Izolacja i analiza zmian łuku aorty i korzeni w mysim modelu miażdżycowym

Badanie bada rozwój zmian miażdżycowych w łuku aorty i korzeniu myszy z nokautem LDLR, oferując protokół izolacji, barwienia i analizy w celu oceny nasilenia miażdżycy. Oprócz badania histologicznego zastosowanego w tym badaniu, praktyczne techniki oceny miażdżycy obejmują również markery biochemiczne, testy biologii molekularnej i ultrasonografię naczyniową. Precyzja procedury preparacji stanowi największą przeszkodę techniczną w wykonywaniu usuwania aorty in vivo w mysim modelu miażdżycy.

Na początek umieść uśpione myszy w pozycji leżącej na plecach na piankowej desce pokrytej jedną lub dwiema warstwami chłonnego papieru. Przymocuj kończyny za pomocą szpilek, aby ustabilizować ciało. Rozpyl 75% etanolu na brzuch myszy, aby oczyścić i zwilżyć sierść.

Użyj kleszczy, aby chwycić brzuszną skórę myszy. Następnie za pomocą cienkich nożyczek odetnij skórę od podstawy brzucha do czubka szyi. Otwórz ścianę brzucha i użyj kleszczy, aby podnieść mostek.

Przetnij zarówno przeponę, jak i żebra, aby odsłonić jamę piersiową. Usuń przełyk i tchawicę, aby ułatwić czyszczenie tętnic szyjnych. Ostrożnie usuń narządy, w tym wątrobę, płuca, śledzionę, przewód pokarmowy i trzustkę, zachowując nerki i aortę brzuszną.

Podczas preparowania tętnic krezkowych podnieś jelita i wykonaj nacięcia z dala od aorty, aby uniknąć uszkodzenia. Teraz umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym, aby zapewnić czyste pole obserwacyjne i wyrównaj źródło zimnego światła z obszarem sekcji. Za pomocą 10-mililitrowej strzykawki wypełnionej PBS powoli wstrzyknąć igłę w wierzchołek lewej komory i obserwować rozszerzenie aorty.

Delikatnie zetrzyj krew i płyn w obszarze sekcji bibułą, aby w pełni odsłonić pole widzenia. Następnie chwyć przeponowy odcinek aorty piersiowej za pomocą kleszczy i za pomocą nożyczek sprężynowych przeciąć tkankę łączną między aortą a ścianą mięśnia piersiowego. Delikatnie pociągnij serce kleszczami i unieś aortę piersiową.

Obserwuj gałęzie łuku aorty i wypreparuj tłuszcz przybyszowy i tkankę łączną wokół łuku aorty i jej gałęzie w górę wzdłuż aorty piersiowej. Rozetnij aortę brzuszną i tętnice biodrowe wspólne w dół wzdłuż aorty piersiowej. Przyciąć tkankę serca i przeciąć dolną połowę serca wzdłuż płaszczyzny równoległej do przedsionków, a następnie umieścić przycięte serce w odpowiednim podłożu do przechowywania.

Przed wycięciem łuku aorty umieść pod nim małą ciemną uszczelkę, aby uzyskać kontrast. Zrób zdjęcie obszaru łuku aorty. Przetnij wspólne tętnice biodrowe od jednego do dwóch milimetrów poniżej ich rozwidlenia i przytnij małe gałęzie aorty wzdłuż kręgosłupa, aby ją uwolnić.

Po odłączeniu tętnic nerkowych w pobliżu nerek odetnij trzy naczynia rozgałęzione w szyi od ich dystalnych końców. Na koniec przetnij aortę wstępującą w pobliżu serca. Przygotuj wcześniej jeden mililitr 4% roztworu paraformaldehydu w 1,5 mililitrowej probówce wirówkowej.

Umieść aortę w przygotowanej rurce i umocuj ją w temperaturze pokojowej na co najmniej 24 godziny. Następnie przenieś aortę na szalkę Petriego zawierającą PBS, aby zapobiec jej wysychaniu. Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie usuń pozostały tłuszcz przybyszowy za pomocą kleszczy i nożyczek sprężynowych, aby zmniejszyć zakłócenia w kwantyfikacji płytki nazębnej.

Za pomocą nożyczek sprężynowych ostrożnie rozetnij aortę wzdłuż jej wewnętrznej osi podłużnej. Kolejno rozetnij trzy gałęzie łuku aorty wzdłuż bocznej strony do poziomu krzywizny łuku aorty, umożliwiając mu pełne rozciągnięcie. Na tym etapie należy przystąpić do barwienia czerwienią olejową O lub przechowywać aortę w 4% paraformaldehydzie do przyszłej analizy.

Umieść rozciętą aortę w płytce z sześcioma dołkami. Dodaj jeden mililitr sterylnej podwójnie destylowanej wody do każdej studzienki i myj przez pięć minut na shakerze. Umieść sześciodołkową płytkę w dygestorium i susz na powietrzu przez 20 minut, aż nie pozostaną żadne widoczne ślady wodne.

Dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego roztworu roboczego Oil Red O do każdej studzienki. Po potrząsaniu płytką przez 20 minut usuń roztwór czerwieni olejowej O z dołków. Dodaj dwa mililitry sterylnej podwójnie destylowanej wody do każdej studzienki i myj przez pięć minut.

Po trzech płukaniach trzymaj aortę w wodzie podwójnie destylowanej. Przenieś aortę na szkiełko i umieść czarną gumową podkładkę pod szkiełkiem, aby zwiększyć kontrast. Rozłóż aortę podczas oglądania pod mikroskopem stereoskopowym.

Teraz umieść slajd na białym papierze, aby jeszcze bardziej zwiększyć kontrast. Umieść linijkę obok slajdu i zrób zdjęcie za pomocą aparatu. Przechowuj leczoną aortę w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej jeden mililitr PBS, aby była wilgotna.

Masa ciała myszy z nokautem LDLR karmionych dietą w stylu zachodnim znacznie wzrosła w porównaniu z myszami karmionymi dietą chow. Poziom trójglicerydów w osoczu i cholesterolu całkowitego był istotnie wyższy w grupie diety zachodniej niż w grupie kontrolnej. Barwienie czerwonym O oleju aortalnego wykazało poważne nagromadzenie lipidów w tętnicach myszy z nokautem LDLR karmionych dietą w stylu zachodnim w porównaniu z myszami na diecie karmowej.

Zwiększone złogi lipidowe korelowały z cięższymi zmianami miażdżycowymi. Obszar uszkodzenia korzenia aorty i martwiczy rdzeń były znacznie większe u myszy karmionych dietą zachodnią w porównaniu z myszami karmionymi dietą karmę. Kwantyfikacja obszaru uszkodzenia korzenia aorty i obszaru martwiczego potwierdziła, że dieta zachodnia nasilała tworzenie się blaszek miażdżycowych u myszy z nokautem LDLR.