Obrazowanie żywych komórek z użyciem fotografii poklatkowej do badania kinetyki proliferacji keratynocytów naskórka
6 czerwca 2025
Przedstawiamy tutaj metodę analizy obrazowania żywych komórek, którą można wykorzystać do ręcznego śledzenia linii keratynocytów przejścia 0 oraz umożliwia zbieranie metryk proliferacji, w tym losów podziału komórkowego i czasu trwania cyklu komórkowego.
Badania koncentrują się na chorobach hiperproliferacyjnych i hipoproliferacyjnych, takich jak łuszczyca i starzenie się, ze szczególnym uwzględnieniem wpływu tych schorzeń na proliferację komórek macierzystych i progenitorów. Identyfikacja konkretnych miejsc defektów proliferacyjnych umożliwi opracowanie bardziej precyzyjnie ukierunkowanych terapii. W przypadku ludzkiej skóry nie mieliśmy technik pozwalających śledzić zaangażowanych przodków przez wiele pokoleń.
Wreszcie, obrazowanie żywych komórek pozwala śledzić zaangażowanego protoplastę przez wiele pokoleń in vitro i dostarczyło wielu wglądów w zachowanie zaangażowanych progenitorów u człowieka. Wykorzystaliśmy obrazowanie żywych komórek, aby pokazać, że choć wiemy, iż komórki macierzyste dzielą się rzadziej niż zaangażowane progenitory, to gdy już się dzielą, dzielą się szybciej. Gdy dochodzi do uszkodzenia tkanek, komórki macierzyste mogą reagować w formie szybkiego wymiany.
Na początek pozyskaj keratinocyty ze świeżej ludzkiej skóry. Określ odpowiednią gęstość siewu dla testu i przeprowadź badania pilotażowe z użyciem próbek wielokrotnego rozcieńczenia od różnych dawców. Aby uzyskać równomierny rozkład komórek, należy aliquotować całkowite ośrodki wymagane dla wszystkich dołków przy określonym rozcieńczeniu do mikrorurki.
Pipetą zgromadzić całkowitą liczbę komórek potrzebnych do osiągnięcia pożądanej gęstości do aliquoty i delikatnie odwrócić mikrorurkę, aby komórki były jednorodnie rozłożone. Teraz dodaj zawieszenie na tablicach. Po nałożeniu na talerz przesuń talerz w układzie krzyżowym trzy razy w górę, w dół, potem w lewo, w prawo i ostrożnie przenieś talerz do inkubatora.
Po inkubacji zmień medium. Aby otworzyć inkubator systemu obrazowania, naciśnij duży trójkątny przycisk w lewym dolnym rogu. Gdy światło zapali się na zielono, umieść naczynie w otwartej zatoce i zamknij tacę tym samym przyciskiem.
Teraz otwórz aplikację na komputerze i zaloguj się, używając odpowiednich danych identyfikacyjnych i hasła użytkownika. Następnie wybierz Harmonogram. Naciśnij przycisk Plus pod Harmonogramem, aby dodać tablicę do Harmonogramu.
Wybierz Skanowanie na Harmonogram, a następnie kliknij Dalej. Następnie wybierz Nowy i wybierz Standard dla typu skanowania. Aby ustawić skanowanie, wybierz adherent Cell by Cell by Cell używając kanału fazowego przy 10x Objective, a następnie kliknij Dalej.
Następnie wybierz naczynie, a następnie kliknij Następny. Wybierz pustą zatokę, aby umieścić jednostkę, a następnie kliknij Następny. Wybierz studnie do zeskanowania oraz liczbę obrazów na odwiert, a następnie kliknij Dalej.
Nazwij eksperyment według pożądanej konwencji nazewnictwa. Stwórz mapę płyty eksperymentu na przyszłość. Następnie kliknij Ok.
Teraz kliknij Dalej, aby kontynuować. Odłóż analizę do czasu zebrania danych, ponieważ analiza Cell by Cell musi zostać rozpoczęta po skanowaniu. Kliknij Następne.
Ustaw częstotliwość obrazowania na 20-minutowe interwały, aby wiarygodnie śledzić mitozę, która występuje mniej więcej co 30 minut. Naciśnij "Dalej" i potwierdź ustawienia, aby rozpocząć eksperyment. Zmieniaj podłoże dla keratynocytów co 48 godzin.
Aby zapewnić prawidłową orientację płyty, należy czekać na zakończenie pierwszego skanowania za każdym razem, gdy naczynie jest umieszczane w maszynie. Umieść tabliczkę tak, aby litery oznaczające rzędy znajdowały się po lewej stronie zatoki. Obserwuj dorosłe kolonie przez około dwa tygodnie, a noworodki przez około 10 dni, podczas których zatłoczenie pogarsza jakość analityczną.
Gdy wszystkie studnie staną się nieruchome lub osiągną zbieg, kliknij zakładkę Widok i dwukrotnie kliknij eksperyment pod listą Ostatnich Oszustw. Kliknij ikonę Poziomy strzałką i poczekaj na uruchomienie narzędzia Eksport. Kliknij Jak wyświetlone, a następnie kliknij Następny.
Następnie ręcznie kliknij każde pole widoku, aby wyeksportować, a następnie kliknij Następny. Wybierz, czy chcesz oglądać film, czy serię obrazów. Aby śledzić linię genealogii keratynocytów, wybierz opcję Film i wybierz wszystkie skany za pomocą ikony Wybierz Wszystko, a następnie kliknij Następne.
Eksportuj z prędkością jednej klatki na sekundę w maksymalnej jakości po ustawieniu paska obok Jakości. Po wybraniu folderu docelowego i typu pliku nazwij plik i kliknij Eksport. Otwórz plik wideo za pomocą odtwarzacza multimedialnego i przewiń filmy, aby zidentyfikować rosnące kolonie.
W VLC zrób zrzut ekranu kolonii do śledzenia i oznacz ją. Zidentyfikuj interesującą się kolonię na końcu lub po kilku dniach nagrywania wideo. Przewiń wideo i zidentyfikuj komórkę tworzącą kolonię.
Zatrzymaj wideo, gdy komórka zaraz się podzieli, bo wydaje się kondensować. Zarejestruj znacznik czasu pokazany w lewym dolnym rogu. Zrób zrzut ekranu dywizji i oznacz ją tak, jak kolonia.
Dokumentuj każdy podział za pomocą ręcznie rysowanego diagramu linii rodowej. Przełóż ręczne drzewo genealogiczne na arkusze danych zwane zielonymi arkuszami ze względu na kolor arkusza kalkulacyjnego. Na koniec użyj zielonych arkuszy do obliczenia proporcji podziałów proliferacyjnych i różniczkowych.
Zidentyfikuj komórki macierzyste i zadeklarowane kolonie progenitorowe oraz określ czas trwania cyklu komórkowego. Pierwotne keratynocyty wykazywały stereotypowy przebieg wyglądu, zaczynając jako małe, zaokrąglone komórki przy początkowym zasiewaniu, a następnie stając się spłaszczone i ruchome. Zaczynają kondensować się przed podziałem i tworzą kolonie proliferacyjne lub kolonie terminalnie zróżnicowane o niejednorodnej morfologii.
Gdy zielona folia zostanie zbudowana, można określić, które kolonie pochodzą z komórek macierzystych, a które z zaangażowanych przodków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na chorobach hiper- i hipoproliferacyjnych, takich jak łuszczyca i starzenie się organizmu, oraz ich wpływie na proliferację komórek macierzystych. Przedstawiamy metodę obrazowania żywych komórek, która umożliwia śledzenie linii keratynocytów oraz gromadzenie parametrów proliferacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad komórkami macierzystymi
Wstęp
- Choroby hiper- i hipoproliferacyjne wpływają na zachowanie komórek macierzystych.
- Śledzenie zróżnicowanych progenitorów na przestrzeni wielu pokoleń było dużym wyzwaniem.
- Obrazowanie żywych komórek pozwala zrozumieć zachowanie progenitorów.
- Zrozumienie tych mechanizmów może prowadzić do opracowania terapii celowanych.
Cel badania
- Opracowanie metody śledzenia linii keratynocytów.
- Zebranie parametrów dotyczących losów podziałów komórkowych oraz czasu trwania cyklu.
- Zrozumienie zachowania zdeterminowanych komórek progenitorowych in vitro.
Zastosowane metody
- Techniki obrazowania żywych komórek.
- Śledzenie linii keratynocytów.
- Analiza parametrów proliferacji.
- Badania in vitro zdeterminowanych komórek progenitorowych.
Główne wyniki
- Komórki macierzyste dzielą się rzadziej, ale w momencie podziału proces ten zachodzi szybciej.
- Obrazowanie żywych komórek umożliwia obserwację zachowania progenitorów na przestrzeni kolejnych pokoleń.
- Zdobyta wiedza może wspomóc opracowanie terapii celowanych.
- Usprawnia to zrozumienie mechanizmów odpowiedzi na uszkodzenia tkanek.
Wnioski
- Obrazowanie żywych komórek jest cennym narzędziem do badania linii keratynocytów.
- Identyfikacja defektów proliferacyjnych może prowadzić do opracowania lepszych terapii.
- Dalsze badania są niezbędne, aby zgłębić znaczenie tych odkryć.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie żywych komórek z wykorzystaniem fotografii poklatkowej umożliwia bezpośrednią obserwację w czasie rzeczywistym kinetyki proliferacji keratynocytów naskórka na poziomie pojedynczej komórki. Możliwość ta pozwala wypełnić istotną lukę w rozumieniu zachowania komórek macierzystych i progenitorowych w kontekście hiper- i hipoproliferacyjnych chorób skóry. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji punktów uchwytu oraz wspiera decyzje skorygowane o ryzyko w początkowych etapach odkrywania leków i w badaniach translacyjnych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę losów podziałów keratynocytów oraz czasu trwania cyklu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez rozróżnienie zachowań proliferacyjnych komórek macierzystych od zachowań komórek progenitorowych zdeterminowanych.
- Ułatwia identyfikację defektów proliferacyjnych w celu generowania ukierunkowanych hipotez terapeutycznych.
Przesiewanie i rozwój testów
- Zapewnia zwalidowane, ilościowe wskaźniki proliferacji w celu standaryzacji i powtarzalności testu.
- Przygotowuje stabilne systemy biologiczne do późniejszego przesiewania i oceny związków.
- Umożliwia skalowalne, bezetykietowe śledzenie linii komórkowych w celu przygotowania do przesiewania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wskaźniki proliferacji in vitro z fenotypami istotnymi dla przebiegu choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera wybór modeli przedklinicznych poprzez wyjaśnienie reakcji komórkowej na uszkodzenia tkanki oraz sygnały różnicowania.
- Usprawnia proces wdrażania z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez powiązanie wglądów mechanistycznych z modelami chorób.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten workflow obrazowania żywych komórek integruje etapy od wczesnego odkrywania po badania przedkliniczne, wspierając testowanie hipotez, opracowywanie testów oraz walidację modeli translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia analizę dynamiki proliferacji i różnicowania keratynocytów opartą na hipotezach.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników do porównywania perturbacji związkami chemicznymi lub genetycznymi.
- Analityka: Zapewnia śledzenie linii komórkowych, analizę losów podziałów oraz wskaźniki czasu trwania cyklu komórkowego dla rzetelnej analizy statystycznej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z systemami istotnymi dla chorób oraz modelami przedklinicznymi.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do kinetycznych badań pojedynczych komórek w ramach wielu programów badawczych nad chorobami skóry.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w biologii skóry.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy proliferacji i wspiera generowanie powtarzalnych oraz skalowalnych danych.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i modeli do dalszego rozwoju z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu żywych komórek, mikroskopii poklatkowej oraz analizie linii komórkowych.
- Wymaga dostępu do zautomatyzowanych platform obrazowania oraz solidnej infrastruktury zarządzania danymi.
- Konieczna jest standaryzacja gęstości wysiewu, odstępów czasowych obrazowania oraz adnotacji danych pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych źródeł dawców lub podtypów keratynocytów.
- Jakość analityczna może ulec pogorszeniu w przypadku zbyt dużego zagęszczenia kolonii lub przedłużonego czasu hodowli.
