Analiza ekspresji onkogenów ze zmianami pH w linii komórek przewodowych trzustki

W szpitalach AIG badamy, w jaki sposób zmniejszone wydzielanie przewodowe trzustki i obniżone pH wpływa na ekspresję genów w komórkach przewodowych trzustki, szczególnie koncentrując się na onkogenach, badając możliwość adaptacji komórkowej do kwaśnych mikrośrodowisk. Wyzwaniem jest tutaj niejednorodność guzów trzustki, co komplikuje zarówno leczenie, jak i podejścia eksperymentalne. Przeprowadziliśmy więc analizę RNAC komórek przewodowych trzustki w warunkach obniżonego pH i stwierdziliśmy, że występuje zwiększona ekspresja trzech onkogenów, co podkreśla potencjalne powiązania między kwaśnym środowiskiem a ekspresją onkogenów w komórkach przewodowych trzustki.

Nasze badanie rzuciło światło na ekspresję onkogenu w warunkach obniżonego pH, a ten system może przyspieszyć nasze badania w badaniu gruczolakoraka przewodowego trzustki w warunkach zapalenia. Tak więc przyszłym celem tego badania jest ocena roli zwiększonej ekspresji onkogenów w inicjacji nowotworów w stanach zapalnych, takich jak przewlekłe zapalenie trzustki. Na początek zaopatrz się w ludzką normalną linię komórek przewodowych trzustki.

Rozmrozić komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Teraz przefiltruj świeżo przygotowane kompletne podłoże przez filtr strzykawkowy. Dodaj sześć mililitrów kompletnej pożywki do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Następnie przenieś rozmrożoną zawiesinę komórkową do probówki i dokładnie wymieszaj. Odwirować zawiesinę o stężeniu 1 800 G przez sześć minut. Odrzucić supernatant i dodać jeden mililitr pożywki hodowlanej do osadu przed delikatnym wymieszaniem.

Następnie dodaj cztery mililitry kompletnej pożywki do 60-milimetrowej szalki Petriego. Następnie odpipetować zawiesinę komórek kroplami do kolby. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% suplementacją dwutlenkiem węgla.

Aby zmienić pH pożywki hodowlanej, najpierw przygotuj 100 mililitrów 0,5-molowych roztworów buforowych fosforanu sodu o wartościach pH 6,0, 6,5 i 7,0. Sprawdź pH za pomocą pH-metru i dostosuj je za pomocą jednego molowego kwasu solnego lub jednego molowego wodorotlenku sodu. Następnie przefiltruj, wysterylizuj w okapie z laminarnym przepływem powietrza za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,45 mikrometra.

Następnie dodaj 20 mililitrów sterylnego 0,5-molowego buforu fosforanu sodu o odpowiednim pH do 80 mililitrów pożywki hodowlanej, aby przygotować pożywkę o różnym pH. Dodaj pożywkę o zmienionym pH do 85 do 90% zlewających się ludzkich komórek przewodowych trzustki. Obserwuj zmiany morfologiczne pod mikroskopem jasnego pola w odstępach godzinnych przez sześć godzin.

Aby wyizolować RNA z hodowli, najpierw odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać komórki jednym mililitrem PBS. Umieść 60-milimetrową miskę na lodzie, a następnie jeden mililitr PBS na 60-milimetrowej misce i zeskrob komórki skrobakiem do komórek. Teraz przenieś zawiesinę do świeżej tubki.

Odwirować go przy stężeniu 8 000 G przez 10 minut i odrzucić supernatant. Następnie dodaj 600 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego beta-merkaptoetanol do granulatu. Pipetować zawiesinę w górę i w dół przez pięć do 10 minut na lodzie.

Dodać równą objętość 70% etanolu do lizatu i odpipetować zawiesinę, aby dokładnie wymieszać. Przenieść roztwór do kolumny z membraną krzemionkową. Następnie odwirować kolumnę o stężeniu ponad 8 000 G przez 30 sekund i odrzucić przepływ.

Następnie dodać 500 mikrolitrów buforu płuczącego do próbki i ponownie odwirować. Wirować pustą probówkę przez jedną minutę przy stężeniu większym niż 8 000 G. Na koniec dodać do kolumny od 30 do 50 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej należy ponownie odwirować kolumnę z prędkościami wyższymi niż 8 000 G przez pięć minut.

Zaobserwowano znaczne zmniejszenie wielkości komórek i kurczenie się komórek ciągliwych w środowisku kwaśnym w porównaniu z komórkami utrzymywanymi w normalnym środowisku. Najbardziej wyraźne zmiany w śmierci komórki wystąpiły po sześciu godzinach inkubacji, z dalszym spadkiem liczby komórek i oznakami stresu komórkowego po 22 godzinach. Liczba genów o podwyższonej regulacji była najwyższa przy pH 6,5 z 148 genami, następnie pH 7 ze 109 genami i pH 6 z 90 genami.

Obniżona regulacja genów była mniejsza i wynosiła 20 przy pH 6, 14 przy pH 6,5 i 23 przy pH 7. Trzy onkogeny, LCK, FGR i ASAP trzy, były regulowane w górę na wszystkich badanych poziomach pH, co sugeruje rolę w proliferacji komórek w warunkach kwaśnych.