Name: Generowanie hodowli pierwotnych do obrazowania żywych komórek keratinocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj metodę hodowli pierwotnych keratynocytów do obrazowania żywych komórek. Protokół umożliwia izolację komórek z świeżej tkanki i ich kulturę w warunkach zapewniających żywotność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została wsparta przez Merit Review Award Number I01 CX001816 od Stanów Zjednoczonych (USA) Służba Badań i Rozwoju (CSRD) Departamentu ds. Weteranów. Treść nie odzwierciedla poglądów Departamentu ds. Weteranów USA ani rządu Stanów Zjednoczonych. Szczególne podziękowania dla T. Richarda Parenteau, MD/PhD, oraz Alexandry Charruyer, PharmD/PhD, za naukę hodowli keratinocytów. Dziękujemy dr Merisie Piper za dostarczenie nam próbek do izolacji keratynocyta. Na koniec podziękowania dla dr Michaela Rosenbluma za umożliwienie nam dostępu do jego systemu obrazowania komórek na żywo, aby dokończyć eksperymenty.

Na wykorzystanie tkanek ludzkich wymagana jest zgoda Komitetu ds. Badań Ludzkich instytucji. Próbki ludzkie do badań często pozyskuje się z komercyjnych źródeł (na przykład ATCC, technologii komórek Lifeline oraz Zen-Bio). Nasze badania wykorzystują odrzuconą tkankę podczas operacji lub pobrane próbki biopsji skóry specjalnie do celów badawczych. W takich sytuacjach wymagana jest odmienna zgoda i procedury uzyskania zgody. Wszystkie tkanki są pobierane po zatwierdzeniu przez Komisję ds. Badań Ludzkich UCSF, wykorzystując pisemną świadomą zgodę i zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej.
1. Oddzielenie naskórka od skóry
<ol>
	<li>Upewnij się, że uzyskano odpowiednie zgody na wykorzystanie ludzkiej tkanki do badania.</li>
	<li>Pobierz próbkę skóry i przetransportuj ją w izolowanym pojemniku z okładem z lodu. Umieść próbkę w pożywce zawierającej 5-krotną koncentrację penicyliny, streptomycyny i amfeterycy. UWAGA: Wymagana ilość zależy od zastosowania. Z naszego doświadczenia wynika, że około 1 000 000 keratynocytów nacm2 pochodzi ze skóry dorosłych i starszych. Jednak może się to znacznie różnić w zależności od próbki.<ol>
		<li>Umieść napletek noworodka w pożywce komórkowej i rozpocznij procedurę izolacji keratinocytów nie później niż 48 godzin po obrzezaniu, aby zminimalizować śmierć komórek. Przechowuj tkankę w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia. Przetwarzanie próbek dorosłych i starszych zazwyczaj rozpoczyna się w ciągu kilku godzin od pobrania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj dostęp do szafy biobezpieczeństwa z wyposażeniem poziomu BS2, zaprojektowaną do pracy z czynnikami powodującymi choroby przez spożycie, ekspozycję błon śluzowych lub przezskórną7. Upewnij się, że szafka bezpieczeństwa biologicznego jest sterylizowana UV przez co najmniej 15 minut oraz że wszystkie powierzchnie są spryskane alkoholem 70% przed użyciem.</li>
	<li>Załóż rękawiczki, spryskaj pojemnik 70% alkoholem i włóż pojemnik do okapu oparowego. Umieść podkładkę chłodzącą pod tkanką, aby zapobiec jej nagrzewaniu się do temperatury pokojowej i zachować jej integralność. Jeśli tkanka jest bardzo duża, odetnij część do obróbki, a resztę trzymaj wilgotną w pojemniku do zbierania. UWAGA: Ponieważ wiele starych okazów to duże skóry brzucha lub piersi po operacjach, cięcie i przetwarzanie tkanek zajmuje trochę czasu. Tkanka nigdy nie powinna być nakładana bezpośrednio na podkładkę, ponieważ ekstremalne zimno może spowodować jej zamarznięcie. Zamiast tego powinien być umieszczony na powierzchni pośredniej, takiej jak marmurowa płyta.</li>
	<li>Umieść w kapturze dwie szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm oraz sterylny skalpel chirurgiczny #23.</li>
	<li>Otwórz szalki Petriego i umieść je na powierzchni szafki tak, aby wewnętrzne powierzchnie każdej misy były skierowane do góry. Dodaj 10 ml 10% chlorheksydyny glukonianu do jednej z szalek Petriego. Dodaj 10 ml 5x penicyliny/streptomycyny/amfeteryny/gentamycyny w roztworze Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; 5x) do 2 innych połówek szalki Petriego (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotuj płytkę z 6 dołkami do etapu Dispase. Do tkanek noworodkowych należy stosować 3 ml Dispase na dołek. Do próbek tkanek starzonych użyj 4 mL. Stosowanie niewystarczającej ilości Dispase dla objętości tkanek może utrudniać oddzielenie naskórka od skóry.</li>
	<li>Użyj skalpela, aby pociąć tkankę na mniejsze kawałki, aby lepiej przeniknęła ją Dispase. Dyspas przenika tylko do 5 mm od krawędzi tkanki, dlatego tnij długie paski tkanki o szerokości 0,5-1 cm. Jeśli nie zostanie przycięta wystarczająco na drobno, nie nastąpi oddzielenie naskórka od skóry skórnej.<ol>
		<li>Tnij grubszą tkankę na mniejsze kawałki. Pokrój napletek noworodka na 3 lub 4 części (~5 mm x 7 mm). Używaj maksymalnie dwóch całych napletków na dołek Dispase. Powierzchowne płaty brzuszne są zazwyczaj znacznie cieńsze, z minimalną lub żadną tkanką podskórną, pociń je na dłuższe paski (~5 mm x 15 mm).</li>
		<li>Umieść maksymalnie cztery paski na studnię Dispase. Jeśli pobrana tkanka zawiera dużo tłuszczu podskórnego, przytnij tkankę podskórną, aby pomóc Dispase w pełni przeniknąć tkankę. Jeśli tkanka zostanie przecięta zbyt mało, może być potrzebne zastosowanie mikroskopu rozcinającego, aby określić, która strona jest naskórna, a która skórna, podczas odklejania naskórka. Uszkodzenie niewłaściwej strony skóry może spowodować dodatkowe urazy tkanek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść stronę naskórną tkanki w pierwszej szalce Petriego przygotowanej w kroku 1.6, zawierającej 10% glukonianu chlorheksydyny, przez 10-20 sekund. Następnie przenieś stronę naskórną tkanki do drugiej szalki Petriego, zawierającej 5x penicyliny/streptomycyny/amfoceryny (PSA) z HBSS, i mieszaj przez 10-20 sekund. Przenieś stronę naskórną tkanki do trzeciej szalki Petriego, ponownie zawierającej 5x PSA z HBSS, i pomieszaj przez kolejne 10 sekund. Przetwarzanie wielu próbek tym samym roztworem jest akceptowalne.</li>
	<li>Przenieś stronę naskórną tkanki na 6-dołkową płytkę Dispase przygotowaną w kroku 1.7. UWAGA: Polecamy stronę epidermalną na naszej konwencji. Inne protokoły zalecają obniżenie skóry skórnej8. Nie wszystkie Dispase są równie skuteczne. Złuszczanie naskórka od starzejącej się skóry okazało się wyzwaniem przy niektórych produktach, nawet w stężeniach przekraczających 4x zalecany przez producenta. Spowodowało to utratę czasu i okazów. Firmy używają niestandaryzowanych jednostek dla Dispase, co utrudnia rozpoznanie, jak różnią się stężenia między markami. Ze względu na te wyzwania zaleca się stosowanie jednej z marek Dispase wymienionych w Tabeli Materiałów .</li>
	<li>Oznacz płytkę z 6 dołkami zawierającą Dispase i próbki, a następnie przenieś do 4 °C. Inkubuj próbki noworodków przez 16-18 godzin w Dispase oraz próbki dorosłych/starszych przez 24 godziny. UWAGA: Istnieje alternatywny protokół 2 godzin, który można stosować dla próbek, gdzie próbka jest umieszczana w fazie dyspozycyjnej w 37 °C przez 2 godziny, a następnie naskórek jest obierany. Niestety, nie zawsze się to sprawdza, a integralność tkanki może zostać osłabiona po inkubacji, co skutkuje utratą próbki. Inkubacja nocna jest preferowana, gdy tylko jest to możliwe.</li>
</ol>
2. Izolacja keratynocytów
<ol>
	<li>Umieść 0,05% Trypsin-EDTA (lub TrypLE), roztwór neutralizujący trypsynę oraz podłoże keratinoctowe w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C 20 minut przed rozpoczęciem kolejnych kroków</li>
	<li>Wyjmij płytkę z 6 dołkami z temperatury 4 °C, spryskaj ją 70% etanolem i umieść w przygotowanej szafce na zabezpieczenia biologicznego (patrz krok 1.3).</li>
	<li>Umieść sterylne i bezząbkowe kleszcze w stożkowej rurce 50 mL zawierającej 20 mL etanolu 70%. Jeśli na początku jesteś poza maską, spryskuj kleszczem 70% etanolu przed włożeniem do maski.</li>
	<li>Używając chemicznie sterylizowanych kleszczy, chwyć kawałek tkanki i połóż go na sterylnej powierzchni naskórkiem do góry (użyj szalki Petriego lub wnętrza górnej połowy płytki z 6 dołkami). Trzymaj skórną część tkanki za pomocą ząbkowanych kleszczy za pomocą niedominującej ręki i jednocześnie mocno chwyć naskórek nieząbkowymi kleszczami i ściągnij ją od krawędzi do krawędzi. Powinno wyjść gładko jak jedna całość.</li>
	<li>Umieść naskórek na wewnętrznej stronie wargi stożkowej rurki o pojemności 15 mL. Każda stożkowa rurka o pojemności 15 mL powinna mieć naskórek składający się maksymalnie z dwóch napletków.<ol>
		<li>Pracuj efektywnie; jeśli tkanka wyschnie, wydajność zostanie osłabiona. Jeśli Dispase nie przeniknął właściwie do tkanki, może wystąpić trudności z odklejeniem naskórka. W takim przypadku oderwij lub zeskrobaj naskórek z podskórnej skóry. To również skutkuje znacznie niższym plonem i nie jest zalecane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 4 mL 0,05% trypsyny-EDTA do stożkowej probówki o pojemności 15 mL, a następnie zamknij i odwróć rurkę, aby upewnić się, że cała naskórka jest zawieszona w trypsinie, a nie przyklejona do boku tubki/pokrywki. Umieść w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut. Pobudzaj komórki co 2 minuty ręcznie. UWAGA: Trypsynizacja przez więcej niż 10 minut może skutkować niższą wydajnością komórek. Jeśli niepokój dotyczy integralności białek powierzchniowych komórek, należy stosować TrypLE, ponieważ jest bardziej specyficzny dla miejsca rozszczepienia, co powoduje mniejsze uszkodzenia komórek i wykazano, że nie zmniejsza istotnie ekspresji antygenów powierzchniowych w porównaniu z Trypsin-EDTA9. Ponadto kąpiel wodna jest częstym źródłem zanieczyszczenia, dlatego dbaj o jej regularne czyszczenie. Regularnie wymieniaj wodę z wodą dejonizowaną zawierającą roztwór aquaguard-2.</li>
	<li>Włóż stożkową probówkę o pojemności 50 ml do szafki zabezpieczeń biologicznych. Odkręć pokrywkę i umieść sitko ogniwa 100 μm na otworze stożkowej rurki.</li>
	<li>Wyjmij stożkową probówkę o pojemności 15 mL zawierającą strawioną próbkę z kąpieli wodnej, dokładnie wysusz i spryskuj alkoholem 70% przed ponownym umieszczeniem jej w szafce zabezpieczeń biologicznych. Stukaj stożkową rurką 3 razy w powierzchnię okapu, a potem odwróć 6 razy. Powtarzaj cykl stukania i odwracania 3 razy.</li>
	<li>Dodaj 6 ml roztworu neutralizującego trypsynę do stożkowej rurki. Przelej przez sitko do 50 mL stożkowej rurki od kroku 2,7.</li>
	<li>Przepłucz stożkową probówkę o pojemności 15 mL z próbką 5 ml roztwórów neutralizujących trypsynę (TNS). Przelej przez sitko do komórki do stożkowej rurki o pojemności 50 mL. Wiruj w 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Natychmiast wyjmij z wirówki i pipetuj supernatant, aby zapobiec utracie komórek do medium. Powinien pozostać tylko granulek z niewielką ilością płynu. Może być trudno dostrzec granulkę z mniejszych próbek tkanek. UWAGA: W supernatancie obecna jest trypsyna, dlatego najlepiej usunąć jej jak najwięcej, nie tracąc przy tym granulatu.</li>
	<li>Ponownie zawiesij pellet keratinocytów w 2 mL podłoża keratinocytowego. UWAGA: Są tu dwie kwestie. Po pierwsze, jakich mediów użyć. W tym celu zaleca się stosowanie medium bez surowicy bez kolagenu. Historycznie standardem hodowli komórek keratinocytów był Zmodyfikowany Medium Orła (DMEM) Dulbecco +10% płodowej surowicy bydła (FBS) + F-12 Hama na warstwie fibroblastowej (3t3-J2s)10. Jednak wraz z pojawieniem się mediów wolnych od surowicy i dostępnością kolagenu, wiele innych możliwości pozostaje realnych (zobacz dyskusję)11. Drugą kwestią jest to, czy stosowanie antybiotyków w pożywce hodowlowej jest odpowiednie do obrazowania żywych komórek. To zależy od czasu trwania obrazowania oraz doświadczenia z systemem obrazowania. Kolonie są obrazowane przez kilka tygodni za pomocą wspólnego systemu obrazowania, co sprawia, że stosowanie antybiotyków jest preferowanym rozwiązaniem mimo potencjalnego wpływu na hodowle (patrz dyskusja). Podczas rezawiesji stosuje się penicylinę, streptomycynę, amfotericynę B oraz keratynocyny zawierające gentamynę, a po początkowej zmianie podłoża na nośnik zawierający penicylinę/streptomycynę. Metoda ta skutecznie zapobiegła skażeniu podczas długotrwałego obrazowania żywych komórek.</li>
	<li>Policz komórki i zasiewaj płytkę (zobacz dyskusję na temat wyboru gęstości siewu). Aby zapewnić równomierny rozkład nasiew, przed powlekaniem ponownie zawiesij komórki keratynocytów w całkowitej ilości podłoża do pokrycia. Po delikatnym poruszeniu przez inwersję lekko przewij przez 1-2 sekundy i wybierz płytę. Następnie przesuwaj mikropłytkę w wzorze krzyżowym (góra-dół, lewo-prawo) 3 razy w inkubatorze.</li>
	<li>Po 24 godzinach umieść płytkę w inkubatorze systemu obrazowania żywych komórek. Wykonuj obrazowanie komórek na żywo 10 razy, z obrazami robionymi co 20 minut. Umieszczaj próbki w temperaturze 37 °C i 5%CO2 w inkubatorze podłączonym do mikroskopu.</li>
</ol>

<ol><li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes%3A+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> Int J Mol Med. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li>
<li>Handl, J., Čapek, J., Majtnerová, P., Báčová, J., Roušar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+repeated+passaging+on+the+susceptibility+of+human+proximal+tubular+HK-2+cells+to+toxic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Phy+Res+Aca+Sci+Boh%22%5BJournal%5D)">The effect of repeated passaging on the susceptibility of human proximal tubular HK-2 cells to toxic compounds.</a> Phy Res Aca Sci Boh. 69 (4), 731-738 (2020).</li>
<li>Xiao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+cell+cycle+duration+is+a+phenotype+of+human+epidermal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+The%22%5BJournal%5D)">Short cell cycle duration is a phenotype of human epidermal stem cells.</a> Stem Cell Res The. 15 (1), 76(2024).</li>
<li>Noujarède, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipid+paracrine+signaling+impairs+keratinocyte+adhesion+to+promote+melanoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Sphingolipid paracrine signaling impairs keratinocyte adhesion to promote melanoma invasion.</a> Cell Rep. 42 (12), 113586(2023).</li>
<li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image-based+dynamic+high-throughput+analysis+of+adherent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-prol%22%5BJournal%5D)">An image-based dynamic high-throughput analysis of adherent cell migration.</a> Bio-prol. 11 (6), e3957(2021).</li>
<li>Chapman, S., McDermott, D. H., Shen, K., Jang, M. K., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Rho+kinase+inhibition+on+long-term+keratinocyte+proliferation+is+rapid+and+conditional%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+The%22%5BJournal%5D)">The effect of Rho kinase inhibition on long-term keratinocyte proliferation is rapid and conditional.</a> Stem Cell Res The. 5 (2), 60(2014).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+microbiological+and+biomedical+laboratories%22">Biosafety in microbiological and biomedical laboratories</a>. , 6th edition, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. USA. (2020).</li>
<li>Poumay, Y., Roland, I. H., Leclercq-Smekens, M., Leloup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+detachment+of+the+epidermis+using+dispase%3A+tissue+spatial+organization+and+fate+of+integrin+alpha+6+beta+4+and+hemidesmosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inv+Der%22%5BJournal%5D)">Basal detachment of the epidermis using dispase: tissue spatial organization and fate of integrin alpha 6 beta 4 and hemidesmosomes.</a> J Inv Der. 102 (1), 111-117 (1994).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22CellTra%22%5BJournal%5D)">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> CellTra. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Rheinwald, J. G., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+cultivation+of+strains+of+human+epidermal+keratinocytes%3A+the+formation+of+keratinizing+colonies+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells.</a> Cell. 6 (3), 331-343 (1975).</li>
<li>Boisseau, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+epidermal+sheets+in+a+serum+free+culture+system%3A+a+further+appraisal+of+the+role+of+extracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Der+Sci%22%5BJournal%5D)">Production of epidermal sheets in a serum free culture system: a further appraisal of the role of extracellular calcium.</a> J Der Sci. 3 (2), 111-120 (1992).</li>
<li>Roshan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+have+two+interconvertible+modes+of+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes have two interconvertible modes of proliferation.</a> Nat Cell Bio. 18 (2), 145-156 (2016).</li>
<li>Nanba, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR-mediated+epidermal+stem+cell+motility+drives+skin+regeneration+through+COL17A1+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">EGFR-mediated epidermal stem cell motility drives skin regeneration through COL17A1 proteolysis.</a> J Cell Bio. 220 (11), e202012073(2021).</li>
<li>Ścieżyńska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Der%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Der. 28 (2), 107-112 (2019).</li>
<li>Guo, A., Jahoda, C. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+human+keratinocyte+culture+from+skin+explants%3A+cell+expansion+is+linked+to+markers+of+activated+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Derm%22%5BJournal%5D)">An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells.</a> Exp Derm. 18 (8), 720-726 (2009).</li>
<li>Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+enzymatic+and+explant+methods+for+the+culture+of+keratinocytes+isolated+from+human+foreskin%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin.</a> Bio Rep. 3 (3), 304-308 (2015).</li>
<li>Usta, S. N., Scharer, C. D., Xu, J., Frey, T. K., Nash, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+serum-free+and+xeno-free+media+for+multiple+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+of+tra+med%22%5BJournal%5D)">Chemically defined serum-free and xeno-free media for multiple cell lineages.</a> Ann of tra med. 2 (10), 97(2014).</li>
<li>Lenihan, C., Rogers, C., Metcalfe, A. D., Martin, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+isolation+and+culture+methods+on+epithelial+stem+cell+populations+and+their+progeny-toward+an+improved+cell+expansion+protocol+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Cyt%22%5BJournal%5D)">The effect of isolation and culture methods on epithelial stem cell populations and their progeny-toward an improved cell expansion protocol for clinical application.</a> Cyt. 16 (12), 1750-1759 (2014).</li>
<li>Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+grown+at+the+air-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes grown at the air-liquid interface.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 22 (12), 695-705 (1986).</li>
<li>Ponce, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+primary+keratinocytes+from+piglet+skin+for+compartmentalized+co-culture+with+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of primary keratinocytes from piglet skin for compartmentalized co-culture with dorsal root ganglion neurons.</a> J Cell Bio. 2 (2), 93-115 (2017).</li>
<li>Nygaard, U. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+in+cell+culture%3A+friend+or+foe%3F+Suppression+of+keratinocyte+growth+and+differentiation+in+monolayer+cultures+and+3D+skin+models%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Der%22%5BJournal%5D)">Antibiotics in cell culture: friend or foe? Suppression of keratinocyte growth and differentiation in monolayer cultures and 3D skin models.</a> Exp Der. 24 (12), 964-965 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj szczegółowo przedstawiliśmy metodę pierwotnej hodowli ludzkich keratinocytów w celu obrazowania żywych komórek. Metoda ta adaptuje istniejące techniki hodowli komórkowych, wykorzystując płytkowanie o niskiej gęstości i hodowlę długoterminową, co umożliwia skuteczne badania obrazowania żywych komórek. Preferowana metoda dysocjacji tego typu komórek polega na dwustopniowym trawieniu enzymatycznym, które wykazano, że skutkuje powstawaniem keratynocytów, z których 3%-4% jest zdolnych do tworzenia kolonii<sup class="xre...

Celem tego protokołu jest umożliwienie śledzenia pojedynczych keratinocytów w hodowli przez stosunkowo długi czas (kilka tygodni), co jest możliwe dzięki niskiej gęstości zasiewów i fotografii poklatkowej. Obrazowanie żywych komórek przy niskiej gęstości daje badaczom możliwość wizualizacji zachowania komórek in vitro na poziomie pojedynczych komórek. Chociaż nie jest to możliwe w konwencjonalnej hodowli komórkowej, obrazowanie żywych komórek umożliwia tworzenie drzew linii w czasie rzeczywistym, bez użycia oznakowania, dzięki czemu można uzyskać informacje o kinetyce podziału, takie jak czas trwania cyklu komórkowego oraz udział podziałów proliferacji i różnicowania w kolonii. Umożliwia także badanie migracji i ruchliwości komórek. Może być technicznie wymagający, z aspektami wymagającymi optymalizacji, w zależności od typu komórki i danych, które mają być zebrane. Inne laboratoria wykorzystały neonatalne keratinocyty i/lub przechodzone keratynycy, które łatwiej hodować1.
Jednak linie komórkowe podlegające powtarzającemu się passingowi różnią się znacząco pod względem zachowania i morfologii od stanu in vivo 2. Aby uzyskać największe biologiczne znaczenie i uzyskać najbliższe zachowanie in vivo , stosuje się komórki o przejściu 0. W populacjach keratynocyta możliwe jest rozróżnienie komórki macierzystej od zaangażowanego progenitora bez sortowania czy etykietowania, ponieważ istnieją wyraźne różnice w zachowaniu podziału, które można zaobserwować za pomocą obrazowania komórek żywych3.
Wykorzystujemy obrazowanie żywych komórek do badania kinetyki proliferacji keratinocytów. Podobne podejście zastosowano do badania ruchliwości komórek czerniaka skórnego współhodowanych z keratinocytami4, adherentnej migracji komórek testów scratch5 oraz wpływu inhibitorów ROCK na proliferację keratinocytów6. Protokół ten jest specjalnie zaprojektowany do hodowli komórek, aby ułatwić śledzenie linii za pomocą obrazowania komórek żywych, choć może być dostosowany do innych celów.
Protokół ten opisuje izolację keratynocytów przejścia 0 do celów obrazowania komórek żywych, omawia komplikacje, które mogą się pojawić, oraz zawiera kwestie wymagające zmian w protokole (Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>0,05% trypsyna-EDTA (1X), 100 mL</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Filtr ogniwa 100 um</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 cm³ Falcon</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 cm³ stożkowy Falcon</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>70% alkoholu odczynnikowego, 4 litry</td><td>VWR Chemicals</td><td>BDH1164-4LP</td><td>Możesz też rozcieńczyć własne</td></tr><tr><td>Amfocerycyna B, 50 ml</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td>Rozcieńcz do 5X (50 ug/mL)</td></tr><tr><td>Dipaza, 100 ml</td><td>Corning</td><td>354235</td><td>Rozcieńcz 1:1 HBSS, dodaj 1x gentamycyny, filtruj sterylizację</td></tr><tr><td>Epilife, 50 mL</td><td>Gibco</td><td>MEP1500CA</td><td>Dodaj HKGS, rozważ antybiotyki</td></tr><tr><td>Płodowa wartość surowicy bydła z inaktywowanym cieplem FBS, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>A52568-01</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicyna, 10 ml</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td>Rozcieńcz do 50 ug/ml dla 5X</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (1X), 500 ml</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>(HBSS)</td></tr><tr><td>HBSS 5X PSAG</td><td></td><td></td><td>To jest HBSS + 5X stężenia Pen/Streptokoka/Ampho/Gent</td></tr><tr><td>Hibiclens, galon</td><td>Molnlycke</td><td>57591</td><td>Rozcieńcz do 10% za pomocą dejonizowanego H2O</td></tr><tr><td>Ludzkie serum wzrostu keratinocytów, 5 mL</td><td>Gibco</td><td>S-001-5</td><td>Dodane do epilife</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna, 100 ml</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Rozcieńcz do 5X (dostępny w 100x fabryczny) dla 5X PSA - 1X do wymiany mediów</td></tr><tr><td>Szalka Petriego 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpelowe nr 23</td><td>VWR</td><td>76457-480</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>Mniej alternatywa dla zwykłej trypsyny</td></tr><tr><td>Roztwór neutralizujący trypsynę</td><td></td><td></td><td>(TNS), to HBSS z 10% FBS (niektórzy używają mniej surowicy, 5%)</td></tr></tbody></table>

generowanie hodowli pierwotnych do obrazowania żywych komórek keratinocytów

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Śledzenie komórek macierzystych i zachowań zakorzenionych progenitorów na poziomie pojedynczych komórek w ludzkiej skórze stanowiło wyzwanie zarówno in vivo , jak i in vitro. Obrazowanie żywymi komórkami umożliwiło znaczący postęp w rozpoznawaniu różnic między komórkami macierzystymi keratynocytów a zachowaniami zadeklarowanych progenitorów. Obrazowanie żywymi komórkami to ewoluująca i nieco wymagająca metoda badania zachowań keratinocytów in vitro. Protokół ten został opracowany do hodowli keratynoocytów o niskiej gęstości zasiewniczej, co umożliwia stosunkowo długoterminową fotografię poklatkową i monitorowanie zachowania poszczególnych komórek. Keratynocyty przepustkowe 0 są hodowane przy gęstości klonalnej, a fotografia poklatkowa pozwala dokumentować poszczególne podziały komórkowe i czas ich wystąpienia. Dla maksymalnej istotności biologicznej, świeżo wyizolowane ludzkie keratynocyty umieszcza się in vitro. To podejście koncentruje się na proliferacji. Jednak protokół ten można dostosować do innych zastosowań obrazowania żywych komórek, które mierzą zachowanie poszczególnych komórek, takie jak migracja komórek, gojenie się ran czy ruchliwość.

Biorąc pod uwagę wiele zmiennych, które mogą być manipulowane w tej metodzie, a które ostatecznie prowadzą do różnych rezultatów, przedstawiamy tutaj typowe błędy i ich skutki, a także przedstawiamy przykładowe wyniki i okoliczności ich istnienia.
Jak w przypadku każdej techniki hodowli komórek, możliwe jest skażenie (Wideo uzupełniające 1). Oprócz starannych technik sterylnych, rozważ stosowanie antybiotyków w podłożu, zwłaszcza jeśli hodowla jest stosowana przez dłuższy czas...

Protokół ten określa hodowlę świeżo pozyskanych (przepustka 0) keratynocytów do wykorzystania w obrazowaniu żywych komórek.

Generowanie hodowli pierwotnych do obrazowania żywych komórek keratinocytów

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

generating-primary-cultures-for-keratinocyte-live-cell-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodę in vitro pozwalającą na naśladowanie różnicowania nabłonkowego in vivo. Wiele wirusów w ramach swojego cyklu życiowego atakuje komórki nabłonkowe, a niniejsza metoda umożliwia badanie interakcji wirus-gospodarz w warunkach ściślej przypominających te występujące in vivo. Technikę tę można zastosować w przypadku pierwotnych keratynocytów, ustalonych linii komórkowych, a także w badaniach prawidłowej lub zmienionej chorobowo tkanki pobranej z biopsji.

Tworzenie organotypowych kultur raftowych z pierwotnych ludzkich keratynocytów

Ten film opisuje izolację keratynocytów - najważniejszych komórek warstwy naskórka ludzkiej skóry, poprzez zastosowanie kombinacji trawienia enzymatycznego i metod mechanicznego zakłócania. Ta metoda pomaga w preferencyjnym wzroście keratynocytów w porównaniu z innymi typami komórek skóry przy użyciu selektywnej pożywki wzrostowej.

Izolacja keratynocytów ludzkiej skóry: metoda hodowli pierwotnych keratynocytów z próbek skóry

W tym filmie przeprowadzamy test klonogenny keratynocytów pobranych od dorosłych myszy, aby określić zdolność poszczególnych komórek do proliferacji i tworzenia kolonii. Ta technika zbierania keratynocytów jest przydatna do badania innych dalszych aspektów chemicznej kancerogenezy skóry i promocji guza.

Test tworzenia kolonii keratynocytów: test in vitro oceniający zdolność keratynocytów do wzrostu w kolonie

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego i szczegółowego protokołu generowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej organotypowej skóry z keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Keratynocyty naskórka tworzą funkcjonalną barierę skórną i są umieszczone na pierwszej linii obrony gospodarza przed zewnętrznymi zniewagami środowiskowymi. W tym miejscu opisano metody izolacji i pierwotnej hodowli keratynocytów naskórka ze skóry noworodków i dorosłych myszy oraz indukcji różnicowania końcowego i odpowiedzi zapalnej wywołanej promieniowaniem UVB przez keratynocyty.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych myszy

Ludzka skóra działa jako pierwsza linia obrony przed środowiskiem zewnętrznym. Przedstawiono metodę izolacji pierwotnych keratynocytów ludzkich od skóry osoby dorosłej. Te izolowane keratynocyty są przydatne w wielu konfiguracjach eksperymentalnych i są bardzo odpowiednim modelem do badania mechanizmów molekularnych w biologii skóry in vitro.

Wytwarzanie i hodowla pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów z tkanek skóry dorosłych. Metoda ta upraszcza konwencjonalną procedurę poprzez zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 w pożywce do inokulacji w celu spontanicznego oddzielenia komórek naskórka od komórek skóry właściwej.

Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

Celem tego protokołu jest wyizolowanie keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry dorosłych myszy do różnych dalszych zastosowań, takich jak biologia molekularna, biochemia, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i podstawowe zastosowania in vitro (np. keratynocyty klonogenne).

Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro

Tutaj opisujemy protokół systematycznej hodowli sferoidów naskórka w hodowli zawiesinowej 3D. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do stosowania w różnych typach tkanek nabłonkowych oraz do modelowania kilku chorób i stanów u ludzi.

Opracowanie wysokoprzepustowego systemu hodowli sferoidów naskórka do modelowania plastyczności komórek macierzystych keratynocytów

Przedstawiamy tutaj metodę analizy obrazowania żywych komórek, którą można wykorzystać do ręcznego śledzenia linii keratynocytów przejścia 0 oraz umożliwia zbieranie metryk proliferacji, w tym losów podziału komórkowego i czasu trwania cyklu komórkowego.

Obrazowanie żywych komórek z użyciem fotografii poklatkowej do badania kinetyki proliferacji keratynocytów naskórka

Poznaj metodę hodowli pierwotnych keratynocytów do obrazowania żywych komórek. Protokół umożliwia izolację komórek z świeżej tkanki i ich kulturę w warunkach zapewniających żywotność.

Generowanie hodowli pierwotnych do obrazowania żywych komórek keratinocytów

Przeglądaj więcej filmów