Name: Izolacja i analiza zmian łuku aorty i korzeni w mysim modelu miażdżycowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę izolacji i analizy zmian łuku aorty oraz korzeni w mysim modelu miażdżycowym LDLR-/-. Protokół obejmuje barwienie Oil Red O i ocenę składu płytek miażdżycowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Shanghai Frontiers Science Research Base of Exercise and Metabolic Health, program badawczy ćwiczeń i zdrowia publicznego (0831) na Uniwersytecie Sportu w Szanghaju, program finansowania szkolenia młodych nauczycieli w szkolnictwie wyższym w Szanghaju (A2-0213-22-0058-5) oraz plan wybitnych liderów akademickich Komitetu Miejskiego Nauki i Technologii w Szanghaju (21XD1403200) dla Longhua Liu.

Wszystkie protokoły na zwierzętach użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet Oceny Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Sportowego w Szanghaju.
1. Przygotowanie odczynników i narzędzi do preparacji
<ol>
	<li>Sterylizuj narzędzia preparacyjne, w tym cienkie nożyczki, kleszcze proste, kleszcze zakrzywione, nożyczki sprężynowe i szpilki, w autoklawie z wyprzedzeniem.</li>
	<li>75% etanolu: Zmieszać 75 ml bezwodnego etanolu z 25 ml ddH2O.</li>
	<li>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): Rozpuścić 0,01 M proszku PBS w 2 litrach ddH2O.</li>
	<li>4% roztwór paraformaldehydu (PFA): Podgrzać 800 ml 1x PBS do około 60 °C na mieszadle magnetycznym w dygestorium. Powoli dodawać 40 g proszku paraformaldehydu, ciągle mieszając. Miareczkować 1N NaOH aż do całkowitego rozpuszczenia. Schłodzić do temperatury pokojowej, dostosować objętość do 1 l za pomocą 1x PBS, przefiltrować i dostosować pH do 7,2-7.4. 
	UWAGA: PFA to niebezpieczna substancja chemiczna, która wymaga ostrożnego obchodzenia się i ścisłego przestrzegania protokołów bezpieczeństwa.</li>
	<li>Roztwór do przechowywania Oil Red O: Rozpuść 2,5 g proszku Oil Red O w 500 ml 100% izopropanolu, zamknij w brązowej butelce i przechowuj w lodówce w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: Izopropanol jest toksyczną i szkodliwą substancją chemiczną; w związku z tym, aby zapewnić zdrowie i bezpieczeństwo, konieczne jest noszenie niezbędnych środków ochrony osobistej (PPE), w tym rękawiczek.</li>
	<li>Roztwór roboczy Oil Red O: Wymieszać roztwór pończochowy i sterylny ddH2O w stosunku 3:2. Przygotuj świeży roztwór do każdego użycia i przefiltruj roztwór za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,22 μm lub dużej bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Roztwór barwiący Victoria Blue: Rozpuść 0,5 g Victoria Blue'B w 100 ml 70% etanolu.</li>
</ol>
2. Izolacja aorty i serca
<ol>
	<li>Wszystkie myszy trzymano w obiekcie SPF z klatkami IVC w kontrolowanych warunkach (23,1 ± 1 °C, 40-50% wilgotności względnej, 12 godzin cyklu światła/ciemności) i zapewniono im karmienie ad libitum i sterylną wodę. W klatce umieszczono od trzech do pięciu zwierząt i karmiono je standardową dietą typu chow (chow) lub dietą typu zachodniego (WTD) zawierającą 0,2% cholesterolu i 21,2% tłuszczu. Wybierz samce myszy C57BL6/J LDLr-/- w wieku 12 tygodni i ważące od 25 do 30 g. Masę ciała mierzono co 4 tygodnie przez 12-tygodniowy okres badania. Eutanazja myszy w komorze CO2 (wyparcie 70%/30% CO2 / O2 ).</li>
	<li>Przed sekcją umieść myszy w pozycji leżącej (brzuszną stroną do góry) na płycie piankowej pokrytej 1-2 warstwami chłonnego papieru i przymocuj kończyny szpilkami.</li>
	<li>Rozpyl 75% etanolu na brzuch myszy, aby oczyścić i zwilżyć sierść.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby chwycić brzuszną skórę myszy i użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć skórę od podstawy brzucha do górnej części szyi.</li>
	<li>Otwórz ścianę brzucha, a następnie użyj kleszczy, aby podnieść mostek i przeciąć zarówno przeponę, jak i żebra, aby odsłonić klatkę piersiową.</li>
	<li>Usuń przełyk i tchawicę, co umożliwi łatwiejsze oczyszczenie tętnic szyjnych. Usuń narządy, w tym wątrobę, płuca, śledzionę, przewód pokarmowy i trzustkę, zachowując nerki znajdujące się za otrzewną i aortę brzuszną obok kręgosłupa. Podczas preparowania tętnic krezkowych należy podnieść jelita i wykonać nacięcia z dala od aorty, aby uniknąć uszkodzenia aorty brzusznej.</li>
	<li>Aby zapewnić czyste pole obserwacyjne, umieść myszy pod mikroskopem stereoskopowym i wyrównaj źródło zimnego światła z obszarem sekcji.</li>
	<li>Powoli wstrzyknąć strzykawkę o pojemności 10 ml wypełnioną PBS z igłą 0,45 x 15 (II) RWLB do wierzchołka lewej komory i obserwować rozszerzenie aorty.</li>
	<li>Delikatnie zetrzyj krew i płyn w obszarze sekcji bibułą, aby w pełni odsłonić pole widzenia.</li>
	<li>Aorta piersiowa jest łatwa do odsłonięcia. Użyj go jako przełomu, używając kleszczy do uchwycenia segmentu przepony przymocowanego do końca aorty piersiowej i nożyczek sprężynowych, aby przeciąć tkankę łączną między aortą a ścianą mięśnia piersiowego.</li>
	<li>Delikatnie pociągnij serce kleszczami i unieś aortę piersiową, obserwując gałęzie łuku aorty, a następnie wypreparuj tłuszcz przybyszowy i tkankę łączną wokół łuku aorty i jej gałęzie w górę wzdłuż aorty piersiowej. 
	UWAGA: Bądź ostrożny, utrzymuj aortę w stanie nienaruszonym, unikaj jej rozerwania lub uszkodzenia oraz dokładnie usuń otaczający tłuszcz i tkankę łączną. Ten krok wymaga wielokrotnej praktyki, aby osiągnąć biegłą manipulację.</li>
	<li>Rozetnij aortę brzuszną i tętnice biodrowe wspólne w dół wzdłuż aorty piersiowej.</li>
	<li>Przeciąć wspólne tętnice biodrowe 1-2 mm poniżej ich rozwidlenia, przyciąć małe gałęzie aorty wzdłuż kręgosłupa, aby ją uwolnić, odłączyć tętnice nerkowe w pobliżu nerek, odciąć trzy naczynia rozgałęzione szyi od ich dystalnych końców, a na koniec przeciąć aortę wstępującą w pobliżu serca.</li>
	<li>Przed wypreparowaniem łuku aorty umieść małą, ciemną uszczelkę o wysokim kontraście do naczyń krwionośnych pod nią i sfotografuj obszar łuku aorty.</li>
	<li>Przytnij tkankę serca i przetnij dolną połowę serca wzdłuż płaszczyzny równoległej do przedsionków. Napraw przycięte serce (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
</ol>
3. Stabilizacja i wstępne leczenie łuku aorty
<ol>
	<li>Przygotuj wcześniej 1 ml 4% roztworu PFA w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Umieść aortę w rurce i mocuj ją przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Aorta może być przechowywana w 4% PFA przez okres do 1 miesiąca bez wpływu na jakość barwienia czerwienią olejową O. Aby utrzymać jej normalną konfigurację, odpowiednią opcją może być umieszczenie chusteczki na gumie przed utrwaleniem.</li>
	<li>Przenieś aortę na szalkę Petriego zawierającą PBS, aby zapobiec jej wysychaniu. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczyków i nożyczek sprężynowych, aby ostrożnie usunąć pozostały tłuszcz przybyszowy, który nie został całkowicie usunięty podczas sekcji, aby zmniejszyć zakłócenia w ilościowym określaniu blaszek w aorcie.</li>
	<li>Użyj nożyczek sprężynowych, aby ostrożnie rozciąć aortę wzdłuż jej wewnętrznej osi podłużnej, a następnie kolejno rozciąć trzy gałęzie łuku aorty wzdłuż bocznej strony do poziomu krzywizny łuku aorty, pozwalając mu w pełni się rozłożyć (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Na tym etapie użyj do barwienia Oil Red O lub przechowuj w 4% PFA.</li>
</ol>
4. Czerwone zabarwienie łuku aorty
<ol>
	<li>Umieść rozciętą aortę na 12-dołkowej płytce. Dodaj 1 ml sterylnego ddH2O do każdej studzienki i myj przez 5 minut na shakerze, powtórz 2x.</li>
	<li>Umieść 12-dołkową płytkę z usuniętym roztworem w dygestoriach i susz na powietrzu przez 20 minut, aż nie będzie widocznych śladów wodnych.</li>
	<li>Dodaj 1 ml świeżo przygotowanego roztworu roboczego Oil Red O do każdej studzienki i potrząsaj przez 20 minut na shakerze, a następnie usuń roztwór roboczy Oil Red O.</li>
	<li>Dodaj 2 ml sterylnego ddH2O do każdej studzienki i myj przez 5 minut, powtórz ten krok 3 razy. Następnie utrzymuj aortę w ddH2O.</li>
	<li>Umieść aortę na szkiełku podstawowym i rozłóż ją pod mikroskopem stereoskopowym. Aby zwiększyć kontrast, umieść czarną gumową podkładkę pod suwakiem.</li>
	<li>Umieść slajd na białym papierze, aby jeszcze bardziej zwiększyć kontrast, z linijką umieszczoną obok niego i zrób zdjęcie za pomocą aparatu. Aby utrzymać wilgotność aorty, należy przechowywać leczoną aortę w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml PBS.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu łuku aorty
<ol>
	<li>Otwórz przechwycony obraz aorty na komputerze wyposażonym w oprogramowanie Image J.</li>
	<li>Zaznacz obszar z prostokątnym polem, na przykład 450 x 900 pikseli, który zawiera całą aortę, i zapisz go jako nowy obraz .tiff.</li>
	<li>Otwórz nowo zapisany obraz .tiff na obrazie J. Kliknij opcję Edytuj > Odwróć, a następnie wybierz opcję Obraz i kliknij opcję Wpisz stos RGB >.</li>
	<li>Przejdź do pozycji Obraz, kliknij pozycję Stosy > Ułóż na obrazach, a następnie wybierz opcję Zielony o najlepszym kontraście.</li>
	<li>Przejdź do Obrazu, kliknij Dostosuj > Jasność/Kontrast. Zmień wartość minimalną na około 200, zminimalizuj tło, zachowując podobne tła dla każdego obrazu, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.</li>
	<li>Przejdź do pozycji Analizuj i wybierz opcję Ustaw pomiar. Wybierz opcję Obszar, Ułamek obszaru, Ogranicz do progu i Wyświetl etykietę, a następnie kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Przejdź do sekcji Analizuj, wybierz opcję Pomiar i skopiuj wynik do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Przejdź do Analizuj, kliknij Narzędzie > Menedżer ROI, a następnie wybierz część łukową aorty z prostokątnym polem. Przejdź do Menedżera zwrotu z inwestycji i wybierz Dodaj [t], a następnie Zmierz. Skopiuj zmierzone wyniki do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Przeanalizuj obszar mierzony w grupach myszy na podstawie testów normalności. A p < 0,05 wskazuje, że różnica jest istotna statystycznie. 
	UWAGA: Wybierz odpowiednią metodę statystyczną zgodnie z projektem eksperymentu.</li>
</ol>
6. Parafina zatapiająca serce
<ol>
	<li>Usuń wierzchołek serca i upewnij się, że nacięcie jest proste i wyrównane z kierunkiem nasady zastawki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Umieść każdą próbkę serca indywidualnie w pudełku do zatapiania parafiny i zaznacz pudełko ołówkiem.</li>
	<li>W dygestorii umieść zatopioną w parafinie kasetę z chusteczką w pustym pojemniku i płucz pojemnik do zatapiania pod bieżącą wodą przez 3 minuty.</li>
	<li>Wykonaj odwodnienie tkanek za pomocą etanolu o rosnących gradientach stężeń w następujący sposób: 50% etanolu przez 2 godziny, 75% etanolu przez 30 minut, 85% etanolu przez 30 minut, 95% etanolu przez 30 minut i 100% etanolu przez 10 minut. Powtórz kroki, zmieniając etanol na każdym kroku.</li>
	<li>Wykonaj przezroczystość tkanek za pomocą ksylenu w następujący sposób: mieszanina ksylenu i etanolu 1:1 przez 20 minut, ksylen przez 15 minut, powtórz to 1x, zmieniając ksylen.</li>
	<li>Wosk parafinowy rozpuścić wcześniej w piecu w temperaturze 60 °C. Próbki należy traktować mieszaniną ksylenu i parafiny przez 30 minut, następnie miękkim woskiem parafinowym przez 2 godziny, a następnie twardym woskiem parafinowym przez 1 godzinę 
	UWAGA: Etanol jest łatwopalnym i lotnym rozpuszczalnikiem organicznym. Ksylen jest umiarkowanie toksyczny i wymaga ochrony podczas stosowania.</li>
	<li>Zatapianie parafiny
	<ol>
		<li>Wybierz formę o odpowiednim rozmiarze, włącz ją i wcześniej ogrzej maszynę do zatapiania.</li>
		<li>Po dodaniu stopionego wosku parafinowego do formy, wyjmij tkankę z kasety do zatapiania i umieść ją, powierzchnią cięcia skierowaną w dół, na środkowym dnie formy za pomocą kleszczy, które zostały wcześniej podgrzane.</li>
		<li>Po ostygnięciu formy na stole zamrażarki i zastygnięciu znajdującej się w niej parafiny, umieść wskazaną pokrywę kasety do zatapiania na wierzchu formy i napełnij ją niezbędną ilością parafiny.</li>
		<li>Gdy wosk parafinowy ostygnie i stwardnieje, wyjmij blok z formy i przechowuj go w lodówce w temperaturze 4 °C (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Skrawki parafinowe korzenia aorty
<ol>
	<li>Usuń nadmiar parafiny otaczającej pokrywę kasety do zatapiania, a następnie bezpiecznie przymocuj blok parafiny do clamp gniazdo znajdujące się na głowicy krajalnicy do parafiny. Ustaw blok w pozycji lekko przesuniętej od miejsca, w którym plasterek zostanie przecięty, upewniając się, że przekrój tkanki w bloku parafiny jest równoległy do krawędzi tnącej ostrza. W przypadku pierwszego przekroju ustaw grubość plastra na 10 μm, aby odsłonić położenie tkanki.</li>
	<li>Gdy pierwsze nacięcie zostanie znalezione pod mikroskopem, dostosuj grubość plastra do 6 μm i wykonaj cięcie seryjne. Wycinaj, kroij i wybieraj sekcje w krajalnicy, aż trzy nienaruszone zastawki aortalne będą widoczne pod mikroskopem, w którym to momencie rozpocznie się przygotowanie do cięcia. Pozostaw jeden plasterek w odstępach 6 μm dla każdej myszy i umieść różne pozycje plasterków na różnych szklanych nośnikach, na przykład w sekcji 1-11-21-31, aby uzyskać właściwy przegląd.</li>
	<li>Unieś skrawki na rozsiewaczu zawierającym ciepłą wodę o temperaturze 37 °C, aby rozprowadzić chusteczkę na płasko, a następnie podnieś tkankę za pomocą szkiełka. Po odczekaniu, aż woda wyschnie, ułóż kromki na tosterze ustawionym na 42 °C na noc.</li>
	<li>Średnia powierzchnia płytki nazębnej w tych 8 sekcjach reprezentuje wartość obszaru płytki nazębnej korzenia aorty u każdej myszy. Po zabarwieniu tych odcinków zmierz średnią powierzchnię płytki nazębnej i powierzchnię płytki nazębnej.</li>
</ol>
8. Barwienie hematoksyliny i eozyny
<ol>
	<li>Umieść plastry w suszarce w temperaturze 60 °C na 30 minut. W dygestorii za pomocą stojaka do barwienia umieść skrawki kolejno w ksylenie na 10 minut (powtórz ten krok raz, zmieniając ksylen), 100% etanolu przez 5 minut (powtórz ten krok, zmieniając etanol), 95% etanolu przez 5 minut, 85% etanolu przez 5 minut i 75% etanolu przez 5 minut.</li>
	<li>Spłukiwać pod bieżącą wodą przez 5 min. Zanurzyć skrawki w barwie z hematoksyliny na 8 min i spłukać pod bieżącą wodą.</li>
	<li>Różnicuj skrawki za pomocą 1% alkoholu kwasu solnego przez kilka sekund, spłucz bieżącą wodą i obserwuj, że skrawki zmieniają kolor na niebiesko-fioletowy pod mikroskopem.</li>
	<li>Zanurz skrawki w roztworze barwiącym eozynę na 5 minut. Umieść skrawki w 95% etanolu na 7 zanurzeń, a następnie w 100% etanolu na 30 s.</li>
	<li>Klaruj w ksylenie przez co najmniej 30 sekund. Uszczelnij szkiełka za pomocą neutralnej gumy, sfotografuj pod mikroskopem i zapisz obrazy w wysokiej rozdzielczości, najlepiej w formacie .tiff.</li>
</ol>
9. Barwienie Verhoeffa-Van Giesona (VVG)
<ol>
	<li>Wykonaj rutynowe odparafinowywanie i ponowne nawodnienie skrawków parafiny, wykonując te same czynności, jak opisano w sekcjach 8.1 i 8.2.</li>
	<li>Po krótkim spłukaniu w 70% etanolu zanurzyć skrawki w roztworze barwiącym Victoria Blue'B na 15 minut.</li>
	<li>Różnicuj sekcje przez kilka sekund w 95% etanolu. Umyj sekcje 2x wodą destylowaną.</li>
	<li>Zabarwić skrawki roztworem barwiącym Ponceau przez 5 minut przez aplikację kropelkową. Odróżnij i odwadniaj sekcje za pomocą 100% etanolu. 
	UWAGA: Po barwieniu Pąsa należy unikać kontaktu z wodą.</li>
	<li>Klaruj w ksylenie przez co najmniej 30 s. Zamontuj szkiełka za pomocą neutralnej gumy i sfotografuj je pod mikroskopem.</li>
</ol>
10. Analiza obrazu płytki korzeniowej aorty
<ol>
	<li>Otwórz obraz na komputerze wyposażonym w oprogramowanie Image J. Wybierz dowolne narzędzie ramki, aby obramować płytkę.</li>
	<li>Przejdź do pozycji Obraz, kliknij opcję Nakładka > Dodaj zaznaczenie, a następnie pozycję Zmierz, aby zmierzyć obszar płytki. Skopiuj zmierzone wyniki do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Przeanalizuj obszar mierzony w grupach myszy na podstawie testów normalności. A p < 0,05 wskazuje, że różnica jest istotna statystycznie.</li>
</ol>

<ol><li>Libby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 56(2019).</li>
<li>Herrington, W., Lacey, B., Sherliker, P., Armitage, J., Lewington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+atherosclerosis+and+the+potential+to+reduce+the+global+burden+of+atherothrombotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of atherosclerosis and the potential to reduce the global burden of atherothrombotic disease.</a> Circ Res. 118 (4), 535-546 (2016).</li>
<li>Frostegård, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> BMC Med. 11, 117(2013).</li>
<li>Gisterå, A., Ketelhuth, D. F. J., Malin, S. G., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atherosclerosis-supportive+notes+and+tricks+of+the+trade%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models of atherosclerosis-supportive notes and tricks of the trade.</a> Circ Res. 130 (12), 1869-1887 (2022).</li>
<li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models of atherosclerosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).</li>
<li>Ilyas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+atherosclerosis+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mouse models of atherosclerosis in translational research.</a> Trends Pharmacol Sci. 43 (11), 920-939 (2022).</li>
<li>Liu, L., Chan, M., Yu, L., Wang, W., Qiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipsin+deficiency+does+not+impact+atherosclerosis+development+in+ldlr%28-%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Adipsin deficiency does not impact atherosclerosis development in ldlr(-/-) mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 320 (1), E87-E92 (2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ppar%CE%B3+deacetylation+confers+the+antiatherogenic+effect+and+improves+endothelial+function+in+diabetes+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pparγ deacetylation confers the antiatherogenic effect and improves endothelial function in diabetes treatment.</a> Diabetes. 69 (8), 1793-1803 (2020).</li>
<li>Zahr, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ppar%CE%B3+%28peroxisome+proliferator-activated+receptor+%CE%B3%29+deacetylation+suppresses+aging-associated+atherosclerosis+and+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Pparγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ) deacetylation suppresses aging-associated atherosclerosis and hypercholesterolemia.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (1), 30-44 (2023).</li>
<li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+ccrl2+induced+by+disturbed+flow+promotes+atherosclerosis+via+chemerin-dependent+%CE%B22+integrin+activation+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial ccrl2 induced by disturbed flow promotes atherosclerosis via chemerin-dependent β2 integrin activation in monocytes.</a> Cardiovasc Res. 119 (9), 1811-1824 (2023).</li>
<li>Andrés-Manzano, M. J., Andrés, V., Dorado, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil+red+o+and+hematoxylin+and+eosin+staining+for+quantification+of+atherosclerosis+burden+in+mouse+aorta+and+aortic+root%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Oil red o and hematoxylin and eosin staining for quantification of atherosclerosis burden in mouse aorta and aortic root.</a> Methods Mol Biol. 1339, 85-99 (2015).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+o+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by oil red o for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li>
<li>Chen, P. Y., Qin, L., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analysis+of+oil+red+o-stained+whole+aorta+lesions+in+an+aneurysm+hyperlipidemia+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging and analysis of oil red o-stained whole aorta lesions in an aneurysm hyperlipidemia mouse model.</a> J Vis Exp. (183), e61277(2022).</li>
<li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+assessment+of+the+quantification+of+atherosclerotic+lesions+in+apoe-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Practical assessment of the quantification of atherosclerotic lesions in apoe-/- mice.</a> Mol Med Rep. 12 (4), 5298-5306 (2015).</li>
<li>Bozycki, L., Łukasiewicz, K., Matryba, P., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+clearing%2C+staining+and+screening+of+calcium+deposits+in+the+mdx+mouse+model+of+duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Whole-body clearing, staining and screening of calcium deposits in the mdx mouse model of duchenne muscular dystrophy.</a> Skelet Muscle. 8 (1), 21(2018).</li>
<li>Glaudemans, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in atherosclerosis.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37 (12), 2381-2397 (2010).</li>
</ol>

Nie ma nic do zadeklarowania.

W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat metod pobierania próbek z aorty u myszy z nokautem Ldlr oraz analizy ilościowej blaszek miażdżycowych.
Precyzja procedury preparacji jest największym wyzwaniem technicznym w usuwaniu aorty in vivo w mysim modelu miażdżycy. Opierając się na naszym doświadczeniu, kluczowe punkty są następujące: (1) użyj PBS do wypłukania całej krwi w tętnicy, aby zwiększyć porównanie między gałęziami łuku aorty a tłuszczem okołonaczyniowym. (2) Uzbr...

Choroby układu krążenia, szczególnie miażdżyca, stały się poważnym obciążeniem zdrowotnym i główną przyczyną zgonów na całym świecie1,2. Miażdżyca jest przewlekłą, postępującą chorobą zapalną charakteryzującą się stopniowym gromadzeniem się lipidów i tworzeniem blaszek miażdżycowych w ścianie tętnicy, co ostatecznie prowadzi do zwężenia światła tętnicy i potencjalnie do pęknięcia blaszek miażdżycowych, wywołując ostre zdarzenia sercowo-naczyniowe, takie jak zawał mięśnia sercowego i udar mózgu1,2,3. Biorąc pod uwagę jej głęboki wpływ na zdrowie człowieka, istnieje pilna potrzeba zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw miażdżycy i opracowania skutecznych strategii terapeutycznych.
W ostatnich latach modele zwierzęce odegrały kluczową rolę w pogłębieniu naszej wiedzy na temat miażdżycy. Wśród różnych gatunków myszy stały się preferowanym modelem ze względu na ich szybką reprodukcję, wygodę operacyjną i dostępność zaawansowanych technik manipulacji genetycznej4,5. W szczególności myszy z nokautem receptora LDL (Ldlr-/-) i myszy ApoE-/- są szeroko stosowane do naśladowania ludzkiej miażdżycy, ponieważ wykazują podobne cechy patofizjologiczne4,5,6,7,8,9.
Zmiany miażdżycowe u myszy mogą występować w różnych miejscach aorty, ale są szczególnie podatne na rozwój w obszarach ściśle związanych z hemodynamiką, takich jak korzeń aorty, łuk aorty i pień ramienno-głowowy, podczas gdy aorta zstępująca jest stosunkowo mniej dotknięta10. Aby dokładnie ocenić obciążenie zmianami miażdżycowymi w modelach mysich, ocenić obecność, rozmiar i stopień zaawansowania blaszek, a tym samym zbadać wpływ różnych leków lub czynników na wystąpienie, progresję i regresję miażdżycy, niezbędne jest połączenie technik barwienia histologicznego i analizy obrazowej11. Barwienie czerwienią olejową O, dobrze znana metoda, w szczególności barwi neutralne lipidy i lipoproteiny12, zapewniając bezpośrednią wizualizację tworzenia się płytki nazębnej w łuku aorty<klasa sup="xref">13. Tymczasem barwienie korzenia aorty hematoksyliną-eozyną (HE) nie tylko wyznacza obszar płytki nazębnej, ale także zapewnia szczegółowe cechy strukturalne, takie jak włóknista czapeczka i nekrotyczny rdzeń lipidowy. Te szczegóły są kluczowe dla oceny stabilności płytki nazębnej i przewidywania ryzyka pęknięcia płytki nazębnej11. Razem techniki te umożliwiają kompleksową ocenę nasilenia i progresji zmian miażdżycowych.
Ten protokół wziął za przykłady myszy C57BL6/J Ldlr-/- karmione dietą Chow i dietą zachodnią, mając na celu dostarczenie szczegółowego przewodnika krok po kroku do oceny obciążenia zmianami miażdżycowymi u myszy za pomocą barwienia łukiem aorty czerwienią olejową O i barwienia HE odcinków korzenia aorty zatopionych w parafinie, a następnie analizy obrazu. Protokół obejmuje wszystkie aspekty izolacji i stabilizacji aorty, zatapiania i cięcia parafiny, procedur barwienia i analizy obrazu, uwzględniając jednocześnie szczegóły operacyjne i rozważania dotyczące kluczowych kroków, zapewniając odtwarzalność i wiarygodność wyników. Postępując zgodnie z tym protokołem, naukowcy mogą dokładnie i skutecznie ocenić skuteczność interwencji terapeutycznych i uzyskać wgląd w mechanizmy leżące u podstaw miażdżycy.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka mikroskopowe adhezyjne (25 i razy; 75mm)</td><td>CITOTEST</td><td>Cat# 80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta do zatapiania</td><td>CITOTEST</td><td>Cat# 80106-1100-16</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia eozyny</td><td>Beyotime</td><td>Cat# C0109</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>Cat# 10009218</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia hematoksyliny</td><td>Beyotime</td><td>Cat# C0107</td><td></td></tr><tr><td>Niskoprofilowe ostrza jednorazowe Leica</td><td></td><td>Cat# 14035838925</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe mikroskopu (24 razy; 50mm)</td> <td>CITOTEST</td><td>Cat# 10212450C</td><td></td></tr><tr><td>Neutralny balsam montażowy Medium</td><td>Sango Biotech</td><td>Cat # E675007-0100</td><td></td></tr><tr><td>Olej czerwony o proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # 1320-06-5</td><td></td></tr><tr><td>parafina z cerezyną</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>Cat# 69019461</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Servicebio</td><td>Cat# G1101</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, proszek)</td><td>Servicebio</td><td>Cat# G0002-2L</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S Roztwór do barwienia</td><td>EveryLab</td><td>Cat# FM024</td><td></td></tr><tr><td>Victoria Blue' B</td><td>Aladyn</td><td>Kot # 2580-56-5</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kot# 104-81-4</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza zmian łuku aorty i korzeni w mysim modelu miażdżycowym

Isolation and Analysis of Aortic Arch and Root Lesions in an Atherosclerotic Mouse Model

Miażdżyca, główna przyczyna chorób sercowo-naczyniowych, wymaga szczegółowego zbadania rozwoju i progresji zmian. Badanie to wprowadza kompleksowy protokół izolacji i analizy histologicznej zmian w łuku aorty i korzeniu u szeroko stosowanych mysich modeli miażdżycowych, myszy z nokautem receptora lipoprotein o niskiej gęstości (Ldlr-/-). Łuk aorty i korzeń są kluczowymi miejscami zmian miażdżycowych, a ich badanie ma kluczowe znaczenie dla oceny początku, progresji lub regresji miażdżycy, przewidywania ryzyka zdarzeń sercowo-naczyniowych i identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych. Protokół ten przedstawia metody ilościowego określania obciążenia miażdżycowego w łuku aorty i korzeniu, w tym izolację tkanek, utrwalanie, barwienie czerwienią olejową O, cięcie korzenia aorty, barwienie hematoksyliną i eozyną (HE), barwienie Verhoeffa-Van Giesona (VVG) oraz analizę obrazu. Barwienie czerwienią olejową O mierzy obszar płytki nazębnej w łuku aorty, oceniając nasilenie miażdżycy, podczas gdy barwienie HE korzenia aorty ujawnia składniki płytki nazębnej, takie jak rdzeń lipidowy i włóknista czapeczka, ułatwiając ocenę stabilności płytki nazębnej i ryzyka pęknięcia. Barwienie VVG może barwić włókna kolagenowe w tkankach, dostarczając dalszych informacji na temat składu płytki nazębnej i powiązanych informacji. Ta dokładna analiza dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów rozwoju zmian chorobowych i może pomóc w tworzeniu nowych strategii terapeutycznych w zakresie zapobiegania i leczenia miażdżycy.

Reprezentatywne wyniki demonstrują zastosowanie techniki izolacji i analizy zmian w łuku i korzeniu aorty w modelu mysim z miażdżycą. Wyniki te stanowią jasny dowód na zdolność tej techniki do identyfikacji i charakterystyki zmian miażdżycowych. Na przykład obrazy histologiczne z zastosowaniem specyficznych barwień (np. Oil Red O) uwydatniają gromadzenie lipidów, podczas gdy barwienie hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) ujawnia ogólną morfologię zmian miażdżycowych, w tym strukturę ściany tętnicy, obecność rdzeni lipidowych...

Ten protokół dostarcza kompleksową metodologię analizy ilościowej blaszek miażdżycowych, aby ułatwić bardziej dogłębne badania nad mechanizmami i postępem miażdżycy.

Izolacja i analiza zmian łuku aorty i korzeni w mysim modelu miażdżycowym

Atherosclerosis, a leading cause of cardiovascular diseases, necessitates a detailed examination of lesion development and progression. This study ...

Badanie bada rozwój zmian miażdżycowych w łuku aorty i korzeniu myszy z nokautem LDLR, oferując protokół izolacji, barwienia i analizy w celu oceny nasilenia miażdżycy. Oprócz badania histologicznego zastosowanego w tym badaniu, praktyczne techniki oceny miażdżycy obejmują również markery biochemiczne, testy biologii molekularnej i ultrasonografię naczyniową. Precyzja procedury preparacji stanowi największą przeszkodę techniczną w wykonywaniu usuwania aorty in vivo w mysim modelu miażdżycy.Na początek umieść uśpione myszy w pozycji leżącej na plecach na piankowej desce pokrytej jedną lub dwiema warstwami chłonnego papieru. Przymocuj kończyny za pomocą szpilek, aby ustabilizować ciało. Rozpyl 75% etanolu na brzuch myszy, aby oczyścić i zwilżyć sierść.Użyj kleszczy, aby chwycić brzuszną skórę myszy. Następnie za pomocą cienkich nożyczek odetnij skórę od podstawy brzucha do czubka szyi. Otwórz ścianę brzucha i użyj kleszczy, aby podnieść mostek.Przetnij zarówno przeponę, jak i żebra, aby odsłonić jamę piersiową. Usuń przełyk i tchawicę, aby ułatwić czyszczenie tętnic szyjnych. Ostrożnie usuń narządy, w tym wątrobę, płuca, śledzionę, przewód pokarmowy i trzustkę, zachowując nerki i aor

isolation-analysis-aortic-arch-root-lesions-an-atherosclerotic-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.

Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Opisujemy procedury ilościowego określania i charakteryzowania zmian miażdżycowych w modelach mysich, wykorzystując precyzyjne przekroje zatoki aortalnej aorty i aorty wstępującej w połączeniu z analizą histochemiczną i immunohistochemiczną.

Analiza ilościowa i charakterystyka zmian miażdżycowych w mysiej zatoce aortalnej

Ten film pokazuje dwa modele rozwoju blaszki miażdżycowej w tętnicach mysich i podkreśla różnice w przeroscie mięśniowo-brzuszkowym i miażdżycy.

Wywoływanie przerostu mięśniowo-wewnętrznego, a miażdżyca u myszy: wprowadzenie dwóch prawidłowych modeli

Modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w definiowaniu mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy mysi model zakażenia jamy ustnej ludzkim patogenem Porphyromonas gingivalis i szczegółowo opisujemy metodologie oceny postępu stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych.

Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

To badanie opisuje inwazyjną procedurę indukcji przyspieszonej miażdżycy u myszy. W porównaniu z innymi metodami wykorzystującymi urazy wywołane elektrycznością lub kriogenicznością, uraz wywołany mechanicznie naśladuje ludzki stan restenozy po terapiach rewaskularyzacyjnych i jest idealny do badania zaangażowanych mechanizmów molekularnych.

Indukcja przyspieszonej miażdżycy u myszy: model "urazu drutowego"

Opisujemy protokół indukowania miażdżycy w korzeniu aorty myszy ApoE-/- karmionych dietą aterogenną, poprzez ciągłe uwalnianie aldosteronu. Opisano również metody charakteryzowania składu płytki nazębnej.

Indukcja blaszek miażdżycowych poprzez aktywację receptorów mineralokortykoidowych u myszy z niedoborem apolipoproteiny E

Mysie modele miażdżycy są użytecznymi narzędziami do badania szlaków patogennych na poziomie molekularnym, ale wymagają standaryzowanej kwantyfikacji rozwoju zmian. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę określania wielkości zmiany w głównych naczyniach tętniczych, w tym w korzeniu aorty, łuku aortalnym i tętnicy ramienno-głowowej.

Kwantyfikacja miażdżycy u myszy

Ten protokół krok po kroku przeprowadza procedurę analizy obciążenia miażdżycowego u myszy. Badacze mogą użyć tego protokołu do porównania obfitości, lokalizacji i wielkości zmian miażdżycowych u różnych zwierząt.

Obrazowanie i analiza zmian całej aorty barwionych czerwienią olejową O w mysim modelu hiperlipidemii tętniaka

Tutaj prezentujemy zoptymalizowane protokoły oczyszczania tkanek do obrazowania mysiej aorty w trzech wymiarach (3D). Opisujemy najnowocześniejsze procedury barwienia immunologicznego, oczyszczania optycznego i obrazowania z zamiarem określenia anatomicznej bliskości obwodowego układu nerwowego z blaszkami miażdżycowymi i przydanką w miażdżycy.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanek aorty w miażdżycy

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Poznaj metodę izolacji i analizy zmian łuku aorty oraz korzeni w mysim modelu miażdżycowym LDLR-/-. Protokół obejmuje barwienie Oil Red O i ocenę składu płytek miażdżycowych.

Izolacja i analiza zmian łuku aorty i korzeni w mysim modelu miażdżycowym

Przeglądaj więcej filmów