Wysokoprzepustowy pomiar mechanotypu komórkowego metodą cytometrii przepływowej w oparciu o pęknięcie i dostarczenie sond napięcia DNA do komórek
13 czerwca 2025
Ta metoda mierzy skłonność komórki do pękania unieruchomionych dupleksów DNA prezentujących ligand, aby zgłosić względne siły przyciągania komórkowego. Pęknięte oligonukleotydy fluorescencyjne są dostarczane do komórki i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, rejestrując historię mechaniczną komórki. Pozwala to na wysokoprzepustowy pomiar generowania siły komórkowej w kontekście mechanofentypowania komórkowego.
Nasze laboratorium generalnie bada mechanizmy molekularne wykorzystywane przez komórki do przekazywania bodźców mechanicznych. Ostatnio opracowujemy wysokoprzepustowe metody pomiaru sił, jakie komórki wywierają na swoje otoczenie, aby wprowadzić mechanobiologię w erę omiki. Badania wskazują na wpływ sił mechanicznych na to, jak limfocyty T są aktywowane przez właściwy antygen i jak komórki macierzyste różnicują się w wyspecjalizowane typy komórek.
Ostatnio ukierunkowanie na procesy leżące u podstaw rozregulowanej mechaniki komórkowej doprowadziło do opracowania mechanoterapeutyków jako metody leczenia chorób. Czujniki DNA duplex i hairpin mierzą siły zewnątrzkomórkowe, podczas gdy czujniki kodowane genetycznie umożliwiają pomiary wewnątrzkomórkowe. Prawie wszystkie wymagają wysokiej klasy mikroskopów.
Mikroskopia sił trakcyjnych może mierzyć siłę, jaką komórki wywierają na otoczenie, ale również obejmuje obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. W tej pracy zajmujemy się trzema wyzwaniami w tej dziedzinie, po pierwsze, wykorzystując cytometrię przepływową do pomiaru siły zamiast obrazowania, po drugie, wykorzystując technologię znaczników HOH do dołączania ligandów i przeciwciał do sond DNA, a po trzecie, wykorzystując standardowe płytki do hodowli komórkowych bez specjalnej obróbki powierzchni. W jaki sposób zmiany sił generowanych przez komórkę mogą być wykorzystane jako marker prognostyczny stanu choroby i czy te siły przyczyniają się do tego stanu chorobowego, czy też są wtórnym efektem tego stanu chorobowego?
Na początek zmontuj dupleksy w stosunku 1,1 do jednego mola nici kotwicznej z wygaszaczem do nici ligandowej z fluoroforem. Przygotować dupleksy o końcowym stężeniu 40 mikromolowych pasm liganda w roztworze. Aby wyżarzać zmontowane dupleksy, inkubuj je w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Następnie pozwól mieszaninie ostygnąć w temperaturze pokojowej przez godzinę z dala od światła. Żarzone dupleksy należy reagować z HUH, stosując stężenie najmniej obfitego pasma z etapu wyżarzania, którym w tym przypadku jest nić liganda. Wymieszać dupleksy z HUH w stosunku od jednego do dwóch molowców przy końcowym stężeniu 10 mikromolowym dupleksu i 20 mikromolowym HUH.
Inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w termocyklerze lub bloku grzewczym chronionym przed światłem. Po inkubacji usuń reakcję z ciepła i użyj mini wirówki stołowej, aby odkręcić obecnie zmontowane linki napinające lub TGT. Gdy TGT odpowiednio przylegają, umyj studzienki żądanymi komórkami trzykrotnie PBS.
Następnie wykonaj dwa płukania przy użyciu pożywki bez surowicy i pozostaw pożywkę w studzienkach po ostatnim płukaniu. Dodaj 200 mikrolitrów PBS do studzienek obwodowych, aby złagodzić efekty krawędziowe. Przenieś płytkę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wstępnie ją podgrzać.
Następnie pobierz interesujące Cię komórki przy około 80% zbieganiu. Odessać pożywkę, a następnie umyć komórki PBS i inkubować komórki z trypsyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki się rozdysocjują, co zajmuje około pięciu do 10 minut. Po dysocjacji komórek dodaj oryginalną objętość kompletnego podłoża komórkowego używanego do utrzymania komórek.
Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety serologicznej i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować komórki w temperaturze 300 G przez cztery minuty. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w PBS.
Po powtórzeniu wirowania ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach pożywki bez surowicy i ponownie odwiruj. Odessać i ponownie zawiesić komórki w około dwóch mililitrach pożywki bez surowicy. Określ gęstość ponownie zawieszonych komórek, aby dostosować stężenie zgodnie z potrzebami.
Opcjonalnie, w przypadku testowania działania leku, dodaj odpowiednie stężenie leku do komórek i zwróć komórki do inkubatora na czas wstępnej inkubacji przed kontynuowaniem. Teraz wyjmij oryginalną płytkę z inkubatora i usuń pozostałości pożywki pozostałe po płukaniu w dołkach doświadczalnych. Umyj studzienki raz żądanym medium i odpipetuj 100 mikrolitrów zawieszonych komórek do żądanych studzienek.
Przenieś posiane komórki do inkubatora na 90 minut. Po inkubacji usuń około 125 do 170 mikrolitrów objętości z każdej studzienki. W razie potrzeby delikatnie umyj komórki 200 mikrolitrami podgrzanego PBS.
Następnie inkubuj komórki w każdej studzience z 50 mikrolitrami trypsyny, aż komórki zaczną dysocjować, co zajmuje około pięciu do 10 minut. Następnie dodaj 160 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu przepływowego do każdej studzienki. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby oddzielić komórki.
Przenieś 196 mikrolitrów tej zawiesiny komórkowej do probówek PCR, dodaj cztery mikrolitry jodku propidyny i delikatnie wymieszaj. Na koniec umieść probówki w pojemniku na lód z pokrywką blokującą światło i zmierz intensywność fluorescencji za pomocą cytometru przepływowego. Bramkowanie metodą cytometrii przepływowej potwierdziło pomyślną izolację żywych pojedynczych komórek, zapewniając dokładną analizę mechanotypu.
Bramkowanie kontroli ujemnej, ustawione na 99. percentylu fluorescencji Cy5-A, stanowiło punkt odniesienia dla porównania warunków eksperymentalnych. Komórki CHO-K1 traktowane Y27632 wykazały znaczny spadek odsetka komórek przekraczających bramkę kontroli ujemnej przy ścinaniu TGT, podczas gdy rozpinanie TGT wykazywało tylko niewielki i statystycznie nieistotny spadek. Rozpinanie TGT konsekwentnie skutkowało wyższym odsetkiem komórek przekraczających kontrolę ujemną w porównaniu ze ścinaniem TGT, co potwierdza ich mniejsze zapotrzebowanie na siłę.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia metodę pomiaru skłonności komórki do pękania unieruchomionych wiązań DNA, które przekazują informacje o względnych siłach ścinających komórek. Podejście to pozwala na wysokowydajne pomiary wytwarzania sił komórkowych, przyczyniając się do rozwoju dziedziny mechanobiologii.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Mechanobiologia
- Mechanika komórki
- Techniki pomiarowe wysokiej wydajności
Tło
- Komórki przekazują bodźce mechaniczne za pomocą różnych mechanizmów molekularnych.
- Rozumienie sił komórkowych jest kluczowe dla wnikliwego zrozumienia aktywacji limfocytów T i różnicowania komórek macierzystych.
- Mechanoterapeutyki są opracowywane w celu leczenia chorób związanych z dysregulacją mechaniki komórkowej.
- Do tych pomiarów zazwyczaj potrzebne są wysokiej klasy mikroskopy.
Cel badania
- Rozwój metod wysokiej wydajności do pomiaru sił komórkowych.
- Poszerzenie rozumienia mechanobiologii w kontekście omików.
- Zbadanie implikacji sił mechanicznych w procesach komórkowych.
Stosowane metody
- Pomiar sił pozakomórkowych za pomocą wiązań DNA duplex i hairpin.
- Wykorzystanie genetycznie zakodowanych czujników do pomiarów wewnątrzkomórkowych.
- Analiza cytometria przepływowa pękniętych fluorescencyjnych oligonukleotydów.
- Techniki wysokiej wydajności do oceny sił ścinających komórek.
Główne wyniki
- Skuteczna pomiar wytwarzania sił komórkowych.
- Wgląd w historię mechaniczną komórek.
- Demonstracja przydatności metody w mechanofenotypowaniu.
- Potencjał dla postępu rozwoju mechanoterapeutyki.
Wnioski
- Metoda zapewnia nowatorskie podejście do badania mechaniki komórkowej.
- Poprawia zrozumienie, w jaki sposób komórki współdziałają ze swoim środowiskiem.
- Badania te mogą prowadzić do nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na mechanikę komórkową.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput flow cytometry measurement of cellular mechanotype using DNA tension probes enables scalable quantification of cell-generated forces, addressing a key bottleneck in mechanobiology-driven drug discovery. This approach supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for diseases where cell mechanics are disrupted. Integrating force measurement into early discovery pipelines enhances portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cellular force generation as a functional biomarker.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing primary versus secondary effects in disease models.
- Facilitates target validation for mechanotherapeutic strategies by linking force phenotypes to molecular interventions.
Screening & Assay Development
- Provides a high-throughput, flow cytometry-based readout for scalable mechanotype screening.
- Standardizes force measurement across cell types and conditions using DNA tension probes.
- Enables reproducible, quantitative outputs suitable for compound evaluation and assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanotype measurements with disease-relevant cellular phenotypes for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling force-based phenotypic screening.
- Improves predictive value for mechanotherapeutic candidate selection in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions cellular force quantification at the intersection of early discovery, lead identification, and preclinical research, enabling mechanotype-based triage and mechanistic insight throughout the pipeline.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the role of mechanical forces in disease-relevant pathways.
- Screening: Delivers standardized, high-throughput force readouts for compound and genetic perturbation screens.
- Analytics: Provides quantitative, flow cytometry-based measurements for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by linking mechanotype to disease state and therapeutic response.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for force measurement across diverse cell types and experimental systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mechanotype assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by integrating force phenotyping into early R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanotherapeutic programs based on quantitative force data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and DNA probe design for assay setup and data interpretation.
- Needs access to standard flow cytometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of gating strategies and negative control thresholds.
- Adaptable to various cell types and experimental conditions with appropriate probe and ligand selection.
- Dependent on robust statistical analysis to distinguish mechanotype shifts across experimental groups.
