Name: Precyzyjna regulacja orientacji Caenorhabditis elegans na kanałowych podkładkach agarowych do obrazowania neuroregeneracji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Poznaj metodę precyzyjnej orientacji Caenorhabditis elegans na kanałowych podkładkach agarowych z form PDMS. Technika poprawia jakość obrazowania neuroregeneracji i ułatwia analizę mechanizmów odbudowy neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez NIH R56NS128413. Dziękujemy Noah Josephowi (Northeastern Bioengineering Department) za pomoc w przetwarzaniu płyt winylowych. Dziękujemy członkom Laboratorium Chunga za wnikliwe komentarze do manuskryptu.

1. Przygotowanie polidimetylosiloksanu (PDMS) do produkcji
<ol>
	<li>Wlej środek szybkoutwardzalny w stosunku 1:10 do podstawy do jednorazowego naczynia wagowego. Mieszaj nieutwardzoną ciecz przez 45 sekund, aż płyn będzie całkowicie zintegrowany i pełen bąbelków.</li>
	<li>Umieścić tackę w eksykatorze próżniowym pod kątem. Zmieniaj ciśnienie w zakresie od -0,09 do -0,1 kPa 3x, aby pęcherzyki powietrza mogły wypłynąć na powierzchnię.</li>
	<li>Utrzymuj próżnię przez około godzinę w zakresie ciśnienia od -0,09 do -0,1 kPa, aż pozostanie niewiele widocznych pęcherzyków, które można usunąć ręcznie.</li>
</ol>
2. Produkcja formy PDMS płyty winylowej
<ol>
	<li>Opłucz płytę winylową i szklaną płytkę wodą dejonizowaną (DI). Upewnij się, że nie ma kurzu, aby uzyskać najlepszą pleśń. Pozostaw płytę winylową do wyschnięcia na powietrzu do momentu użycia.</li>
	<li>Umieść arkusz folii aluminiowej na górze płyty grzejnej, aby złapać nadmiar PDMS.</li>
	<li>Umieść szklane szkiełko na każdym końcu płyty winylowej, aby ustawić grubość formy na szerokość szkiełek. Zapewnia to jednolitą wysokość podczas dociskania tafli szkła do nieutwardzonego PDMS.</li>
	<li>Wlej nieutwardzony płyn PDMS na jedną stronę płyty winylowej.</li>
	<li>Obserwuj bąbelki za pomocą odbicia światła od powierzchni cieczy i usuń je końcówką pipety. Przechyl szklaną płytkę i powoli opuść płytkę, umożliwiając ucieczkę powietrza, zapobiegając wprowadzaniu się pęcherzyków.</li>
	<li>Utwardzać PDMS w temperaturze 80 °C przez 35 min.</li>
	<li>Wyjmij płytę winylową z płyty grzejnej i pozwól jej ostygnąć. Ostrożnie oderwij PDMS od płyty winylowej, aby uniknąć rozerwania.</li>
	<li>Użyj nowego szkiełka jako prowadnicy, aby przeciąć PDMS ostrą brzytwą, aby utworzyć kanałową formę agarową.</li>
</ol>
3. Wytwarzanie kanałowych padów agarowych z NaN3
UWAGA: Procedura i materiały dla płaskich podkładek agarowych zostały wcześniej ustalone9. Ta procedura jest bardzo podobna.
<ol>
	<li>Do kolby dodać 0,6 g agaru i 30 ml bulionu NGM liquid9. Dodaj mieszadło i podgrzej na płycie grzejnej w temperaturze 120 °C.</li>
	<li>Dodać 120 μl bulionu NaN3 (stężenie podstawowe 1 M) po stopieniu żelu.</li>
	<li>Umyj formę PDMS wodą i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Umieść formę PDMS między dwoma zestawami par suwaków.</li>
	<li>Pipetuj agar w górę iw dół, aby ogrzać końcówkę pipety. Odpipetować 300 μl stopionego agaru na formę PDMS, ręcznie rozprowadzając agar po kanałach, ponieważ umieszczenie szkiełka spowoduje rozprowadzenie agaru wzdłuż kanałów.</li>
	<li>Umieść szkiełko mikroskopowe bezpośrednio na agarze opartym na szkiełkach po bokach. Zdejmij szkiełko po ostygnięciu agaru.</li>
</ol>
4. Montaż C. elegans
<ol>
	<li>Gdy szkiełka ostygną, podnieś szkiełko prosto z formy bez ścinania.</li>
	<li>Przenoszenie zwierząt do kanałów po ich unieruchomieniu przez NaN3</li>
	<li>Obróć zwierzęta do żądanej orientacji.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na podkładce. Przechyl podkładkę i lekko dociśnij z jednej strony na drugą, aby wypchnąć powietrze na bok i uniknąć tworzenia się pęcherzyków.</li>
</ol>

Fabricating Channeled Agar Pads using PDMS Molds For Controlling Animal Orientation

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 48, 225-250 (1995).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-regulating+feed-forward+circuit+controlling+C-elegans+egg-laying+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A self-regulating feed-forward circuit controlling C-elegans egg-laying behavior.</a> Curr Biol. 18 (19), 1445-1455 (2008).</li>
<li>Chung, S. H., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A-Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).</li>
<li>Zellag, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CentTracker%3A+a+trainable%2C+machine-learning-based+tool+for+large-scale+analyses+of+Caenorhabditis+elegans+germline+stem+cell+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">CentTracker: a trainable, machine-learning-based tool for large-scale analyses of Caenorhabditis elegans germline stem cell mitosis.</a> Mol Biol Cell. 32 (9), 915-930 (2021).</li>
<li>Huang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+neuron+in+C.+elegans+orchestrates+multiple+motor+outputs+through+parallel+modes+of+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A single neuron in C. elegans orchestrates multiple motor outputs through parallel modes of transmission.</a> Curr Biol. 33 (20), 4430-4445.e6 (2023).</li>
<li>Rasmussen, N. R., Dickinson, D. J., Reiner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras-dependent+cell+fate+decisions+are+reinforced+by+the+RAP-1+small+GTPase+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ras-dependent cell fate decisions are reinforced by the RAP-1 small GTPase in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (4), 1339-1354 (2018).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+vinyl+record%5BTitle%5D)+AND+%22MicroPubl+Biol%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a vinyl record.</a> MicroPubl Biol. 2018, (2018).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neuroscience. 7 (1), 30(2006).</li>
<li>Gerhold Abigail, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+regulation+of+stem+and+progenitor+cell+mitotic+progression+by+in+situ+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating the regulation of stem and progenitor cell mitotic progression by in situ imaging.</a> Curr Biol. 25 (9), 1123-1134 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podstawową zaletą kanałowych padów agarowych jest ich zdolność do utrzymywania orientacji zwierząt podczas obrazowania. Kanały pasują do dorosłych zwierząt, umożliwiając kontrolowaną rotację, która jest utrzymywana po wprowadzeniu szkiełka nakrywkowego. Udało nam się zobrazować zwierzęta typu dzikiego, rolkowego i przysadzistego. Odpowiednio orientujemy zwierzęta za pomocą anatomicznych punktów orientacyjnych, co pozwala na obrazowanie i porównywanie wielu struktur w jednym polu widzenia i przybliża komórki docelowe do powierzchni. W szczególności rotacja ta ułatwia wizualizację w widoku grzbietowym lub brzusznym (widok obustronny), który umożliwia porównanie lewej i prawej strony zwierzęcia.
Wcześniej wizualizacja i porównanie tych dwustronnych struktur wymagałoby 3D z-stacków i potencjalnej normalizacji sygnałów, aby uwzględnić zmniejszoną transmisję na większych głębokościach. W związku z tym zdefiniowana orientacja możliwa dzięki agarowi kanałowemu pozwala na bardziej spójne obrazowanie w wielu robakach i powinna pozwolić na lepsze pomiary. Jest to szczególnie pomocne w ocenie pooperacyjnej zregenerowanych włókien neuronalnych, które mogą rosnąć w kierunkach trudnych do zobrazowania, takich jak obwodowy2.
Dodatkowo, agar kanałowy zmniejsza stres u zwierząt, ponieważ są one umieszczane w zagłębieniu, które zmniejsza nacisk na szkiełko nakrywkowe i wspomaga normalną fizjologię5. Podczas gdy wiotkie szczepy mogą skręcać się podczas montażu, kanały zachęcają do liniowej konfiguracji zwierzęcia i rotacji całego zwierzęcia. W innej implementacji wzorzec może również ograniczać ruchy zwierzęcia, aby zmniejszyć ilość środka znieczulającego wymaganego do zobrazowania lub obserwacji zwierzęcia8.
Wreszcie, technika agaru kanałowego jest również bardzo dostępna. Po wyprodukowaniu formy tworzenie kanałowych wacików agarowych wymaga mniej więcej tyle samo czasu, wiedzy i kosztów, co wykonanie zwykłych płaskich padów agarowych. Wszystkie komponenty potrzebne do stworzenia formy PDMS są wspólne dla wielu laboratoriów akademickich lub kupowane online. Trwałość form PDMS sprawia, że są one opłacalną opcją dla laboratoriów, zdolną do wytrzymania intensywnego użytkowania w czasie. Formy PDMS mogą służyć przez lata i setki zastosowań. Nadal używamy 17-letniej pleśni o umiarkowanej degradacji. Zalecamy przechowywanie foremek w temperaturze pokojowej w pojemniku, aby były wolne od zanieczyszczeń, które w razie potrzeby można zmyć wodą dejonizowaną.
Pomimo tych zalet, istnieje kilka ograniczeń związanych z naszą techniką. Siła kilofa używanego do umieszczania zwierząt na podkładce może zdeformować kanały, potencjalnie wpływając na ułożenie zwierzęcia. Podobnie jak w przypadku każdej precyzyjnej manipulacji, pozycjonowanie i obracanie zwierzęcia do pożądanej orientacji może być czasochłonne, co zwiększa narażenie zwierzęcia na znieczulenie i potencjalnie wywołuje stres. Kanały mogą również zatrzymywać powietrze i tworzyć pęcherzyki podczas umieszczania szkiełka nakrywkowego, które mogą zakłócać przejrzystość obrazowania poprzez rozpraszanie światła. Omawiamy sposoby zminimalizowania pęcherzyków w protokole. Z naszego doświadczenia wynika, że większości wad agaru kanałowego można w dużej mierze uniknąć dzięki odrobinie szkolenia i praktyki.
Przyszłe kierunki optymalizacji tych kanałów obejmują opracowywanie projektów dostosowanych do konkretnych potrzeb eksperymentalnych, w tym różnych rozmiarów i kształtów dla różnych grup wiekowych i fenotypów C. elegans. Wytwarzanie niestandardowych rozmiarów kanałów za pomocą nanowytwarzania10 może zmniejszyć fizjologiczny wpływ na zwierzęta w porównaniu z kanałami ogólnymi5. Podsumowując, zastosowanie kanałowych padów agarowych umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości niejasnych struktur u starszych zwierząt. Poduszki te utrzymują orientację C. elegans, co prowadzi do lepszej jakości obrazowania i szczegółowej wizualizacji, jednocześnie zmniejszając stres u zwierząt ze względu na strukturę nośną kanałów.

Nicień Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest szeroko wykorzystywanym organizmem modelowym do badania procesów biologicznych, takich jak rozwój i zachowanie, ze względu na jego silnie zachowaną genetykę z odpowiednikami ssaków1. Naukowcy hodują C. elegans na pożywce wzrostowej nicieni (NGM) w ściśle kontrolowanym środowisku, które standaryzuje warunki eksperymentalne i pozwala na bardziej precyzyjne przypisanie wyników zmiennym eksperymentalnym. Zwierzę jest przezroczyste, co umożliwia wyraźne obrazowanie tkanek, komórek i struktur subkomórkowych. C. elegans są małe, dorosłe zwierzęta mają ~1 mm długości i 80 μm średnicy, co pozwala na umieszczenie wielu zwierząt na jednym uchwycie ślizgowym do obrazowania1. Ich niewielkie rozmiary pozwalają również na uchwycenie pojedynczego obrazu całego organizmu przy jednoczesnej rozdzielczości pojedynczych komórek, co ma kluczowe znaczenie dla wizualizacji regeneracji włókien neuronowych. Synergiczny z tymi zaletami dla mikroskopii, szybki rozwój, stereotypowa anatomia i łatwa genetyka C. elegans pozwalają na badania na dużą skalę1.
Typowa procedura obrazowania komórek u C. elegans została ustalona dziesiątki lat temu i w dużej mierze pozostała niezmieniona. Naukowcy używają płaskich podkładek agarowych na szkiełkach do montażu i unieruchamiania zwierząt w celu wizualizacji ich komórek2. Szkiełko nakrywkowe na górze podkładki utrzymuje zwierzęta na miejscu i chroni soczewkę mikroskopu. Co ważne, szkiełko nakrywkowe ma wysoki współczynnik załamania światła, który zwiększa aperturę numeryczną przechwytywanego światła i poprawia rozdzielczość obrazowania. Dodatkowo szkiełko nakrywkowe zmniejsza zniekształcenia w przepuszczalności światła. W ten sposób szkiełko nakrywkowe poprawia wizualizację docelowych komórek i struktur.
Jednak w połączeniu z szkiełkiem nakrywkowym, płaskie podkładki agarowe często ograniczają orientację zwierząt. C. elegans zgina się wzdłuż kierunku grzbietowo-brzusznego (DV), tak aby przyjmowały orientację boczną na płaskiej podkładce agarowej. Jednak nawet po unieruchomieniu, wyprostowaniu i wstępnym obróceniu do orientacji DV, umieszczenie szkiełek nakrywkowych przywraca prawie wszystkie zwierzęta do widoku bocznego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Uważamy, że ta reorientacja następuje, ponieważ szkiełko nakrywkowe wypycha wystający srom C. elegans na bok. Młodsze zwierzęta bez sromu są bardziej zorientowane losowo. Ta ograniczona kontrola nad orientacją jest problematyczna z co najmniej dwóch powodów. Po pierwsze, może nie pozwalać na umieszczenie dwóch struktur w jednym polu widzenia (np. dwustronnym), co komplikuje ich porównanie. Po drugie, ustawienie orientacji jest ważne dla optymalizacji jakości obrazowania, ponieważ struktury będące przedmiotem zainteresowania są zazwyczaj najlepiej obrazowane, gdy znajdują się blisko obiektywu. Dzieje się tak dlatego, że obiektywy obrazują ograniczoną głębokość w próbce (tj. odległość roboczą) oraz dlatego, że światło z głębszych miejsc ulega większemu rozpraszaniu i absorpcji.
Dla C. elegans, ograniczona kontrola nad orientacją jest generalnie poważniejsza u starszych zwierząt. Zwierzęta w wieku od L1 do L4 mają mniejszą średnicę, co sprawia, że większa część robaka jest obrazowalna. Larwy te mają również mniejszą pigmentację, co skutkuje zmniejszoną absorpcją światła widzialnego i rozpraszaniem fotonów, co poprawia klarowność i rozdzielczość obrazu. I odwrotnie, dorosłe zwierzęta mają większą średnicę i większą pigmentację, co stanowi wyzwanie dla obrazowania w głębszych płaszczyznach z, ponieważ szkiełko nakrywkowe wpływa na początkową orientację.
W 2008 roku wprowadziliśmy strategię wykorzystującą podkładki agarowe z kanałami, aby sprostać tym wyzwaniom poprzez utrzymanie orientacji zwierząt3,4. Jak opisano poniżej, użytkownicy obracają unieruchomione zwierzęta w kanałach do pożądanej orientacji, zauważając anatomiczne punkty orientacyjne. Kanały utrzymują zwierzęta w zagłębieniach między podwyższonymi powierzchniami agaru, minimalizując siłę działającą na zwierzę podczas zakładania szkiełka nakrywkowego i eliminując obracanie się zwierzęcia. Ponieważ wytwarzanie padów kanałowych i zwykłych płaskich padów przebiega prawie tak samo proceduralnie i wymaga tego samego czasu, nasza technika jest bardzo dostępna. Wiele laboratoriów wykorzystuje naszą technikę do unieruchamiania C. elegans do badania cech anatomicznych, obserwacji rozwoju i analizowania wkładu neuronów w zachowanie5,6,7,8. Poniższa sekcja opisuje cały proces wytwarzania agaru kanałowego, zaczynając od płyty winylowej, która została pocięta na ćwiartki za pomocą gorącego noża. Po pierwsze, opisujemy wytwarzanie formy z polidimetylosiloksanu (PDMS) używanej do odlewania agaru kanałowego. Następnie pokazujemy, jak krok po kroku wykonać agar kanałowy. Oczekuje się, że cała procedura zajmie 3 godziny bez specjalistycznej wiedzy. Zgodnie z procedurą wytwarzania PDMS, wykonanie padów wykonanych za pomocą formy zajmie tyle samo czasu, co typowe podkładki agarowe (kilka minut).

<table><tbody><tr><td>Kolba Erlenmeyera 125 ml</td><td>Corning</td><td>4980-125</td><td></td></tr><tr><td>33 1/2 RPM lub 12-calowa długa płyta winylowa (LP)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Głębokość pojedynczego kanału: 50 &micro; m, szerokość: 200 &mikro; m</td></tr><tr><td>30 ml plastikowa strzykawka</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-793-817</td><td></td></tr><tr><td>90% platyna, 10% drut irydowy</td><td>Tritech Research&nbsp;</td><td>PT-9010</td><td>służy do tworzenia folii aluminiowej z platynowym kilofem</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAL131910B</td><td></td></tr><tr><td>szyba</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>7 cali x 5 cali tafla szkła wyjęta z ramy&nbsp;</td></tr><tr><td>pipeta szklana</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A służąca</td><td>do tworzenia platynowej</td></tr><tr><td>płyty grzejnej&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>SP88857104</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan Magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA3333736</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka mikroskopowe&nbsp;</td><td>Mckesson</td><td>938360</td><td></td></tr><tr><td>agar klasy biologii molekularnej&nbsp;</td><td>Benchmark Scientific</td><td>A1705</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ2161022</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>kwadratowa szklana osłona</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-016</td><td></td></tr><tr><td>SYLCAP 284-F (Fast Cure) zestaw do kapsułkowania z elastomeru silikonowego, przezroczysty, optycznie przezroczysty, mieszanka 10:1, 500 gm/ML (0,5 kg), szybszy niż Sylgard 184 i podobne&nbsp;</td>Eksykator próżniowy <td>MicroLubrol</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Naczynie wagowe <td>Fisher Scientific</td><td>08-648-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy</td><td>01-549-750</td><td></td></tr></tbody></table>

precyzyjna regulacja orientacji caenorhabditis elegans na kanałowych podkładkach agarowych do obrazowania neuroregeneracji

Fine Adjustment of Caenorhabditis elegans Orientation on Channeled Agar Pads for Imaging Neuroregeneration

Caenorhabditis elegans to organizm modelowy szeroko stosowany do badania procesów biologicznych. Jego przezroczystość i niewielki rozmiar sprawiają, że idealnie nadaje się do obrazowania tkanek, komórek i struktur subkomórkowych. Tradycyjne płaskie podkładki agarowe do obrazowania C. elegans ograniczają kontrolę nad orientacją zwierzęcia, ograniczając widoki przede wszystkim do perspektywy bocznej. To ograniczenie komplikuje wizualizację struktur grzbietowo-brzusznych i zmniejsza klarowność obrazu, szczególnie u starszych zwierząt o zwiększonej pigmentacji i większych średnicach. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy kanalizowane poduszki agarozowe, które umożliwiają precyzyjną kontrolę orientacji zwierząt. Kanały te umożliwiają naukowcom obracanie i unieruchamianie C. elegans w określonych pozycjach, ułatwiając jednoczesne obrazowanie wielu struktur i poprawiając rozdzielczość obrazu poprzez zbliżenie komórek docelowych do obiektywu mikroskopu. Jest to szczególnie przydatne do obrazowania zregenerowanych włókien neuronalnych po operacji, które mogą rosnąć w kierunkach trudnych do uchwycenia za pomocą tradycyjnych płaskich płatków agarowych. Ta metoda jest dostępna, ponieważ wytwarzanie kanałowych wacików agarowych wymaga tyle samo czasu i materiałów, co płaskie podkładki, co czyni ją praktyczną opcją dla większości laboratoriów.

Wytwarzanie formy z PDMS 
Cykliczne zmienianie ciśnienia próżni podczas wytwarzania formy powoduje przebijanie i usuwanie pęcherzyków powietrza z nieutwardzonego PDMS, co zapewnia uzyskanie formy wolnej od pęcherzyków. Jak pokazano na Rysunku 3D, pęcherzyki unoszą się na powierzchnię i pękają. Formy wolne od pęcherzyków pozwalają na uzyskanie czystych kanałów.
Utwardzanie formy z PDMS 
Podczas kładzenia szklanej płytki na płycie winylowej należy unikać powstawania szczelin powietrznych. Szczeliny te mogą prowadzić do nierównomiernej grubości lub defektów powierzchni. Pęcherzyki powietrza, jeśli wystąpią, można wykryć wizualnie. Dociskanie szklanej płytki z jednej strony na drugą wypycha powietrze, co minimalizuje powstawanie pęcherzyków i zapewnia równomierną grubość formy, pokazaną na Rysunku 4A.
Wykorzystanie żelowych podkładek z kanałami do precyzyjnego orientowania C. elegans 
Żelowe podkładki z kanałami umożliwiają precyzyjne orientowanie osobników C. elegans. Ustawiamy orientację zwierzęcia, delikatnie przetaczając je za pomocą platynowej igły, weryfikując położenie za pomocą punktów orientacyjnych, takich jak wulwa lub jelito w kształcie litery S (Rysunek 5A,C). Potwierdzamy orientację pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym przed przeniesieniem zwierząt pod mikroskop odwrócony pokazany na Rysunku 5B,D.
Ocena regeneracji włókien neuronowych z wykorzystaniem żelowych podkładek z kanałami 
Żelowe podkładki z kanałami poprawiają jakość obrazowania regeneracji neuronów poprzez optymalne ustawienie zwierzęcia. Pozycjonowanie zregenerowanych włókien neuronowych bliżej soczewki obiektywu redukuje rozproszenie i absorpcję światła, zwiększając przejrzystość obrazu. Rysunek 5E,F pokazują, że umieszczenie miejsca regeneracji bliżej obiektywu poprawia jakość obrazowania, co ułatwia dokładniejszą analizę odrostu neuronów.
<img alt="Układ eksperymentalny z płaską i kanałową podkładką do mikroskopii C. elegans; badanie orientacji sromki z szkiełkiem nakrywką." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Caenorhabditis elegans na płaskich i kanałowych podkładkach.(A) Zwierzę na płaskiej podkładce agarowej w orientacji DV; sromka skierowana w stronę szkiełka nakrywki. (B) Nałożenie szkiełka nakrywki przesuwa sromkę na bok, wymuszając orientację boczną zwierzęcia. (C) Zwierzę na kanałowej podkładce agarowej w orientacji DV. (D) Zwierzę pozostaje w orientacji DV po nałożeniu szkiełka nakrywki. (E) Obraz w jasnym polu mutanta roller na kanałowej podkładce agarowej w orientacji DV. (F) Obraz w jasnym polu ze szkiełkiem nakrywką; to samo zwierzę co w E pozostaje w orientacji DV. Skróty: DV = grzbietowo-brzuszna; lat = boczna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Ustawienie aparatury próżniowej do osadzania cienkich warstw; obejmuje deskryptor, mieszadło i żel krzemionkowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Materiały i sprzęt do wytwarzania PDMS. (A) Zestaw do elastomeru silikonowego SYLCAP 284-F. (B) Waga. (C) Strzykawka plastikowa. (D) Suszarka próżniowa. (E) Płyta grzewcza. (F) 12-calowa winylowa płyta długogrająca, rozbita zgodnie z potrzebami. (G) Tafla szkła. Skrót: PDMS = polidimetylosiloksan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces syntezy polimeru; A: Formowanie żelu, B: Układ desykatora próżniowego, C-D: Etapy suszenia polimeru." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Mieszanie i odgazowywanie nieutwardzonego PDMS. (A) Wymieszaj bazę i czynnik sieciujący w kuwecie. (B) Umieść kuwetę w komorze próżniowej. (C) Powtórz cykl próżni trzy razy, aby umożliwić wypłynięcie pęcherzyków powietrza na powierzchnię. (D) Po jednej godzinie większość pęcherzyków pękła. Zwróć uwagę na poprawioną transmitancję przez PDMS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ustawienie chromatograficzne z osłoną z folii oraz szczegółowy schemat próbki do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Nakładanie taflą szkła na nieutwardzony PDMS bez pęcherzyków powietrza. (A) Nakładanie taflą szkła na płytę winylową bez pęcherzyków powietrza. (B) Utwardzona forma z PDMS usunięta z płyty, z powiększeniem przedstawiającym kanały. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia w świetle przechodzącym i fluorescencyjna anatomii C. elegans, jelita i wulwy z regeneracją." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjne C. elegans zamontowanych na agaro-kanałach. (A) Obraz w świetle przechodzącym zwierzęcia w orientacji DV (grzbietowo-brzusznej). Punkt orientacyjny dla orientacji DV: spiralne, kształtujące się w literę S jelito (ciemniejsza tkanka wskazana strzałką) przecinające linię środkową w ok. 60% odległości od nosa do ogona. (B) Obraz fluorescencyjny neuronów w orientacji DV, to samo zwierzę co w A. (C) Obraz w świetle przechodzącym zwierzęcia w orientacji bocznej (lat). Punkt orientacyjny dla orientacji bocznej: wulwa skierowana na bok. (D) Obraz fluorescencyjny neuronów w orientacji bocznej, to samo zwierzę co w C. (E) Orientacja z regeneracją (strzałka) po głębszej (dalekiej) stronie zwierzęcia. (F) Orientacja z regeneracją po stronie płytkiej zwierzęcia znajdującej się bliżej obiektywu; regeneracja jest wyraźniejsza (strzałka). Paski skali = 20 µm. Skróty: DV = grzbietowo-brzuszna; lat = boczna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania kanalizowanych padów agarowych przy użyciu form PDMS utworzonych z płyt winylowych. Kanały umożliwiają użytkownikom precyzyjną orientację Caenorhabditis elegans w celu poprawy kontrastu obrazowania i ułatwienia porównywania struktur. Zdolności te są szczególnie przydatne w badaniach nad neuroregeneracją.

Precyzyjna regulacja orientacji Caenorhabditis elegans na kanałowych podkładkach agarowych do obrazowania neuroregeneracji

Caenorhabditis elegans is a model organism widely used for studying biological processes. Its transparency and small size make it ideal for imaging ...

Głównym celem naszego laboratorium jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw regeneracji ośrodkowego układu nerwowego ssaków przy użyciu organizmu modelowego C.elegans. Badamy regenerację wielu neuronów i poszukujemy tożsamości sygnału warunkowania, który prowadzi do zwiększonej regeneracji ośrodkowego układu nerwowego. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują wprowadzenie pęcherzyków powietrza podczas wymiany szklanej płyty na płycie winylowej i uzyskanie jednolitej grubości formy.Jednak po utworzeniu formy PDMS można ją ponownie wykorzystać do szczęk. Luka badawcza, którą się zajmujemy, to ograniczona kontrola nad orientacją dorosłych zwierząt. Dorosłe zwierzęta mają większą średnicę i są bardziej pigmentowane, co powoduje problemy z obrazowaniem w głębszych płaszczyznach Z.Dodatkowo wprowadzenie szkiełek nakrywkowych zmienia również początkową orientację. Kanały pomagają utrzymać orientację zwierząt po wprowadzeniu szkiełka nakrywkowego, dzięki czemu komórki docelowe znajdują się bliżej celu obrazowania. Kanały zmniejszają również stres u zwierząt, promując normalną fizjologię, zachęcając do liniowej konfiguracji zwierząt i zapewniając spójność podczas obrazowania u wielu zwierząt.Na początek wlej od jednego do 10 proporcji środka szybkoutwardzającego do podstawy do jednorazowego naczynia wagowego. Dokładnie mieszaj nieutwardzony płyn przez 45 sekund, aż będzie całkowicie zintegrowany i wypełniony bąbelkami. Następnie umieścić tackę zawierającą nieutwardzoną mieszaninę PDMS w eksykatorze próżniowym pod kątem.Trzykrotnie zwiększ ciśnienie w zakresie od minus 0.09 kg paskala do minus 0.1 kg paskala, aby pęcherzyki powietrza wypłynęły na powierzchnię. Dokładnie opłucz płytę winylową i szklaną płytkę wodą dejonizowaną i pozostaw płytę winylową do całkowitego wyschnięcia przed dalszym użyciem. Umieść arkusz folii aluminiowej na górze płyty grzejnej, aby złapać nadmiar PDMS.Następnie umieść szkiełko na każdym końcu płyty winylowej, aby ustawić grubość formy, zapewniając jednolitą wysokość podczas dociskania szklanej tafli do nieutwardzonego PDMS. Teraz wylej nieutwardzony płyn PDMS na jedną stronę płyty winylowej. Przechyl szklaną płytkę i powoli opuść ją, aby umożliwić ucieczkę uwięzionego powietrza.Następnie utwardź PDMS w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 20 minut. Wyjmij płytę winylową z płyty grzejnej i pozwól jej ostygnąć. Następnie ostrożnie oderwij PDMS od płyty winylowej, aby uniknąć rozdarcia.Następnie oderwij PDMS od tafli szkła. Używając nowego szkiełka jako prowadnicy, przetnij PDMS ostrą brzytwą, aby utworzyć kanałową formę agarową. Obierz nadmiar PDMS, aby pokazać ostateczną ciętą kanałową formę agarową.Dodać 0,6 grama agaru i 30 mililitrów płynnego wywaru z pożywki dla nicieni do kolby. Umieść mieszadło w kolbie i podgrzej mieszaninę na płycie grzejnej, ustawionej na 120 stopni Celsjusza. Dodać 120 mikrolitrów roztworu podstawowego azydku sodu po stopieniu żelu.Następnie dokładnie umyj formę PDMS wodą i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Umieść formę PDMS między dwoma zestawami par szkiełek, aby przygotować się do użycia. Za pomocą pipety narysuj roztwór agaru w górę iw dół, aby ogrzać końcówkę pipety i odpipetuj 300 mikrolitrów stopionego agaru na formę PDMS.Na koniec umieść szkiełko mikroskopowe bezpośrednio na agarze tak, upewniając się, że spoczywa na szkiełkach po bokach. Usuń szkiełko po całkowitym ostygnięciu agaru. Kanałowe podkładki agarowe ułatwiły precyzyjną orientację Caenorhabditis elegans poprzez przetaczanie zwierzęcia w celu wyrównania punktów orientacyjnych, takich jak srom i jelito w kształcie litery S, zweryfikowanych pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym przed przeniesieniem do mikroskopu odwróconego.Obrazowanie fluorescencyjne potwierdziło prawidłową orientację Caenorhabditis elegans na kanałowych podkładkach agarowych, jak pokazano na mikrofotografiach fluorescencyjnych. Kanałowe podkładki agarowe poprawiły jakość obrazowania w celu regeneracji neuronów poprzez umieszczenie zregenerowanych włókien neuronalnych bliżej soczewki obiektywu, minimalizując rozpraszanie i absorpcję światła.

fine-adjustment-caenorhabditis-elegans-orientation-on-channeled-agar

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Podczas obrazowania na żywo C. elegans, można użyć podkładki agarozowej, aby utrzymać nicień nieruchomo bez jego uszkadzania lub suszenia. Ten film opisuje, jak przygotować prostą podkładkę montażową do mikroskopii.

Przygotowanie szkiełka z nicieni: metoda montowania zwierząt na podkładce agarowej

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest dobrym modelem do badania transportu aksonalnego i wewnątrzkomórkowego. W tym miejscu opisuję protokół rejestracji i analizy in vivo transportu aksonalnego i wewnątrzwiciowego u C. elegans.

Unieruchomienie Caenorhabditis elegans w celu analizy transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Artykuł opisuje optymalizację parametrów akwizycji mikroskopii fluorescencyjnej w celu wizualizacji aksonalnego transportu endogennych znakowanych ładunków w rozdzielczości pojedynczego neuronu u żywego nicienia.

Optymalizacja wizualizacji transportu aksonalnego ładunków endogennych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej u żywych Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę precyzyjnej orientacji Caenorhabditis elegans na kanałowych podkładkach agarowych z form PDMS. Technika poprawia jakość obrazowania neuroregeneracji i ułatwia analizę mechanizmów odbudowy neuronów.

Precyzyjna regulacja orientacji Caenorhabditis elegans na kanałowych podkładkach agarowych do obrazowania neuroregeneracji

Przeglądaj więcej filmów