Name: Zastosowanie montażu in vivo do wysokowydajnej budowy plazmidu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Poznaj metodę montażu in vivo do klonowania DNA w bakteriach E. coli z wykorzystaniem wewnętrznych enzymów naprawczych. Protokół osiąga do 99% wydajności klonowania przy niższych kosztach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HGB jest finansowany przez Canada Graduate Scholarships - program magisterski od Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) oraz Dziekanat Doktorat (University of Saskatchewan). Prace te były wspierane przez NSERC Discovery Grant (RGPIN-2021-03066), fundusze na rozpoczęcie działalności (dla JLT) z University of Saskatchewan oraz Canada Foundation for Innovation John R. Evans Leaders Fund (numer grantu 42269 dla JLT). Autorzy dziękują panu Ericowi Toombsowi za dostarczenie zdjęcia przedstawiającego kwantyfikację DNA za pomocą spektroskopii UV.

1. Zaprojektuj startery lub fragmenty DNA z homologicznymi końcami
<ol>
	<li>Użyj edytora tekstu lub specjalistycznego oprogramowania do analizy DNA, aby sztucznie złożyć żądany plazmid. 
	UWAGA: Często pomocne jest kodowanie kolorami fragmentów DNA z różnych źródeł i podkreślanie regionów homologicznych, które będą używane na dalszych etapach montażu. Ponadto pomocne jest również kodowanie kolorami homologicznego DNA, aby zapewnić montaż kierunkowy.</li>
	<li>Zaprojektuj startery, które wiążą się z każdym fragmentem DNA i zawierają 15-50 pz homologicznej sekwencji DNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)2,15.
	<ol>
		<li>Aby zwiększyć wydajność IVA, upewnij się, że homologiczne fragmenty DNA mają temperaturę topnienia 47-52 °C2. 
		UWAGA: Temperaturę topnienia można określić za pomocą oprogramowania online18 lub wzoru: Temperatura topnienia = 64,9 + 41 * (nG + nC - 16,4)/(nA + nT + nG + nC), gdzie n = liczba G, C, A lub T w sekwencji6,19.</li>
		<li>Unikaj starterów z bardzo powtarzającymi się sekwencjami, takich jak CATCATCATCATCATCATCAT, które kodują dla znacznika HIS, ponieważ mogą one wprowadzać niestabilność20. Jeśli do zastosowań takich jak wstawienie znacznika poli-HIS potrzebna jest końcowa powtarzalna sekwencja aminokwasów, użyj alternatywnych kodonów, takich jak CATCACCATCATCACCAC, aby zmniejszyć powtarzalność sekwencji kwasu nukleinowego. 
		UWAGA: Podkłady można zamówić u dowolnego preferowanego dostawcy. Jeśli fragmenty DNA mają być syntetyzowane, do zsyntetyzowanego fragmentu DNA powinny zostać włączone końce homologiczne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Amplifikacja produktów DNA zawierających homologiczne końce
<ol>
	<li>Wyizoluj plazmidowe DNA lub genomowe matryce DNA za pomocą standardowych dostępnych na rynku zestawów do izolacji DNA lub lizy alkalicznej6,17.</li>
	<li>Użyć matrycy DNA (z kroku 2.1) i starterów zawierających regiony homologiczne (krok 1.2) w reakcji PCR z dostępną w handlu polimerazą o wysokiej wierności. Aby ograniczyć przenoszenie matrycy DNA w dalszych reakcjach, należy użyć małej ilości matrycowego DNA (20 pg-1 ng) w każdej reakcji. Zapoznaj się z zaleceniami producenta dotyczącymi składników mieszaniny do reakcji PCR specyficznych dla enzymów i zalecanych warunków cyklicznych PCR. Kontynuuj reakcję PCR.
	<ol>
		<li>Ustaw reakcje PCR (50 μL) w celu amplifikacji fragmentów DNA pokazanych na <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2 tak, aby zawierały 100 μM dNTP, 0,2 μM każdego startera DNA, matrycę DNA (50 pg pSU19 i 1 ng pSU18mCherry), 1x mieszaninę buforu reakcyjnego PCR zawierającą Mg2+ (2 mM stężenie końcowe) i 1 U polimerazy DNA o wysokiej wierności.</li>
		<li>Użyj programu cyklicznego PCR z przyłożeniem, aby wzmocnić pSU19 i mCherry (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Ustawić początkowy etap denaturacji na 95 °C na 5 minut, następnie 10 cykli po 95 °C przez 15 s, 55 °C -0,5 °C na cykl przez 15 s i 72 °C przez 1 minutę, a następnie 20 dodatkowych cykli po 95 °C przez 15 s, 50 °C przez 15 s, i 72 °C przez 1 min. Zakończyć cykl PCR ostatnim etapem przedłużania w temperaturze 72 °C przez 10 min. 
		UWAGA: Jeśli szkielet plazmidowy ma być amplifikowany, dostosuj ilość matrycy DNA w oparciu o masę cząsteczkową: z ~20 pg/1 kbp plazmidowego DNA na 50 μL reakcji PCR (50 pg DNA dla pSU19 (pokazano)). Ponadto należy dostosować cykle PCR, aby zminimalizować liczbę mutacji wprowadzanych podczas amplifikacji: do amplifikacji szkieletów plazmidowych wystarczy zaledwie 20-25 cykli PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji PCR usuń podwielokrotność (2 μl) reakcji PCR, połącz z barwnikiem ładującym (do stężenia 1x) i oddziel fragmenty DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym21. Użyj transiluminatora ultrafioletowego (UV) lub LED, aby uwidocznić fragmenty DNA, które migrowały w żelu agarozowym. Określ, czy produkty PCR są unikalne i porównaj produkty z drabiną DNA, aby sprawdzić, czy mają oczekiwaną masę cząsteczkową (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). Jeśli nie zostaną uwidocznione żadne produkty PCR o prawidłowej masie cząsteczkowej, należy zapoznać się z zaleceniami producenta dotyczącymi optymalizacji reakcji PCR. 
	UWAGA: Gdy produkty PCR nie są unikalne, ale występuje obfity fragment DNA odpowiadający oczekiwanej masie cząsteczkowej, można uniknąć dodatkowej reakcji PCR.</li>
	<li>Jeżeli w żelu agarozowym znajduje się wiele fragmentów DNA, należy wyciąć fragment DNA odpowiadający oczekiwanej masie cząsteczkowej z żelu agarozowego i użyć zestawu do ekstrakcji żelu agarozowego w celu odzyskania fragmentu DNA.</li>
	<li>Aby usunąć metylowany matrycowy DNA z reakcji PCR, dodaj 1 μl DpnI bezpośrednio do probówki reakcyjnej. Reakcje inkubować w temperaturze 37°C przez 15 minut do nocy. 
	UWAGA: Ten opcjonalny krok jest wysoce zalecany w celu ograniczenia ilości matrycowego DNA, które jest przenoszone w dalszych reakcjach. Jednak ten krok można pominąć, jeśli w reakcji PCR stosuje się bardzo niskie stężenia matrycowego DNA.</li>
	<li>Użyj zestawu do oczyszczania kwasów nukleinowych, aby usunąć pozostałości enzymów, soli, dimerów starterów i innych niepożądanych niskocząsteczkowych produktów DNA powstałych w wyniku testów enzymatycznych. 
	UWAGA: Kroki 2.1-2.6 można pominąć, jeśli syntetyzowane są fragmenty DNA.</li>
	<li>Określić ilościowo stężenie DNA w oczyszczonych fragmentach DNA za pomocą spektrofotometrii lub oceny żelu.</li>
</ol>
3. IVA (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
<ol>
	<li>Oblicz ilość DNA wymaganą do każdej reakcji IVA (zalecane jest 25-50 ng plazmidowego DNA). Użyj większych ilości plazmidowego DNA dla plazmidów o większej masie cząsteczkowej (np. dla plazmidów o wielkości 2,3 kpz użyj 25 ng plazmidu, ale gdy plazmidy mają 9 kbp, użyj 50 ng w każdej reakcji). Obliczyć objętość insercji DNA potrzebną do reakcji; użyj stosunku molowego plazmidu 1:3 lub 1:5:wstaw DNA. 
	UWAGA: Kalkulatory biologiczne online lub poniższe wzory mogą być używane do obliczenia ilości molowej dwuniciowego fragmentu DNA i określenia stosunku molowego każdego fragmentu DNA. 
	Do obliczenia ilości molowej dwuniciowego fragmentu DNA używamy następującego wzoru: pmol = (waga w ng) × 1,000 / (pary zasad × 650 daltonów). Ponadto stosunki molowe można obliczyć ze wzoru: wstawka masowa (g) = pożądany stosunek molowy wstawienia do plazmidu × masy plazmidu (g) × stosunek długości wstawki do plazmidu6.</li>
	<li>Połączyć obliczoną objętość plazmidu i wprowadzić DNA do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i trzymać na lodzie.</li>
	<li>Przenieść plazmid i wstawić mieszaninę DNA z kroku 3.2 do podwielokrotności (25-100 μL) rozmrożonego chemicznie kompetentnego E. coli (np. E. coli DH5a;22). 
	UWAGA: Objętość użytych kompetentnych komórek zależy od objętości mieszaniny plazmidu i wstawienia DNA; Ta mieszanina nie powinna przekraczać 10% objętości właściwych komórek.</li>
	<li>Kontynuuj transformację szoku cieplnego23.
	<ol>
		<li>Mieszaninę chemicznie kompetentnych bakterii E. coli i DNA inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 1 minutę, a następnie umieścić probówkę w lodzie na 2 minuty.</li>
		<li>W asepcie przenieść LB do probówki, aby uzupełnić objętość do 1 ml.</li>
		<li>Przenieść objętość 1 ml do szklanej probówki hodowlanej i umieścić w inkubatorze do wytrząsania ustawionym na 37 °C, 220 obr./min lub w temperaturze zalecanej dla odzyskania szczepu bakteryjnego i/lub plazmidu (typowy zakres od 25 °C do 37 °C) i umożliwić wytworzenie markera selekcji antybiotyku kodowanego przez plazmid.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po odzyskaniu komórek przez 30 minut do 1 godziny, umieścić podwielokrotność (100 μl z 1 000 μl) reakcji przemiany na stałym pożywce selekcyjnej i użyć sterylnego rozsiewacza komórek do rozproszenia podwielokrotności na płytce hodowli agarowej. Zebrać resztę przekształconych komórek przez odwirowanie (13 000 × g przez 1 minutę), wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl sterylnego podłoża i umieścić na stałym pożywce selekcyjnej, jak powyżej. Pozwól cieczy wchłonąć się w podłoże stałe przez 30 minut, odwróć płytki hodowlane. i umieścić je na noc w inkubatorze w temperaturze zalecanej dla szczepu bakteryjnego i/lub plazmidu.</li>
</ol>
4. Badania przesiewowe pod kątem prawidłowego montażu plazmidu
<ol>
	<li>Po inkubacji (etap 3.5) wyjąć płytki hodowlane z inkubatora i policzyć kolonie przez bezpośrednie zliczenie, jeśli na każdej płytce hodowlanej znajduje się kilka izolowanych kolonii bakterii. Wybierz kilka kolonii (1-10) do badań przesiewowych, aby określić, czy zawierają one pożądany złożony plazmid.
	<ol>
		<li>Przenieś sterylne pożywki wzrostowe uzupełnione odpowiednimi antybiotykami do sterylnych probówek hodowlanych (szklanych lub plastikowych). Zaszczepić pożywkę hodowlaną, dotykając 1 kolonii sterylną igłą lub pętlą transferową i przenieść komórki do pożywki z probówką hodowlaną za pomocą igły do przenoszenia. Umieścić probówki hodowlane w inkubatorze z wytrząsaniem i inkubować przez 16-18 godzin w temperaturze zalecanej dla szczepu bakteryjnego i/lub plazmidu (typowy zakres od 25 °C do 37 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia wyizoluj plazmidowe DNA z kultur bakteryjnych metodą alkalicznej lizy6 lub za pomocą dostępnego na rynku zestawu do izolacji plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Ustal, czy plazmidy są prawidłowo złożone.
	<ol>
		<li>Określić ilościowo stężenie DNA w izolowanych plazmidach za pomocą spektrofotometrii lub oceny żelu.</li>
		<li>Użyć podwielokrotności (50-150 ng) plazmidowego DNA do diagnostycznej reakcji trawienia restrykcyjnego (10 μl końcowej objętości). Wybierz enzymy restrykcyjne na podstawie miejsca, w którym oczekuje się, że rozszczepią złożone plazmidowe DNA. 
		UWAGA: Zalecamy dwie oddzielne reakcje: (1) traktowanie plazmidowego DNA enzymem restrykcyjnym, który ma rozszczepić plazmid w jednym miejscu oraz (2) traktowanie plazmidowego DNA dwoma enzymami restrykcyjnymi, które mają wyciąć całość lub część wstawionego fragmentu DNA. Enzymy restrykcyjne są dostępne w handlu i należy je stosować zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Po zakończeniu reakcji enzymu restrykcyjnego połącz z barwnikiem ładującym (do stężenia 1x), załaduj całą mieszaninę na żel agarozowy i oddziel fragmenty DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym21. Użyj transiluminatora UV lub LED, aby uwidocznić fragmenty DNA, które migrowały w żelu agarozowym. Porównaj ograniczone fragmenty DNA z drabinką masy cząsteczkowej, aby określić, czy są to oczekiwane masy cząsteczkowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Zwróć uwagę na plazmidy z oczekiwanymi wzorcami ograniczenia enzymów (zwane klonami dodatnimi); Wyrzuć probówki zawierające plazmidy, które nie mają oczekiwanego wzorca restrykcji (zwane klonami ujemnymi).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby upewnić się, że dodatnie klony mają oczekiwaną sekwencję nukleotydów, wyślij podwielokrotność dodatnich klonów plazmidu do sekwencjonowania. 
	UWAGA: Zalecane jest sekwencjonowanie całego plazmidu (np. sekwencjonowanie nanoporowe).</li>
</ol>

<ol><li>Bertero, A., Brown, S., Vallier, L. Methods of cloning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertero%2C+A+%22Basic+Science+Methods+for+Clinical+Researchers%22">Basic Science Methods for Clinical Researchers</a>. Chapter 2, Academic Press. 19-39 (2017).</li>
<li>Garcia-Nafria, J., Watson, J. F., Greger, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IVA+cloning%3A+A+single-tube+universal+cloning+system+exploiting+bacterial+in+vivo+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">IVA cloning: A single-tube universal cloning system exploiting bacterial in vivo assembly.</a> Sci Rep. 6, 27459(2016).</li>
<li>Bubeck, P., Winkler, M., Bautsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cloning+by+homologous+recombination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid cloning by homologous recombination in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 21 (15), 3601-3602 (1993).</li>
<li>Avilan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembling+multiple+fragments%3A+the+Gibson+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembling multiple fragments: the Gibson assembly.</a> Methods Mol Biol. 2633, 45-53 (2023).</li>
<li>Stukenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Marburg+Collection%3A+A+Golden+Gate+DNA+assembly+framework+for+synthetic+biology+applications+in+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">The Marburg Collection: A Golden Gate DNA assembly framework for synthetic biology applications in Vibrio natriegens.</a> ACS Synth Biol. 10 (8), 1904-1919 (2021).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Engler, C., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golden+Gate+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Golden Gate cloning.</a> Methods Mol Biol. 1116, 119-131 (2014).</li>
<li>Ma, H., Kunes, S., Schatz, P. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+construction+by+homologous+recombination+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmid construction by homologous recombination in yeast.</a> Gene. 58 (2-3), 201-216 (1987).</li>
<li>Cao, P., Wang, L., Zhou, G., Wang, Y., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+of+multiple+DNA+fragments+through+direct+transformation+of+PCR+products+into+E.+coli+and+Lactobacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly of multiple DNA fragments through direct transformation of PCR products into E. coli and Lactobacillus.</a> Plasmid. 76, 40-46 (2014).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+rearrangement+of+plasmid+DNA+during+transformation+of+Escherichia+coli+with+linear+plasmid+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deletion and rearrangement of plasmid DNA during transformation of Escherichia coli with linear plasmid molecules.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8905-8917 (1986).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Jackson, V., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intramolecular+recyclization+and+deletion+formation+following+transformation+of+Escherichia+coli+with+linearized+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intramolecular recyclization and deletion formation following transformation of Escherichia coli with linearized plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8919-8932 (1986).</li>
<li>Sung, W. L., Zahab, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+directed+by+single-stranded+crossover+linkers%3A+specific+deletion+of+the+amino-terminal+region+of+the+beta-galactosidase+gene+in+pUC+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22DNA%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination directed by single-stranded crossover linkers: specific deletion of the amino-terminal region of the beta-galactosidase gene in pUC plasmids.</a> DNA. 6 (4), 373-379 (1987).</li>
<li>Mandecki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-directed+double-strand+break+repair+in+plasmids+of+Escherichia+coli%3A+a+method+for+site-specific+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19), 7177-7181 (1986).</li>
<li>Jones, D. H., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+recombination+and+site-specific+mutagenesis+by+placing+homologous+ends+on+DNA+using+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends on DNA using polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 10 (1), 62-66 (1991).</li>
<li>Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+should+be+simple%3A+Escherichia+coli+DH5alpha-mediated+assembly+of+multiple+DNA+fragments+with+short+end+homologies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cloning should be simple: Escherichia coli DH5alpha-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies.</a> PLoS One. 10 (9), e0137466(2015).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+plasmid+cloning+with+a+universal+MCS+design+and+bacterial+in+vivo+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simplified plasmid cloning with a universal MCS design and bacterial in vivo assembly.</a> BMC Biotechnol. 21 (1), 24(2021).</li>
<li>Braun, H. G., Kanwal, N., Rivera Lopez, L. F., Thomassin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+plasmid+series+for+rapid+sub-cloning+and+use+in+various+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generation of a plasmid series for rapid sub-cloning and use in various Enterobacteriaceae.</a> J Biosci Bioeng. 138 (6), 478-487 (2024).</li>
<li>Kibbe, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OligoCalc%3A+an+online+oligonucleotide+properties+calculator%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator.</a> Nucleic Acids Res. 35 (Web Server issue), W43-W46 (2007).</li>
<li>Wallace, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+of+synthetic+oligodeoxyribonucleotides+to+phi+chi+174+DNA%3A+the+effect+of+single+base+pair+mismatch%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch.</a> Nucleic Acids Res. 6 (11), 3543-3557 (1979).</li>
<li>Bzymek, M., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+repetitive+DNA+sequences%3A+The+role+of+replication+in+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Instability of repetitive DNA sequences: The role of replication in multiple mechanisms.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (15), 8319-8325 (2001).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inoue+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+E.+coli%3A+%26%2334%3Bultra-competent%26%2334%3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">The inoue method for preparation and transformation of competent E. coli: &#34;ultra-competent&#34; cells.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Fürste, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+plasmid+RP4+primase+region+in+a+multi-host-range+tacP+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector.</a> Gene. 48 (1), 119-131 (1986).</li>
<li>Bäumler, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+iron+regulated+locus+of+Salmonella+typhi%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Identification of a new iron regulated locus of Salmonella typhi.</a> Gene. 183 (1-2), 207-213 (1996).</li>
<li>Godiska, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+plasmid+vector+for+cloning+of+repetitive+or+unstable+sequences+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 38 (6), e88(2010).</li>
<li>Watson, J. F., Garcia-Nafria, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+DNA+assembly+using+common+laboratory+bacteria%3A+A+re-emerging+tool+to+simplify+molecular+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: A re-emerging tool to simplify molecular cloning.</a> J Biol Chem. 294 (42), 15271-15281 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Najważniejszym krokiem do udanego klonowania IVA jest projekt fragmentu DNA i startera. Wydajność IVA ulega znacznej poprawie, gdy fragmenty homologiczne są zaprojektowane tak, aby miały długość co najmniej 15 pz i temperaturę topnienia około 47–52 °C. Opublikowano szczegółowe badanie dotyczące optymalizacji projektowania fragmentów IVA16. Kolejnym ważnym krokiem do uzyskania wysokiej wydajności klonowania jest użycie jak najmniejszej ilości matrycowego DNA na etapach amplifikacji PCR. Aby jeszcze...

Klonowanie molekularne obejmuje szereg technik laboratoryjnych potrzebnych do produkcji plazmidów zawierających specyficzne rekombinowane DNA1. Te wszechobecne techniki często działają jako wąskie gardło w eksperymentalnym przepływie pracy2. Wiele technik klonowania molekularnego opiera się na składaniu fragmentów DNA in vitro przy użyciu serii reakcji enzymatycznych przed przekształceniem w szczep gospodarza (np. Escherichia coli DH5a) w celu amplifikacji3,4,5,6,7. Ponieważ metody składania plazmidów in vitro opierają się na enzymach, zakup lub oczyszczanie enzymów może być zarówno kosztowne, jak i czasochłonne.
Montaż in vivo (IVA) to metoda klonowania molekularnego, która opiera się na międzycząsteczkowej rekombinacji fragmentów DNA w odpowiednim gospodarzu8,9,10,11,12. Podstawą tej metody była obserwacja, że powszechnie stosowane szczepy klonowania E. coli mogą pośredniczyć w międzycząsteczkowej rekombinacji jednoniciowego startera z plazmidem rozszczepionym przez enzymy restrykcyjne13. Zastosowanie PCR do generowania homologicznych końcówek DNA do składania plazmidu u E. coli zostało opisane w latach 90., a metoda ta została nazwana rekombinacją PCR3,14. Skuteczność rekombinacji PCR wyniosła około 50%14. Jednak metoda ta nie została powszechnie przyjęta, prawdopodobnie ze względu na wysoki koszt starterów i ryzyko wprowadzenia niepożądanych mutacji przy użyciu polimeraz o niskiej wierności do amplifikacji dużych fragmentów DNA. Wady te były znaczące w latach dziewięćdziesiątych XX wieku i można było ich uniknąć, stosując metody klonowania in vitro, takie jak klonowanie za pośrednictwem enzymów restrykcyjnych.
W ostatnich latach koszt starterów spadł, a nowe komercyjne polimerazy zwiększyły wierność amplifikacji PCR. W rezultacie, rekombinacja PCR została ponownie przeanalizowana jako szybka i opłacalna technika klonowania molekularnego i przemianowana na IVA2,9,15,16. Wraz ze wzrostem wykonalności, IVA było dalej badane, a metoda została zoptymalizowana pod kątem osiągnięcia wydajności klonowania do 99%16. Optymalizacje pozwoliły zidentyfikować cechy homologicznego DNA, takie jak liczba par zasad i temperatura topnienia, które maksymalizują wydajność rekombinacji in vivo2,16. Dalsza analiza wykazała, że do 6 fragmentów DNA o wielkości od 150 pz do 7 kpz może być efektywnie złożonych przez IVA15. Ponadto, nasza grupa niedawno użyła IVA do złożenia serii plazmidów z różnymi kasetami oporności na antybiotyki i pochodzeniem replikacji17. W tym badaniu klonowanie IVA było bardzo skuteczne (71-100%) przy niewielkiej liczbie klonów testowanych dla każdego plazmidu (n = 2)17. Poniżej opisujemy protokół IVA stosowany przez nasze laboratorium.

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus Drabinka DNA</td><td>FroggaBio</td><td>DM015-R500</td><td>Marker masy cząsteczkowej DNA</td></tr><tr><td>AccuReady M Pojedynczy kanał 0,5-10 &mikro; L</td><td>Bulldog Bio</td><td>BPP020</td><td>Pipety do przenoszenia cieczy</td></tr><tr><td>AccuReady M Zestaw pipet jednokanałowych</td><td>Bulldog Bio</td><td>BPK100</td><td>Pipety do przenoszenia cieczy</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003.1</td><td>Środek zestalający do podłoża wzrostowego</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td>Wytwarzanie żeli agarozowych do elektroforezy DNA</td></tr><tr><td>Biometra TOne&nbsp;</td><td>Analytikjena</td><td>846-2-070-301</td><td>Termocykler</td></tr><tr><td>Nakrętki do szklanych probówek</td><td>hodowlanych Fisher Scientific</td><td>14-957-91</td><td>Nakrętki wielokrotnego użytku do szklanych probówek hodowlanych</td></tr><tr><td>Startery DNA</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy</td><td>Wiązanie i amplifikacja matrycowego DNA w reakcji PCR</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>Rozszczepienie metylowanego matrycy DNA po amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101L</td><td>Enzym restrykcyjny, dostarczany z odpowiednim buforem</td></tr><tr><td>Mikroprobówki Eppendorf 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td>Mikroprobówka, 1,5 mL, stożkowa podstawa, PP, dołączona płaska nasadka, formowane podziałki i matowa przestrzeń do pisania</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAL0748203</td><td>Wizualizacja/czynnik interkalacyjny DNA, toksyczny</td></tr><tr><td>EZ-10 Kolumna spinowa Plazmid DNA Miniprep Kit</td><td>Biobasic</td><td>BS614</td><td>Izoluj plazmidowe DNA z nocnych kultur bakteryjnych</td></tr><tr><td>System GelDoc Go-Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>12009077</td><td>Obrazowanie Żele DNA</td></tr><tr><td>Szklane probówki</td><td>hodowlane Fisher Scientific</td><td>14-925E</td><td>Szklane probówki</td></tr><tr><td>hodowlane myGel&nbsp; Mini system do elektroforezy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Z742288 System używany do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>Określanie stężenia DNA</td></tr><tr><td>PCR Oczyszczanie do sekwencjonowania DNA</td><td>Biobasic</td><td>BT5100</td><td>Purify PCR produkty&nbsp;</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.011</td><td>Szalka Petriego 92 x 16 mm, PS, przezroczysta, z krzywkami wentylacyjnymi</td></tr><tr><td>Końcówka do pipet, 1000 &mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.305</td><td>Końcówki do pipet 100-1000 i mikro; L</td></tr><tr><td>Końcówka do pipet, 2,5 i mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3010.265</td><td>Końcówki do pipet do 2,5 i mikro; L</td></tr><tr><td>Końcówka do pipet, 20 i mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3020.200</td><td>Końcówki do pipet do 20 i mikro; L</td></tr><tr><td>Końcówka do pipet, 200 i mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3030.020</td><td>Końcówki do pipet 1-200 i mikro; L</td></tr><tr><td>Sól (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>Składnik pożywki bakteryjnej (10 g/L)</td></tr><tr><td>Pojedyncza 0,2 ml probówka PCR z płaską nakrętką</td><td>FroggaBio</td><td>TF-1000</td><td>Probówki PCR</td></tr><tr><td>Trypton (bakteriologiczny)</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402.5</td><td>Składnik pożywki bakteryjnej (10 g/L)</td></tr><tr><td>VeriFi DNA polimeraza</td><td>PCR Biosystems</td><td>PB10.42-01</td><td>Polimeraza o wysokiej wierności, bufor PCR zawierający Mg2+ i dNTPs jest dostarczany z zakupem</td></tr><tr><td>Xba I</td><td>New England Biolabs</td> Enzym restrykcyjny <td>R0145S</td><td>, dostarczany z odpowiednim buforem</td></tr><tr><td>Ekstrakt</td> drożdżowy <td>BioShop Canada</td><td>YEX401.205</td><td>Składnik pożywki bakteryjnej (5 g/L)</td></tr></tbody></table>

zastosowanie montażu in vivo do wysokowydajnej budowy plazmidu

Use of In Vivo Assembly for High-efficiency Plasmid Construction

Montaż in vivo (IVA) to metoda klonowania molekularnego, która wykorzystuje wewnętrzne enzymy obecne u bakterii, które promują międzycząsteczkową rekombinację fragmentów DNA w celu złożenia plazmidów. Metoda ta polega na przekształcaniu fragmentów DNA z regionami homologii 15-50 pz w powszechnie stosowane laboratoryjne szczepy Escherichia coli, a bakterie wykorzystują niezależny od RecA szlak naprawczy do składania fragmentów DNA w plazmid. Metoda ta jest szybsza i bardziej opłacalna niż wiele metod klonowania molekularnego, które opierają się na składaniu plazmidów in vitro przed przekształceniem w szczepy E. coli. Dzieje się tak dlatego, że metody in vitro wymagają zakupu specjalistycznych enzymów i przeprowadzenia sekwencyjnych reakcji enzymatycznych, które wymagają inkubacji. Jednak w przeciwieństwie do metod in vitro, nie wykazano eksperymentalnie, aby IVA składało liniowe plazmidy. Tutaj dzielimy się protokołem IVA używanym przez nasze laboratorium do szybkiego składania plazmidów i subklonowania fragmentów DNA między plazmidami o różnym pochodzeniu replikacji i markerami oporności na antybiotyki.

W niniejszej pracy, jako przykład zastosowania metody IVA, przeprowadzono proces re-klonowania otwartej ramki odczytu mCherry do miejsca wielokrotnego klonowania plazmidu pSU19 w celu otrzymania plazmidu identycznego z pSU19mCherry (Rysunek 3)17. Startery odpowiednie dla metody IVA zaprojektowano zgodnie z krokami 1.1 i 1.2 protokołu. Następnie, przy użyciu zestawu do izolacji plazmidów, wyizolowano pSU19 oraz pSU18mCherry, które posłużyły odpowiednio jako matryce w r...

Montaż in vivo to metoda klonowania niezależna od ligacji, która opiera się na wewnętrznych enzymach naprawy DNA u bakterii w celu złożenia fragmentów DNA przez rekombinację homologiczną. Protokół ten jest zarówno czasochłonny, jak i opłacalny, ponieważ wymagana jest niewielka liczba odczynników, a skuteczność klonowania może sięgać nawet 99%.

Zastosowanie montażu in vivo do wysokowydajnej budowy plazmidu

In vivo assembly (IVA) is a molecular cloning method that uses intrinsic enzymes present in bacteria that promote intermolecular recombination of DNA ...

Moje badania doktoranckie koncentrują się na badaniu białek, które są wydzielane przez bakterie. W szczególności chcę się dowiedzieć, czy niektóre z tych wydzielanych białek są ważne dla wywoływania infekcji u ludzi. Głównym wyzwaniem w pracy z niedawno wyizolowanymi bakteriami klinicznymi jest ich oporność na antybiotyki, co utrudnia techniki genetyki molekularnej, które opierają się na selekcji antybiotyków, takie jak delecje genów i komplementacja genetyczna.Ten protokół klonowania jest szybszy i bardziej opłacalny, ponieważ IVA eliminuje potrzebę stosowania wyspecjalizowanych enzymów i sekwencyjnych reakcji enzymatycznych do składania plazmidów przed transformacją E. coli. Aby rozpocząć, uruchom specjalistyczne oprogramowanie do analizy DNA w systemie komputerowym. Sztucznie zmontuj żądany plazmid.Następnie zaprojektuj startery, które wiążą się z każdym fragmentem DNA. Połącz DNA wyizolowane za pomocą komercyjnych zestawów ze starterami zawierającymi homologiczne DNA w probówce do PCR. Następnie amplifikuj DNA za pomocą serii PCR.Po zakończeniu reakcji PCR odpipetować podwielokrotność dwóch mikrolitrów. Połącz go z barwnikiem ładującym. Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym na 1% żelu agarozowym, aby oddzielić fragmenty DNA.Następnie użyj oświetlacza ultrafioletowego lub LED trans, aby uwidocznić fragmenty. Następnie dodaj jeden mikrolitr DpnI bezpośrednio do probówki reakcyjnej PCR, aby usunąć metylowaną matrycę DNA. Inkubować reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut lub przez noc.Za pomocą zestawu do oczyszczania kwasów nukleinowych usuń resztki enzymów, soli, dimerów starterów i produktów DNA o niskiej masie cząsteczkowej. Określić ilościowo stężenie DNA w oczyszczonych fragmentach za pomocą spektrofotometrii. Uzyskaj czyste amplifikowane plazmidowe DNA.Obliczyć ilość plazmidu i wstawić DNA wymagane dla każdej reakcji składania in vivo. Teraz połącz obliczone objętości plazmidu i włóż DNA do wstępnie schłodzonej 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Umieść rurkę na lodzie.Następnie odpipetować od 25 do 100 mikrolitrów rozmrożonej, chemicznie kompetentnej Escherichia coli do probówki. Przenieść mieszaninę DNA do podwielokrotności. Aby przeprowadzić transformację szoku cieplnego, najpierw inkubuj mieszaninę E. coli i DNA na lodzie przez 30 minut.Przenieś probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza na jedną minutę. Następnie przenieś go z powrotem na lód na dwie minuty. Aseptycznie przenieś pożywkę LB do probówki, aby uzupełnić objętość do jednego mililitra.Przenieś mieszaninę o objętości jednego mililitra do szklanej probówki hodowlanej. Następnie umieść go w inkubatorze wstrząsającym w celu odzyskania i wytworzenia markera selekcji antybiotyków kodowanego przez plazmid. Po odzysku należy umieścić około 100 do 1 000 mikrolitrów reakcji przemiany na stałym podłożu selekcyjnym.Użyj sterylnego rozsiewacza komórek, aby rozproszyć podwielokrotność na płytce hodowlanej ślimaka. Odwirować pozostałe przekształcone komórki w temperaturze 13 000 G przez jedną minutę. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 mikrolitrach sterylnego podłoża.Umieść ponownie zawieszone komórki na stałym podłożu selekcyjnym, jak pokazano wcześniej. Następnie odwróć płytki hodowlane. Umieść je na noc w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wyjąć z inkubatora płytki hodowlane zawierające przekształcone kultury E. coli. Policz kolonie bezpośrednio, aby je wyliczyć. Przenieść sterylne pożywki wzrostowe uzupełnione odpowiednimi antybiotykami do sterylnych probówek hodowlanych.Za pomocą sterylnej pętli transferowej zbierz kolonię i zaszczep komórki w pożywce hodowlanej. Inkubować probówki hodowlane w inkubatorze z wytrząsaniem. Następnego dnia wyizoluj plazmidowe DNA z kultur bakteryjnych za pomocą dostępnego na rynku zestawu do izolacji plazmidu.Aby określić, czy plazmidy są prawidłowo złożone, użyj spektrofotometrii do ilościowego określenia stężenia DNA. Odpipetować od 50 do 150 nanogramów porcji plazmidowego DNA w celu przeprowadzenia diagnostycznej reakcji trawienia restrykcyjnego. Dodaj enzymy restrykcyjne wybrane na podstawie ich oczekiwanych miejsc rozszczepienia na plazmidowym DNA.Po zakończeniu reakcji restrykcji dodaj barwnik ładujący do probówki. Załaduj całą mieszaninę na 1% żel agarozowy i wykonaj przebieg elektroforetyczny. Po przebiegu wizualizuj fragmenty DNA za pomocą oświetlacza UV lub LED trans w celu porównania z tym ostatnim.Trawienie enzymatyczne dwóch izolowanych klonów plazmidów dało pojedynczy produkt DNA o długości 2,3 kilopary zasad dla klonu plazmidu 1, co wskazuje, że jest to sam PSU 19. Pojedyncze rozszczepienie klonu plazmidu 2 spowodowało powstanie pojedynczego produktu DNA o długości trzech kilopar zasad i dwóch produktów DNA o długości 2,3 kilopary zasad i 770 par zasad po podwójnym rozszczepieniu.

use-of-in-vivo-assembly-for-high-efficiency-plasmid-construction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano szybką i wydajną metodę wprowadzania obcego DNA o określonym znaczeniu do wcześniej przygotowanych szczepów akceptorowych, nazywanych szczepami z platformą lądowania (landing pad strains). Metoda ta umożliwia specyficzną dla miejsca integrację kasety DNA w zaprojektowanym locus platformy lądowania danego szczepu, poprzez koniugację i ekspresję integrazu ΦC31.

Inżynieria bakteryjnego chromosomu w konkretnych miejscach: wymiana kasety zapośredniczona przez integrazę $\Phi$C31 (IMCE)

Źródło: Tomás, J. M., et al. Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje zależną od inicjatora amplifikację plazmidu samobójczego u E. coli. Plazmid, który jest nosicielem genu oporności na antybiotyki, replikuje się tylko w obecności białka inicjującego kodowanego przez gospodarza. Po elektroporacji i inkubacji w pożywce regeneracyjnej, mieszaninę umieszcza się na agarze zawierającym...

Amplifikacja plazmidu samobójczego w gospodarzu bakteryjnym

Metodologie celowania w geny mogą być używane do generowania transgenicznych myszy z allelami knockout, knock-in i taged.  W tym miejscu opisujemy ulepszoną metodę rekombinacji u E. coli, którą nazywamy "subklonowaniem plus insercją", która może być wykorzystana do szybkiego generowania niestandardowych wektorów docelowych genów.

Subklonowanie plus insercja (SPI) - nowatorska metoda rekombinacji do szybkiej budowy wektorów celowania w geny

Synteza niestandardowych plazmidów jest pracochłonna i czasochłonna. Protokół ten opisuje zastosowanie klonowania zespołu Gibsona w celu zmniejszenia pracy i czasu trwania niestandardowej procedury klonowania DNA. Opisany protokół pozwala również na uzyskanie wiarygodnych znakowanych konstruktów białkowych do ekspresji ssaków przy podobnych kosztach jak w przypadku tradycyjnego klonowania DNA metodą "wytnij i wklej".

Generowanie wektorów plazmidowych eksprymujących białka znakowane FLAG pod regulacją promotora ludzkiego czynnika wydłużenia-1α przy użyciu zespołu Gibsona

Domeny palców cynkowych są z natury przepuszczalne dla komórek i zdolne do pośredniczenia w dostarczaniu białek do szerokiego zakresu typów komórek ssaków. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku wdrażania technologii palca cynkowego do wewnątrzkomórkowego dostarczania białka.

Bezpośrednie dostarczanie białek do komórek ssaków za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen Cys2-his 2 palców cynkowych

Tutaj prezentujemy składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego (CAPRRESI), protokół oparty na wstawianiu miejsc enzymów restrykcyjnych do sekwencji synonimów DNA i funkcjonalnym odzyskiwaniu plazmidu. Protokół ten jest szybką i tanią metodą fuzji genów kodujących białka.

CAPRRESI: Składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji dużych ilości rekombinowanego RNA w Escherichia coli poprzez współekspresję chimerycznego RNA, który zawiera interesujące RNA w rusztowaniu wiroidowym i roślinnej ligazie tRNA. Głównym produktem jest okrągła cząsteczka, która ułatwia oczyszczanie do jednorodności.

Produkcja na dużą skalę rekombinowanych RNA na okrągłym rusztowaniu przy użyciu systemu pochodzącego z wiroidu w Escherichia coli

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Niniejszy artykuł przedstawia krok po kroku protokół demonstrujący, jak klonowanie modułowe (MoClo) można dostosować do klonowania operonów policistronnych.

Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning

Obecne badanie opisuje przepływ pracy dla sekwencjonowania nanoporami plazmidów, gdy sekwencja chromosomowa jest już znana lub nie jest istotna. Początkowy krok wzbogacania DNA plazmidowego zapewnia optymalną głębokość sekwencji plazmidu i maksymalizuje liczbę próbek, które mogą być sekwencjonowane na jednej komórce przepływowej.

Sekwencjonowanie i montaż długich plazmidów za pomocą przepływów opartych na sekwencjonowaniu Nanopore

Poznaj metodę montażu in vivo do klonowania DNA w bakteriach E. coli z wykorzystaniem wewnętrznych enzymów naprawczych. Protokół osiąga do 99% wydajności klonowania przy niższych kosztach.

Zastosowanie montażu in vivo do wysokowydajnej budowy plazmidu

Przeglądaj więcej filmów