Name: Nowatorska i skuteczna metoda barwienia fluorescencyjnego serca Drosophila z kriosekcją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj nowatorską metodę fluorescencyjnego barwienia serca Drosophila z kriosekcją. Technika eliminuje złożone preparaty, poprawia penetrację przeciwciał i rozdzielczość obrazowania, ułatwiając badania kardiologiczne na muszce owocowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Melkani za pomoc w postaci cennych informacji zwrotnych dotyczących rozwoju protokołu. Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) AG065992 i RF1NS133378 dla GCM. Prace te są również wspierane przez fundusze UAB Startup 3123226 i 3123227 G.C.M.

1. Przygotowanie sprzętu
<ol>
	<li>Upewnij się, że kriostat jest włączony i ustawiony na -20 °C. Poczekaj, aż upłynie odpowiedni czas, aby temperatura osiągnęła ten punkt. Jeśli maszyna ma temperaturę otoczenia, schłodzenie do optymalnej temperatury cięcia może zająć około 5 godzin.</li>
	<li>Włącz podgrzewacz do szkiełkek lub inkubator, upewniając się, że jest ustawiony na 37 °C. Upewnij się, że szkiełka mają wystarczająco dużo czasu, aby osiągnąć żądaną temperaturę. 
	UWAGA: Na tym etapie oznakowane preparaty można umieścić na podgrzewaczu lub inkubatorze i pozostawić na czas nieokreślony do momentu pokrojenia.</li>
	<li>Upewnij się, że suchy lód jest gotowy do użycia. Lód można usunąć z magazynu w temperaturze – 80 °C po osiągnięciu kroku 5.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj 50 ml PBS. Przygotować 10 ml 10 ml kwasu tetraoctowego glikolu etelinowego w PBS. Przygotować roztwór 4% paraformaldehydu w PBS, w którym końcowa objętość jest równa 100 μl razy liczba grup doświadczalnych.</li>
	<li>Przygotuj roztwór czyszczący składający się z 70% etanolu w wodzie w butelce z rozpylaczem. Przygotuj wszystkie fluorescencyjne roztwory barwiące. 
	UWAGA: Ten protokół szczegółowo opisuje, jak wykonać proste barwienie przy użyciu prostych barwników fluorescencyjnych lub barwników. W tym przypadku opiszemy zastosowanie 1x Phalloidin 594 w stosunku 1:250 w PBS. Stężenia barwników fluorescencyjnych będą się różnić w zależności od odczynnika i celów eksperymentalnych. Należy przeprowadzić wstępne badania w celu ustalenia odpowiedniego stężenia. Barwienie przeciwciał nie będzie tutaj szczegółowo opisane, ale powinno być stosowane przy użyciu konwencjonalnych metod barwienia.</li>
</ol>
3. Pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Znieczulij 5-10 much za pomocą maty przeciw owadom CO2 i ustaw muchy w polu widzenia pod mikroskopem w powiększeniu 1x-2x. Regulator CO2 powinien rejestrować od 1 do 5 kPa do CO2 mat. 
	UWAGA: Dostępne są inne metody znieczulania (np. FlyNap2), które nie wpływają znacząco na wyniki.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych odetnij głowę, przytnij skrzydła i usuń nogi od 5 do 10 much. To, co pozostaje, to klatka piersiowa i brzuch, razem będą określane jako ciało. 
	UWAGA: Aby odpowiednio wyrównać ciała muchy w kroku 5, wszelkie pozostałe długości skrzydeł lub nóg nie mogą kolidować z płaskim wyrównaniem wzdłuż dna formy. Osiągnij to, przycinając skrzydła i nogi jak najbliżej klatki piersiowej.</li>
	<li>Za pomocą pędzla delikatnie umieść ciała w oznaczonych probówkach o pojemności 1,5 ml na lodzie, aż wszystkie grupy eksperymentalne zostaną zebrane.</li>
</ol>
4. Utrwalenie całej tkanki
<ol>
	<li>Po wyjęciu probówek z lodu dodaj 100 μl 10 mM EGTA, pH 8 do każdej probówki, aby rozluźnić tkankę serca w jamie brzusznej. Upewnij się, że wszystkie ciała są zanurzone na 10 minut i umieszczone na wytrząsarce orbitalnej. Aby ułatwić zanurzenie ciał, można użyć wirówki stołowej.</li>
	<li>Wyjąć i wyrzucić roztwór z probówki. Odpipetować 100 μl PBS do każdej probówki, aby przemywać tkankę przez 10 minut, umieszczając na wytrząsarce orbitalnej. Usuń i wyrzuć po upływie czasu.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl 4% paraformaldehydu w roztworze PBS do każdej probówki. Upewnij się, że wszystkie ciała są zanurzone w roztworze.</li>
	<li>Umieść na wytrząsarce orbitalnej na 15 minut, ustawiając prędkość na około 100 jednostek. Upewnij się, że ustawienie nie powoduje poruszenia tkanek w kontakcie z roztworem.</li>
	<li>Po upływie tego czasu wyrzuć PFA i zastąp go 1x PBS na 10 minut, ponownie upewniając się, że wszystkie ciała mają kontakt z roztworem. Umieść probówki z powrotem w wytrząsarce orbitalnej z podobną prędkością, jak w kroku 4.4 dla każdego pozostałego prania.</li>
	<li>Za każdym razem odrzucając poprzedni roztwór, przemyj chusteczkę PBS 2x przez 10 minut każde, w sumie 3 prania.</li>
	<li>Po odrzuceniu końcowego płukania przenieś ciała do 10% roztworu sacharozy w PBS, upewniając się, że stykają się z roztworem w probówce. Aby uzyskać optymalne nasycenie, pozostaw je na noc lub na tyle długo, aby ciała opadły na dno. 
	UWAGA: Preferowana jest krioprotekcja przez noc, ale jeśli konieczne jest obrazowanie tego samego dnia, należy odczekać jak najdłużej krioprotektant na infiltrację tkanki.</li>
</ol>
5. Przygotowanie formy
<ol>
	<li>W tym momencie wyjmij suchy lód z magazynu i wybierz kilka kawałków do umieszczenia na małej metalowej lub plastikowej tacy. Wymiary tacki powinny być takie, aby można było włożyć formę, umieszczając ją bezpośrednio na pojedynczym, dużym i najlepiej płaskim kawałku suchego lodu.</li>
	<li>Napełnij oznakowaną formę w około 50% związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Staraj się ograniczyć wprowadzanie pęcherzyków, pozwalając związkowi powoli przepływać.</li>
	<li>Za pomocą pędzla ostrożnie umieść ciała na powierzchni OCT w formie. Na tym etapie należy wyraźnie rozdzielić wiele grup eksperymentalnych. 
	UWAGA: Ważne jest, aby zapobiec rozcieńczeniu związku OCT poprzez zanieczyszczenie roztworem sacharozy przez szczotkę. Ponadto umieszczenie głęboko w OCT za pomocą szczotki może spowodować powstanie wielu pęcherzyków powietrza. Unikaj tych błędów, aby zapobiec późniejszym problemom z sekcjami.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy popchnij każde ciało na dno formy grzbietową ścianą klatki piersiowej i brzucha, zwykle wzdłuż dna. Następnie wyreguluj ciało tak, aby brzuch był priorytetowo traktowany jako płaski wzdłuż dna formy. Wyrównaj wszystkie obiekty w wymiarach X, Y i Z w taki sposób, aby każda sekcja zawierała wszystkie obiekty jednocześnie.</li>
	<li>Może wystąpić skrzywienie brzucha, szczególnie u samców; spłaszcz je najlepiej jak potrafi technik. Jest to niezbędne, aby dłuższe odcinki mogły być zbierane w płaszczyźnie koronalnej. Podczas tego procesu unikaj przebijania lub zgniatania ciał o dno formy. Pracuj metodycznie, aby prawidłowo wyrównać każdy temat.</li>
	<li>Gdy wszystkie przedmioty znajdą się na miejscu, weź formę i połóż spód bezpośrednio na kawałku suchego lodu. Sprawdź, czy OCT zaczyna się zamarzać po kilku chwilach po kontakcie. Pozwól temu trwać, aż wszystkie obiekty zostaną otoczone zamrożoną częścią formy.</li>
	<li>Po osiągnięciu tego etapu przenieś formę do -20 °C, aby zamrozić ją w całości. Napełnij pozostałą część formy, gdy pierwsza porcja jest całkowicie zamrożona. Formy można następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania, owijając je folią aluminiową lub natychmiast pociąć. 
	UWAGA: Unikaj otwartej ekspozycji na powietrze w temperaturze -20 °C i -80 °C między dwoma etapami zamrażania. Może to spowodować rozwój wilgoci między warstwami.</li>
</ol>
6. Kriosekcja form
UWAGA: Generalnie zaleca się przygotowanie i wycięcie pustej formy przed cięciem eksperymentalnych form grupowych. Dzięki temu możemy zapewnić prawidłową funkcjonalność koła, ostrza i szkła anty-roll-roll bezpośrednio przed przecięciem tkanki. Ponadto pozwól, aby wszelkie pleśnie pochodzące z chłodniejszego przechowywania zaaklimatyzowały się w kriostacie przez 30 minut.
<ol>
	<li>Przymocuj wiertło do formy, nakładając dużą ilość OCT na blok i umieszczając wiertło na górze, dociskając je płasko. Pozostaw to do całkowitego zamrożenia w kriostacie, zwykle w ciągu 5 minut.</li>
	<li>Zwolnij wiertło i blok OCT z formy i umieść je w uchwycie, upewniając się, że blok pozostaje prawidłowo zorientowany od góry do dołu. Dokręć klucz do uchwytu wiertarskiego, aż wiertło będzie bezpieczne.</li>
	<li>Dopasuj blok do ostrza za pomocą pokręteł regulacyjnych i regulatorów głębokości uchwytu. Ustaw szerokość przekroju na 20 μM lub mniej. 
	UWAGA: Cieńsze sekcje są bardziej pożądane, aby zwiększyć liczbę możliwych zebranych sekcji. Pierwsze 2-6 sekcji każdego tematu powinno zawierać pożądane, niezakłócone części serca, które są funkcją orientacji i szerokości sekcji. Należy spróbować uzyskać odpowiednią orientację uchwytu przed przecięciem ważnych 2-6 sekcji.</li>
	<li>Pokrój każdy plasterek powolnym, ale konsekwentnym ruchem, pozwalając szkłu zapobiegającemu przetaczaniu się uchwycić każdy plasterek. Zbieraj sekcje za pomocą rozgrzanych szkiełek. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż 1 godzinę przed pierwszą rundą prania.</li>
</ol>
7. Barwienie fluorescencyjne
<ol>
	<li>Bezpośrednio po okresie suszenia usuń nadmiar OCT otaczającego sekcje za pomocą żyletki. Uważaj, aby na tym etapie nie natknąć się na tkankę. Jeśli szkiełko ma być zabarwione w późniejszym czasie, należy je przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Obrysuj tę granicę na każdym slajdzie za pomocą markera hydrofobowego. To obramowanie posłuży do utrzymania roztworów do mycia i barwienia na tkance. 
	UWAGA: Protokół ten określa, jak wykonywać barwienie i mycie metodą pipet, można również używać przesuwnych wiader i stojaków. Wystarczy zastąpić pipetowanie roztworów na wierzchu szkiełek zanurzeniem szkiełek w każdym ze świeżych roztworów. Tak jak zrobiliśmy to ostatnio dla obrazowania mózgu17, procedura barwienia immunologicznego może być również zastosowana do barwienia serca.</li>
	<li>Myć wszystkie szkiełka podstawowe 3 razy po 5 minut za pomocą PBS, delikatnie pipetując na wierzchu szkiełka, unikając pipetowania bezpośrednio na chusteczkę, jeśli to możliwe. Zrób to za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i dołączonych końcówek. Staraj się nie wstrzykiwać roztworu w pośpiechu, ponieważ może to spowodować uwolnienie tkanek z powierzchni szkiełka.</li>
	<li>Wyrzuć końcowe płukanie i odpipetuj roztwór barwnika fluorescencyjnego (1:250, 1x falloidyna) na tkanki. Pozostaw do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Po tym momencie badani są wrażliwi na światło. Wszystkie kolejne kroki wykonuj w ciemności lub zakrywając szkiełka. Wyrzuć barwnik fluorescencyjny i za pomocą pipety o pojemności 1000 μl przemyj 3x przez 5 minut PBS.</li>
</ol>
8. Montaż i przygotowanie do obrazowania
<ol>
	<li>Wyrzuć końcowe płukanie, pozostawiając niewielką ilość PBS na szkiełku. Za pomocą pipety o pojemności 1000 μl należy nanieść 3-5 kropli podłoża montażowego na szkiełko, unikając bezpośredniego rozprowadzania na tkankę.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku w taki sposób, aby zminimalizować wytwarzanie pęcherzyków powietrza. Dla ułatwienia użyj kleszczyków, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na jednej krawędzi i stopniowo opuszczaj drugą stronę, aż zrówna się ze szkiełkiem. Ze świeżo zamontowanymi prowadnicami należy obchodzić się ostrożnie i przechowywać je w pozycji złożonej na płasko przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Uszczelnij prowadnice za pomocą lakieru do paznokci lub, jeśli media montażowe twardnieją, unikaj tego. Nie należy używać lakieru do paznokci zawierającego neon lub brokat. W zależności od barwienia fluorescencyjnego należy natychmiast wykonać obrazowanie lub przechowywać preparaty do późniejszego uchwycenia.</li>
</ol>
9. Obrazowanie
UWAGA: Mikroskop Olympus BX 63 z obiektywami 10x, 40x i 60x był używany do przechwytywania obrazu. Zastosowano również odpowiednie filtry dla DAPI, Lipid Spot 488 i Phalloidin 594.
<ol>
	<li>Przed obrazowaniem sprawdź szkiełka i wyczyść je chusteczką chusteczkową i 70% etanolem w roztworze wodnym. Jeśli slajdy są obrazowane bezpośrednio po zamontowaniu, należy zachować szczególną ostrożność podczas czyszczenia, aby nie naruszyć szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Wybierz odpowiednie czasy ekspozycji dla każdego kanału w oparciu o najjaśniejsze fluorescencyjne obiekty w całym eksperymencie. Unikaj przesycenia, generując jak najjaśniejszy obraz i zmniejszając tło. Szybko przeprowadź ankietę wśród każdej grupy eksperymentalnej za pomocą podglądu na żywo każdego kanału, aby upewnić się, że ekspozycje są odpowiednio ustawione.</li>
	<li>Skoncentruj się na każdym obiekcie, używając tego samego kanału dla wszystkich obiektów, aby zachować spójność. Następnie uchwyć każdy obiekt. Uchwyć wszystkie grupy eksperymentalne użyte do porównania w tym samym dniu, aby uniknąć różnic w rozpadzie fluorescencyjnym między porównywanymi grupami.</li>
	<li>Po zobrazowaniu przechowuj slajdy w ciemności w temperaturze 4 °C w celu późniejszego uchwycenia obrazu.</li>
</ol>

<ol><li>Baker, K. D., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+larvae+and+obese+flies-emerging+studies+of+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Diabetic larvae and obese flies-emerging studies of metabolism in Drosophila.</a> Cell Metab. 6 (4), 257-266 (2007).</li>
<li>Bhide, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+autophagy+and+blocking+Nrf2+suppress+laminopathy-induced+age-dependent+cardiac+dysfunction+and+shortened+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Increasing autophagy and blocking Nrf2 suppress laminopathy-induced age-dependent cardiac dysfunction and shortened lifespan.</a> Aging Cell. 17 (3), e12747(2018).</li>
<li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+an+emerging+model+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342 (1), 1-11 (2004).</li>
<li>Bodmer, R., Venkatesh, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+development+in+Drosophila+and+vertebrates%3A+conservation+of+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genet%22%5BJournal%5D)">Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms.</a> Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).</li>
<li>Gill, S., Le, H. D., Melkani, G. C., Panda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-restricted+feeding+attenuates+age-related+cardiac+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Time-restricted feeding attenuates age-related cardiac decline in Drosophila.</a> Science. 347 (6227), 1265-1269 (2015).</li>
<li>Melkani, Y., Pant, A., Guo, Y., Melkani, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+assessment+of+cardiac+dynamics+in+aging+and+dilated+cardiomyopathy+Drosophila+models+using+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated assessment of cardiac dynamics in aging and dilated cardiomyopathy Drosophila models using machine learning.</a> Commun Biol. 7 (1), 702(2024).</li>
<li>Ocorr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 3943-3948 (2007).</li>
<li>Piazza, N., Wessells, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of cardiac disease.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 155-210 (2011).</li>
<li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+genetic+screens%2C+and+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circ Res. 109 (7), 794-806 (2011).</li>
<li>Lee, J. H., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-and+muscle-derived+signaling+system+dependent+on+MED13+and+Wingless+controls+obesity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Heart-and muscle-derived signaling system dependent on MED13 and Wingless controls obesity in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci. 111 (26), 9491-9496 (2014).</li>
<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).</li>
<li>Rotstein, B., Paululat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+morphology+of+the+Drosophila+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Dev+Dis%22%5BJournal%5D)">On the morphology of the Drosophila heart.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 3 (2), 15(2016).</li>
<li>Alayari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+Drosophila+heart+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of Drosophila heart structures.</a> J Vis Exp. (32), e1423(2009).</li>
<li>Guo, Y., Abou Daya, F., Le, H. D., Panda, S., Melkani, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+expression+of+Dgat2+induced+by+time%E2%80%90restricted+feeding+maintains+cardiac+health+in+the+Drosophila+model+of+circadian+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Diurnal expression of Dgat2 induced by time‐restricted feeding maintains cardiac health in the Drosophila model of circadian disruption.</a> Aging Cell. 23 (7), e14169(2024).</li>
<li>Melkani, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease-induced+cardiac+amyloidosis+is+reversed+by+modulating+protein+folding+and+oxidative+stress+pathways+in+the+Drosophila+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease-induced cardiac amyloidosis is reversed by modulating protein folding and oxidative stress pathways in the Drosophila heart.</a> PLoS Genet. 9 (12), e1004024(2013).</li>
<li>Hartley, P. S., Coward, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+podocyte+biology+using+Drosophila+nephrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling podocyte biology using Drosophila nephrocytes.</a> Methods Mol Biol. 2067, 11-24 (2020).</li>
<li>Watson, J. R., Roth, J., Melkani, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cryosectioning+of+Drosophila+heads+for+enhanced+Brain+Fluorescence+Staining+and+Immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct cryosectioning of Drosophila heads for enhanced Brain Fluorescence Staining and Immunostaining.</a> J. Vis. Exp. , Press e67791(2025).</li>
<li>Kelso, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flytrap%2C+a+database+documenting+a+GFP+protein%E2%80%90trap+insertion+screen+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Flytrap, a database documenting a GFP protein‐trap insertion screen in Drosophila melanogaster.</a> Nuc Acids Res. 32 (suppl_1), D418-D420 (2004).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li>
<li>Mery, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+muscle+LIM+protein%2C+Mlp84B%2C+is+essential+for+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function.</a> J Exp Biol. 211 (1), 15-23 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowaliśmy skuteczny protokół przygotowania rurki kardiologicznej Drosophila do wizualizacji za pomocą obrazowania fluorescencyjnego lub konfokalnego. Jest to poprzedzone omówieniem powszechnie stosowanej, ale czasochłonnej i pracochłonnej metody uzyskiwania dostępu i monitorowania integralności cytologicznej serca Drosophila. Nasza innowacyjna i wydajna metoda stanowi zwięzłą i skuteczną alternatywę dla tradycyjnych podejść poprzez wykorzystanie bezpośredniego osadzania kriogenicznego, które zachowu...

Choroby układu krążenia (CVD) są główną przyczyną zgonów na całym świecie, odpowiadają za około 17,9 miliona zgonów rocznie, co stanowi prawie 1/3 wszystkich zgonów na świecie. Drosophila melanogaster (powszechnie znana jako muszka owocowa) jest szeroko stosowana jako organizm modelowy do badania genetycznych, komórkowych i molekularnych podstaw rozwoju serca, fizjologii, metabolizmu, starzenia się i kardiomiopatii1,2,3,4,5,6,7,8,9. Modele Drosophila zostały również wykorzystane do zbadania roli mięśnia sercowego w ogólnoustrojowej regulacji otyłości10, głównego czynnika ryzyka zachorowalności i śmiertelności z przyczyn sercowo-naczyniowych. Badania nad sekwencjonowaniem genomu Drosophila11 wykazały znaczną ochronę genów u ludzi, w tym tych związanych z rozwojem różnych narządów, w tym serca. Wśród tych wysoce konserwatywnych genów, niektóre są zaangażowane w dysfunkcję serca, takie jak kardiomiopatie lub kanałopatie3. Niedawny rozwój skutecznych technik badania wydolności serca rozszerzył zastosowania modelu o badanie długoterminowych zmian w fizjologii serca u dorosłych spowodowanych takimi czynnikami, jak ćwiczenia, dieta i starzenie się8. Jednak wyzwania techniczne i logistyczne często utrudniają korzystanie z tego modelowego systemu. Jednym z wyzwań związanych z wykorzystaniem Drosophila w badaniach kardiologicznych jest precyzyjna sekcja serca w sposób, który zachowuje cytoarchitekturę i elementy mięśnia sercowego.
Serce Drosophila lub naczynie grzbietowe składa się z rurkowatej struktury składającej się z pojedynczej warstwy kardiomiocytów, komórek osierdzia umieszczonych wzdłuż ściany serca, wspieranych przez mięśnie alaryczne, a u dorosłych z warstwą brzusznej podłużnej komórki mięśniowej12. Dokładna sekcja w celu uzyskania dostępu do tych delikatnych struktur jest procesem czasochłonnym i pracochłonnym. Obecny standard obejmuje technicznie wymagającą sekcję i kapilarne odsysanie próżniowe, co wymaga zaawansowanego treningu i umiejętności motorycznych13,14,15,16. Zazwyczaj sekcja rozpoczyna się od nacięcia brzusznej ściany ciała, a wyzwania pojawiają się szybko ze względu na drobiazgową anatomię serca, jego delikatną strukturę i trudno dostępne położenie grzbietowe. To w połączeniu z tradycyjnymi technikami preparacyjnymi pozwala na precyzyjną analizę struktury i funkcji serca, zapewniając ulepszone narzędzie do badania chorób sercowo-naczyniowych w Drosophila13. Na przykład, korzystając z tego, Alayari i in. opracowali protokół fluorescencyjnego znakowania struktur serca Drosophila, ułatwiając wizualizację morfologii i struktury serca. Pomimo tych wysiłków, tradycyjne preparowanie i barwienie serca napotyka kilka wyzwań, w tym trudności w utrzymaniu integralności tkanek i specjalistyczne szkolenie wymagane do skutecznego barwienia serca.
Metoda oferuje innowacyjne rozwiązanie tego problemu, zastępując całą procedurę prostszym protokołem, który wykorzystuje krioembed klatki piersiowej i brzucha Drosophila, a następnie barwienie immunologiczne i obrazowanie fluorescencyjne. To łatwe do opanowania podejście zapewnia szybszą i prostszą wizualizację struktur serca z większą odtwarzalnością. Dodatkowo opisujemy prostą metodę z użyciem suchego lodu, która zapewnia równomierne ułożenie naskórka brzusznego Drosophila na tej samej płaszczyźnie z, usprawniając etap kriosekcji w dół rzeki. Wykazujemy skuteczność tego protokołu w wykrywaniu ważnych markerów serca, morfologii serca i organizacji komórkowej za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej i konfokalnej. Łatwość i wysoka skuteczność tego podejścia jest szczególnie pomocna w przypadku wysokoprzepustowych badań kardiologicznych opartych na Drosophila.

<table><tbody><tr><td>1000 &mikro; L Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Końcówki do pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>23-165R</td><td></td></tr><tr><td>10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td> <td>Fisher</td><td>J62036.K7</td><td>ph=7,4</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>20X Tris Buffered Saline</td><td>Thermo Scientific</td><td>J60877. K2</td><td>pH = 7,4</td></tr><tr><td>Szkło antyrolkowe</td><td>IMEB</td><td>AR-14047742497</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Naładowane szkiełka</td><td>Globe Scientific</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Formy do kriosekcji</td><td>Fisher</td><td>2363553</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza kriostatu</td><td>CL Sturkey</td><td>DT554N50</td><td></td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drobne kleszcze</td><td>Narzędzia precyzyjne</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Fly Pad</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>Hartowanie podłoża montażowego z Dapi</td><td>Vectashield</td><td>H-1800</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Optymalna temperatura cięcia</td><td>Związek Fisher</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 20%</td> <td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Falloidyna 594</td><td>Abnova</td><td>U0292</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Gravey</td><td>#40475</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td> <td>sprężynoweNarzędzia do nauki o nakładzie</td> pięknym <td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher</td><td>S5-500</td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorska i skuteczna metoda barwienia fluorescencyjnego serca drosophila z kriosekcją

Novel And Efficient Method for Drosophila Heart Fluorescence Staining with Cryosectioning

Modele serca Drosophila są szeroko stosowane w badaniu starzenia się serca i modelowaniu chorób serca u ludzi. Jednak sekcja serc Drosophila przed obrazowaniem jest skrupulatnym, czasochłonnym procesem, który wymaga zaawansowanego treningu i umiejętności motorycznych. Aby sprostać tym wyzwaniom, przedstawiamy innowacyjny protokół, który wykorzystuje kriosekcję do obrazowania fluorescencyjnego tkanki serca Drosophila. Protokół ten został zademonstrowany w obrazowaniu serca dorosłego Drosophila, ale może być dostosowany do etapów rozwojowych. Metoda ta zwiększa zarówno skuteczność, jak i dostępność barwienia fluorescencyjnego przy jednoczesnym zachowaniu integralności tkanki. Protokół ten upraszcza proces bez uszczerbku dla jakości obrazowania, zmniejszając w ten sposób zależność od techników z wysoko rozwiniętym przeszkoleniem i umiejętnościami motorycznymi. W szczególności zastępujemy złożone techniki, takie jak kapilarne odsysanie próżniowe, prostszymi metodami, takimi jak osadzanie tkanek. Takie podejście pozwala na wizualizację struktur serca z większą łatwością i powtarzalnością. Wykazujemy użyteczność tego protokołu, skutecznie wykrywając kluczowe markery serca i uzyskując obrazowanie fluorescencyjne i immunologiczne o wysokiej rozdzielczości, które ujawnia skomplikowane szczegóły morfologii serca i organizacji komórek. Metoda ta stanowi solidne i dostępne narzędzie dla naukowców badających biologię serca Drosophila, ułatwiając szczegółowe analizy rozwoju, funkcji i modeli chorób.

Opisana powyżej metoda ułatwia badanie serca Drosophila przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego bez uciążliwej dyssekcji. Jest to główna zaleta tej metody, ponieważ konwencjonalna metoda dyssekcji serca wymaga wypracowania złożonych umiejętności motorycznych. Jak zilustrowano na Rysunku 1, metoda ta jest bardziej przystępna dla nowych badaczy niż dyssekcja serca i zapewnia większą elastyczność w przeprowadzaniu eksperymentów. Alternatywnie, dzięki przechowywaniu w temperaturze -8...

Protokół sekcji serca i obrazowania fluorescencyjnego Drosophila upraszcza badanie struktury i patologii serca. Podejście to obejmuje proste cięcie, barwienie i obrazowanie, z pominięciem wiedzy technicznej potrzebnej do tradycyjnej sekcji. Zwiększa to dostępność, dzięki czemu Drosophila jest modelem szerzej wykorzystywanym do badań związanych z sercem w szerszej społeczności naukowej.

Nowatorska i skuteczna metoda barwienia fluorescencyjnego serca Drosophila z kriosekcją

Drosophila heart models are widely employed in studying cardiac aging and modeling&#160;human cardiac diseases. However, the dissection of Drosophila ...

Moje laboratorium badawcze wykorzystuje model suszycy do badania starzenia się i zaburzeń metabolicznych, badając ograniczone czasowo karmienie i ćwiczenia jako interwencję w przypadku chorób metabolicznych, mięśnia sercowego, snu i innych chorób związanych ze starzeniem się. Uczenie maszynowe i omika z fizjologiczną strategią genetyczną i żywieniową usprawnia oznaczanie sosophila przy użyciu urządzeń drukowanych w 3D i podejść uczenia maszynowego. Immunohistochemia fluorescencyjna serc drosophila umożliwia wykrywanie wielu białek w różnych genotypach i wieku, ale wiąże się z wyzwaniami, takimi jak skomplikowane sekcje, konserwacja tkanek i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości określonych wzorców ekspresji białka.Protokół ten poprawia zachowanie tkanek, penetrację przeciwciał i rozdzielczość obrazowania, umożliwiając lepszą wizualizację markerów białkowych serca. Rozwiązuje problemy, takie jak złożona sekcja, uszkodzenie tkanek i ograniczona rozdzielczość w tradycyjnej metodzie montażu całego serca. Protokół ten zwiększa dostępność badań nad sercem drosophila, eliminując skomplikowane preparacje, umożliwiając wykonanie jedną ręką i unikając kosztownej mikroskopii konfokalnej, dzięki czemu obrazowanie w wysokiej rozdzielczości jest bardziej wykonalne.Na początek znieczulij od 5 do 10 much za pomocą maty przeciw owadom z dwutlenkiem węgla. Ustaw muchy w zasięgu wzroku pod mikroskopem przy powiększeniu od 1 do 2 razy. Za pomocą nożyczek sprężynowych odetnij głowy muchom, przytnij skrzydła i usuń nogi.Trzymaj klatkę piersiową i brzuch razem, zwane ciałem. Za pomocą pędzla delikatnie umieść ciała w oznaczonych 1,5-mililitrowych probówkach na lodzie, aż wszystkie grupy eksperymentalne zostaną zebrane. Po wyjęciu probówek z lodu do każdej probówki dodać 100 mikrolitrów 10-milimolowego kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego o pH 8.Upewnij się, że wszystkie ciała są zanurzone i umieść rurki na wytrząsarce orbitalnej na 10 minut. Następnie wyjmij i wyrzuć roztwór kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego z probówek. Odpipetuj 100 mikrolitrów PBS do każdej probówki, aby myć chusteczkę przez 10 minut.Umieść rurki na wytrząsarce orbitalnej podczas procesu mycia. Po odrzuceniu PBS do każdej probówki wsypać pipetą 100 mikrolitrów 4% paraformaldehydu w roztworze PBS. Umieść probówki na wytrząsarce orbitalnej o temperaturze 100 jednostek na 15 minut, upewniając się, że tkanki pozostają w kontakcie z roztworem.Następnie wyrzuć roztwór paraformaldehydu. Po zakończeniu ostatniego mycia przenieś ciała do roztworu 10% sacharozy w PBS. Upewnij się, że ciała stykają się z roztworem w probówce.Wyjmij suchy lód z magazynu i wybierz kilka kawałków do umieszczenia w małej metalowej lub plastikowej tacy. Wybierz tackę o wymiarach umożliwiających włożenie formy i umieść ją bezpośrednio na pojedynczym dużym i płaskim kawałku suchego lodu. Napełnij oznakowaną formę do 50% optymalną temperaturą cięcia lub związkiem OCT, wlewając powoli, aby zminimalizować pęcherzyki.Za pomocą pędzla ostrożnie umieść wypreparowane i utrwalone ciała Drosophila na powierzchni związku OCT w formie. Za pomocą kleszczy popchnij każde ciało na dno formy, tak aby grzbietowa ściana klatki piersiowej i brzucha były zwykle wyrównane wzdłuż dna. Wyreguluj ciała tak, aby brzuch leżał płasko wzdłuż dna formy.Wyrównaj wszystkie obiekty w wymiarach X, Y i Z, aby upewnić się, że każda sekcja będzie obejmować wszystkie obiekty jednocześnie. Popraw krzywiznę brzucha, szczególnie u mężczyzn, aby spłaszczyć ją tak bardzo, jak to możliwe, bez nakłuwania lub miażdżenia ciał. Gdy wszystkie przedmioty znajdą się na miejscu, ustaw formę tak, aby spód znajdował się bezpośrednio na kawałku suchego lodu.Upewnij się, że związek OCT zaczyna zamarzać po kontakcie i kontynuuj, aż wszystkie przedmioty zostaną całkowicie zamknięte w formie. Po zamrożeniu przenieś formę do zamrażarki ustawionej na minus 20 stopni Celsjusza, aby umożliwić całkowite zamrożenie przez cały czas. Po całkowitym zamrożeniu wypełnij pozostałą część formy związkiem OCT.Aby przymocować wiertło do formy, nałóż dużą ilość mieszanki OCT na blok. Dociśnij wiertło płasko do związku i pozwól mu całkowicie zamarznąć w kriostacie, zwykle w ciągu pięciu minut. Następnie odczep wiertło uchwytu i blok OCT z formy.Umieść wiertło w uchwycie, upewniając się, że blok pozostaje prawidłowo zorientowany od góry do dołu i dokręć klucz do uchwytu, aby zabezpieczyć wiertło. Teraz, za pomocą pokręteł regulacyjnych i regulatorów głębokości uchwytu, wyrównaj blok z ostrzem i ustaw szerokość sekcji na 20 mikrometrów lub mniej. Wytnij każdy plasterek z bloku, wykonując powolny, ale konsekwentny ruch, pozwalając szkłu zapobiegającemu przetaczaniu się uchwycić każdy plasterek podczas cięcia.Zbierz sekcje za pomocą rozgrzanych szkiełek. Za pomocą żyletki usuń nadmiar związku OCT otaczającego sekcje. Obrysuj granicę każdego szkiełka za pomocą markera hydrofobowego, aby roztwory do mycia i barwienia były ograniczone do tkanki.Za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów umyj szkiełka trzy razy PBS przez pięć minut każde, nie dotykając chusteczki. Po odrzuceniu ostatniego płukania odpipetować fluorescencyjny roztwór barwienia na chusteczki i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie wyrzuć plamę fluorescencyjną i umyj szkiełka trzy razy przez pięć minut za pomocą PBS.Następnie wyrzuć ostatnie płukanie PBS, pozostawiając niewielką ilość roztworu na szkiełku. Używając pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, odpipetuj od trzech do pięciu kropli pożywki montażowej na szkiełko, unikając bezpośredniego nakładania na tkankę. Za pomocą kleszczy umieść szkiełko nakrywkowe na jednej krawędzi i stopniowo opuszczaj drugą stronę, aż zrówna się z szkiełkiem.Uszczelnij slajdy lakierem do paznokci bez neonu i brokatu. Jeśli nośnik montażowy nie twardnieje, w zależności od plamy fluorescencyjnej, natychmiast zobrazuj lub zachowaj szkiełka na później. Przed obrazowaniem sprawdź szkiełka pod kątem czystości i delikatnie wyczyść je chusteczką z 70% etanolem w roztworze wodnym.Przeanalizuj najjaśniejsze fluorescencyjne obiekty w eksperymencie, aby wybrać odpowiednie czasy ekspozycji dla każdego kanału fluorescencji. Przeprowadź ankietę wśród każdej grupy eksperymentalnej w podglądzie na żywo dla wszystkich kanałów, aby potwierdzić prawidłowe ustawienia ekspozycji. Aby zachować spójność, ustaw ostrość na każdym obiekcie przy użyciu tego samego kanału fluorescencji i uchwyć obrazy dla wszystkich obiektów.Po zobrazowaniu przechowuj slajdy w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby w przyszłości odzyskać obraz. Metoda obrazowania fluorescencyjnego pozwoliła zachować kluczowe cechy serca drosophila, takie jak ujści, zastawka, włókna podłużne i włókna obwodowe. Cała struktura rurki serca i szczegółowe drobne struktury zostały uchwycone w różnych powiększeniach, z 10-krotnym dla całej struktury i 40-krotnymi do 60-krotnymi powiększeniami pokazującymi drobniejsze szczegóły, takie jak obwodowe włókna kurczliwe i podłużne włókna stabilizujące.Reprezentatywne mikrofotografie fluorescencyjne wykazały zachowane struktury serca u w1118 drosophila z jądrami barwionymi DAPI, lipidami zabarwionymi na zielono i miofibrylami zawierającymi aktynę zabarwionymi na czerwono falloidyną. Barwienie falloidyną skutecznie uwydatniło włókna podłużne i obwodowe, wykazując zachowaną strukturę włókien aktynowych pomimo naprężeń zamrażających i tnących. Barwienie plamkami lipidowymi ujawniło magazynowanie tłuszczu zlokalizowane w pobliżu rurki serca.

novel-efficient-method-for-drosophila-heart-fluorescence-staining

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym opracowaniu opisujemy podstawowy protokół fluorescencyjnego znakowania różnych elementów cewek serca larw i osobników dorosłych Drosophila melanogaster. Próbki te są dobrze dostosowane do obrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Technika ta umożliwia szczegółową analizę strukturalną cech serc tego potężnego organizmu modelowego.

Fluorescencyjne znakowanie struktur serca Drosophila

Opisujemy proces utrwalania, zatapiania, krojenia i obrazowania późnych stadiów embrionów Drosophila do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu badania embrionalnej rurki serca. Technika ta umożliwia wizualizację światła rurki serca, a także błony podstawnej wyścielającej światło serca.

Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

Opisujemy usprawniony protokół przygotowywania preparatów typu „fillet” (filetowanie) zarodków Drosophila o określonych genotypach. Protokół ten umożliwia efektywne przeprowadzanie różnorodnych przesiewów genetycznych. Pozwala on również na doskonałą wizualizację struktur w późnym stadium rozwoju zarodka.

Żywa dyssekcja zarodków Drosophila: Usprawnione metody przesiewania kolekcji mutantów za pomocą barwienia przeciwciałami

Identyfikacja mechanizmów leżących u podstaw uszkodzeń mięśni jest kluczowa. Przedstawiamy tutaj technikę histologiczną przygotowywania skrawków z laniny oraz skrawków mrożonych mięśni klatki piersiowej Drosophila. Pozwala to na analizę morfologii mięśni oraz lokalizację białek i innych składników komórek mięśniowych.

Przekroje woskowe i mrożone mięśni dorosłych osobników Drosophila

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Opisujemy protokół do wolumetrycznego obrazowania komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych. Wykorzystując metody oczyszczania tkanek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, pojedyncze komórki znakowane białkiem fluorescencyjnym wewnątrz serca embrionalnego lub pourodzeniowego mogą być wyraźnie i dokładnie zobrazowane.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy do ekstrakcji danych ilościowych z badań biologicznych komórek opartych na obrazowaniu fluorescencyjnym agregacji białek i przepływu autofagicznego w ośrodkowym układzie nerwowym modeli neurodegeneracji Drosophila.

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ

Tutaj opisujemy protokół wykrywania i lokalizacji białka zarodka Drosophila i RNA od pobrania do wstępnego osadzenia i osadzenia, barwienia immunologicznego i hybrydyzacji mRNA in situ.

Protokół immunohistochemii i dystrybucji RNA in-situ we wczesnym zarodku Drosophila

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

To badanie przedstawia uproszczony protokół przetwarzania tkanek obejmujący dekapitację, fiksację, kriosekcję, barwienie fluorescencyjne, barwienie immunologiczne i obrazowanie, który może być rozszerzony na obrazowanie konfokalne i wielofotonowe. Metoda zachowuje skuteczność porównywalną ze skomplikowanymi sekcjami, omijając potrzebę zaawansowanych umiejętności motorycznych. Ilościowa analiza obrazu daje szeroki potencjał badawczy.

Bezpośrednia kriosekcja głów Drosophila w celu wzmocnienia barwienia fluorescencyjnego mózgu i barwienia immunologicznego

Poznaj nowatorską metodę fluorescencyjnego barwienia serca Drosophila z kriosekcją. Technika eliminuje złożone preparaty, poprawia penetrację przeciwciał i rozdzielczość obrazowania, ułatwiając badania kardiologiczne na muszce owocowej.

Nowatorska i skuteczna metoda barwienia fluorescencyjnego serca Drosophila z kriosekcją

Przeglądaj więcej filmów