza wypłynęły na powierzchnię. Dokładnie opłucz płytę winylową i szklaną płytkę wodą dejonizowaną i pozostaw płytę winylową do całkowitego wyschnięcia przed dalszym użyciem. Umieść arkusz folii aluminiowej na górze płyty grzejnej, aby złapać nadmiar PDMS.

Następnie umieść szkiełko na każdym końcu płyty winylowej, aby ustawić grubość formy, zapewniając jednolitą wysokość podczas dociskania szklanej tafli do nieutwardzonego PDMS. Teraz wylej nieutwardzony płyn PDMS na jedną stronę płyty winylowej. Przechyl szklaną płytkę i powoli opuść ją, aby umożliwić ucieczkę uwięzionego powietrza.

Następnie utwardź PDMS w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 20 minut. Wyjmij płytę winylową z płyty grzejnej i pozwól jej ostygnąć. Następnie ostrożnie oderwij PDMS od płyty winylowej, aby uniknąć rozdarcia.

Następnie oderwij PDMS od tafli szkła. Używając nowego szkiełka jako prowadnicy, przetnij PDMS ostrą brzytwą, aby utworzyć kanałową formę agarową. Obierz nadmiar PDMS, aby pokazać ostateczną ciętą kanałową formę agarową.

Dodać 0,6 grama agaru i 30 mililitrów płynnego wywaru z pożywki dla nicieni do kolby. Umieść mieszadło w kolbie i podgrzej mieszaninę na płycie grzejnej, ustawionej na 120 stopni Celsjusza. Dodać 120 mikrolitrów roztworu podstawowego azydku sodu po stopieniu żelu.

Następnie dokładnie umyj formę PDMS wodą i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Umieść formę PDMS między dwoma zestawami par szkiełek, aby przygotować się do użycia. Za pomocą pipety narysuj roztwór agaru w górę iw dół, aby ogrzać końcówkę pipety i odpipetuj 300 mikrolitrów stopionego agaru na formę PDMS.

Na koniec umieść szkiełko mikroskopowe bezpośrednio na agarze tak, upewniając się, że spoczywa na szkiełkach po bokach. Usuń szkiełko po całkowitym ostygnięciu agaru. Kanałowe podkładki agarowe ułatwiły precyzyjną orientację Caenorhabditis elegans poprzez przetaczanie zwierzęcia w celu wyrównania punktów orientacyjnych, takich jak srom i jelito w kształcie litery S, zweryfikowanych pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym przed przeniesieniem do mikroskopu odwróconego.

Obrazowanie fluorescencyjne potwierdziło prawidłową orientację Caenorhabditis elegans na kanałowych podkładkach agarowych, jak pokazano na mikrofotografiach fluorescencyjnych. Kanałowe podkładki agarowe poprawiły jakość obrazowania w celu regeneracji neuronów poprzez umieszczenie zregenerowanych włókien neuronalnych bliżej soczewki obiektywu, minimalizując rozpraszanie i absorpcję światła.