Protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego dla szczurów

Prowadzimy badania przedkliniczne w zakresie terapii genowozastępczej. Wykorzystujemy zwierzęta laboratoryjne w celu ustalenia optymalnej metody dostarczania leków w celu rozwiązania problemów z autonomicznym i obwodowym układem nerwowym. Wektorowa terapia zastępcza genów jest jedną z nowych technologii w terapii genowej. Zastosowanie wektora wirusowego związanego z adino jest jedną z potencjalnych opcji dostępnych obecnie. AAV9 jest szeroko stosowany w badaniach nad terapią genową w celu dostarczenia interesującego genu do ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Naukowcy nie mają wystarczających możliwości, aby dostarczyć środki farmaceutyczne bezpośrednio do obwodowego układu nerwowego. Zdarzają się sytuacje, które wiążą się z zaburzeniami neurologicznymi spowodowanymi przez obwodowy lub autonomiczny układ nerwowy. Brakuje jednak skutecznej metody dostarczania leków, która zaradziłaby tym sytuacjom.

Metoda ta demonstruje sposób dostarczania leków bezpośrednio do nerwów błędnych w celu rozwiązania problemu autonomicznego układu nerwowego w badaniach przedklinicznych na szczurach. Dodatkowo metoda ta może być eksportowana w celu dostarczania leków przez inne nerwy obwodowe z niezbędnymi modyfikacjami u innych gatunków. Szare laboratorium będzie kontynuować przedkliniczne badania nad terapią genową za pośrednictwem AV, zarówno na gryzoniach, jak i dużych zwierzętach. Dodatkowo skupiliśmy się na opracowaniu nowych metod mających zastosowanie w celu utorowania strategii terapii genowo-zastępczej.

[Narrator] Aby rozpocząć, podłącz szklaną strzykawkę o pojemności 100 mikrolitrów z wyjętym tłokiem do igły o rozmiarze 27. Podłącz jeden koniec około 45 centymetrów wysterylizowanej rurki polietylenowej do igły o rozmiarze 27, a następnie załóż trzymililitrową plastikową strzykawkę z igłą o rozmiarze 27 i załaduj strzykawkę około 0,5 mililitra 0,9% normalnej soli fizjologicznej. Użyj 0,9% normalnej soli fizjologicznej, aby napełnić rurkę polietylenową od otwartego końca, upewniając się, że rurka jest na całej długości, a cylinder szklanej strzykawki jest napełniony, aż sól fizjologiczna się przeleje. Po zakończeniu wyjmij i wyrzuć trzymililitrową strzykawkę i jej igłę. Teraz włożyć tłok do cylindra szklanej strzykawki i popchnąć go lekko do przodu do środka cylindra, a następnie umieścić szklaną strzykawkę w pompie strzykawki. Za pomocą pompki strzykawkowej lekko odciągnąć tłok do tyłu, tworząc przestrzeń powietrzną o długości około 1,5 centymetra na otwartym końcu rurki. Odpipetować co najmniej pięć mikrolitrów barwnika i potencjalnej mieszaniny leków za pomocą mikropipety o pojemności 10 mikrolitrów na wysterylizowany kawałek folii para. Pobrać proponowaną mieszaninę leku do rurki za pomocą pompy strzykawkowej i oznaczyć poziom mieszaniny do wstrzykiwań markerem. Dopasuj igłę o rozmiarze 35 do rurki i przymocuj ją do czystej powierzchni na etapie chirurgicznym za pomocą taśmy, upewniając się, że pozostaje zamocowana, wysterylizowana i nie dotyka niczego innego. Uruchomić pompę strzykawkową na 10 do 15 sekund, aż roztwór do wstrzykiwań zacznie wypływać z końcówki igły. Przenieś znieczulonego szczura na stół wyposażony w depilację i przygotowanie miejsca. Nałóż maść na sztuczne łzawienie w oba oczy szczura, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu. Podawaj leki przeciwbólowe zgodnie z zatwierdzonym instytucjonalnym protokołem dla zwierząt, aby kontrolować ból, gdy szczur odzyska przytomność. Ogoliłem brzuszną stronę szyi w okolicy szyjnej i przedłuż ją do około dwóch centymetrów prostopadle od linii środkowej po obu stronach od podbródka do mostka. Wysterylizuj ogolony obszar trzy razy 70% alkoholem etylowym i 10% betadyną, wycierając na zewnątrz w okrągły wzór. Przenieś szczura do etapu chirurgicznego w pozycji leżącej na plecach pod mikroskopem preparacyjnym. Upewnij się, że poduszka grzewcza pod szczurem jest odpowiednio hartowana i ustaw mikroskopy skupione, aby uwidocznić obszar szyjki macicy do operacji. Zaczep szczury lub zęby szczęki za pomocą niewchłanialnego szwu. Zamocuj otwarty koniec szwu wewnątrz stożka nosowego, aby nozdrza pozostały w stożku nosowym przez cały czas znieczulenia. Ustaw szczura tak, aby jego głowa leżała po lewej stronie praworęcznego chirurga. Umieść wysterylizowaną poduszkę z gazy pod szyją, aby wyrównać i wyprostuj odcinek szyjny. Przykryj ciało szczura wysterylizowaną serwetą, pozostawiając odsłonięte pole operacyjne. Zamocuj cztery kołki zwijacza z magnetycznymi stabilizatorami w czterech rogach etapu chirurgicznego. Teraz wstrzyknij znieczulenie miejscowe naskórka w linię środkową odcinka szyjki macicy, w którym zostanie wykonane nacięcie. Użyj ostrza skalpela, aby wykonać dwucentymetrowe podłużne nacięcie skóry na linii środkowej między podbródkiem a mostkiem w brzusznej części szyjki macicy. Następnie za pomocą wysterylizowanych bawełnianych końcówek oddziela przecięte krawędzie skóry. Za pomocą końcówek zwijacza cofnij oddzielone krawędzie skóry w przeciwnych kierunkach. Oddziel powięź za pomocą bawełnianych końcówek, aby wejść głębiej, i wypchnij gruczoły ślinowe na boki. Teraz oddziel mięśnie wyrostka sutkowatego mostka bawełnianymi końcówkami i schuj je na boki za pomocą kołków zwijających. Kontynuuj oddzielanie tkanki po lewej stronie tchawicy, aż osłonka tętnicy szyjnej będzie widoczna. Użyj cienkich kleszczy, aby utworzyć mały otwór w pochewce tętnicy szyjnej bez uszkadzania tętnicy szyjnej i ostrożnie oddziel lewy nerw błędny od wspólnej tętnicy szyjnej. Gdy nerw zostanie oddzielony od tętnicy za pomocą kleszczy, użyj zakrzywionej igły o rozmiarze 25 dopasowanej do jednomililitrowej strzykawki, aby zaczepić i przytrzymać nerw ręką niedominującą. Trzymaj igłę załadowaną mieszanką barwników kandydujących do leków dominującą ręką. Aby ułatwić płynne nakłucie, utrzymuj nerw prosto, delikatnie pociągając go za pomocą haczyka o rozmiarze 25. Włóż igłę do nerwu i przesuń ją do przodu o więcej niż 0,5 centymetra, trzymając igłę równolegle do nerwu błędnego. Pociągnij lekko do tyłu, tak aby około 0,4 do 0,5 centymetra igły pozostało wewnątrz nerwu. Ogranicz liczbę nakłuć nerwów jedną igłą do nie więcej niż trzech razy. Po potwierdzeniu wkłucia igły należy utrzymać jej pozycję bez ruchu i włączyć pompę strzykawkową. Należy monitorować infuzję, aby upewnić się, że pozostaje ona w nerwie i płynnie przepływa. Użyj zaznaczonego punktu na rurce infuzyjnej, aby śledzić ruch mieszaniny barwników leczniczych. Obserwuj, jak nerw zaczyna rozwijać kolor barwnika. Wyjmij zakrzywioną igłę o rozmiarze 25 i za pomocą sterylnych bawełnianych końcówek delikatnie przesuń chusteczki z powrotem do ich pierwotnej pozycji. Następnie zdejmij końcówki zwijacza. Zamknij ranę wchłanialnym lub niewchłanialnym szwem i w razie potrzeby nałóż niewielką ilość kleju tkankowego między szwami, aby rana idealnie się zamknęła.