Name: Analiza ekspresji onkogenów ze zmianami pH w linii komórek przewodowych trzustki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Poznaj analizę ekspresji onkogenów w komórkach przewodowych trzustki przy zmniejszonym pH. Metoda RNA-seq ujawnia związek między kwaśnym środowiskiem a aktywnością onkogenów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Renuka Goudshelwar jest wdzięczna DBT za zapewnienie jej stypendium. Renuka Goudshelwar dziękuje za pomoc otrzymaną od Wydziału Biochemii Uniwersytetu Osmania (Hyderabad) oraz do dr V. V. Ravikanth za jego wskazówki podczas analizy danych NGS. Dr M. Sasikala dziękuje za pomoc finansową otrzymaną od ICMR, Ministerstwa Zdrowia, Rządu Indii (Grant no-94/2020/5582/Proteomics-Adhoc/BMS).

1. Odrodzenie linii komórkowej
<ol>
	<li>Zaopatrz się w ludzką normalną linię komórek przewodowych trzustki (HPDEC / H6C7) i ożywij komórki w świeżej pożywce.
	<ol>
		<li>Rozmrozić komórki w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Świeżo przygotować kompletne podłoże i przefiltrować je za pomocą filtra strzykawkowego. 
		UWAGA: Kompletna pożywka zawiera zmodyfikowaną pożywkę Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
		<li>Dodać 6 ml kompletnej pożywki do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, dodać rozmrożoną zawiesinę komórkową i dokładnie wymieszać.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę o stężeniu 1 800 × g przez 6 minut. Wyrzucić supernatant, dodać 1 ml pożywki do osadu i delikatnie wymieszać. 
		UWAGA: Pożywka hodowlana zawiera DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykami wstrzykiwaczymi/paciorkowcami.</li>
		<li>Dodawać komórki kroplami do kolby T-25 zawierającej 4 ml pożywki hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zmiana pH pożywki hodowlanej
<ol>
	<li>Przygotować 100 ml 0,5 M roztworów podstawowych buforu fosforanu sodu o wartościach pH 6,0, 6,5 i 7,0, jak podano w Tabeli 1.</li>
	<li>Sprawdź pH za pomocą pH-metru i dostosuj je za pomocą 1 N HCl/1 M NaOH.</li>
	<li>Przefiltruj i wysterylizuj w okapie z laminarnym przepływem powietrza za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm. 
	UWAGA: Bufor może być przechowywany w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną o wartościach pH 6,0, 6,5 i 7,0, dodając 20 ml sterylnego 0,5 M buforu fosforanu sodu o odpowiednim pH do 80 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Dodać pożywkę o zmienionym pH do 85-90% zlewających się ludzkich komórek przewodowych trzustki i sprawdzić zmiany morfologiczne pod mikroskopem jasnego pola w odstępach 1 h przez 6 godzin.</li>
</ol>
3. Izolacja RNA
UWAGA: Do izolacji RNA z komórek muszą być używane sterylne rękawiczki, a powierzchnia musi być odkażona przy użyciu 100% etanolu.
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i przepłukać komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	<li>Umieść płytkę na lodzie, dodaj PBS do studzienki, a następnie zeskrob komórki za pomocą skrobaka do komórek. 
	UWAGA: Ilość dodanego PBS powinna wystarczyć do pokrycia komórek do skrobania. Nie ma potrzeby dodawania dużej ilości PBS.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę do świeżej probówki i odwirować ją pod ciśnieniem 8 000 ×g przez 10 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodaj bufor do lizy zawierający β-merkaptoetanol do granulek i pipetuj go w górę iw dół przez 5-10 minut na lodzie.</li>
	<li>Dodaj równą objętość 70% etanolu do lizatu i dokładnie wymieszaj. Nie wirować.</li>
	<li>Dodaj roztwór do kolumny z membraną krzemionkową, odwiruj przy >8 000 ×g przez 30 s i odrzuć przepływ.</li>
	<li>Dodać bufor do przemywania próbki i odwirowywać przy >8 000 ×g przez 30 s. Odwirować pustą probówkę przez 1 minutę w temperaturze >8 000 ×g.</li>
	<li>Do kolumny dodać 30-50 μl wody wolnej od nukleaz i pozostawić na 5 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować kolumnę przy >8 000 ×g przez 5 min. 
	UWAGA: Próbki RNA można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego wykorzystania.</li>
</ol>
4. Sekwencja RNA/Transkryptom
<ol>
	<li>Ocena integralności RNA
	<ol>
		<li>Sprawdź integralność RNA w bioanalizatorze, pobierając 1 μl (25-500 ng) i mieszając go z 5 μl buforu barwnika.</li>
		<li>Wirować roztwór o stężeniu 500 ×g przez 1 minutę i krótko wirować.</li>
		<li>Przeprowadzić jednoetapową reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) dla każdej próbki w temperaturze 72 °C przez 3 minuty, a następnie pobrać probówki i inkubować je na lodzie przez 2 minuty przed analizą za pomocą bioanalizatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Całkowite RNA zubożone w rRNA
	<ol>
		<li>Dodaj 5 μg całkowitego RNA, 50 μl buforu hybrydyzacyjnego i 1-3 μl mieszaniny sondy do świeżej probówki PCR.</li>
		<li>Wykonać następujące etapy: pierwszy etap, denaturacja w temperaturze 70 °C przez 10 minut; drugi etap, hybrydyzacja w temperaturze 37 °C przez 20 minut; i inkubacja w temperaturze 37 °C aż do użycia.</li>
		<li>Do świeżej probówki dodać 500 μl kulek magnetycznych i próbkę; umieścić mieszaninę na stojaku magnetycznym na 1 minutę, aż roztwór stanie się klarowny.</li>
		<li>Ostrożnie wyrzucić supernatant. Wyjmij probówkę, umyj kulki, dodając 500 μl wody wolnej od nukleaz i umieść mieszaninę z powrotem na stojaku magnetycznym na 1 minutę. Usunąć supernatant, gdy roztwór stanie się klarowny.</li>
		<li>Powtórz proces 5-7 razy. Dodać 200 μl buforu hybrydyzacyjnego i odpowiednio wymieszać. Probówki należy przechowywać w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Dodać 100 μl sondy RNA do powyższej mieszaniny, delikatnie wymieszać i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Krótko obróć rurkę przed umieszczeniem jej na stojaku magnetycznym na 1 minutę.</li>
		<li>Zebrać klarowny supernatant zawierający RNA zubożone w rRNA w świeżej probówce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fragmentacja RNA
	<ol>
		<li>W świeżej probówce do PCR dodaj 8-10 μl całkowitego RNA zubożonego w rRNA (500 ng / g), 1 μl 10x buforu i 1 μl RNazy III.</li>
		<li>Wymieszaj roztwór, stukając i krótko obracając.</li>
		<li>Umieścić probówki w termocyklerze na 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>W świeżej probówce dodaj 5 μl kulek wiążących kwasy nukleinowe, a następnie dodaj 90 μl koncentratu roztworu wiążącego.</li>
		<li>Do powyższej mieszaniny dodać 30 μl fragmentów RNA i 150 μl 100% etanolu. Wymieszać próbkę pipetując 10x i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieść probówki na stojaku magnetycznym, aż roztwór stanie się klarowny. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.</li>
		<li>Przemyć kulki 150 μl etanolu, gdy probówki znajdują się na stojaku magnetycznym; pozostawić mieszaninę na 30 sekund, a następnie usunąć supernatant.</li>
		<li>Pozostaw probówki na stojaku magnetycznym na 1-2 minuty, aby pozostały etanol odparował.</li>
		<li>Dodać 12 μl wstępnie podgrzanej wody wolnej od nukleaz do kulek i wymieszać próbkę pipetując 10 razy.</li>
		<li>Inkubować próbkę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Umieść probówki na stojaku magnetycznym i zbierz supernatant, gdy będzie czysty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie biblioteki i przygotowanie cDNA
	<ol>
		<li>Dodać 3 μl rozdrobnionej próbki RNA do probówki PCR, a następnie dodać 5 μl mieszaniny hybrydyzacyjnej. Wymieszać próbkę przez kilka razy, pipetując kilka razy, a następnie krótko odwirować próbkę.</li>
		<li>Przechowywać probówki w termocyklerze przez 10 minut w temperaturze 65 °C, a następnie przez 5 minut w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Do powyższego roztworu dodać 10 μl buforu do ligacji i 2 μl mieszaniny enzymów ligacyjnych. Inkubować reakcję w termocyklerze przez 1 godzinę w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Dodać główną mieszankę odwrotnej transkryptazy do mieszaniny ligacyjnej i inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut, a następnie inkubować na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja cDNA
	<ol>
		<li>Dodać 6 μl cDNA (500 ng) do świeżej probówki PCR, a następnie dodać 46 μl mieszanki PCR z kodami kreskowymi z probówki zawierającej 46 μl enzymu polimerazy o wysokiej wierności i 1 μl 3-stopowych starterów kodów kreskowych.</li>
		<li>Ustawić warunki PCR w następujący sposób: pierwszy etap, utrzymywać w temperaturze 94 °C przez 2 minuty; drugi etap, cykle w temperaturze 94 °C przez 30 s i 50 °C przez 30 s; trzeci etap, 16 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 62 °C przez 30 s i 68 °C przez 30 s. Utrzymywać reakcję w temperaturze 68 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Oczyść amplifikowany cDNA, powtarzając kroki od 4.3.5 do 4.3.10 i zastąp fragmentaryczną próbkę RNA produktem PCR otrzymanym w poprzednim kroku.</li>
		<li>Przeanalizuj oczyszczoną próbkę RNA na sekwenatorze (NGS) w celu wygenerowania danych w postaci plików FASTq.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Bioinformatyka
<ol>
	<li>Otwórz narzędzie Galaxy dostępne online, kopiując i wklejając link: https://usegalaxy.org do zakładki wyszukiwania w przeglądarce.</li>
	<li>Przy pierwszej wizycie na tej stronie zarejestruj się w celu uzyskania profilu, klikając opcję logowania lub rejestracji w prawym górnym rogu.</li>
	<li>Po utworzeniu konta zaloguj się na konto, podając nazwę publiczną/nazwę użytkownika i hasło.</li>
	<li>Prześlij pliki FASTq uzyskane po analizie sekwencyjnej RNA, klikając opcję przesyłania w panelu po lewej stronie.</li>
	<li>Wybierz narzędzie cutadapt z sekcji narzędzi na lewym panelu bocznym. To narzędzie przycina sekwencje o niskiej jakości. 
	UWAGA: Ten plik może być teraz używany do mapowania.</li>
	<li>Kliknij przycisk narzędzia na lewym panelu bocznym i poszukaj narzędzia Gwiazda RNA. Wypełnij szczegóły w następujący sposób: Użyj pliku wyjściowego cutadapt, wybierz genom referencyjny jako ludzki genom referencyjny (hg38) i zmień długość sekwencji genomowej wokół połączeń z adnotacjami na 36. Wybierz dane wyjściowe jako liczbę genów i kliknij opcję narzędzia Uruchom w prawym górnym rogu. 
	UWAGA: To narzędzie wygeneruje plik BAM.</li>
	<li>Wybierz narzędzie do zliczania cech z opcji narzędzia i prześlij pliki BAM uzyskane po analizie gwiazd RNA. Ustaw minimalną jakość odwzorowania na odczyt w opcjach filtrowania odczytu na 10 i kliknij opcję uruchom narzędzie w prawym górnym rogu.</li>
	<li>Otwórz plik wyjściowy featurecount z prawego panelu i skopiuj dane do arkusza kalkulacyjnego. Oblicz zmianę krotności względem kontrolki, dzieląc liczbę zliczeń odczytu uzyskanych w teście przez liczbę liczb odczytu uzyskanych w kontrolce za pomocą polecenia =log (zmiana składania, 2). 
	UWAGA: Uważa się, że zmiana krotności <-2,0 wskazuje na regulację w dół, a zmiana składania > 2,0 jest uważana za regulację w górę.</li>
</ol>

<ol><li>Franck, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%3A+Moving+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advanced pancreatic ductal adenocarcinoma: Moving forward.</a> Cancers (Basel). 12 (7), 1955(2020).</li>
<li>Kong, X., Sun, T., Kong, F., Du, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest+Tumors%22%5BJournal%5D)">Chronic pancreatitis and pancreatic cancer.</a> Gastrointest Tumors. 1 (3), 123-134 (2014).</li>
<li>Jura, N., Archer, H., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pancreatitis%2C+pancreatic+adenocarcinoma+and+the+black+box+in-between%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Chronic pancreatitis, pancreatic adenocarcinoma and the black box in-between.</a> Cell Res. 15 (1), 72-77 (2005).</li>
<li>Kloppel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pancreatitis%2C+pseudotumors+and+other+tumor-like+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Chronic pancreatitis, pseudotumors and other tumor-like lesions.</a> Mod Pathol. 20 (Suppl 1), S113-S131 (2007).</li>
<li>Schneider, A., Whitcomb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+pancreatitis%3A+a+model+for+inflammatory+diseases+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Hereditary pancreatitis: a model for inflammatory diseases of the pancreas.</a> Best Pract Res Clin Gastroenterol. 16 (3), 347-363 (2002).</li>
<li>Boedtkjer, E., Pedersen, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acidic+tumor+microenvironment+as+a+driver+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">The acidic tumor microenvironment as a driver of cancer.</a> Annu Rev Physiol. 82, 103-126 (2020).</li>
<li>Coussens, L. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cancer.</a> Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).</li>
<li>Balkwill, F., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cancer%3A+back+to+Virchow%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cancer: back to Virchow.</a> Lancet. 357 (9255), 539-345 (2001).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+crossroads+of+inflammation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">At the crossroads of inflammation and cancer.</a> Cell. 118 (6), 671-674 (2004).</li>
<li>Kato,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+extracellular+microenvironment+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Acidic extracellular microenvironment and cancer.</a> Cancer Cell Int. 13 (1), 89(2013).</li>
<li>Hegyi, P., Maléth, J., Venglovecz, V., Rakonczay, Z. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+ductal+bicarbonate+secretion%3A+challenge+of+the+acinar+acid+load%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic ductal bicarbonate secretion: challenge of the acinar acid load.</a> Front Physiol. 2, 36(2011).</li>
<li>Ibrahim-Hashim, A., Estrella, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+and+cancer%3A+from+mechanism+to+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Acidosis and cancer: from mechanism to neutralization.</a> Cancer Metastasis Rev. 38 (1-2), 149-155 (2019).</li>
<li>Vakkila, J., Lotze, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+necrosis+promote+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and necrosis promote tumour growth.</a> Nat Rev Immunol. 4 (8), 641-648 (2004).</li>
<li>Zepecki, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+glioma+cell+migration%2C+tumor+growth%2C+and+stemness+gene+expression+using+a+Lck+targeted+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor.</a> Oncogene. 38 (10), 1734-1750 (2019).</li>
<li>Kim, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lymphocyte-specific+protein+tyrosine+kinase+%28LCK%29+in+the+expansion+of+glioma-initiating+cells+by+fractionated+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Role of lymphocyte-specific protein tyrosine kinase (LCK) in the expansion of glioma-initiating cells by fractionated radiation.</a> Biochem Biophys Res Commun. 402 (4), 631-636 (2010).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+Src+kinases+Lyn%2C+Hck+and+Fgr+for+BCR-ABL1-induced+B-lymphoblastic+leukemia+but+not+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Requirement of Src kinases Lyn, Hck and Fgr for BCR-ABL1-induced B-lymphoblastic leukemia but not chronic myeloid leukemia.</a> Nat Genet. 36 (5), 453-461 (2004).</li>
<li>Sharp, N. A., Luscombe, M. J., Clemens, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+c-fgr+proto-oncogene+expression+in+Burkitt%27s+lymphoma+cells%3A+effect+of+interferon+treatment+and+relationship+to+EBV+status+and+c-myc+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Regulation of c-fgr proto-oncogene expression in Burkitt's lymphoma cells: effect of interferon treatment and relationship to EBV status and c-myc mRNA levels.</a> Oncogene. 4 (8), 1043-1046 (1989).</li>
<li>Hui, A. B., Lo, K. W., Yin, X. L., Poon, W. S., Ng, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+multiple+gene+amplifications+in+glioblastoma+multiforme+using+array-based+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Detection of multiple gene amplifications in glioblastoma multiforme using array-based comparative genomic hybridization.</a> Lab Invest. 81 (5), 717-723 (2001).</li>
<li>Fang, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+and+functional+characterization+of+a+novel+ARF6+GTPase-activating+protein%2C+ACAP4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification and functional characterization of a novel ARF6 GTPase-activating protein, ACAP4.</a> Mol Cell Proteomics. 5 (8), 1437-1449 (2006).</li>
<li>Okabe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+development+and+differentiation+enhancing+factor-like+1+%28DDEFL1%29+as+a+drug+target+for+hepatocellular+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Isolation of development and differentiation enhancing factor-like 1 (DDEFL1) as a drug target for hepatocellular carcinomas.</a> Int J Oncol. 24 (1), 43-48 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Metoda ta została opracowana w celu określenia wpływu warunków kwaśnych na nienowotworowe ludzkie komórki nabłonka przewodowego trzustki w powtórzeniach biologicznych. Zmiana pH pożywki spowodowała, że komórki znalazły się w stanie stresu i zaobserwowano zmianę morfologii. Komórki hodowano w pH 6,0, 6,5 lub 7,0 przez 24 godziny i monitorowano co godzinę w celu optymalizacji okresu inkubacji do dalszych eksperymentów. Zaobserwowaliśmy zmianę morfologii po 4 godzinach inkubacji, a śmiertelność komórek wzrosła po 6 godzinac...

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest jednym z głównych nowotworów i zajmuje czwarte miejsce wśród nowotworów pod względem liczby powiązanych zgonów1. Wyższa śmiertelność jest widoczna wśród pacjentów z PDAC, a według ostatnich badań pięcioletni wskaźnik przeżycia wynosi tylko 12%. Pacjenci z udokumentowanym przewlekłym zapaleniem trzustki, chorobą prowadzącą do zapalenia trzustki2, są bardziej narażeni (około 15-16-krotnie) na rozwój PDAC3. Istnieją różne rodzaje CP o różnej etiologii, takie jak CP4. Wiadomo, że warunki występujące podczas CP prowadzą do powstawania zwapniałych kamieni, rozwoju komórek rakowych, a nawet cukrzycy. Częstość występowania PDAC jest wysoka u pacjentów z dziedzicznym przewlekłym zapaleniem trzustki5.
Niektóre warunki fizjologiczne w trzustce pacjentów z MPD mogą być korzystne dla inicjacji innych dolegliwości; obejmują one środowisko zapalne, aktywne enzymy trawienne i kwaśne pH soku trzustkowego6. Prowadzony jest szeroki zakres badań w obszarze zapalenia, ponieważ stan zapalny powoduje chaos w normalnym funkcjonowaniu narządu7,8,9. Jednak brak równowagi w regulacji pH jest kolejnym zjawiskiem, które może wywołać inicjację niekontrolowanego wzrostu komórek10. Sok trzustkowy zdrowych osób ma odczyn zasadowy, co pomaga zneutralizować kwaśną treść pokarmową wytwarzaną przez żołądek. Natomiast sok trzustkowy pozostaje kwaśny u pacjentów z CP z powodu niewystarczającego wydzielania wodorowęglanów. Niski poziom wodorowęglanów nie jest w stanie całkowicie zneutralizować soku, co skutkuje lekko kwaśnym środowiskiem w kanale11.
Wcześniejsze badania wskazują, że komórki nowotworowe przystosowują się do kwaśnego środowiska i rozwijają się w nim12. W takich przypadkach warunki, które występują podczas procesu przewlekłego zapalenia trzustki, sugerują korzystne środowisko dla proliferacji i przerzutów tych komórek13. W związku z tym nasze badania miały na celu ocenę zmian morfologicznych w ludzkich komórkach przewodowych trzustki oraz ocenę ekspresji onkogenów w warunkach lekko kwaśnych.

<table><tbody><tr><td>Probówki wirówkowe z podziałką 15 ml (Falcon)&nbsp;</td><td>Tarsons&nbsp;</td><td>500031</td><td>służy do przygotowania próbek&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe z podziałką 50 ml (Falcon)</td><td>Tarsons&nbsp;</td><td>500041</td><td>służy do przygotowania próbek&nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td>Agilent G2938A</td><td>Instrment do oceny jakości RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Antybiotyk Roztwór przeciwgrzybiczy 100x płyn</td><td>Himedia</td><td>A002-100 ml</td><td>Stosowany w celu zapobiegania zanieczyszczeniu&nbsp;</td></tr><tr><td>Skrobak do komórek z obrotowym ostrzem</td><td>Himedia&nbsp;</td><td>TCP223</td><td>Skrobanie i zbieranie komórek</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 &nbsp;</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170 S</td><td>Służy do inkubacji kultury&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozy&nbsp;</td><td>Himedia</td><td>AL007S-500 mL</td><td>Pożywka używana do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1x</td><td>Himedia</td><td>TL1006-500mL</td><td>mycie komórek</td></tr><tr><td>Galaxy&nbsp;</td><td>(https://usegalaxy.org)Narzędzie</td><td></td> <td>online do przetwarzania danych NSG&nbsp;</td></tr><tr><td>HI FBS (pochodzenie: Australia)</td><td>Gibco</td><td>10100-147</td><td>Służy do wzrostu komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Ludzka linia komórek nabłonka przewodowego trzustki (HPDEC / H6C7)</td> <td>Addex Bio T0018001</td><td></td><td>Linia komórek przewodowych trzustki</td></tr><tr><td>Zestaw jonów Total RNA-Seq v2</td> Zestaw do <td>przygotowania próbek RNA</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>4475936</td></tr><tr><td>Laminarny przepływ</td><td></td><td></td><td></td>powietrza</tr><tr><td>Na2HPO4 Diabasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264-250G</td><td>Fosforan sodu Przygotowanie buforu&nbsp;</td></tr><tr><td>NaH2PO4 Monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3139-250G</td><td>Preparat buforowy fosforanu sodu&nbsp;</td></tr><tr><td>Sekwencer 3376672 NovaSeq 6000</td><td>Illumina</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunclon Delta Surface (płytka 6-dołkowa)</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>Hodowla komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa z chłodzeniem</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Sorvall ST 8R</td><td>Służy do wirowania</td></tr><tr><td>RiboMinus Eukaryote System v2</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>A15026</td><td>zestaw do dezuplikacji rRNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw Rneasy Mini&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Zestaw do izolacji całkowitego RNA z komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Eppendorf</td><td>E950040025</td><td>reakcji PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna&nbsp;</td><td>Equitron</td><td>#8406M</td><td>Rozmrażanie próbki</td></tr></tbody></table>

analiza ekspresji onkogenów ze zmianami ph w linii komórek przewodowych trzustki

Oncogene Expression Analysis with Alterations in pH in a Pancreatic Ductal Cell Line

Czwarta najczęstsza przyczyna zgonów związanych z rakiem, gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC), ma 12% pięcioletni wskaźnik przeżycia. Choroba ta ma złe rokowanie i charakteryzuje się sztywnym mikrośrodowiskiem zrębu, co stanowi namacalne wyzwanie w jej leczeniu. Pacjenci z przewlekłym zapaleniem trzustki mają 10-krotnie większe ryzyko rozwoju PDAC; u tych pacjentów pH przewodowe spada z pH 8,0 do pH 6,0 z powodu niedoboru wodorowęglanów i środowiska zapalnego. Naszym celem było zrozumienie roli kwaśnego środowiska obserwowanego w przewlekłym zapaleniu trzustki na ekspresję onkogenów w linii komórek przewodowych trzustki.
Dlatego 80% zlewających się ludzkich komórek nabłonka przewodowego trzustki inkubowano w pH od 6,0 do pH 7,2 przez 6 godzin. Całkowite RNA z komórek zostało przetworzone w celu wzbogacenia całkowitego mRNA w próbkach. Ekspresję genów oceniano za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS) kontrprób biologicznych. Analizę sekwencji RNA przeprowadzono za pomocą narzędzia internetowego i zidentyfikowano geny o zróżnicowanej ekspresji (FC < ± 2,0); było 90, 148 i 109 genów regulowanych w górę oraz 20, 14 i 23 geny regulowane w dół odpowiednio przy pH 6,0, 6,5 i 7,0. Cztery onkogeny były regulowane w górę przy pH 6,0, siedem było regulowanych w górę przy pH 6,5, a siedem było regulowanych w górę przy pH 7,0. Wspólnymi genami, które były regulowane w górę przy pH 6,0, pH 6,5 i pH 7,0, były kinaza białkowo-tyrozynowa specyficzna dla komórek limfocytów (LCK) [pH 6,0, FC: 2,93; pH 6,5, FC: 2,93; pH 7,0, FC: 3,32], protoonkogen FGR, kinaza tyrozynowa rodziny Src (FGR) [pH 6,0, FC: 4,17; pH 6,5, FC: 5,25; pH 7,0, FC: 5,09] i ArfGAP z domeną SH3, powtórzenie ankyryny i domena pH 3 (ASAP3) [pH 6,0, FC: 2,37; pH 6,5, FC: 3,84; pH 7,0, FC: 2,51]. Kwaśne środowisko wyzwala aktywację protoonkogenów, które mogą wywołać inicjację guza w przewlekłym zapaleniu trzustki.

Zmiany morfologiczne 
Inkubacja ludzkich komórek przewodowych trzustki w środowisku kwaśnym spowodowała zmianę morfologii komórek. Konfluentny i gęsty układ komórek przekształcił się w układ rozproszony w warunkach zakwaszenia, a z czasem coraz bardziej widoczna stała się śmierć komórek. W porównaniu z komórkami w medium normalnym, komórki przewodowe uległy skurczeniu i zmniejszeniu rozmiarów. Drastyczna zmiana w tempie obumierania została zaobserwowana po 6 h inkubacji. Po 24 h liczba komórek spadła,...

To badanie opisuje protokół badania wpływu zmienionego pH na ekspresję onkogenu za pomocą analizy sekwencyjnej RNA linii komórkowej przewodu trzustkowego.

Analiza ekspresji onkogenów ze zmianami pH w linii komórek przewodowych trzustki

The fourth leading cause of cancer-related death, pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), has a 12% five-year survival rate. This disease has a poor ...

W szpitalach AIG badamy, w jaki sposób zmniejszone wydzielanie przewodowe trzustki i obniżone pH wpływa na ekspresję genów w komórkach przewodowych trzustki, szczególnie koncentrując się na onkogenach, badając możliwość adaptacji komórkowej do kwaśnych mikrośrodowisk. Wyzwaniem jest tutaj niejednorodność guzów trzustki, co komplikuje zarówno leczenie, jak i podejścia eksperymentalne. Przeprowadziliśmy więc analizę RNAC komórek przewodowych trzustki w warunkach obniżonego pH i stwierdziliśmy, że występuje zwiększona ekspresja trzech onkogenów, co podkreśla potencjalne powiązania między kwaśnym środowiskiem a ekspresją onkogenów w komórkach przewodowych trzustki.Nasze badanie rzuciło światło na ekspresję onkogenu w warunkach obniżonego pH, a ten system może przyspieszyć nasze badania w badaniu gruczolakoraka przewodowego trzustki w warunkach zapalenia. Tak więc przyszłym celem tego badania jest ocena roli zwiększonej ekspresji onkogenów w inicjacji nowotworów w stanach zapalnych, takich jak przewlekłe zapalenie trzustki. Na początek zaopatrz się w ludzką normalną linię komórek przewodowych trzustki.Rozmrozić komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Teraz przefiltruj świeżo przygotowane kompletne podłoże przez filtr strzykawkowy. Dodaj sześć mililitrów kompletnej pożywki do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki.Następnie przenieś rozmrożoną zawiesinę komórkową do probówki i dokładnie wymieszaj. Odwirować zawiesinę o stężeniu 1 800 G przez sześć minut. Odrzucić supernatant i dodać jeden mililitr pożywki hodowlanej do osadu przed delikatnym wymieszaniem.Następnie dodaj cztery mililitry kompletnej pożywki do 60-milimetrowej szalki Petriego. Następnie odpipetować zawiesinę komórek kroplami do kolby. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenkiem węgla.Aby zmienić pH pożywki hodowlanej, najpierw przygotuj 100 mililitrów 0,5-molowych roztworów buforowych fosforanu sodu o wartościach pH 6,0, 6,5 i 7,0. Sprawdź pH za pomocą pH-metru i dostosuj je za pomocą jednego molowego kwasu solnego lub jednego molowego wodorotlenku sodu. Następnie przefiltruj, wysterylizuj w okapie z laminarnym przepływem powietrza za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,45 mikrometra.Następnie dodaj 20 mililitrów sterylnego 0,5-molowego buforu fosforanu sodu o odpowiednim pH do 80 mililitrów pożywki hodowlanej, aby przygotować pożywkę o różnym pH. Dodaj pożywkę o zmienionym pH do 85 do 90% zlewających się ludzkich komórek przewodowych trzustki. Obserwuj zmiany morfologiczne pod mikroskopem jasnego pola w odstępach godzinnych przez sześć godzin.Aby wyizolować RNA z hodowli, najpierw odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać komórki jednym mililitrem PBS. Umieść 60-milimetrową miskę na lodzie, a następnie jeden mililitr PBS na 60-milimetrowej misce i zeskrob komórki skrobakiem do komórek. Teraz przenieś zawiesinę do świeżej tubki.Odwirować go przy stężeniu 8 000 G przez 10 minut i odrzucić supernatant. Następnie dodaj 600 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego beta-merkaptoetanol do granulatu. Pipetować zawiesinę w górę i w dół przez pięć do 10 minut na lodzie.Dodać równą objętość 70% etanolu do lizatu i odpipetować zawiesinę, aby dokładnie wymieszać. Przenieść roztwór do kolumny z membraną krzemionkową. Następnie odwirować kolumnę o stężeniu ponad 8 000 G przez 30 sekund i odrzucić przepływ.Następnie dodać 500 mikrolitrów buforu płuczącego do próbki i ponownie odwirować. Wirować pustą probówkę przez jedną minutę przy stężeniu większym niż 8 000 G. Na koniec dodać do kolumny od 30 do 50 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej należy ponownie odwirować kolumnę z prędkościami wyższymi niż 8 000 G przez pięć minut.Zaobserwowano znaczne zmniejszenie wielkości komórek i kurczenie się komórek ciągliwych w środowisku kwaśnym w porównaniu z komórkami utrzymywanymi w normalnym środowisku. Najbardziej wyraźne zmiany w śmierci komórki wystąpiły po sześciu godzinach inkubacji, z dalszym spadkiem liczby komórek i oznakami stresu komórkowego po 22 godzinach. Liczba genów o podwyższonej regulacji była najwyższa przy pH 6,5 z 148 genami, następnie pH 7 ze 109 genami i pH 6 z 90 genami.Obniżona regulacja genów była mniejsza i wynosiła 20 przy pH 6, 14 przy pH 6,5 i 23 przy pH 7. Trzy onkogeny, LCK, FGR i ASAP trzy, były regulowane w górę na wszystkich badanych poziomach pH, co sugeruje rolę w proliferacji komórek w warunkach kwaśnych.

oncogene-expression-analysis-with-alterations-ph-pancreatic-ductal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Lepsze zrozumienie biologii raka trzustki jest niezwykle potrzebne, aby umożliwić opracowanie lepszych opcji terapeutycznych w leczeniu raka trzustki. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, demonstrujemy ortotopowy model raka trzustki, który umożliwia nieinwazyjne monitorowanie progresji raka za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo.

Bioluminescencyjny ortotopowy model progresji raka trzustki

Tutaj opisujemy metodę izolacji komórek w mikrośrodowisku trzustki z tkanek embrionalnych, noworodkowych i dorosłych myszy, koncentrując się na izolacji komórek mezenchymalnych. Metoda ta umożliwia profilowanie ekspresji genów komórkowych i wydzielania białek w celu wyjaśnienia sygnałów zewnętrznych, które regulują rozwój, funkcję i nowotworzenie trzustki.

Izolowanie i analiza komórek mezenchymy trzustki za pomocą cytometrii przepływowej

Pierwotna izolacja komórek groniastych, ekspresja białka lub modulacja aktywności, hodowla i dalsze zastosowania są bardzo przydatne w badaniach ex vivo metaplazji acinar-przewodowej (ADM), wczesnego zdarzenia w rozwoju raka trzustki.

Naśladowanie i manipulowanie metaplazją pęcherzowo-przewodową trzustki w trójwymiarowej hodowli komórkowej

Ten protokół wykorzystuje opartą na sondzie reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), test sulforodaminy B (SRB), klonowanie 3' nietranslowanych regionów (3' UTR) oraz test lucyferazy w celu weryfikacji docelowych genów interesującego miRNA i zrozumienia funkcji miRNA.

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Sok z trzustki jest cennym źródłem biomarkerów ludzkiego raka trzustki. Opisujemy tutaj metodę procedury pobrania śródoperacyjnego. Aby sprostać wyzwaniu polegającemu na zastosowaniu tej procedury w modelach mysich, sugerujemy alternatywną próbkę, płyn śródmiąższowy guza, i opisujemy tutaj dwa protokoły jego izolacji.

Izolacja płynów proksymalnych w celu zbadania mikrośrodowiska guza gruczolakoraka trzustki

Komórki metaplastyczne trzustki są prekursorami komórek nowotworowych, które powodują powstawanie guzów trzustki. Jednak wyizolowanie nienaruszonych żywotnych komórek trzustki jest trudne. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę dysocjacji tkanek trzustkowych. Komórki można następnie wykorzystać do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) lub do dwu- lub trójwymiarowej kohodowli.

Wypreparowanie tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek

Celem tego protokołu jest określenie poziomów autofagicznych w raku trzustki i komórkach groniastych trzustki poprzez immunofluorescencję LC3 i kwantyfikację kropek LC3.

Ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji LC3

Obecny protokół opisuje przeprogramowanie gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) i normalnych komórek nabłonka przewodowego trzustki na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Zapewniamy zoptymalizowaną i szczegółową procedurę krok po kroku, od przygotowania lentiwirusa do ustanowienia stabilnych linii iPSC.

Przeprogramowanie gruczolakoraka przewodowego trzustki na pluripotencję

Rak trzustki pozostaje jednym z najtrudniejszych nowotworów do leczenia. Dlatego tak ważne jest, aby modele przedkliniczne oceniające skuteczność leczenia były powtarzalne i istotne klinicznie. Protokół ten opisuje prostą procedurę kohodowli w celu wygenerowania powtarzalnych, klinicznie istotnych sferoid desmoplastycznych.

Hodowla desmoplastycznych trójwymiarowych sferoid raka trzustki z kokultury

Poznaj analizę ekspresji onkogenów w komórkach przewodowych trzustki przy zmniejszonym pH. Metoda RNA-seq ujawnia związek między kwaśnym środowiskiem a aktywnością onkogenów.

Analiza ekspresji onkogenów ze zmianami pH w linii komórek przewodowych trzustki

Przeglądaj więcej filmów