Name: Obrazowanie żywych komórek z użyciem fotografii poklatkowej do badania kinetyki proliferacji keratynocytów naskórka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek do śledzenia linii keratynocytów naskórka ludzkiego. Technika ta pozwala zbierać dane o kinetyce proliferacji i losach podziałów komórkowych, wspierając badania nad chorobami skóry.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została wsparta przez Merit Review Award Number I01 CX001816 od Stanów Zjednoczonych (USA) Służba Badań i Rozwoju (CSRD) Departamentu ds. Weteranów. Treść nie odzwierciedla poglądów Departamentu ds. Weteranów USA ani rządu Stanów Zjednoczonych. Dziękujemy dr. Michaelowi Rosenblumowi za udostępnienie nam swojego mikroskopu poklatkowego do przeprowadzania naszych eksperymentów.

Badanie to przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską. Cała tkanka ludzka została pobrana po zatwierdzeniu przez instytucjonalną komisję rewizyjną Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Francisco (UCSF) oraz uzyskano zgodę na wszystkie użyte tkanki.
1. Zdjęcie poklatkowe przejścia 0 ludzkich keratynocytów
UWAGA: Ten protokół jest specyficzny dla modeli IncuCyte S3 i SX5.
<ol>
	<li>Upewnij się, że uzyskano odpowiednie zgody od komitetu badawczego instytucji na ludziach na wykorzystanie tkanek ludzkich do badania.</li>
	<li>Wyizoluj keratinocyty ze świeżej skóry, jak opisano wcześniej9.</li>
	<li>Określ gęstość siewu do testu. Przeprowadź badania pilotażowe z próbkami w wielu rozcieńczeniach od różnych dawców, aby zrozumieć gęstość komórek potrzebnych do zapewnienia odpowiedniej liczby kolonii do badań, ale zapobiec nadmiernym koloniom prowadzącym do nakładania się kolonii w okresie obserwacji. Uruchom te piloty w identycznych warunkach eksperymentalnych (te same płyty, odczynniki itp.), ponieważ te czynniki mogą wpływać na wyniki. UWAGA: Zbyt niska gęstość zasiewu skutkuje niewystarczającym wzrostem, natomiast zbyt wysoka gęstość zasiewu uniemożliwia dokładne śledzenie komórek z powodu stłoczenia komórek w terenie.<ol>
		<li>Dla przepustu 0 keratynocytów z napletka noworodka poniżej 48 godzin z kolekcji przechowywanej w 4 °C w pożywce zbiorczej, należy upewnić się, że gęstość nasiewnicza wynosi 1000-5000/cm2. Dla keratynocytów P1 użyj 500-2000 komórek/cm2. Im dalej przejście, tym niższa gęstość siew.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki płytek na wybranym rozmiarze płytki. UWAGA: 96-dołkowe płytki i mikropłytki mają efekt łąkotki, co skutkuje niejednorodnym rozmieszczeniem komórek, przy czym większość wzrostu znajduje się poza polem obrazowania. Płytki z większymi dołkami (na przykład płyty z 24 dołkami) pozwalają na zebranie większej ilości danych. 24 płytki dołkowe umożliwiają wizualizację do 36 pól, natomiast płyty z 96 dołkami umożliwiają wizualizację do 5 pól. Jednak liczba pól rejestrowanych na przyrządzie jest skończona, a więcej pól zużywa większą część pojemności obrazowca. Zazwyczaj stosuje się płytę z 24 dołkami.<ol>
		<li>Aby osiągnąć równomierne rozłożenie komórek na płytce, można stosować różne techniki. Po pierwsze, zamiast zasiewać każdą studnię osobno, aliquotuj całkowite ośrodki potrzebne do wszystkich otworów przy określonym rozcieńczeniu do mikrorurki. Następnie pipetować całkowitą liczbę komórek potrzebnych do osiągnięcia pożądanej gęstości aliquotu i delikatnie odwrócić rurkę, aby jednorodnie rozłożyć komórki.</li>
		<li>Po pokryciu przesuń płytkę w układzie poprzecznym trzy razy (w górę-dół, w lewo-prawo), a następnie ostrożnie przełóż ją do inkubatora. UWAGA: Jeśli używasz mikropłytki, unikaj zewnętrznych rzędów i kolumn studni, ponieważ mikroskop poklatkowy generuje ciepło podczas obrazowania i może powodować parowanie ośrodka w tych studniach. Studnie eksperymentalne powinny być grupowane w centrum płyty i otoczone studniami zawierającymi PBS lub inny płyn sterylny o maksymalnej pojemności, aby ograniczyć parowanie/efekty krawędziowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubuj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5%CO2 , aby umożliwić przyleganie.</li>
	<li>Zmień nośnik po 24 godzinach. UWAGA: Nie zakłócaj rosnącej monowarstwy podczas ssania. Zawsze używaj podgrzanych mediów (37 °C) i delikatnie wprowadzaj je do studni przez boczną ściankę. Stosowane tutaj środki to Epilife/Suplement S7/Primocin. Zaleca się stosowanie antybiotyków w ośrodkach do długoterminowego obrazowania żywych komórek. Długotrwała hodowla w maszynie stosowanej do wielu jednoczesnych eksperymentów wiąże się z wysokim ryzykiem skażenia. Powszechnie stosuje się penicylinę i streptomycynę.</li>
	<li>Otwórz inkubator, naciskając duży trójkątny przycisk w lewym dolnym rogu, aby otworzyć tacę, gdy światło zapali się na zielono. Umieść statek w otwartej zatoce. Następnie zamknij tackę tym samym przyciskiem w lewym dolnym rogu. Nigdy nie otwieraj tacy, gdy przycisk otwierania jest czerwony, bo oznacza to, że skanowanie jest aktywne, a skanowanie zostanie przerwane. UWAGA: Upewnij się, że nie ma skanów, zaczynając od patrzenia na ekran modułu kontrolera. Pokazuje czas do kolejnego badania oraz długość skanowania. Jeśli skanowanie już się rozpoczęło, poda czas do zakończenia skanowania.</li>
	<li>Otwórz aplikację na komputerze i zaloguj się, używając odpowiedniego identyfikatora użytkownika i hasła. Wybierz harmonogram.</li>
	<li>Naciśnij przycisk + w lewym górnym rogu pod harmonogramem, aby dodać tablicę do harmonogramu.</li>
	<li>Wybierz Skanowanie na Harmonogram, a następnie kliknij Dalej.</li>
	<li>Wybierz Nowe, a następnie kliknij Następny. UWAGA: Jeśli ta tablica jest identyczna z poprzednim lub trwającym eksperymentem, można użyć opcji Copy Previous lub Copy Current , aby przyspieszyć formatowanie eksperymentu.</li>
	<li>Wybierz Standard dla typu skanowania, a następnie kliknij Dalej. UWAGA: Blokada obrazu to autorska płytka z 96 otworami, która pomaga zminimalizować występowanie utraty ostrości lub skoków obrazu, co może być pomocne, gdy pojawią się takie problemy. Pozostałe typy skanów nie są szczególnie przydatne do śledzenia linii geneażowej.</li>
	<li>Aby ustawić skanowanie, wybierz Adherent Cell-by-Cell używając kanału fazowego przy 10x celu, a następnie kliknij Dalej. UWAGA: Dopóki wybrany jest kanał fazowy, nie trzeba wybierać opcji analizy w tym momencie, ponieważ analiza może zostać rozpoczęta po przechwyceniu danych.</li>
	<li>Wybierz statek, a następnie kliknij Dalej. Większość powszechnych naczyń jest kompatybilna z urządzeniem, choć niemikropłyty mogą wymagać specjalnych końcówek, aby zmieścić się w komorach mikroskopu poklatkowego czasopobiegowego.</li>
	<li>Wybierz pustą zatokę, aby umieścić jednostkę, a następnie kliknij Dalej.</li>
	<li>Wybierz studnie do skanowania oraz obrazy w każdej studni, a następnie kliknij Następny. Szacowany czas trwania skanowania będzie podany w lewym dolnym rogu ekranu.</li>
	<li>Nazwij eksperyment według pożądanej konwencji nazewnictwa. Stwórz mapę płyty eksperymentu na przyszłość, a potem kliknij OK. Na koniec kliknij Dalej.</li>
	<li>Odłóż analizę do czasu zebrania danych, ponieważ analiza komórka po komórce musi zostać rozpoczęta po zakończeniu skanowania. Kliknij Następne.</li>
	<li>Na koniec ustaw częstotliwość obrazowania. Aby wiarygodnie śledzić mitozy, które występują w ciągu 30 minut, skanuj co 20 minut pod kątem keratynocytów. Naciśnij "Dalej" i potwierdź ustawienia, aby rozpocząć eksperyment. UWAGA: Czasy skanowania nie mogą się pokrywać, a producenci zalecają, aby urządzenie pozostawało w spoczynku tak długo, jak trwa skanowanie. W odstępach 20 minut oznacza to, że maksymalnie 10 minut powinno być poświęconych na skanowanie. Jeśli obrazuje się 12 studni z płyty 24-dołkowej z 36 widokami na odwiert, skanowanie zajmuje 7 minut, dlatego zawsze należy pamiętać o dostępnych zasobach podczas planowania.<ol>
		<li>Jest powiadomienie, jeśli maszyna nie ma wystarczającego czasu na odpoczynek, a jeśli czasy skanowania się pokrywają, jednostka nie może zostać dodana do harmonogramu. Jeśli statek nie zmieści się w harmonogramie w regularnych odstępach, kliknij Reserve tacy location i kliknij Next.</li>
		<li>Kliknij dwukrotnie harmonogram u góry ekranu i wybierz jednostkę w rezerwie, a następnie ręcznie kliknij, aby dodać zdjęcia w wolnych przedziałach czasowych. Alternatywnie, kliknij prawym przyciskiem myszy po otwarciu harmonogramu, aby usunąć wszystkie zaplanowane czasy skanowania, a następnie ustawić nowe czasy skanowania dla grupy skanowania w regularnych odstępach czasu. UWAGA: To przerwałoby wszystkie eksperymenty obecne na maszynie do czasu ustalenia nowych czasów. Nie zapomnij kliknąć ikony dyskietki, aby zapisać kartę, lub czerwonego X, aby anulować zmiany w harmonogramie. Wybór pożądanych otworów lub widoków jest prosty, ponieważ maszyna natychmiast podaje szacowany czas skanowania po wybraniu parametru. Czas trwania skanowania zależy od typu i marki wybranej płyty, a także od liczby wgłębień lub widoków do skanowania. Pozwala to użytkownikom dostosować parametry skanowania do możliwości urządzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku keratynocyta zmieniaj ośrodek co 48 godzin. Aby zapewnić prawidłową orientację płyty, należy czekać na zakończenie pierwszego skanu za każdym razem, gdy naczynie jest umieszczane w maszynie (jeśli czas pozwoli). To prosty błąd do popełnienia. Włóż płytkę do maszyny tak, aby litery oznaczające rzędy znajdowały się po lewej stronie zatoki.<ol>
		<li>Aby zobaczyć skany, naciśnij przycisk View z ikoną oka , a następnie kliknij dwukrotnie eksperyment. Rozważ wczesną zmianę ośrodka, jeśli nastąpi nagła zmiana koloru podłoża (ośrodek zawierający czerwień fenolową żółknie w wyniku zakwaszenia), jeśli obecna jest nadmiar martwych komórek (co może zakłócać rozmnażanie się żywych kolonii) lub jeśli zaobserwuje się nieprawidłową morfologię.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy wszystkie studnie staną się nieruchome lub osiągną zbieg, eksportuj eksperyment. Obserwuj dorosłe kolonie przez ~2 tygodnie, a noworodki przez ~10 dni, po czym stłoczenie powoduje spadające korzyści z analiz.</li>
	<li>Aby wyeksportować, kliknij zakładkę Widok i dwukrotnie kliknij eksperyment pod listą ostatnich skanów (domyślnie są one uporządkowane od najnowszego wstecz). Kliknij ikonę poziomego strzałką i poczekaj na uruchomienie narzędzia eksportującego.</li>
	<li>Kliknij Jak wyświetlone, a następnie kliknij Następny.</li>
	<li>Ręcznie kliknij każde pole widzenia, aby wyeksportować, a następnie kliknij Dalej.</li>
	<li>Wybierz, czy pożądany jest film lub seria obrazów, a następnie wybierz czasy skanowania do eksportu. Aby śledzić linię genealogii keratynocytów, użyj opcji filmu i wybierz wszystkie skany (jest szybka ikona Wybierz wszystko z przerywaną linią, co przyspiesza proces). Kliknij Następne.</li>
	<li>Eksportuj z prędkością 1 klatki na sekundę przy maksymalnej jakości (ustaw to za pomocą paska obok jakości). Kliknij Następne.</li>
	<li>Wybierz docelowy folder i typ pliku. Nazwij plik, a następnie kliknij Eksportuj. UWAGA: Eksport filmów może zająć dużo czasu, w zależności od prędkości połączenia internetowego i zaangażowanego komputera. Przygotuj się na kilka dni na eksport wszystkich plików wideo do większych eksperymentów. Możliwość zdalnego logowania się do mikroskopu poklatkowego jest niezwykle wygodna.</li>
</ol>
2. Wykorzystanie obrazowania poklatkowego do budowy drzew linii i generowania arkuszy danych
<ol>
	<li>Otwórz plik wideo za pomocą odtwarzacza multimedialnego. Polecam odtwarzacz multimedialny VLC.</li>
	<li>Przewiń filmy i zidentyfikuj rosnące kolonie. W VLC używaj strzałki, aby pomijać klatki do przodu i do tyłu. Zrób zrzut ekranu kolonii, aby ją śledzić i oznacz ją.</li>
	<li>Zidentyfikuj interesującą mnie kolonię na końcu lub po kilku dniach nagrywania wideo, a następnie przewiń wideo i zidentyfikuj komórkę tworzącą kolonię. UWAGA: Tutaj istotna jest odpowiednia gęstość siewu. Jeśli zbyt wiele kolonii rozwija się obok siebie, rozszerzają się i łączą ze sobą, co uniemożliwia dokładne śledzenie podziałów komórkowych.</li>
	<li>Gdy komórka ma się podziwać, wydaje się kondensować (Rysunek 1). Zatrzymaj wideo, gdy następuje podział. Zapisz czas podziału (znacznik czasu znajduje się w lewym dolnym rogu). Zrób zrzut ekranu tego początkowego podziału i nadaj mu tę samą etykietę co kolonia. Zapisz podziały na ręcznie rysowanym diagramie linii (zobacz Reprezentatywne Rezultaty). Kontynuuj śledzenie i dokumentowanie jak największej liczby pokoleń. UWAGA: Automatyczne śledzenie komórek jest rozwijane, aby przyspieszyć ten proces i dokładniej śledzić komórki7. Nawet w warunkach hodowli o niskiej zawartości wapnia i minimalnej różnicacji modele uczenia maszynowego obecnie nie mają wystarczającej czułości, by dokładnie śledzić podziały keratynocytów.</li>
	<li>Przepisz ręczne drzewo linii do arkuszy danych – tak nazwanych "zielonymi arkuszami" ze względu na kolor w arkuszu kalkulacyjnym (Plik Uzupełniający 1).</li>
	<li>Użyj zielonych arkuszy do obliczenia proporcji podziałów proliferacyjnych i różnicowania, identyfikacji komórek macierzystych i zaangażowanych kolonii progenitorowych oraz długości cyklu komórkowego (zobacz reprezentatywne wyniki). UWAGA: Maszyna jest zdolna do analizy danych za pomocą własnych podstawowych i analizatorów komórka po komórce, aby wykonać wiele innych testów (konfluencja, scratch). Jednak to wykracza poza zakres tego protokołu.</li>
</ol>

<ol><li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes%3A+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> Int J Mol Med. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li>
<li>Handl, J., Čapek, J., Majtnerová, P., Báčová, J., Roušar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+repeated+passaging+on+the+susceptibility+of+human+proximal+tubular+HK-2+cells+to+toxic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of repeated passaging on the susceptibility of human proximal tubular HK-2 cells to toxic compounds.</a> Physiol Res. 69 (4), 731-738 (2020).</li>
<li>Moran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+keratinocyte+cell+lines+for+barrier+studies%5BTitle%5D)+AND+%22JID+Innov%22%5BJournal%5D)">Characterization of human keratinocyte cell lines for barrier studies.</a> JID Innov. 1 (2), 100018(2021).</li>
<li>Seo, M. -D., Kang, T. J., Lee, C. H., Lee, A. -Y., Noh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaCaT+keratinocytes+and+primary+epidermal+keratinocytes+have+different+transcriptional+profiles+of+cornified+envelope-associated+genes+to+T+helper+cell+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol+Ther%22%5BJournal%5D)">HaCaT keratinocytes and primary epidermal keratinocytes have different transcriptional profiles of cornified envelope-associated genes to T helper cell cytokines.</a> Biomol Ther. 20 (2), 171-176 (2012).</li>
<li>Jahn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+immortalized+keratinocyte+cell+lines+display+distinct+capabilities+to+differentiate+and+reconstitute+an+epidermis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Different immortalized keratinocyte cell lines display distinct capabilities to differentiate and reconstitute an epidermis in vitro.</a> Exp Dermatol. 33 (1), e14985(2024).</li>
<li>Xiao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+cell+cycle+duration+is+a+phenotype+of+human+epidermal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Short cell cycle duration is a phenotype of human epidermal stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 15 (1), 76(2024).</li>
<li>Hirose, T., Kotoku, J., Toki, F., Nishimura, E. K., Nanba, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quality+control+and+identification+of+human+keratinocyte+stem+cells+by+deep+learning-based+automated+cell+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Label-free quality control and identification of human keratinocyte stem cells by deep learning-based automated cell tracking.</a> Stem Cells. 39 (8), 1091-1100 (2021).</li>
<li>Roshan, A., Murai, K., Fowler, J., Simons, B. D., Nikolaidou-Neokosmidou, V., Jones, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+have+two+interconvertible+modes+of+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes have two interconvertible modes of proliferation.</a> Nat Cell Biol. 18 (2), 145-156 (2016).</li>
<li>Abegaze, B., Ijeh, N., Vittimberga, B., Ghadially, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+primary+cultures+for+the+purpose+of+keratinocyte+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating primary cultures for the purpose of keratinocyte live cell imaging.</a> J Vis Exp. , In Press (2024).</li>
<li>Piedrafita, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-progenitor+model+as+the+unifying+paradigm+of+epidermal+and+esophageal+epithelial+maintenance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A single-progenitor model as the unifying paradigm of epidermal and esophageal epithelial maintenance in mice.</a> Nat Commun. 11 (1), 1429(2020).</li>
<li>Ścieżyńska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).</li>
<li>Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+edge+effect%3A+A+global+problem.+The+trouble+with+culturing+cells+in+96-well+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates.</a> Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).</li>
<li>Malin-Mayor, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+reconstruction+of+whole-embryo+cell+lineages+by+learning+from+sparse+annotations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Automated reconstruction of whole-embryo cell lineages by learning from sparse annotations.</a> Nat Biotechnol. 41 (1), 44-49 (2023).</li>
<li>Waliman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+lineage+reconstruction+using+label-free+4D+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Automated cell lineage reconstruction using label-free 4D microscopy.</a> Genetics. 228 (2), iyae135(2024).</li>
</ol>

Obrazowanie żywych komórek keratynocytów to metoda bez oznakowania, umożliwiająca śledzenie zachowania podziału komórek macierzystych i zadeklarowanych progenitorów. Biorąc pod uwagę, że utrzymanie naskórka zależy od kinetyki proliferacji komórek macierzystych i zaangażowanych progenitorów10, posiadanie szczegółowego zrozumienia zmian w populacjach tych keratinocytów oraz ich wpływu w różnych warunkach ułatwia opracowanie terapii łagodzących odkryte defekty.
Ostatecznie...

Możliwość wizualizacji populacji komórek in vitro w czasie rzeczywistym, gdy rozszerzają się przez dłuższy czas, to wyjątkowa zaleta obrazowania komórek żywych. Obrazowanie żywych komórek pozwala ocenić ruchliwość, migrację i proliferację komórek na poziomie pojedynczych komórek. Celem tego protokołu jest optymalizacja wizualizacji hodowli keratinocytów za pomocą fotografii poklatkowej, tworząc nagrania wideo, które można następnie śledzić ręcznie, aby uzyskać szczegółowe dane o zachowaniu komórkowym.
Naszym celem jest kinetyzja proliferacji. Na podstawie analizy filmów obrazujących na żywo można wyjaśnić drzewa genealogii, a także ocenić czas między podziałami (zastępstwo długości cyklu komórkowego), a także proporcje podziałów prowadzących do dalszego podziału w porównaniu z różnicowaniem komórek potomnych.
Występuje znaczna zmienność między dawcami w przypadku pierwotnych keratinocytów oraz częste nieudane próby propagacji komórek. Z tego powodu wielu badaczy decyduje się na stosowanie wysoce proliferacyjnych keratynocytów, takich jak komórki HaCaT lub neonatalne keratinocyty, często po wielokrotnych przejściach in vitro1. Hodowla pierwotnych keratinocytów ze skóry dorosłych lub starszych w celu śledzenia linii może być trudna. Jednak istnieją problemy z wykorzystaniem komórek przepuszczonych z linii komórkowych lub z męskiego napletka. Powtarzające się przepuszczanie skutkuje powstawaniem komórek istotnie różniących się od ich stanu in vivo 2. Ponadto wykazano, że komórki HaCaT reagują inaczej niż pierwotne keratinocyty w wielu testach 3,4,5. Aby wykorzystać komórki najbardziej przypominające swoje odpowiedniki in vivo, wykorzystuje się keratynocyty przejścia 0 pochodzące z dorosłych dawców. Komórki macierzyste keratynocyta i zaangażowane progenitory wykazują wyraźne różnice w zachowaniu, co pozwala rozróżnić kolonie z obu populacji za pomocą obrazowania żywych komórek6. Ta stosunkowo nowatorska zdolność wizualizacji zachowania pojedynczych keratinocytów w dłuższej perspektywie była wykorzystywana tylko w kilku wcześniejszych badaniach z podobnymi technikami 6,7,8. Protokół ten opisuje obrazowanie na żywo komórek pierwotnych keratinocytów z wykorzystaniem systemu analizy żywych komórek IncuCyte S3. Na podstawie konstruowanych drzew linii można określić typ kolonii (komórka macierzysta kontra zadeklarowany przodek), a także czas trwania cyklu komórkowego oraz udział podziałów różnicowania.

<table><tbody><tr><td>Płyta Imagelock 96 Well</td><td>Sartorius</td><td>BA-04856</td><td>Zalecana mikropłytka kompatybilna z maszyną, jeśli używasz płyty 96-dołkowej.</td></tr><tr><td>Płyta 24-studniowa</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>Zalecana mikropłytka kompatybilna z maszyną, jeśli używasz płytki z 24 dołkami.</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B, 50 mL</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td>Rozcieńcz do 5x (jest w wersji 100x fabrycznie) dla 5x PSA - 1x do wymiany mediów</td></tr><tr><td>Epilife, 50 mL</td><td>Gibco</td><td>MEP1500CA</td><td>Dodaj S7, rozważ prymocynę</td></tr><tr><td>IncuCyte S3</td><td>Sartorius</td><td>4637</td><td>Obrazowanie (akceptowalne alternatywy dla Zoom/SX5)</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna, 100 mL</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Rozcieńcz do 5x (dostępny jest w 100x oryginalnym zestawie)</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-PM-05</td><td>1 mL na 500 mL media</td></tr><tr><td>Dodatek S7</td><td>Gibco</td><td>S0175</td><td>Dodane do epilife</td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek z użyciem fotografii poklatkowej do badania kinetyki proliferacji keratynocytów naskórka

Live Cell Imaging with Time Lapse Photography to Study Epidermal Keratinocyte Proliferation Kinetics

Obrazowanie żywymi komórkami to ewoluująca i nieco wymagająca metoda badania zachowań keratinocytów in vitro. Historycznie zachowanie podziału keratinocytów badano metodami takimi jak analiza klonalna, immunobarwienie oraz analiza cyklu komórkowego. Żadna z tych metod nie pozwala na analizę zachowania keratynocytów na poziomie pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym. W ciągu ostatniej dekady grupy wykorzystywały obrazowanie żywych komórek do identyfikacji komórek macierzystych keratinocytów oraz zadeklarowanych progenitorów bez konieczności oznakowania. Zidentyfikowano różnice w zachowaniu podziału każdej z grup, tempie nieuleczalnej różnicowania oraz długości cyklu komórkowego. Tutaj opisano metodę obrazowania żywych komórek keratinocytów z użyciem fotografii poklatkowej oraz jej analizy. Zaleca się wykorzystanie nieprzepuszczonych keratinocytów, aby jak najwierniej naśladować zachowania in vivo . Obrazowanie żywych komórek zapewnia unikalną możliwość badania zachowań komórek macierzystych i zaangażowanych progenitorów na poziomie pojedynczych komórek oraz określania losów podziałów, czasu trwania cyklu komórkowego oraz innych wskaźników proliferacji.

Pierwotne keratynocyty rosną w sposób stereotypowy, co można śledzić za pomocą obrazowania żywych komórek. Odtwarzacz multimedialny VLC służy do przeglądania nagrań. Czas do pierwszego podziału jest zmienny i może trwać kilka dni, w zależności od cech dawcy, takich jak wiek, stan zdrowia czy czynniki wzrostu obecne w środowisku in vitro . Po początkowym zasiewaniu keratinocyty mają niewielki, zaokrąglony wygląd (Rysunek 1). Po zasiewaniu keratynocyty tworzące kolonie zazwyczaj ulega...

Przedstawiamy tutaj metodę analizy obrazowania żywych komórek, którą można wykorzystać do ręcznego śledzenia linii keratynocytów przejścia 0 oraz umożliwia zbieranie metryk proliferacji, w tym losów podziału komórkowego i czasu trwania cyklu komórkowego.

Obrazowanie żywych komórek z użyciem fotografii poklatkowej do badania kinetyki proliferacji keratynocytów naskórka

Live-cell imaging is an evolving and somewhat challenging method to study keratinocyte behavior in vitro. Historically, keratinocyte division behavior was ...

Badania koncentrują się na chorobach hiperproliferacyjnych i hipoproliferacyjnych, takich jak łuszczyca i starzenie się, ze szczególnym uwzględnieniem wpływu tych schorzeń na proliferację komórek macierzystych i progenitorów. Identyfikacja konkretnych miejsc defektów proliferacyjnych umożliwi opracowanie bardziej precyzyjnie ukierunkowanych terapii. W przypadku ludzkiej skóry nie mieliśmy technik pozwalających śledzić zaangażowanych przodków przez wiele pokoleń.Wreszcie, obrazowanie żywych komórek pozwala śledzić zaangażowanego protoplastę przez wiele pokoleń in vitro i dostarczyło wielu wglądów w zachowanie zaangażowanych progenitorów u człowieka. Wykorzystaliśmy obrazowanie żywych komórek, aby pokazać, że choć wiemy, iż komórki macierzyste dzielą się rzadziej niż zaangażowane progenitory, to gdy już się dzielą, dzielą się szybciej. Gdy dochodzi do uszkodzenia tkanek, komórki macierzyste mogą reagować w formie szybkiego wymiany.Na początek pozyskaj keratinocyty ze świeżej ludzkiej skóry. Określ odpowiednią gęstość siewu dla testu i przeprowadź badania pilotażowe z użyciem próbek wielokrotnego rozcieńczenia od różnych dawców. Aby uzyskać równomierny rozkład komórek, należy aliquotować całkowite ośrodki wymagane dla wszystkich dołków przy określonym rozcieńczeniu do mikrorurki.Pipetą zgromadzić całkowitą liczbę komórek potrzebnych do osiągnięcia pożądanej gęstości do aliquoty i delikatnie odwrócić mikrorurkę, aby komórki były jednorodnie rozłożone. Teraz dodaj zawieszenie na tablicach. Po nałożeniu na talerz przesuń talerz w układzie krzyżowym trzy razy w górę, w dół, potem w lewo, w prawo i ostrożnie przenieś talerz do inkubatora.Po inkubacji zmień medium. Aby otworzyć inkubator systemu obrazowania, naciśnij duży trójkątny przycisk w lewym dolnym rogu. Gdy światło zapali się na zielono, umieść naczynie w otwartej zatoce i zamknij tacę tym samym przyciskiem.Teraz otwórz aplikację na komputerze i zaloguj się, używając odpowiednich danych identyfikacyjnych i hasła użytkownika. Następnie wybierz Harmonogram. Naciśnij przycisk Plus pod Harmonogramem, aby dodać tablicę do Harmonogramu.Wybierz Skanowanie na Harmonogram, a następnie kliknij Dalej. Następnie wybierz Nowy i wybierz Standard dla typu skanowania. Aby ustawić skanowanie, wybierz adherent Cell by Cell by Cell używając kanału fazowego przy 10x Objective, a następnie kliknij Dalej.Następnie wybierz naczynie, a następnie kliknij Następny. Wybierz pustą zatokę, aby umieścić jednostkę, a następnie kliknij Następny. Wybierz studnie do zeskanowania oraz liczbę obrazów na odwiert, a następnie kliknij Dalej.Nazwij eksperyment według pożądanej konwencji nazewnictwa. Stwórz mapę płyty eksperymentu na przyszłość. Następnie kliknij Ok.Teraz kliknij Dalej, aby kontynuować. Odłóż analizę do czasu zebrania danych, ponieważ analiza Cell by Cell musi zostać rozpoczęta po skanowaniu. Kliknij Następne.Ustaw częstotliwość obrazowania na 20-minutowe interwały, aby wiarygodnie śledzić mitozę, która występuje mniej więcej co 30 minut. Naciśnij "Dalej" i potwierdź ustawienia, aby rozpocząć eksperyment. Zmieniaj podłoże dla keratynocytów co 48 godzin.Aby zapewnić prawidłową orientację płyty, należy czekać na zakończenie pierwszego skanowania za każdym razem, gdy naczynie jest umieszczane w maszynie. Umieść tabliczkę tak, aby litery oznaczające rzędy znajdowały się po lewej stronie zatoki. Obserwuj dorosłe kolonie przez około dwa tygodnie, a noworodki przez około 10 dni, podczas których zatłoczenie pogarsza jakość analityczną.Gdy wszystkie studnie staną się nieruchome lub osiągną zbieg, kliknij zakładkę Widok i dwukrotnie kliknij eksperyment pod listą Ostatnich Oszustw. Kliknij ikonę Poziomy strzałką i poczekaj na uruchomienie narzędzia Eksport. Kliknij Jak wyświetlone, a następnie kliknij Następny.Następnie ręcznie kliknij każde pole widoku, aby wyeksportować, a następnie kliknij Następny. Wybierz, czy chcesz oglądać film, czy serię obrazów. Aby śledzić linię genealogii keratynocytów, wybierz opcję Film i wybierz wszystkie skany za pomocą ikony Wybierz Wszystko, a następnie kliknij Następne.Eksportuj z prędkością jednej klatki na sekundę w maksymalnej jakości po ustawieniu paska obok Jakości. Po wybraniu folderu docelowego i typu pliku nazwij plik i kliknij Eksport. Otwórz plik wideo za pomocą odtwarzacza multimedialnego i przewiń filmy, aby zidentyfikować rosnące kolonie.W VLC zrób zrzut ekranu kolonii do śledzenia i oznacz ją. Zidentyfikuj interesującą się kolonię na końcu lub po kilku dniach nagrywania wideo. Przewiń wideo i zidentyfikuj komórkę tworzącą kolonię.Zatrzymaj wideo, gdy komórka zaraz się podzieli, bo wydaje się kondensować. Zarejestruj znacznik czasu pokazany w lewym dolnym rogu. Zrób zrzut ekranu dywizji i oznacz ją tak, jak kolonia.Dokumentuj każdy podział za pomocą ręcznie rysowanego diagramu linii rodowej. Przełóż ręczne drzewo genealogiczne na arkusze danych zwane zielonymi arkuszami ze względu na kolor arkusza kalkulacyjnego. Na koniec użyj zielonych arkuszy do obliczenia proporcji podziałów proliferacyjnych i różniczkowych.Zidentyfikuj komórki macierzyste i zadeklarowane kolonie progenitorowe oraz określ czas trwania cyklu komórkowego. Pierwotne keratynocyty wykazywały stereotypowy przebieg wyglądu, zaczynając jako małe, zaokrąglone komórki przy początkowym zasiewaniu, a następnie stając się spłaszczone i ruchome. Zaczynają kondensować się przed podziałem i tworzą kolonie proliferacyjne lub kolonie terminalnie zróżnicowane o niejednorodnej morfologii.Gdy zielona folia zostanie zbudowana, można określić, które kolonie pochodzą z komórek macierzystych, a które z zaangażowanych przodków.

live-cell-imaging-with-time-lapse-photography-to-study-epidermal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Tutaj prezentujemy monitorowanie migracji komórek w czasie rzeczywistym w teście gojenia ran przy użyciu komórek nabłonka piersi MCF10A zubożonych w TIP60. Implementacja technik obrazowania żywych komórek w naszym protokole pozwala nam analizować i wizualizować ruch pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym i w czasie.

Obrazowanie na żywo migracji komórek nabłonka piersi po przejściowym wyczerpaniu TIP60

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.

Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

Tutaj opisujemy protokół systematycznej hodowli sferoidów naskórka w hodowli zawiesinowej 3D. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do stosowania w różnych typach tkanek nabłonkowych oraz do modelowania kilku chorób i stanów u ludzi.

Opracowanie wysokoprzepustowego systemu hodowli sferoidów naskórka do modelowania plastyczności komórek macierzystych keratynocytów

Protokół przedstawia nowe narzędzie do uproszczenia obrazowania przyżyciowego za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej.

Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

Połączenie iteracyjnego wybielania-rozszerzającego multipleksję (IBEX) oraz komercyjnego testu znakowania nukleotydów (Click-iT EdU) umożliwia wykrywanie i kategoryzację dzielących się typów komórek w wysoce dynamicznych procesach w stałych zamarzniętych przekrojach tkanek myszy. Ponadto nowatorski otwarty pipeline przetwarzania obrazów zapewnia wysokoprzepustowe pozyskiwanie i analizę obrazów.

Wysokoprzepustowy workflow obrazowania i analizy do oceny fenotypów komórek skóry i stanów proliferacji w próbkach tkanek

Protokół ten określa hodowlę świeżo pozyskanych (przepustka 0) keratynocytów do wykorzystania w obrazowaniu żywych komórek.

Generowanie hodowli pierwotnych do obrazowania żywych komórek keratinocytów

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek do śledzenia linii keratynocytów naskórka ludzkiego. Technika ta pozwala zbierać dane o kinetyce proliferacji i losach podziałów komórkowych, wspierając badania nad chorobami skóry.

Obrazowanie żywych komórek z użyciem fotografii poklatkowej do badania kinetyki proliferacji keratynocytów naskórka

Przeglądaj więcej filmów