Nowatorska i skuteczna metoda barwienia fluorescencyjnego serca Drosophila z kriosekcją

Moje laboratorium badawcze wykorzystuje model suszycy do badania starzenia się i zaburzeń metabolicznych, badając ograniczone czasowo karmienie i ćwiczenia jako interwencję w przypadku chorób metabolicznych, mięśnia sercowego, snu i innych chorób związanych ze starzeniem się. Uczenie maszynowe i omika z fizjologiczną strategią genetyczną i żywieniową usprawnia oznaczanie sosophila przy użyciu urządzeń drukowanych w 3D i podejść uczenia maszynowego. Immunohistochemia fluorescencyjna serc drosophila umożliwia wykrywanie wielu białek w różnych genotypach i wieku, ale wiąże się z wyzwaniami, takimi jak skomplikowane sekcje, konserwacja tkanek i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości określonych wzorców ekspresji białka.

Protokół ten poprawia zachowanie tkanek, penetrację przeciwciał i rozdzielczość obrazowania, umożliwiając lepszą wizualizację markerów białkowych serca. Rozwiązuje problemy, takie jak złożona sekcja, uszkodzenie tkanek i ograniczona rozdzielczość w tradycyjnej metodzie montażu całego serca. Protokół ten zwiększa dostępność badań nad sercem drosophila, eliminując skomplikowane preparacje, umożliwiając wykonanie jedną ręką i unikając kosztownej mikroskopii konfokalnej, dzięki czemu obrazowanie w wysokiej rozdzielczości jest bardziej wykonalne.

Na początek znieczulij od 5 do 10 much za pomocą maty przeciw owadom z dwutlenkiem węgla. Ustaw muchy w zasięgu wzroku pod mikroskopem przy powiększeniu od 1 do 2 razy. Za pomocą nożyczek sprężynowych odetnij głowy muchom, przytnij skrzydła i usuń nogi.

Trzymaj klatkę piersiową i brzuch razem, zwane ciałem. Za pomocą pędzla delikatnie umieść ciała w oznaczonych 1,5-mililitrowych probówkach na lodzie, aż wszystkie grupy eksperymentalne zostaną zebrane. Po wyjęciu probówek z lodu do każdej probówki dodać 100 mikrolitrów 10-milimolowego kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego o pH 8.

Upewnij się, że wszystkie ciała są zanurzone i umieść rurki na wytrząsarce orbitalnej na 10 minut. Następnie wyjmij i wyrzuć roztwór kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego z probówek. Odpipetuj 100 mikrolitrów PBS do każdej probówki, aby myć chusteczkę przez 10 minut.

Umieść rurki na wytrząsarce orbitalnej podczas procesu mycia. Po odrzuceniu PBS do każdej probówki wsypać pipetą 100 mikrolitrów 4% paraformaldehydu w roztworze PBS. Umieść probówki na wytrząsarce orbitalnej o temperaturze 100 jednostek na 15 minut, upewniając się, że tkanki pozostają w kontakcie z roztworem.

Następnie wyrzuć roztwór paraformaldehydu. Po zakończeniu ostatniego mycia przenieś ciała do roztworu 10% sacharozy w PBS. Upewnij się, że ciała stykają się z roztworem w probówce.

Wyjmij suchy lód z magazynu i wybierz kilka kawałków do umieszczenia w małej metalowej lub plastikowej tacy. Wybierz tackę o wymiarach umożliwiających włożenie formy i umieść ją bezpośrednio na pojedynczym dużym i płaskim kawałku suchego lodu. Napełnij oznakowaną formę do 50% optymalną temperaturą cięcia lub związkiem OCT, wlewając powoli, aby zminimalizować pęcherzyki.

Za pomocą pędzla ostrożnie umieść wypreparowane i utrwalone ciała Drosophila na powierzchni związku OCT w formie. Za pomocą kleszczy popchnij każde ciało na dno formy, tak aby grzbietowa ściana klatki piersiowej i brzucha były zwykle wyrównane wzdłuż dna. Wyreguluj ciała tak, aby brzuch leżał płasko wzdłuż dna formy.

Wyrównaj wszystkie obiekty w wymiarach X, Y i Z, aby upewnić się, że każda sekcja będzie obejmować wszystkie obiekty jednocześnie. Popraw krzywiznę brzucha, szczególnie u mężczyzn, aby spłaszczyć ją tak bardzo, jak to możliwe, bez nakłuwania lub miażdżenia ciał. Gdy wszystkie przedmioty znajdą się na miejscu, ustaw formę tak, aby spód znajdował się bezpośrednio na kawałku suchego lodu.

Upewnij się, że związek OCT zaczyna zamarzać po kontakcie i kontynuuj, aż wszystkie przedmioty zostaną całkowicie zamknięte w formie. Po zamrożeniu przenieś formę do zamrażarki ustawionej na minus 20 stopni Celsjusza, aby umożliwić całkowite zamrożenie przez cały czas. Po całkowitym zamrożeniu wypełnij pozostałą część formy związkiem OCT.

Aby przymocować wiertło do formy, nałóż dużą ilość mieszanki OCT na blok. Dociśnij wiertło płasko do związku i pozwól mu całkowicie zamarznąć w kriostacie, zwykle w ciągu pięciu minut. Następnie odczep wiertło uchwytu i blok OCT z formy.

Umieść wiertło w uchwycie, upewniając się, że blok pozostaje prawidłowo zorientowany od góry do dołu i dokręć klucz do uchwytu, aby zabezpieczyć wiertło. Teraz, za pomocą pokręteł regulacyjnych i regulatorów głębokości uchwytu, wyrównaj blok z ostrzem i ustaw szerokość sekcji na 20 mikrometrów lub mniej. Wytnij każdy plasterek z bloku, wykonując powolny, ale konsekwentny ruch, pozwalając szkłu zapobiegającemu przetaczaniu się uchwycić każdy plasterek podczas cięcia.

Zbierz sekcje za pomocą rozgrzanych szkiełek. Za pomocą żyletki usuń nadmiar związku OCT otaczającego sekcje. Obrysuj granicę każdego szkiełka za pomocą markera hydrofobowego, aby roztwory do mycia i barwienia były ograniczone do tkanki.

Za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów umyj szkiełka trzy razy PBS przez pięć minut każde, nie dotykając chusteczki. Po odrzuceniu ostatniego płukania odpipetować fluorescencyjny roztwór barwienia na chusteczki i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie wyrzuć plamę fluorescencyjną i umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut za pomocą PBS.

Następnie wyrzuć ostatnie płukanie PBS, pozostawiając niewielką ilość roztworu na szkiełku. Używając pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, odpipetuj od trzech do pięciu kropli pożywki montażowej na szkiełko, unikając bezpośredniego nakładania na tkankę. Za pomocą kleszczy umieść szkiełko nakrywkowe na jednej krawędzi i stopniowo opuszczaj drugą stronę, aż zrówna się z szkiełkiem.

Uszczelnij slajdy lakierem do paznokci bez neonu i brokatu. Jeśli nośnik montażowy nie twardnieje, w zależności od plamy fluorescencyjnej, natychmiast zobrazuj lub zachowaj szkiełka na później. Przed obrazowaniem sprawdź szkiełka pod kątem czystości i delikatnie wyczyść je chusteczką z 70% etanolem w roztworze wodnym.

Przeanalizuj najjaśniejsze fluorescencyjne obiekty w eksperymencie, aby wybrać odpowiednie czasy ekspozycji dla każdego kanału fluorescencji. Przeprowadź ankietę wśród każdej grupy eksperymentalnej w podglądzie na żywo dla wszystkich kanałów, aby potwierdzić prawidłowe ustawienia ekspozycji. Aby zachować spójność, ustaw ostrość na każdym obiekcie przy użyciu tego samego kanału fluorescencji i uchwyć obrazy dla wszystkich obiektów.

Po zobrazowaniu przechowuj slajdy w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby w przyszłości odzyskać obraz. Metoda obrazowania fluorescencyjnego pozwoliła zachować kluczowe cechy serca drosophila, takie jak ujści, zastawka, włókna podłużne i włókna obwodowe. Cała struktura rurki serca i szczegółowe drobne struktury zostały uchwycone w różnych powiększeniach, z 10-krotnym dla całej struktury i 40-krotnymi do 60-krotnymi powiększeniami pokazującymi drobniejsze szczegóły, takie jak obwodowe włókna kurczliwe i podłużne włókna stabilizujące.

Reprezentatywne mikrofotografie fluorescencyjne wykazały zachowane struktury serca u w1118 drosophila z jądrami barwionymi DAPI, lipidami zabarwionymi na zielono i miofibrylami zawierającymi aktynę zabarwionymi na czerwono falloidyną. Barwienie falloidyną skutecznie uwydatniło włókna podłużne i obwodowe, wykazując zachowaną strukturę włókien aktynowych pomimo naprężeń zamrażających i tnących. Barwienie plamkami lipidowymi ujawniło magazynowanie tłuszczu zlokalizowane w pobliżu rurki serca.