Name: Protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego dla szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego u szczurów, umożliwiający ukierunkowane podawanie leków w badaniach przedklinicznych terapii genowej układu autonomicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować UT Southwestern Animal Resource Center za zorganizowanie przestrzeni chirurgicznej dla szczurów. Fundusze na tę pracę zostały zapewnione przez SJG Z NASTĘPUJĄCYCH ŹRÓDEŁ: NIH/NINDS R01 NS087175, Hannah's Hope Fund i Taysha Gene Therapies.

Poniższy protokół jest przeprowadzany zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi i zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).
1. Przygotowanie mieszkania
UWAGA: Ten protokół jest przeznaczony dla dorosłych szczurów w wieku co najmniej 2 miesięcy. Mniejsze zwierzęta (w tym myszy i młodsze szczury) są możliwe, ale nie są zalecane i będą znacznie trudniejsze.
<ol>
	<li>Zapewnij wilgotną karmę lub inny miękki pokarm (żel weterynaryjny) przez 48 godzin przed operacją nerwu błędnego. Ponieważ zwierzęta mogą mieć trudności z jedzeniem po zabiegu, należy zapoznać je z tymi przedmiotami przed operacją, aby pomóc im zapoznać się ze smakiem tych produktów i wywołać motywację do jedzenia.</li>
	<li>Szczury domowe należy trzymać pojedynczo w klatce (lub zgodnie z wytycznymi instytucji) co najmniej 1 tydzień przed operacją, a także 1 tydzień po operacji. Pozwoli im to przyzwyczaić się do stresu związanego z samotnością i zapobiegnie drapaniu ran po operacji przez rodzeństwo z miotu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie przedmiotów chirurgicznych i przestrzeni
<ol>
	<li>Sporządź z wyprzedzeniem listę wszystkich niezbędnych przedmiotów i dokładnie sprawdź, czy wszystkie przedmioty są dostępne do operacji.</li>
	<li>Przed zabiegiem należy wysterylizować wszystkie przedmioty odpowiednimi metodami sterylizacji.</li>
	<li>Ustaw sterylną przestrzeń chirurgiczną pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść poduszkę grzewczą pod mikroskopem, aby utrzymać szczura w cieple podczas operacji.</li>
	<li>Umieść wszystkie materiały chirurgiczne na stole operacyjnym na sterylnej serwety. Zachowaj wystarczająco dużo miejsca na operację pod mikroskopem preparacyjnym. Upewnij się, że ostrość mikroskopu jest optymalna i obejmuje obszar chirurgiczny, aby uwidocznić nerw.</li>
	<li>Umieścić pompę strzykawkową w pobliżu etapu chirurgicznego, tak aby długość rurki była wystarczająca, aby dotrzeć do miejsca wstrzyknięcia.</li>
	<li>Umieść narzędzia chirurgiczne w kierunku boku dominującej ręki chirurga.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mieszaniny leku kandydującego i barwnika śledzącego
<ol>
	<li>Upewnij się, że lek kandydujący jest rozcieńczony w celu osiągnięcia wymaganego stężenia w zalecanym rozcieńczalniku, tak aby 5 μl leku zmieszanego z barwnikiem dało wymaganą ilość leku kandydującego do dostarczenia. Zaleca się, aby maksymalna objętość wstrzyknięcia metodą bezpośredniego nerwu błędnego wynosiła 5 μl (łącznie z barwnikiem śledzącym, patrz krok 3.2).</li>
	<li>Zmieszaj kompatybilny barwnik z kandydującym lekiem, aby umożliwić śledzenie wierności wstrzyknięć w czasie rzeczywistym. Na przykład końcowe stężenie 1% Luxol Fast Blue lub 0,002% fluoresceiny jest kompatybilnymi barwnikami. 
	UWAGA: Barwnik należy stosować w optymalnym stężeniu w mieszaninie barwnika i leku kandydującego. Gdy stężenie barwnika w mieszaninie jest zbyt niskie, śledzenie wstrzyknięcia może nie być widoczne. Gdy stężenie barwnika jest zbyt wysokie, może to spowodować, że mieszanina będzie zbyt gęsta i ma wysoką lepkość, co spowoduje zablokowanie igły iniekcyjnej.</li>
</ol>
4. Ładowanie mieszanki leku i barwnika do rurki
<ol>
	<li>Podłączyć szklaną strzykawkę o pojemności 100 μl z wyjętym tłokiem do igły 27 G.</li>
	<li>Podłącz jeden koniec około 45 cm wysterylizowanej rurki polietylenowej do igły 27 G.</li>
	<li>Weź plastikową strzykawkę o pojemności 3 ml i wyposaż ją w igłę 27 G. Umieścić w strzykawce około 0,5 ml 0,9% soli fizjologicznej.</li>
	<li>Napełnij rurkę polietylenową 0,9% soli fizjologicznej od otwartego końca, aby wypełnić całą długość rurki i całą lufę szklanej strzykawki, aż się wyleje. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza wewnątrz rurki.</li>
	<li>Wyjąć i wyrzucić strzykawkę i igłę o pojemności 3 ml.</li>
	<li>Włożyć tłok strzykawki do cylindra szklanej strzykawki i popchnąć go lekko do przodu do środka cylindra.</li>
	<li>Umieścić szklaną strzykawkę w pompie strzykawkowej.</li>
	<li>Pociągnąć tłok lekko do tyłu za pomocą pompki strzykawkowej, aby utworzyć przestrzeń powietrzną o długości około 1,5 cm na otwartym końcu rurki.</li>
	<li>Odpipetować co najmniej 5 μl mieszaniny barwnika i potencjalnego leku za pomocą mikropipety o pojemności 10 μl i upuścić ją na wysterylizowany kawałek parafilmu.</li>
	<li>Pobrać proponowaną mieszaninę leku do rurki, odciągając tłok z powrotem za pomocą pompy strzykawkowej. Utrzymuj pęcherzyki powietrza między 0,9% solą fizjologiczną a roztworem do wstrzykiwań, ale poza tym należy unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza w roztworze do wstrzykiwań. Oznaczyć poziom mieszaniny iniekcyjnej w drenach markerem. 
	UWAGA: Szczelina powietrzna między mieszaniną leku i barwnika a sterylną solą fizjologiczną w rurce ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia mieszaniu się tych dwóch roztworów.</li>
	<li>Dopasuj igłę 35 G do rurki. Przymocuj igłę do czystej powierzchni etapu chirurgicznego za pomocą taśmy, tak aby igła nie była luźna, nie poruszała się i nie dotykała niczego innego oraz pozostała wysterylizowana.</li>
</ol>
5. Gruntowanie igły iniekcyjnej
<ol>
	<li>Ustawić program pompy strzykawkowej na dozowanie 0.5 μl/min.</li>
	<li>Pompę strzykawkową należy uruchomić na około 10-15 s, aż roztwór do wstrzykiwań zacznie wypływać z końcówki igły. Niewielka ilość mieszaniny na końcu igły bez nieszczelności na połączeniu rurki i igły do wstrzykiwań (lub w dowolnym innym miejscu na długości strzykawki, rurki lub igły) wskazuje, że konfiguracja jest prawidłowa. 
	UWAGA: Jeśli mała kropelka na końcu igły nie jest widoczna, oznacza to zablokowanie igły. Zablokowanie igły może wystąpić z powodu wysokiej lepkości mieszanki leku kandydującego i barwnika, nadmiaru powietrza uwięzionego w systemie, a szklana strzykawka nie jest prawidłowo osadzona w pompie strzykawki. Zobacz Rysunek 1 dla przykładu wycieku na styku igły i rurki. Przygotowanie ma kluczowe znaczenie, ponieważ pomaga określić, czy igła jest drożna, a wstrzyknięcie do wnętrza nerwu przejdzie płynnie.</li>
</ol>
6. Przygotowanie szczura do operacji
<ol>
	<li>Uzyskaj masę ciała szczura, aby obliczyć niezbędną dawkę leków przeciwbólowych. Na przykład karprofen stosuje się podskórnie w dawce 5 mg/kg mc. u szczurów. 
	UWAGA: Karprofen zaleca się przechowywać w temperaturze 4 °C przed wstrzyknięciem.</li>
	<li>Znieczulić szczura parownikiem izofluranowym, stosując natężenie przepływu 3%-4% w celu indukcji znieczulenia przez około 2-3 minuty. Zmniejsz szybkość przepływu izofluranu do około 1,75%-2% w celu utrzymania znieczulenia.</li>
	<li>Przenieś szczura na osobny stół z zestawem do usuwania włosów i przygotowania miejsca. Upewnij się, że ten stół znajduje się blisko przestrzeni operacyjnej.</li>
	<li>Nałóż maść na sztuczne łzawienie w oba oczy szczura, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu.</li>
	<li>Podawaj leki przeciwbólowe zgodnie z zatwierdzonym instytucjonalnym protokołem dla zwierząt, aby kontrolować ból, gdy szczur wraca do przytomności.</li>
	<li>Ogol obszar operacyjny maszynką do strzyżenia włosów po brzusznej stronie szyi w okolicy szyjki macicy. Ogolić się do około 2 cm prostopadłej odległości od linii środkowej po obu stronach, od podbródka do mostka.</li>
	<li>Wysterylizuj obszar 70% alkoholem etylowym i 10% betadyną, przecierając obszar trzykrotnie na przemian wacikiem nasączonym alkoholem i jodonem powidonu. Wytrzyj od środka obszaru na zewnątrz w okrągły wzór.</li>
	<li>Przenieś szczura do etapu chirurgicznego pod mikroskopem w pozycji leżącej. Dostosuj ostrość mikroskopu, aby uwidocznić obszar operacji w odcinku szyjnym macicy.</li>
</ol>
7. Przeprowadzanie operacji na szczurach w celu wstrzyknięcia potencjalnego leku bezpośrednio do lewego nerwu błędnego (Rysunek 2, Rysunek 3, oraz Rysunek 4)
UWAGA: Ta część metody będzie wymagała drugiej osoby do asystowania chirurgowi.
<ol>
	<li>Umieść szczura na poduszce grzewczej w pozycji leżącej pod mikroskopem preparacyjnym powiązanym z zamontowanym światłem.</li>
	<li>Zaczep przednie górne zęby szczęki szczura kawałkiem niewchłanialnego szwu i zamocuj otwarty koniec szwu wewnątrz stożka nosowego tak, aby nozdrze szczura zawsze znajdowało się wewnątrz stożka nosa przez cały czas znieczulenia.</li>
	<li>Ustaw szczura tak, aby jego głowa leżała po lewej stronie praworęcznego chirurga (lub po prawej stronie leworęcznego chirurga). W tej pozycji przednia strona chirurga jest prostopadła do ciała szczura. Umieść poduszkę ze sterylizowanego miernika pod szyją i wyreguluj kąt odcinka szyjnego szczura tak, aby odcinek szyjny stał się prosty. Ułatwi to zlokalizowanie lewego nerwu błędnego i wykonanie iniekcji.</li>
	<li>Ułóż całe ciało szczura wysterylizowaną serwetą, pozostawiając otwartą przestrzeń chirurgiczną.</li>
	<li>Zamocuj cztery kołki zwijacza indywidualnie za pomocą 4 stabilizatorów magnetycznych z elastomerami i umieść stabilizatory w czterech rogach etapu chirurgicznego.</li>
	<li>Wstrzyknąć miejscowo środki znieczulające naskórkowo w linię środkową odcinka szyjki macicy, w którym wykonuje się nacięcie. Na przykład zwykle stosuje się mieszaninę lidokainy i bupiwakainy.</li>
	<li>Wykonaj podłużne nacięcie skóry o długości około 2 cm na linii środkowej między podbródkiem a mostkiem za pomocą ostrza skalpela po brzusznej stronie szyi w okolicy szyjki macicy (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3A).</li>
	<li>oddziel odcięte krawędzie skóry za pomocą wysterylizowanych bawełnianych końcówek.</li>
	<li>Cofnij krawędzie skóry w przeciwnych kierunkach od miejsca nacięcia za pomocą końcówek retraktora.</li>
	<li>Oddziel deskę rozdzielczą bawełnianymi końcówkami, aby wejść głębiej. Wypchnij gruczoły ślinowe w kierunku bocznej strony.</li>
	<li>Oddziel mięśnie mostkowo-sutkowe bawełnianymi końcówkami i odsuń je na bok za pomocą szpilek. W miarę jak separacja mięśnia mostkowo-sutkowego postępuje szeroko, tchawica pojawia się pośrodku, pokryta mięśniem mostkowo-gnykowym (<silna klasa="xfig">Ryc. 3B). 
	UWAGA: Uważaj, aby nie wywierać nacisku na tchawicę.</li>
	<li>Przyspiesz separację tkanek po lewej stronie tchawicy szczura, aż pojawi się osłonka szyjna, która zawiera wspólną tętnicę szyjną biegnącą razem z lewym nerwem błędnym.</li>
	<li>Ostrożnie wykonaj mały punktowy otwór w pochwce tętnicy szyjnej za pomocą drobnych kleszczy, uważając, aby nie uszkodzić tętnicy szyjnej pod mikroskopem. Oddziel lewy nerw błędny od tętnicy szyjnej wspólnej za pomocą drobnych kleszczy. 
	UWAGA: Obszar operacyjny jest anatomicznie krytyczny. Ściana tętnicy szyjnej jest gruba, śliska i niełatwo się uszkadza, ale ostra końcówka cienkich kleszczy może ją zranić i może dojść do krwawienia. Jednocześnie zwróć uwagę, aby nie uszkodzić nerwu.</li>
	<li>Gdy nerw zostanie oddzielony od tętnicy za pomocą kleszczy, użyj zakrzywionej igły o wadze 25 G dopasowanej do strzykawki o pojemności 1 ml z tego otworu, aby "zaczepić" i przytrzymać nerw ręką niedominującą (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A). 
	UWAGA: Końcówka zakrzywionej igły jest, aby nie uszkodzić nerwu i tętnicy. Kąt krzywizny końcówki igły jest dostosowywany do około 90° przy użyciu hemostatu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Ręką dominującą przytrzymaj igłę załadowaną mieszanką leku i barwnika i delikatnie nakłuj nerw w tym samym kierunku, w którym biegnie nerw, tak aby skos igły był skierowany do góry.
	<ol>
		<li>Aby ułatwić nakłucie, utrzymuj nerw prosto, delikatnie pociągając za pomocą haczyka 25 G. Wbij igłę do nerwu i przesuwaj się do przodu o więcej niż 0,5 cm, trzymając igłę równolegle do nerwu błędnego. Następnie odciągnąć lekko do tyłu, tak aby około 0,4-0,5 cm igły pozostało wewnątrz nerwu. 
		UWAGA: Kąt igły powinien być na tyle płytki, aby wniknąć do wnętrza nerwu bez przechodzenia na drugą stronę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mogą wystąpić sytuacje, w których igła jest drożna na zewnątrz nerwu w momencie gruntowania, ale kandydat na mieszaninę leku i barwnika nie przechodzi gładko wewnątrz nerwu. Aby uniknąć takiej sytuacji, ogranicz liczbę nakłuć nerwów za pomocą jednej igły nie więcej niż 3 razy. Jeśli igła zostanie stępiona, zwiększa się ryzyko zablokowania lub w inny sposób słabego wstrzyknięcia.</li>
	<li>Upewnij się, że igła znajduje się całkowicie wewnątrz nerwu. Utrzymać pozycję nieruchomą i włączyć pompę strzykawkową. 
	UWAGA: Należy dokładnie sprawdzić miejsce wstrzyknięcia, aby upewnić się, że potencjalna mieszanina leku i barwnika nie wypływa wstecznie z nerwu.</li>
	<li>W trakcie wstrzykiwania należy stale sprawdzać, czy napar pozostaje w nerwie i płynnie płynie. Użyj oznaczenia wykonanego na rurce infuzyjnej, aby monitorować ruch mieszaniny leku i barwnika od punktu początkowego.
	<ol>
		<li>Jeśli kandydat na mieszaninę leku i barwnika nie przepływa płynnie, wyciągnąć igłę i powtórzyć etap zalewania (krok 5.2). Następnie ponownie wprowadzić igłę do nerwu i wznowić infuzję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nerw zaczyna rozwijać kolor barwnika (<silna klasa = "xfig">Ryc. 4B). Kontynuować infuzję w dawce 0,5 μl/min przez 10 minut, aby podać wszystkie 5 μl kandydackiej mieszaniny leku i barwnika. 
	UWAGA: W razie potrzeby zaleca się nawodnienie odsłoniętych tkanek niewielką ilością ciepłej 0,9% sterylnej soli fizjologicznej, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu i uszkodzeniom.</li>
	<li>Po podaniu w infuzji 5 μl i zatrzymaniu pompy strzykawkowej, należy przytrzymać igłę na miejscu przez dodatkowe 1 minutę, aby umożliwić rozprzestrzenienie się całej kandydackiej mieszaniny leku i barwnika z miejsca wstrzyknięcia. Wyjąć igłę.</li>
	<li>Wyjąć zakrzywioną igłę 25 G. Użyj sterylnych bawełnianych końcówek, aby delikatnie przesunąć chusteczki z powrotem na ich pierwotne miejsce. Zdejmij końcówki zwijacza.</li>
	<li>Zamknij ranę szwem niewchłanialnym (można również zastosować szew wchłanialny). W razie potrzeby nałóż niewielką ilość kleju tkankowego między szwy, aby idealnie zamknąć ranę.</li>
</ol>
8. Opieka pooperacyjna szczura
<ol>
	<li>Po zamknięciu rany podać podskórnie około 3 ml 0,9% ciepłej soli fizjologicznej. Pomaga to szczurom w natychmiastowym nawodnieniu.</li>
	<li>Umieść szczura w źródle ciepła, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia do normalnego stanu. Zwróć uwagę na wszystko, co jest nieprawidłowe podczas procesu odzyskiwania. 
	UWAGA: czas rekonwalescencji może być dłuższy, jeśli procedura iniekcji nerwu trwa długo.</li>
	<li>Przenieś szczura do jego domowej klatki z wilgotną karmą na podłodze klatki. Upewnij się, że woda jest dostępna przez cały czas. Obserwuj szczura po operacji przez około 2 godziny, aby upewnić się, że nie jest mu zimno. 
	UWAGA: Umieść szczura w źródle ciepła na dodatkowe godziny, jeśli jest mu zimno.</li>
	<li>Monitoruj szczura po 12 godzinach, 24 godzinach, 36 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach po operacji z pisemnymi notatkami z obserwacji. Powtórz leki przeciwbólowe zgodnie z zatwierdzonym instytucjonalnym protokołem dla zwierząt w celu kontrolowania bólu. Na przykład karprofen podaje się podskórnie w dawce 5 mg/kg dwa razy w odstępie 24 godzin. Skonsultuj się z weterynarzem, jeśli ból utrzymuje się u szczura dłużej niż 48 godzin.</li>
	<li>Powtórz wstrzyknięcie podskórne około 3 ml 0,9% ciepłej soli fizjologicznej po 24 godzinach, w zależności od warunków szczura.</li>
	<li>Kontynuuj ocenę rany. Upewnij się, że rana jest sucha i jest w trakcie gojenia. 
	UWAGA: Zaczerwienienie, obrzęk i bolesny stan rany z bezczynnością i otępieniem szczura może wskazywać na stan zapalny rany i może wymagać dodatkowej konsultacji z weterynarzem. Szczur z bólem pokaże zgarbione plecy, potarganą sierść, czerwone oczy i nieaktywny stan. Zwykle znajduje się w rogu klatki.</li>
	<li>Usuń niewchłanialne szwy w ciągu 2 tygodni po zagojeniu się rany.</li>
</ol>

<ol><li>Fischer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+injection+into+the+dorsal+root+ganglion%3A+Technical%2C+behavioral%2C+and+histological+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct injection into the dorsal root ganglion: Technical, behavioral, and histological observations.</a> J Neurosci Methods. 199 (1), 43-55 (2011).</li>
<li>O'donnell, M., Fontaine, A., Caldwell, J., Weir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+dorsal+root+ganglia+%28drg%29+injection+in+mice+for+analysis+of+adeno-associated+viral+%28AAV%29+gene+transfer+to+peripheral+somatosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct dorsal root ganglia (drg) injection in mice for analysis of adeno-associated viral (AAV) gene transfer to peripheral somatosensory neurons.</a> J Neurosci Methods. 411, 110268(2024).</li>
<li>Puljak, L., Kojundzic, S. L., Hogan, Q. H., Sapunar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+pharmacological+agents+into+rat+dorsal+root+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of pharmacological agents into rat dorsal root ganglion.</a> J Neurosci Methods. 177 (2), 397-402 (2009).</li>
<li>Rueter, L. E., Kohlhaas, K. L., Curzon, P., Surowy, C. S., Meyer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+and+central+sites+of+action+for+a-85380+in+the+spinal+nerve+ligation+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Peripheral and central sites of action for a-85380 in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain.</a> Pain. 103 (3), 269-276 (2003).</li>
<li>Ulusoy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-to-neuron+alpha-synuclein+propagation+in+vivo+is+independent+of+neuronal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Neuron-to-neuron alpha-synuclein propagation in vivo is independent of neuronal injury.</a> Acta Neuropathol Commun. 3, 13(2015).</li>
<li>Helwig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+propagation+of+transduced+alpha-synuclein+involves+non-fibrillar+protein+species+and+is+enhanced+in+alpha-synuclein+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Brain propagation of transduced alpha-synuclein involves non-fibrillar protein species and is enhanced in alpha-synuclein null mice.</a> Brain. 139 (Pt 3), 856-870 (2016).</li>
<li>Chiang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+suprachoroidal-to-optic-nerve+%28scone%29+drug+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Development of a novel suprachoroidal-to-optic-nerve (scone) drug delivery system.</a> Drug Deliv. 31 (1), 2379369(2024).</li>
<li>Ferrari, L. F., Cunha, F. Q., Parada, C. A., Ferreira, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+to+perform+direct+intraganglionar+injections+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel technique to perform direct intraganglionar injections in rats.</a> J Neurosci Methods. 159 (2), 236-243 (2007).</li>
<li>Yuan, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+injection+of+lumbar+dorsal+root+ganglia+under+direct+vision%3A+Relevant+anatomy%2C+protocol%2C+and+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rapid injection of lumbar dorsal root ganglia under direct vision: Relevant anatomy, protocol, and behaviors.</a> Front. Neurol. 14, 1138933(2023).</li>
<li>Mason, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+AAV+serotypes+for+gene+delivery+to+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons.</a> Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).</li>
<li>Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+recombinant+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer.</a> BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).</li>
<li>Ertl, H. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+and+toxicity+of+AAV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity and toxicity of AAV gene therapy.</a> Front Immunol. 13, 975803(2022).</li>
<li>Wayman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+permanent+distal+middle+cerebral+with+common+carotid+artery+occlusion+in+aged+rats+to+study+cortical+ischemia+with+sustained+disability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing permanent distal middle cerebral with common carotid artery occlusion in aged rats to study cortical ischemia with sustained disability.</a> J Vis Exp. (108), e53106(2016).</li>
</ol>

Autorzy: NR i XC nie pozostają w konflikcie interesów. RMB i SJG są wynalazcami własności intelektualnej związanej z transferem genów do ANS poprzez zastrzyki z nerwu błędnego (patent Stanów Zjednoczonych #11,753,655). SJG i RMB otrzymały dochody z tantiem od Taysha Gene Therapies, a SJG otrzymało dochody z doradztwa od Taysha Gene Therapies.

Metodę bezpośredniego wstrzyknięcia do lewego nerwu błędnego można wykonać bezpiecznie i bez powikłań pooperacyjnych u szczurów. Dostarczanie leku do nerwu błędnego może być wykorzystane do celowania w autonomiczny układ nerwowy (ANS). Wiąże się to z pewnymi krytycznymi krokami, które wymagają praktyki i umiarkowanego lub wysokiego stopnia umiejętności chirurgicznych.
Ten zabieg chirurgiczny wymaga zrównoważonego znieczulenia ogólnego u szczurów. Chirurg dąży do zakończenia operacji w krótszym...

Stosowanie prawidłowej metody podawania leków jest jednym z kluczowych czynników w osiąganiu pomyślnych wyników terapeutycznych. Pomimo obfitości metod dostarczania środków terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), opisano tylko kilka metod dostarczania do obwodowego układu nerwowego (PNS) przez bezpośrednie wstrzyknięcie nerwu. Bezpośrednie wstrzyknięcie nerwu, takie jak wstrzyknięcie do zwojów korzenia grzbietowego (DRG) u szczurów, zostało wypróbowane w badaniach przedklinicznych w celu lepszego zrozumienia mechanizmów bólu, toksyczności leków, transferu genów1,2,3, oraz ogólny rozwój metody1,4. Dodatkowe doniesienia na temat bezpośredniego wstrzykiwania nerwu obejmują wstrzyknięcie nerwu rdzeniowego4, wstrzyknięcie nerwu kulszowego1 oraz wstrzyknięcie nerwu błędnego u szczurów5 i myszy6. Ostatnio zaproponowano metodę wstrzykiwania nadchondrialnego w celu lepszej dystrybucji leków do głowy nerwu wzrokowego u królików7.
DRG jest uważane za idealne miejsce do bezpośredniego wstrzykiwania wektorów obciążonych transgenami, takich jak wirus związany z adenowirusem (AAV), ze względu na funkcję sensoryczną ciał komórkowych w klasie DRG<sup="xref">2. Opisano zarówno chirurgiczne, jak i niechirurgiczne metody iniekcji DRG1,8. Znaleziono jednak kontrowersyjne wnioski dotyczące spójności wyników z niechirurgiczną metodą iniekcji DRG1. Sugeruje się, że metoda chirurgiczna polegająca na częściowej laminektomii jest w 100% skuteczna w przypadku wstrzyknięcia DRG szczurom bez żadnej zmiany wyników zachowania3, podobnie jak metoda obejmująca częściową osteotomię u myszy9. Kilka badań donosi o metodach dostarczania leków do wstrzykiwań DRG, które były stosowane w przedklinicznych badaniach nad terapią genową u szczurów i myszy1,2,10. Badania nad terapią genową opartą na wektorach, obejmujące miejscowe wstrzyknięcia, mogą przynieść następujące korzyści: zmniejszona ekspresja poza celem, zmniejszenie toksyczności ogólnoustrojowej oraz mniejsze miano wirusa i objętość wstrzyknięć, zmniejszone ryzyko powikłań immunogennych11,12.
Metoda bezpośredniego wstrzykiwania w nerw kulszowy, najdłuższy nerw ciała, została wypróbowana poprzez odsłonięcie prawego nerwu kulszowego na poziomie połowy uda szczura. W metodzie wykorzystano pipetę z wyciąganego szkła wyposażoną w system iniekcji sterowany przez mikroprocesor w celu wstrzyknięcia całkowitej objętości 10 μl barwnika o natężeniu przepływu 1,2 μl/min1. Eksperyment ten wykazał brak dystrybucji barwnika do poziomu DRG, a dystrybucja była w większości ograniczona wokół miejsca wstrzyknięcia. Podobnie, inne metody bezpośrednich zastrzyków nerwowych, takie jak zastrzyki z nerwu rdzeniowego, zostały wypróbowane z barwnikiem w celu oceny odpowiedniej objętości wstrzyknięcia i wzorca dystrybucji barwnika u szczurów. Sugeruje się, że 2 μl są optymalne do wstrzyknięcia nerwu rdzeniowego, podczas gdy 3 μl barwnika przez wstrzyknięcie DRG wykazały rozkład zarówno w zwojach korzenia grzbietowego, jak i brzusznego u szczurów1. Stwierdzono, że objętość do wstrzyknięcia DRG u myszy jest optymalna od 1,0 μl do 1,5 μl w zależności od szczepu i wielkości ciała2,9.
Metoda bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego została użyta u szczurów5 i myszy6 do oceny roli uszkodzenia nerwowego lub integralności komórkowej w przenoszeniu ludzkiej α-synukleiny. Te dwa badania, przeprowadzone przez tę samą grupę badaczy, opisują krótką metodę bezpośredniego wstrzykiwania wektorów AAV do lewego nerwu błędnego w okolicy szyjki macicy. U szczurów metoda obejmowała szklaną kapilarnę o średnicy końcówki 60 μm w celu wstrzyknięcia 2 μl wektora przy natężeniu przepływu 0,5 μl/min za pomocą strzykawki Hamilton o pojemności 5 μm. U myszy wstrzyknięto całkowitą objętość roztworu wektorowego o stężeniu 750 nL / min z szybkością przepływu 160 nl / min za pomocą stalowej igły 36 G umieszczonej na strzykawce NanoFil o pojemności 10 μl6. Eksperymenty te wykazały, że transgen był dostarczany i wyrażany w aksonach w moście i śródmózgowiu szczurów i myszy. Podobnie grzbietowe jądro ruchowe lewego nerwu błędnego wykazało dodatnią reakcję immunologiczną z transgenem. Te dowody ilustrują, że metoda bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego może być niezawodną metodą w terapii genowej, w której transdukcja komórkowa jest przedłużona do kilku miejsc w mózgu, które wysuwają aksony przez nerw błędny. Jednak metody te nie wspominają o użyciu żadnego barwnika do śledzenia wierności wtrysku.
Tutaj opisana jest metoda bezpośredniego wstrzykiwania do lewego nerwu błędnego przy użyciu nietoksycznych barwników śledzących, które są w dużej mierze stosowane przez badaczy w badaniach przedklinicznych. Omówiono potencjalne pułapki, które mogą powodować trudności w dostarczaniu leków oraz sposoby ich pokonania. Sytuacje te są zilustrowane zdjęciami, aby pokazać, co sprawia, że poród się nie udaje i jak sprawić, by zakończyła się sukcesem.

<table><tbody><tr><td>1 ml BD&nbsp; Strzykawka tuberkulinowa z odłączaną strzykawką 25 G x 5/8". Igła</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>SKU:309626</td><td>Służy do łączenia z zakrzywioną igłą w celu pociągnięcia nerwu błędnego i przytrzymania go w momencie wstrzyknięcia.</td></tr><tr><td>0,5% chlorowodorek bupiwakainy do wstrzykiwań</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-1162-19</td><td>Znieczulenie miejscowe stosowane do znieczulenia miejscowej tkanki.</td></tr><tr><td>100 ml 0,9% Chlorek sodu Nawadnianie USP</td><td>Stericare Solutions</td><td>Pozycja #6240</td><td>Sól fizjologiczna zwykła, używana do nawadniania szczurów i tkanek.</td></tr><tr><td>20 końcówek retraktora, 7,5 mm</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>Surgi 5018</td><td>Służy do rozsuwania i przytrzymywania tkanek podczas operacji.</td></tr><tr><td>Strzykawka 3 ml BD-Luer-Lok, sterylna, jednorazowego użytku&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>SKU # 309657</td><td>Służy do wstrzykiwania soli fizjologicznej szczurom i napełniania soli fizjologicznej rurkami polietylenowymi.</td></tr><tr><td>AK-Fluor10%</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>Barwnik fluoresceinowy widoczny w obrębie nerwu. Służy do śledzenia wierności wtrysku.</td></tr><tr><td>Waga do ważenia zwierząt</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SCL 4000</td><td>Służy do pomiaru masy ciała szczura.</td></tr><tr><td>Rękawice chirurgiczne Ansell ENCORE Perry Style 42 PF</td> Rękawica <td>Ansell</td><td>ASTM D3577</td><td>Sterilie, jest używana podczas operacji przez chirurga.</td></tr><tr><td>Maść na sztuczne łzy 3,5g</td><td>Pivetal</td><td>NDC 46066-753-55</td><td>Stosowana w celu zapobiegania nadmiernej suchości oczu.</td></tr><tr><td>Hemostat Baby-Myxter&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td>Służy do tamowania krwawienia w nagłych wypadkach. Służy również do zginania igły 25 G x 5/8".</td></tr><tr><td>Rurki BD Intramedic PE</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>14-170-12A</td><td>Używane w systemie konfiguracji wtrysku do łączenia z igłą Hamilton i igłami NanoFil. Mieści również mieszaninę iniekcyjną.</td></tr><tr><td>Igła BD Precison Glide, 25 G x 5/8"</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>REF#305122</td><td>Służy do wstrzykiwania soli fizjologicznej szczurom i do wytwarzania zakrzywionej igły.</td></tr><tr><td>Igła do ślizgu BD Precison Glide, 27 G x & frac12; "</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>REF#301629</td><td>Służy do napełniania sterylnego roztworu soli fizjologicznej do rurki BD Intradermic.</td></tr><tr><td>Benchmark Accuris " NastępnyPette" Zestaw startowy mikropipet o zmiennej objętości zawiera 4 pipety: 10/20/200/1000 &mu; L, plus podstawka</td><td>MilliporeSigma</td><td>BMSP7700S1</td><td>Służy do pipetowania sterylnego roztworu.</td></tr><tr><td>Betadine, Povidine Jod 10%&nbsp;</td><td>Honestmed</td><td>67618015017</td><td>Służy do dezynfekcji pola operacyjnego.</td></tr><tr><td>Karprofen Roztwór do wstrzykiwań 50 mg / ml</td><td>Dostarczany przez Covtrus (6451506845)</td><td>SKU 591149</td><td>W naszym przypadku użyliśmy rozcieńczonego karprofenu w dawce 5 mg / kg dostarczonej przez Animal Resource Center of University of Texas Southwestern Medical Center.</td></tr><tr><td>Zakrzywiona igła (wykonana na zamówienie)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>REF#305122</td><td>Igła BD PrecisionGlide 25 G x 5/8" jest zakrzywiona do 90 stopni za pomocą hemostatu. Końcówka igły jest. Przed użyciem należy go wysterylizować. Służy do zaczepienia nerwu błędnego i przytrzymania go w momencie separacji i wstrzyknięcia.</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Motic&nbsp;</td><td>SMZ-171-BLED (lornetka ze światłami)</td><td>Służy do powiększania kryficznego obszaru anatomicznego w momencie separacji nerwu błędnego, injecitonu oraz do sprawdzania wycieku wstrzyknięcia.</td></tr><tr><td>Arkusz zasłony&nbsp;</td><td>Dynarex</td><td>Reorder#8122</td><td>Używany jako serweta po sterylizacji.</td></tr><tr><td>Dukal Cotton Tip Applicators, niesterylne</td><td>Dukal</td><td>Item 9003</td><td>Służy do oddzielania tkanek, przed użyciem należy je wysterylizować.</td></tr><tr><td>Dumont #7 - Cienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>Służy do oddzielania lewego nerwu błędnego od tętnicy szyjnej wspólnej. Jest zakrzywiony, więc łatwy w użyciu.</td></tr><tr><td>Ethicon PDS II Niebarwiony szew monofilamentowy - SZEW, 4/0 18 PDS II CLR MONO PS</td><td>Ethicon</td><td>VA - Z682G</td><td>Stosowany do szycia ran.</td></tr><tr><td>Ethilon Nylon Suture Black Monofilament</td><td>Ethicon</td><td>1856G</td><td>Stosowany do szycia rany, jeśli stosowany jest szew niewchłanialny. Służy również do zaczepiania zęba szczura, aby zamocować nos wewnątrz stożka nosowego.</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze - Lustrzane wykończenie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11412-11</td><td>Używany w momencie oddzielenia nerwu błędnego od wspólnej tętnicy szyjnej. To jest proste.</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki - Ostre</td><td>narzędzia do nauki</td><td>14060-09</td><td>Służy do cięcia tkanki.</td></tr><tr><td>Roztwór czyszczący</td><td>Hamilton</td><td>HT18311</td><td>Służy do czyszczenia Hamiltona po użyciu.</td></tr><tr><td>Igła Hamilton, 27G, Mała Piasta RN Igła, 2", PT3, 6/PK</td><td>Hamilton</td><td>7762-01</td><td>Służy do podłączenia BD Intramedic&trade; Rurki PE.</td></tr><tr><td>Strzykawka Hamiltona , 710RN&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>7638-01</td><td>Służy do przechowywania leku w czasie wstrzyknięcia nerwu błędnego.</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>EXEL INT, punkt komfortu</td><td>REF 26027</td><td>Służy do wstrzykiwania karprofenu i środków znieczulających miejscowo.</td></tr><tr><td>Lidokaina 2% Injection</td><td>Covetrus</td><td>Reorder#002468</td><td>Służy do mieszania z bupiwakainą i wstrzykiwania w miejsce nacięcia.&nbsp;</td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue MBSN</td><td>Acros Organics</td><td>212170250</td><td>Barwnik widoczny w obrębie nerwu, stosowany do mieszania z lekiem, tak aby widoczna była mieszanina iniekcyjna.</td></tr><tr><td>Sterylizator mikrokulek ze szklanymi koralikami</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr artykułu 18090-46</td><td>Służy do sterylizacji narzędzi chirurgicznych między operacjami na szczurach.</td></tr><tr><td>Igły NanoFil-NF35BV-2&nbsp;</td><td>World Precision Instrument</td><td>NC9708956</td><td>Służy do wstrzykiwania mieszaniny narkotyków i barwników do nerwu błędnego.</td></tr><tr><td>Uchwyty igieł Olsen-Hegar z obcinakami do szwów</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td>Stosowany do szycia ran.</td></tr><tr><td>Laboratoryjna folia do pakowania Parafilm M, 4 cale x 125 stóp, 1 rolka w pudełku, 12 sztuk</td><td>Honestmed</td><td>PM#996</td><td>Służy do przechowywania 5 μl mieszaniny leku i barwnika, tak aby ładowanie mieszaniny leku i barwnika do rurki śródskórnej BDTM było dokładne.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>PDI Alcohol Prep Pads</td><td>Honestmed</td><td>NDC 10819-3914-2</td><td>Służy do dezynfekcji pola operacyjnego.</td></tr><tr><td>Sterylne gąbki z gazy typu VII Premium Care, 8-warstwowe, 2" x 2"</td> <td>Dukal</td><td>Pozycja C5119</td><td>Używana jako cushon pod szyją szczura w czasie operacji.&nbsp;</td></tr><tr><td>Naciśnij przycisk n Folia spożywcza Seal</td><td>Glad</td><td></td><td>Służy do przykrywania szczura w czasie operacji jak zasłona.&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw zwijaczy szczurów</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>Surgi 5002</td><td>Służy do utrzymywania otwartego nacięcia, dzięki czemu łatwo jest oddzielić nerw błędny od tętnicy szyjnej.</td></tr><tr><td>RightTemp Jr.</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td></td><td>20,3 cm szer. x 25,4 cm dł. (8 cali szer. x 10 cali dł.), służy do utrzymywania szczurów w cieple.</td></tr><tr><td>S& Kleszcze T - Końcówki SuperGrip</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td>Używane w czasie szycia do utrzymywania tkanki bez uszkodzeń.</td></tr><tr><td>S& T Kleszcze do wiązania szwów</td><td>Fine Science Tools</td><td>00272-13</td><td>Służy do zaciskania szwu.</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td>Służy do wykonywania nacięcia w skórze po brzusznej stronie szyi.</td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela-#7</td><td>Fine Science Tools</td><td>10007-12</td><td>Służy do przytrzymywania ostrza skalpela.</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>&nbsp; KD Scientific</td><td>78-81-8052GL&</td><td>nbsp; Serial #D107034, Model#LEGATO-180, to programowalna pompa, która może pompować małą objętość mieszanki w ramach programu.</td></tr><tr><td>TipOne Filter Tip Refill Starter Systems</td><td>USA Pozycja naukowa</td><td>#1120-3510</td><td>Służy do pipetowania mieszaniny leku i barwnika.</td></tr><tr><td>Waporyzator do izofluranu, wypełniony lejkiem</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>Vetflow 1231</td><td>Służy do znieczulania szczurów.</td></tr><tr><td>Kleje do tkanek Vetbond</td><td>3M Science Applied to Life</td><td>ID B00016067</td><td>Służy do uszczelniania tkanek w miejscu przeciętej rany, jeśli szycie nie jest idealne.</td></tr><tr><td>Profesjonalny akumulatorowy zestaw do strzyżenia Wahl BravMini+</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>CL7300-Kit</td><td>Służy do strzyżenia sierści szczurów.</td></tr></tbody></table>

protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego dla szczurów

Direct Vagus Nerve Injection Protocol For Rats

Istnieje względna obfitość strategii i metodologii ułatwiających dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego. Jednak dostarczanie leków bezpośrednio do obwodowego układu nerwowego jest mniej powszechne, a publikacja dotycząca szczegółowych metod jest dostępna, aby pomóc naukowcom. W tym miejscu opisujemy metodę bezpośredniego wstrzykiwania nerwu w celu dostarczania leków do obwodowego układu nerwowego, wykorzystując nerw błędny jako nerw modelowy. Metoda ta może być stosowana w leczeniu zaburzeń autonomicznego układu nerwowego poprzez celowanie w lewy nerw błędny, chociaż tę ogólną metodę iniekcji można ekstrapolować na iniekcję innych nerwów z niewielkimi modyfikacjami. Metoda ta wyjaśnia wszystkie krytyczne etapy związane z procedurą obejmującą mikrochirurgię u znieczulonych dorosłych szczurów pod mikroskopem preparacyjnym. Opisano zastosowanie barwnika śledzącego w celu ułatwienia monitorowania wierności wtrysku w czasie rzeczywistym. Przedstawiono ilustracje udanych i nieudanych wstrzyknięć. Jeśli zostaną przeprowadzone prawidłowo, bezpośrednie zastrzyki z nerwu błędnego mogą być przeprowadzone w bezpieczny sposób, który jest dobrze tolerowany przez szczura, bez komplikacji po porodzie. Na przykład, gdy chirurdzy zostali przeszkoleni w tej metodzie, sześciu z sześciu szczurów udało się wstrzyknąć bez żadnych komplikacji. Ta metoda bezpośredniego wstrzykiwania nerwów w badaniach przedklinicznych na szczurach jest w stanie dostarczyć środki (w tym między innymi terapię genową) do nerwów obwodowych.

W niniejszym badaniu wykorzystano sześć dorosłych szczurów (3 samców i 3 samice). Z sześciu szczurów jeden otrzymał wielokrotne zastrzyki w celu zademonstrowania nieprawidłowego wstrzyknięcia, które objawia się dyfuzją barwnika wokół miejsca wstrzyknięcia Rycina 5A. U wszystkich pozostałych szczurów odnotowano prawidłowe wstrzyknięcie i barwienie nerwów, co przedstawiono na Rycini 4B oraz Rycini 5B.<...

Przedstawiamy protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego u szczurów, umożliwiający dostarczanie leku bezpośrednio do nerwu bez powikłań po wstrzyknięciu. Metoda ta ma zastosowanie w przedklinicznych badaniach neurologicznych obejmujących manipulację autonomicznego układu nerwowego. Może być stosowany do bezpośredniego wstrzykiwania nerwów dla innych nerwów u szczurów i innych gatunków, z niezbędnymi modyfikacjami.

Protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego dla szczurów

There is a relative abundance of strategies and methodologies to facilitate drug delivery to the central nervous system. However, drug delivery directly ...

Prowadzimy badania przedkliniczne w zakresie terapii genowozastępczej. Wykorzystujemy zwierzęta laboratoryjne w celu ustalenia optymalnej metody dostarczania leków w celu rozwiązania problemów z autonomicznym i obwodowym układem nerwowym. Wektorowa terapia zastępcza genów jest jedną z nowych technologii w terapii genowej. Zastosowanie wektora wirusowego związanego z adino jest jedną z potencjalnych opcji dostępnych obecnie. AAV9 jest szeroko stosowany w badaniach nad terapią genową w celu dostarczenia interesującego genu do ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Naukowcy nie mają wystarczających możliwości, aby dostarczyć środki farmaceutyczne bezpośrednio do obwodowego układu nerwowego. Zdarzają się sytuacje, które wiążą się z zaburzeniami neurologicznymi spowodowanymi przez obwodowy lub autonomiczny układ nerwowy. Brakuje jednak skutecznej metody dostarczania leków, która zaradziłaby tym sytuacjom.Metoda ta demonstruje sposób dostarczania leków bezpośrednio do nerwów błędnych w celu rozwiązania problemu autonomicznego układu nerwowego w badaniach przedklinicznych na szczurach. Dodatkowo metoda ta może być eksportowana w celu dostarczania leków przez inne nerwy obwodowe z niezbędnymi modyfikacjami u innych gatunków. Szare laboratorium będzie kontynuować przedkliniczne badania nad terapią genową za pośrednictwem AV, zarówno na gryzoniach, jak i dużych zwierzętach. Dodatkowo skupiliśmy się na opracowaniu nowych metod mających zastosowanie w celu utorowania strategii terapii genowo-zastępczej.[Narrator] Aby rozpocząć, podłącz szklaną strzykawkę o pojemności 100 mikrolitrów z wyjętym tłokiem do igły o rozmiarze 27. Podłącz jeden koniec około 45 centymetrów wysterylizowanej rurki polietylenowej do igły o rozmiarze 27, a następnie załóż trzymililitrową plastikową strzykawkę z igłą o rozmiarze 27 i załaduj strzykawkę około 0,5 mililitra 0,9% normalnej soli fizjologicznej. Użyj 0,9% normalnej soli fizjologicznej, aby napełnić rurkę polietylenową od otwartego końca, upewniając się, że rurka jest na całej długości, a cylinder szklanej strzykawki jest napełniony, aż sól fizjologiczna się przeleje. Po zakończeniu wyjmij i wyrzuć trzymililitrową strzykawkę i jej igłę. Teraz włożyć tłok do cylindra szklanej strzykawki i popchnąć go lekko do przodu do środka cylindra, a następnie umieścić szklaną strzykawkę w pompie strzykawki. Za pomocą pompki strzykawkowej lekko odciągnąć tłok do tyłu, tworząc przestrzeń powietrzną o długości około 1,5 centymetra na otwartym końcu rurki. Odpipetować co najmniej pięć mikrolitrów barwnika i potencjalnej mieszaniny leków za pomocą mikropipety o pojemności 10 mikrolitrów na wysterylizowany kawałek folii para. Pobrać proponowaną mieszaninę leku do rurki za pomocą pompy strzykawkowej i oznaczyć poziom mieszaniny do wstrzykiwań markerem. Dopasuj igłę o rozmiarze 35 do rurki i przymocuj ją do czystej powierzchni na etapie chirurgicznym za pomocą taśmy, upewniając się, że pozostaje zamocowana, wysterylizowana i nie dotyka niczego innego. Uruchomić pompę strzykawkową na 10 do 15 sekund, aż roztwór do wstrzykiwań zacznie wypływać z końcówki igły. Przenieś znieczulonego szczura na stół wyposażony w depilację i przygotowanie miejsca. Nałóż maść na sztuczne łzawienie w oba oczy szczura, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu. Podawaj leki przeciwbólowe zgodnie z zatwierdzonym instytucjonalnym protokołem dla zwierząt, aby kontrolować ból, gdy szczur odzyska przytomność. Ogoliłem brzuszną stronę szyi w okolicy szyjnej i przedłuż ją do około dwóch centymetrów prostopadle od linii środkowej po obu stronach od podbródka do mostka. Wysterylizuj ogolony obszar trzy razy 70% alkoholem etylowym i 10% betadyną, wycierając na zewnątrz w okrągły wzór. Przenieś szczura do etapu chirurgicznego w pozycji leżącej na plecach pod mikroskopem preparacyjnym. Upewnij się, że poduszka grzewcza pod szczurem jest odpowiednio hartowana i ustaw mikroskopy skupione, aby uwidocznić obszar szyjki macicy do operacji. Zaczep szczury lub zęby szczęki za pomocą niewchłanialnego szwu. Zamocuj otwarty koniec szwu wewnątrz stożka nosowego, aby nozdrza pozostały w stożku nosowym przez cały czas znieczulenia. Ustaw szczura tak, aby jego głowa leżała po lewej stronie praworęcznego chirurga. Umieść wysterylizowaną poduszkę z gazy pod szyją, aby wyrównać i wyprostuj odcinek szyjny. Przykryj ciało szczura wysterylizowaną serwetą, pozostawiając odsłonięte pole operacyjne. Zamocuj cztery kołki zwijacza z magnetycznymi stabilizatorami w czterech rogach etapu chirurgicznego. Teraz wstrzyknij znieczulenie miejscowe naskórka w linię środkową odcinka szyjki macicy, w którym zostanie wykonane nacięcie. Użyj ostrza skalpela, aby wykonać dwucentymetrowe podłużne nacięcie skóry na linii środkowej między podbródkiem a mostkiem w brzusznej części szyjki macicy. Następnie za pomocą wysterylizowanych bawełnianych końcówek oddziela przecięte krawędzie skóry. Za pomocą końcówek zwijacza cofnij oddzielone krawędzie skóry w przeciwnych kierunkach. Oddziel powięź za pomocą bawełnianych końcówek, aby wejść głębiej, i wypchnij gruczoły ślinowe na boki. Teraz oddziel mięśnie wyrostka sutkowatego mostka bawełnianymi końcówkami i schuj je na boki za pomocą kołków zwijających. Kontynuuj oddzielanie tkanki po lewej stronie tchawicy, aż osłonka tętnicy szyjnej będzie widoczna. Użyj cienkich kleszczy, aby utworzyć mały otwór w pochewce tętnicy szyjnej bez uszkadzania tętnicy szyjnej i ostrożnie oddziel lewy nerw błędny od wspólnej tętnicy szyjnej. Gdy nerw zostanie oddzielony od tętnicy za pomocą kleszczy, użyj zakrzywionej igły o rozmiarze 25 dopasowanej do jednomililitrowej strzykawki, aby zaczepić i przytrzymać nerw ręką niedominującą. Trzymaj igłę załadowaną mieszanką barwników kandydujących do leków dominującą ręką. Aby ułatwić płynne nakłucie, utrzymuj nerw prosto, delikatnie pociągając go za pomocą haczyka o rozmiarze 25. Włóż igłę do nerwu i przesuń ją do przodu o więcej niż 0,5 centymetra, trzymając igłę równolegle do nerwu błędnego. Pociągnij lekko do tyłu, tak aby około 0,4 do 0,5 centymetra igły pozostało wewnątrz nerwu. Ogranicz liczbę nakłuć nerwów jedną igłą do nie więcej niż trzech razy. Po potwierdzeniu wkłucia igły należy utrzymać jej pozycję bez ruchu i włączyć pompę strzykawkową. Należy monitorować infuzję, aby upewnić się, że pozostaje ona w nerwie i płynnie przepływa. Użyj zaznaczonego punktu na rurce infuzyjnej, aby śledzić ruch mieszaniny barwników leczniczych. Obserwuj, jak nerw zaczyna rozwijać kolor barwnika. Wyjmij zakrzywioną igłę o rozmiarze 25 i za pomocą sterylnych bawełnianych końcówek delikatnie przesuń chusteczki z powrotem do ich pierwotnej pozycji. Następnie zdejmij końcówki zwijacza. Zamknij ranę wchłanialnym lub niewchłanialnym szwem i w razie potrzeby nałóż niewielką ilość kleju tkankowego między szwami, aby rana idealnie się zamknęła.

direct-vagus-nerve-injection-protocol-for-rats

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Sanchez, CA i wsp. Przygotowanie elektrod do stymulacji nerwów obwodowych do przewlekłej implantacji u szczurów. J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje stymulację nerwu błędnego u obudzonego szczura. Szczur z wszczepioną przewlekłą elektrodą mankietową nerwu obwodowego i przeszkolony w zadaniu naciskania dźwigni jest podłączony do generatora bodźców za pomocą wszczepionej nasadki na głowę. Nerw błędny jest stymulowany natychmiast po każdym udanym naciśnięciu dźwigni, co powoduje...

Stymulacja nerwu błędnego za pomocą przewlekle wszczepionych elektrod mankietowych nerwów obwodowych u szczurów

Ten film opisuje wewnątrzkomórkowy zapis in vivo motoneuronów szczura pod wpływem przezrdzeniowej stymulacji prądem stałym. Protokół opisuje, w jaki sposób mierzyć właściwości błony i rejestrować rytmiczne odpalanie neuronów ruchowych przed, w trakcie i po anodowej lub katodowej polaryzacji rdzenia kręgowego.

Transrdzeniowa stymulacja prądem stałym motoneuronu rdzeniowego szczura

Źródło: Grames, M. S., et al. Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wstrzyknięcie do żyły ogonowej rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (AAV) u szczurów. Po wstrzyknięciu do żyły ogonowej bocznej wirus dostaje się do krwiobiegu, krąży w sercu i dociera do mózgu, gdzie dostaje się do neuronów i ułatwia produkcję białka docelowego do zastosowań...

 Dożylne podawanie rekombinowanych wektorów wirusa związanego z adenowirusem w modelu szczurzym 

Aferentna sygnalizacja błędna przekazuje ważne informacje do ośrodkowego układu nerwowego z receptorów znajdujących się w narządach brzucha i klatki piersiowej. Zwoje nerwu błędnego bez dawki zawierają wiele rodzajów receptorów, które modulują aktywność nerwu błędnego. Protokół ten opisuje metodę miejscowych wstrzykiwań neurochemikaliów do zwojów nerwowych bez dawki.

Metoda wstrzykiwania zwojów nerwowych bez dawki u szczura Sprague-Dawley

Stymulacja nerwu błędnego (VNS) pojawiła się jako narzędzie do wywoływania ukierunkowanej plastyczności synaptycznej w przodomózgowiu w celu modyfikacji szeregu zachowań. Ten protokół opisuje, jak zaimplementować VNS, aby ułatwić konsolidację pamięci wygaszania strachu.

Stymulacja nerwu błędnego jako narzędzie do indukowania plastyczności w szlakach istotnych dla uczenia się wymierania

Stymulacja nerwu błędnego okazała się skuteczna w zmniejszaniu obwodowego stanu zapalnego. W niniejszym artykule przedstawiamy zmodyfikowany protokół stymulacji nerwu błędnego, który pozwala na dalsze badania cholinergicznych mechanizmów przeciwzapalnych w ograniczonych odpowiedziach zapalnych.

Wydłużony czas rekonwalescencji i zmniejszone podawanie LPS w celu zbadania mechanizmów stymulacji nerwu błędnego w ograniczonych reakcjach zapalnych

Tutaj prezentujemy metodę walidacji iniekcji do żył ogonowych u szczurów poprzez wykorzystanie danych obrazowania fluorescencji w bliskiej podczerwieni z barwników włączonych do środków lub sond biologicznych. Ogon jest obrazowany przed i po iniekcji, sygnał fluorescencyjny jest określany ilościowo i dokonywana jest ocena jakości iniekcji.

Nowa najlepsza praktyka walidacji iniekcji do żył ogonowych u szczurów za pomocą środków znakowanych w bliskiej podczerwieni

Tutaj opisujemy metodę dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego szczura poprzez wszczepienie cewnika w śródoponową przestrzeń lędźwiową kręgosłupa. Koncentrujemy się na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych, chociaż ta metoda nadaje się również do dostarczania innych metod terapeutycznych.

Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura

Ten protokół opisuje in vivo wewnątrzkomórkowy zapis neuronów lędźwiowych szczura z jednoczesną przezrdzeniową stymulacją prądem stałym. Metoda ta pozwala na pomiar właściwości błony i rejestrację rytmicznego odpalania neuronów ruchowych przed, w trakcie i po anodowej lub katodowej polaryzacji rdzenia kręgowego.

Wewnątrzkomórkowy zapis in vivo zidentyfikowanych typów neuronów rdzeniowych szczura podczas transrdzeniowej stymulacji prądem stałym

Obecny protokół opisuje technikę chirurgiczną polegającą na wszczepianiu elektrod do nerwu błędnego w jamie brzusznej u szczurów, wraz z metodami przewlekłego testowania elektrofizjologii i stymulacji za pomocą wszczepionego urządzenia.

Chirurgia implantacji w celu stymulacji nerwu błędnego jamy brzusznej i rejestrowanie badań na obudzonych szczurach

Ten protokół opisuje unikalną technikę wykorzystującą podejście przezspojówkowe do dostępu do nerwu wzrokowego szczura w celu wykonania zastrzyków.

Podejście przezspojówkowe do wstrzyknięcia do nerwu wzrokowego szczura

Poznaj protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego u szczurów, umożliwiający ukierunkowane podawanie leków w badaniach przedklinicznych terapii genowej układu autonomicznego.

Protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego dla szczurów

Przeglądaj więcej filmów