Izolacja i identyfikacja szczepów bakteryjnych ze skóry lądowych

Badania te miały na celu opracowanie skutecznego protokołu pobierania mikrobioty skóry od dzikich lądowych oraz zapewnienie integralności mikrobiologicznej podczas przechowywania i obchodzenia się

Kluczowe wyzwania obejmują zapobieganie zanieczyszczeniu próbek, utrzymanie żywotności mikrobiologicznej podczas przechowywania oraz hodowlę powolnego wzrostu, aby w pełni ocenić różnorodność mikrobioty skóry.

Ustalono, że sól fizjologiczna wzbogacona glicerolem zachowuje integralność mikrobioty skóry podczas przechowywania i obchodzenia się z nimi, zapewnia spójną hodowlę bakterii i ulepsza strategie ochrony mikrobiologicznej na potrzeby badań ekologicznych i biotechnologicznych.

Protokół ten rozwiązuje problem braku ustandaryzowanych metod pobierania próbek, zachowuje i przetwarza bakterie skórne nadające się do hodowli oraz zapewnia integralność społeczności.

[Narrator] Na początek wysterylizuj pożywkę przez autoklawowanie w temperaturze od 121 do 134 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut. Po sterylizacji w autoklawie pozwól pożywce agarowej ostygnąć do około 45 do 50 stopni Celsjusza. Pod uprzednio wysterylizowanym okapem z przepływem laminarnym wlej schłodzone podłoże do sterylnych szalek Petriego. Gdy agar zastygnie, oznacz szalki Petriego rodzajem pożywki i datą przygotowania. Wymieszaj próbkę uzyskaną w terenie z roztworem, dociskając wacik do ścianek probówki, jednocześnie ściskając probówkę i dokładnie obracając wacik, 10 razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara i 10 razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Dokładnie wymieszać próbkę mikrobiologiczną przed przetwarzaniem. Przygotować seryjne rozcieńczenie próbki skórnej roztworem soli w zakresie od 10 do potęgi -1 do 10 do potęgi -6. Zaszczepić 100 mikrolitrów nierozcieńczonej próbki i seryjnie rozcieńczyć przygotowane płytki agarowe. Za pomocą sterylnej pętli w kształcie litery L rozprowadź próbkę po powierzchni podłoża agarowego, zapewniając równomierne rozprowadzenie bez wywierania nadmiernego nacisku. Odwróć zaszczepione płytki i umieść je w inkubatorze ustawionym na 20 do 25 stopni Celsjusza na trzy do pięciu dni, aby wspomóc wzrost bakterii mezofilnych i psychotropowych na skórze. Po inkubacji wybierz kolonie bakterii o odrębnej morfologii do dalszej analizy. Upewnij się, że kolonie są dobrze odizolowane i wykazują różny wygląd, taki jak różnice w kolorze, rozmiarze, kształcie, krawędzi, powierzchni lub fakturze. Aby przeprowadzić subkulturę wybranych kolonii, przenieś dobrze odizolowaną kolonię z oryginalnej płytki agarowej na świeżą płytkę agarową za pomocą pętli zaszczepiającej w warunkach aseptycznych. Smuguj kolonię, aby ją odizolować. A następnie odpowiednio go inkubuj. Skoordynowana procedura pobierania próbek od osobnika speleomantes italicus przy użyciu sterylnych narzędzi w warunkach polowych jest pokazana tutaj. Pobieranie próbek zostało przeprowadzone przez dwóch operatorów przy użyciu sterylnych rękawiczek i wacików, aby zminimalizować stres u i zapewnić precyzję podczas obsługi. Wymaz został natychmiast przeniesiony do roztworu soli fizjologicznej z 20% glicerolem w celu zachowania integralności mikrobiologicznej podczas transportu do laboratorium. Przedstawiono porównanie gęstości zbiorowisk drobnoustrojów przechowywanych w roztworze soli z dodatkiem glicerolu i bez niego. Obciążenie bakteryjne w magazynie soli fizjologicznej bez glicerolu było istotnie niższe niż w grupie kontrolnej i soli fizjologicznej z glicerolem. Społeczność mikrobiologiczna przechowywana w soli fizjologicznej z glicerolem wykazywała podobne obciążenie bakteryjne jak kontrola, co wskazuje na zachowanie integralności mikrobiologicznej. Najlepsze zachowanie społeczności mikrobiologicznej zaobserwowano w soli fizjologicznej z glicerolem przechowywanym w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wykazując najbardziej stabilne obciążenie bakteryjne w czasie. Przechowywanie w samej soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej powodowało najwyższy wzrost bakterii, co wskazuje na zanieczyszczenie mikrobiologiczne lub selektywne promowanie niektórych grup bakterii. Zamrożenie w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza zmniejszyło obciążenie bakteryjne, co sugeruje, że niskie temperatury negatywnie wpłynęły na przeżycie drobnoustrojów.