Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych
24 stycznia 2025
Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.
Nasze badania koncentrują się na badaniu funkcji dojrzałych adipocytów pochodzących z różnych magazynów tłuszczu i warunków żywieniowych. Jesteśmy szczególnie zainteresowani zrozumieniem, w jaki sposób dojrzałe adipocyty komunikują się z otaczającymi komórkami i jak ten przesłuch może wpływać na postęp choroby i być zmieniany w otyłości. Dojrzałe adipocyty są dużymi i delikatnymi komórkami, co sprawia, że powszechnie stosowane metody izolacji komórek, takie jak FACS, są nieskuteczne.
Co więcej, wysoki poziom wolnego lipidu, często występujący w tkance tłuszczowej, może być toksyczny dla dojrzałych adipocytów, komplikując ich utrzymanie. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanych metod, które opierają się na różnicowaniu preadipocytów in vitro, ten protokół pozwala nam badać adipocyty izolowane ex vivo, które funkcjonalnie i transkrypcyjnie są podobne do adipocytów in vivo. Jest to szczególnie ważne, ponieważ adipocyty różnią się znacznie w zależności od magazynu tłuszczu i w różnych warunkach diety.
Protokół ten skutecznie izoluje, odzwierciedlając dojrzałe adipocyty i jest łatwo skalowalny. Uwzględniono korekty w celu optymalizacji izolacji adipocytów od myszy różnej płci i z różnymi warunkami żywieniowymi. Po wyizolowaniu adipocyty mogą być hodowane, obrazowane lub w inny sposób wykorzystywane w razie potrzeby.
Na początek przygotuj roztwór kolagenazy z DNazą, dodając 0,00017 grama DNazy na jeden mililitr roztworu kolagenazy i wymieszaj mieszaninę, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Za pomocą żyletki zmiel izolowaną tkankę tłuszczową myszy, aż stanie się jednorodna. Następnie przenieś tkankę mieloną do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.
Dodaj przygotowany roztwór kolagenazy i DNazy do zmielonej tkanki tłuszczowej i wiruj z maksymalną prędkością przez siedem do 10 sekund, aby dokładnie wymieszać składniki. Następnie umieść 50-mililitrowe stożkowe rurki poziomo w wytrząsarce ustawionej na 220 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut. Po inkubacji wyjmij probówki, wiruj przez pięć sekund i sprawdź próbki.
Teraz za pomocą pipety serologicznej przełóż strawioną tkankę przez sito do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj FBS równy objętości tkanki i roztworu kolagenazy przez sito do tej samej stożkowej probówki, aby zneutralizować kolagenazę. Wirować probówki pod ciśnieniem 300 G przez trzy minuty w temperaturze określonej w przedstawionej tutaj tabeli.
Następnie za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów ostrożnie wyrzuć górną warstwę wolnych lipidów. Następnie użyj pipety P1000 z odciętą końcówką, aby przenieść dojrzałe adipocyty do przygotowanej 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów pożywki wzrostowej. Delikatnie odwróć 15-mililitrowe probówki zawierające dojrzałe adipocyty trzy do pięciu razy, aż biała warstwa rozproszy się po pożywce.
Po odstawieniu rurek przez 10 minut, należy je obrócić w ustalonej wcześniej temperaturze, aby jeszcze bardziej rozdzielić warstwy. Następnie użyj pipety, aby wyrzucić górną warstwę wolnych lipidów. Teraz przymocuj igłę o rozmiarze 21 do pięciomililitrowej strzykawki i ostrożnie przesuń igłę w dół krawędzi rurki, aż spód igły znajdzie się poniżej warstwy miejsca dojrzałych adipocytów.
Następnie powoli pociągnij strzykawkę do góry, aby usunąć pożywkę hodowlaną i wszelkie zanieczyszczenia komórkowe. Delikatnie dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej do probówki. Za pomocą końcówek do pipet z wkładem żelowym Przesuń końcówkę w dół krawędzi probówki, aby usunąć pozostałą pożywkę spod warstwy dojrzałych adipocytów.
Następnie odwirować komórki o sile 100 G przez jedną minutę. Za pomocą pipety usuń wolne lipidy. Za pomocą końcówki pipety ładującej żel usuń pożywkę hodowlaną poniżej adipocytów.
Wyjmij wkładki do hodowli komórkowych z 24-dołkowej płytki poddanej hodowli tkankowej i umieść je membraną do góry na powierzchni kaptura. Napełnij naprzemienne dołki płytki ciepłymi pożywkami hodowlanymi. Za pomocą przeciętej końcówki pipety P200 przenieś 30 mikrolitrów upakowanych dojrzałych adipocytów na wierzch wkładki Transwell.
Następnie ostrożnie podnieś wkładkę Transwell, odwróć ją i umieść w wstępnie napełnionej studzience w 24-dołkowej płytce. Aby usunąć pożywkę z dołków, trzymaj wkładkę Transwell stabilnie i zasysaj pipetą P200 przez małe otwory po bokach. Po wyjęciu pożywki, nadal trzymając Transwell na miejscu, powoli dodaj jeden mililitr świeżego podłoża wzdłuż bocznej ściany studni.
Przegląd
Niniejsze badanie podejmuje problem izolacji dojrzałych adipocytów z różnych depotów tłuszczowych w zależności od warunków dietetycznych. Przedstawiono w nim skalowalny protokół umożliwiający analizę funkcjonalną tych delikatnych komórek, które są kluczowe dla zrozumienia ich roli w otyłości i innych chorobach.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia adipocytów
- Badania nad otyłością
- Techniki izolacji komórek
Wstęp
- Dojrzałe adipocyty są duże i kruche
- Standardowe metody izolacji są często nieskuteczne
- Charakterystyka depot tłuszczowych różni się w zależności od wpływu diety
Zastosowane metody
- Izolacja dojrzałych adipocytów z wykorzystaniem kolagenazy i DNazy
- Model badania ex vivo z wykorzystaniem komórek mysich
- Skalowalny protokół możliwy do dostosowania do różnych warunków dietetycznych i płci
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja dojrzałych adipocytów odzwierciedlających charakterystykę in vivo
- Zoptymalizowana metodologia dla różnych tkanek tłuszczowych
- Protokół umożliwia dalszą hodowlę i obrazowanie na potrzeby badań funkcjonalnych
Wnioski
- Badanie dostarcza wiarygodnego protokołu do badań nad adipocytami
- Zwiększa zrozumienie funkcji adipocytów w zdrowiu i chorobie
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna izolacja i hodowla pierwotnych adipocytów mysich z modeli szczupłych i otyłych rozwiązuje krytyczny problem w badaniach nad chorobami metabolicznymi i walidacją celów terapeutycznych. Niniejszy protokół umożliwia funkcjonalną analizę biologii adipocytów, wspierając mechanistyczne ograniczanie ryzyka oraz ciągłość translacyjną w modelach chorób wywołanych otyłością. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych fazach odkrywania leków oraz w programach przedklinicznych skoncentrowanych na funkcji tkanki tłuszczowej i sygnalizacji endokrynnej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcjonalną dojrzałych adipocytów z różnych depotów tłuszczowych i stanów dietetycznych.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez zachowanie profili transkrypcyjnych i funkcjonalnych zbliżonych do warunków in vivo.
- Ułatwia testowanie hipotez dotyczących mechanizmów chorobowych napędzanych przez adipocyty oraz interakcji międzykomórkowych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celów w badaniach nad metabolizmem i endokrynologią.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane pierwotne układy adypocytów do dalszych testów kokultury i lipolizy.
- Umożliwia powtarzalne przygotowanie pożywki warunkowanej adypocytami do analizy sekretomu.
- Wspiera standaryzację i skalowalność testów w modelach osób szczupłych i otyłych, mężczyzn i kobiet.
- Przygotowuje stabilne platformy do przesiewania związków i odczytów funkcjonalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wyników in vitro z biologią tkanki tłuszczowej istotną dla przebiegu choroby w modelach przedklinicznych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację interwencji ukierunkowanych na adipocyty.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez odwzorowanie funkcji adipocytów in vivo.
- Ułatwia odkrywanie biomarkerów dzięki analizie czynników wydzielanych przez adipocyty.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając analizę funkcji adipocytów ex vivo, co wspiera zarówno walidację celów terapeutycznych, jak i badania translacyjne w ramach opracowywania leków na choroby metaboliczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie mechanizmów roli adipocytów w chorobach.
- Screening: Zapewnia powtarzalne preparaty adipocytów, specyficzne dla depotu i diety, do opracowywania testów.
- Analityka: Dostarcza wyników ilościowych dla badań nad lipolizą, ko-kulturą i sekretomem.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro i in vivo w celu dostosowania do modeli przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalny, adaptowalny protokół dla różnorodnych programów badawczych w zakresie metabolizmu i endokrynologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach chorób napędzanych przez adipocyty.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację i hodowlę w zależności od płci, depotu oraz warunków dietetycznych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie wiarygodnych decyzji typu go/no-go oraz efektywne pod względem kapitałowym sortowanie portfela w badaniach nad metabolizmem.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów terapeutycznych celujących w adipocyty z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymagana jest wiedza z zakresu izolacji pierwotnych komórek oraz obchodzenia się z kruchymi adipocytami.
- Niezbędny jest dostęp do infrastruktury hodowli tkankowej i specjalistycznych narzędzi do pipetowania.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności w różnych modelach i warunkach.
- Metoda jest możliwa do zastosowania zarówno w modelach mysich szczupłych, jak i otyłych, u osobników obu płci.
- Ograniczenia obejmują delikatną naturę dojrzałych adipocytów oraz potencjalną toksyczność lipidów podczas procesu izolacji.
