Opracowanie i ocena wewnątrzkomórkowych modeli zakażeń Staphylococcus aureus

Nasze badania koncentrują się na zakażeniach gronkowcem złocistym w celu ustalenia modelu infekcji międzykomórkowej. Model ten dostarczy cennych informacji na temat mechanizmu leżącego u podstaw zakażeń międzykomórkowych i przyczyni się do opracowania ścisłego wieku zapobiegania im i leczenia. Najnowszym osiągnięciem w wewnątrzkomórkowym zakażeniu gronkowcem złocistym jest badanie mechanizmu infekcji w celu regulacji przeżycia i rozprzestrzeniania się bakterii w komórce, a także optymalizacja leku i modyfikacji strukturalnej w celu poprawy efektu terapeutycznego.

Ta dziedzina badawcza wykorzystuje hodowlę komórkową, technologię sekwencjonowania pojawiających się komórek, termy tlenowe o wysokiej zawartości paliwa, technologię edycji genów i inne powiązane technologie do badania infekcji bakteryjnych w komórkach. W przeciwieństwie do tradycyjnych modeli infekcji, udoskonaliliśmy warunki eksperymentalne specyficzne dla infekcji wewnątrzkomórkowych. Po indywidualnym zakażeniu komórek Staphylococcus aureus, komórki zakażone bakteriami są następnie inokulowane myszom w celu wywołania infekcji wewnątrzkomórkowych.

Takie podejście poprawia wydajność poprzez minimalizację interferencji wolnych bakterii, zapewniając dokładniejsze zatrzymywanie procesu infekcji wewnątrzkomórkowej. Nasza metoda skupi się na opracowaniu leków opartych na przeciwciałach i przyczyni się do postępów w zapobieganiu i leczeniu infekcji bakteryjnych w przyszłości. Aby przygotować 6% bulion skrobiowy, dodaj ekstrakt wołowy w proszku, trypton i chlorek sodu do szklanego pojemnika kolejno w stosunku masowym 3 do 10 do 5.

Dodaj 100 mililitrów podwójnie destylowanej wody i wymieszaj, aby rozpuścić składniki. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej. Następnie dodaj rozpuszczalną skrobię w stosunku masowym 6 i mieszaj mieszaninę aż do całkowitego rozpuszczenia.

Autoklaw bulionu w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po wysterylizowaniu przechowuj bulion w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż utworzy pastę. Aby zebrać makrofagi otrzewnowe myszy, lewą ręką chwyć szyję myszy i kontroluj jej ogon.

Następnie obróć mysz tak, aby jej głowa była skierowana w dół, a brzuch skierowany do góry. Podaj myszowi trzymililitrowe wstrzyknięcie dootrzewnowe 6% bulionu skrobiowego. Po 72 godzinach od wstrzyknięcia należy poświębić znieczuloną mysz i zdezynfekować ją 75% alkoholem etylowym.

Za pomocą nożyczek okulistycznych rozetnij brzuch myszy, aby całkowicie odsłonić otrzewną. Wstrzyknąć 10 mililitrów DMEM do jamy brzusznej poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Delikatnie pocieraj brzuch przez minutę, aby spłukać jamę.

Następnie za pomocą strzykawki zebraj wyciek płynu do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować płyn popłuczyn o stężeniu 300 G przez pięć minut i wyrzucić sklarowany osad. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach DMEM uzupełnionym 10% FBS, penicyliną i streptomycyną.

Weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i dodaj ją do licznika komórek, aby policzyć komórki. Rozcieńczyć komórki do stężenia 2 razy 10 do mocy 6 komórek na mililitr za pomocą DMEM FBS. Umieścić jeden mililitr zawiesiny komórek na studzience na płytce sześciodołkowej.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez cztery godziny. Po inkubacji usunąć supernatant. Przemyj komórki dwukrotnie sterylnym PBS i hoduj je przez noc z jednym mililitrem DMEM na studzienkę w tych samych warunkach.

Inkubować makrofagi otrzewnowe z gronkowcem złocistym MRSA-252 przez dwie godziny. Usunąć supernatant i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Dodać jeden mililitr na studzienkę kompletnej pożywki DMEM zawierającej 100 mikrogramów na mililitr gentamycyny i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie PBS. Za pomocą skrobaka do komórek zbierz makrofagi otrzewnej do 50-mililitrowych probówek wirówkowych. Odwirować próbki o stężeniu 1000 G przez pięć minut.

Dodaj 10 mikrogramów na mililitr lizozymu do makrofagów zakażonych wewnątrzkomórkowym MRSA-252 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po dwukrotnym umyciu ogniw PBS, ponownie zawieś je w jednym mililitrze PBS. Następnie wyjmij około 20 mikrolitrów podwielokrotności i dodaj 0,1% Triton X-100 na pięć minut, aby zlizować komórki.

Wykonaj seryjne rozcieńczenia zawiesiny zlizowanych komórek za pomocą PBS i upuść je na tryptyczną płytkę ślimakową sojową. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia policz kolonie bakteryjne, aby obliczyć wewnątrzkomórkowe bakterie MRSA-252 w makrofagach otrzewnowych.

Umieść mysz pod lampą fizjoterapeutyczną na podczerwień, aż żyła ogonowa zostanie rozszerzona. Losowo podziel myszy na cztery grupy. Wstrzyknąć dożylnie 3 razy 10 do mocy 6 CFU Planktonowego MRSA-252 do żyły ogonowej myszy.

Po 24 godzinach poświęć znieczuloną mysz i dokładnie zdezynfekuj ją 75% alkoholem etylowym. Użyj pęsety jedną ręką, aby unieść skórę brzucha, a drugą ręką przeciąć skórę za pomocą nożyczek okulistycznych. Zlokalizuj nerki w jamie brzusznej i ostrożnie całkowicie je ogołocij.

Przenieś nerki do probówki mielącej zawierającej jeden mililitr PBS i zmiel je, aż nie pozostanie żadna tkanka stała. Wlej homogenizowaną tkankę do probówki Eppendorfa. Wykonać seryjne rozcieńczenia homogenatu tkankowego za pomocą PBS.

Umieść każde rozcieńczenie na oddzielnych tryptykach sojowych i inkubuj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Policz kolonie bakterii następnego dnia i przeanalizuj dane. Z powodzeniem stworzono wewnątrzkomórkowe modele infekcji S. aureus w zoptymalizowanych warunkach fagocytozy i rozszerzonej antybiotykoterapii z niektórymi bakteriami przeżywającymi w makrofagach.

Makrofagi zakażone opornym na metycylinę S.aureus zatrzymywały bakterie wewnątrzkomórkowe po dwóch godzinach antybiotykoterapii, gdy supernatant nie zawierał już bakterii. In vivo testy kolonizacji bakteryjnej u myszy wykazały, że wankomycyna eliminowała zewnątrzkomórkowy S. aureus, ale nie usuwała bakterii wewnątrzkomórkowych.