Analiza subpopulacji płytek krwi za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej

Nasze badania wykorzystują wielobarwną cytometrię przepływową do identyfikacji i charakterystyki subpopulacji płytek krwi, mając na celu zrozumienie ról, wzorców aktywacji i znaczenia klinicznego w kontekście specyficznym dla zakrzepicy, stanu zapalnego i choroby. Ustalony wielobarwny test cytometrii przepływowej pozwolił zaobserwować, że agonista płytek krwi indukuje wyraźny wzorzec aktywacji i w porównaniu z peptydem związanym z kolagenem generuje prokoagulant i subpopulację. Test wielobarwny umożliwia jednoczesny pomiar aktywacji, adhezji, agregacji i potencjału apoptotycznego pojedynczej płytki krwi w populacji izolowanych ludzkich płytek krwi w jednej probówce.

[Instruktor] Na początek przygotuj wszystkie odczynniki potrzebne do zabiegu. Teraz wymieszaj 10 mililitrów 10x buforu Tyrode'a z 90 mililitrami wody destylowanej. Dodaj 0,1 grama glukozy i dostosuj pH całej objętości za pomocą hepes, aby osiągnąć 7,4. Najpierw ustaw pH 10 mililitrów buforu na 7,4, a następnie dostosuj pH pozostałych 90 mililitrów jednym normalnym kwasem solnym do 6,5. Do pobrania próbki krwi przygotuj 10-mililitrową strzykawkę dla każdego dawcy z dwoma mililitrami antykoagulantu ACD. Pozwól, aby strzykawka zrównoważyła się w temperaturze pokojowej. Po pobraniu krwi dawcy do wstępnie podgrzanej strzykawki ACD, powoli przenieś krew leczoną ACD do 15-mililitrowej probówki reakcyjnej. Odwirować krew potraktowaną ACD w temperaturze 209 G przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez korzystania z przerwy. W międzyczasie przygotuj 25 mililitrów buforu Hepes Tyrode'a o pH 6,5 w 50-mililitrowej probówce reakcyjnej. Po odwirowaniu delikatnie przenieś górną warstwę osocza bogatopłytkowego do probówki zawierającej bufor Hepes firmy Tyrode. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, pozostaw około jednego mililitra osocza bogatopłytkowego powyżej warstwy kożucha kożuchowego i erytrocytów. Następnie odwirować zawiesinę o sile 430 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać granulki płytek krwi. Odrzucić supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad płytek krwi w 200 do 300 mikrolitrach buforu Tyrode, dostosowanego do pH 7,4. Zmierz liczbę płytek krwi za pomocą licznika komórek, a następnie dostosuj ją do 200 000 płytek krwi na mikrolitr za pomocą buforu Hepes firmy Tyrode o pH 7,4. W przypadku receptorów, które nie wymagają aktywacji przed barwieniem, w tym CD61, CD42B, CD41, CXCR7 i CXCR4, należy przygotować jedną niebarwioną i jedną barwioną próbkę na przeciwciało. Dla receptorów lub markerów, które wymagają aktywacji, takich jak PAC-1, CD63, CD62P, NXN5 i zombie NIR. Aktywuj próbkę za pomocą 10 mikrogramów na mililitr CRPXL i przygotuj zarówno próbki aktywowane, jak i nieaktywowane. Aby aktywować płytki krwi, inkubuj je z 10 mikrogramami na mililitr CRPXL przez 30 minut. Następnie inkubować wyizolowaną płytkę krwi z różnymi stężeniami przeciwciała sprzężonego z fluorochromem lub umrzeć przez 30 minut. Następnie dodaj 300 mikrolitrów buforu wiążącego aneksyny do każdej próbki, aby ją rozcieńczyć. Zmierz 10 000 zdarzeń dla każdej próbki za pomocą cytometru przepływowego. Oblicz indeks barwienia dla każdego przeciwciała, aby określić optymalną separację między populacjami dodatnimi i ujemnymi. Wykreśl indeks barwienia w stosunku do stężeń przeciwciał, aby określić optymalne stężenie dla każdego przeciwciała Do barwienia rozpuść proszek hemowy w 1,4 M wodorotlenku sodu, aby uzyskać roztwór 3M. Podgrzej roztwór do 96 stopni Celsjusza przez pięć minut z prędkością 450 obrotów na minutę. Rozcieńczyć go wodą destylowaną, aby uzyskać trzymilimolowy roztwór łodygi. Po dostosowaniu liczby płytek krwi do 1 miliona płytek krwi na próbkę, aktywuj płytki krwi, jak pokazano wcześniej. Dodaj 43,3 mikrolitrów koktajlu przeciwciał do każdej próbki i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po inkubacji rozcieńczyć każdą próbkę 300 mikrolitrami jednego X i X w buforze wiążącym złożonym z 10 milimolowego wodorotlenku sodu Hepes o pH 7,4. Natychmiast zmierzyć każdą barwioną próbkę za pomocą cytometru przepływowego. W celu kompensacji za pomocą kulek przygotuj 150 mikrolitrów PBS dla każdego fluoroforu i dodaj jedną kroplę kulek i jeden mikrolitr przeciwciała sprzężonego z fluorescencją. Aby skompensować anektynę V, użyj siedmiu kulek PECY7B oznaczonych anty-ludzkim CD 62L sprzężonym z tym samym fluoroforem co aneksyna V. Użyj kulek kompensacyjnych reaktywnych aminy dla barwnika reaktywnego aminy, mieszając dwie krople kulek dodatnich i jedną kroplę kulek ujemnych w 150 mikrolitrach PBS z jednym mikrolitrem matrycy. Upewnij się, że koraliki dodatnie reagują i wyświetlają sygnał, a koraliki ujemne nie. Przygotuj fluorescencję minus jedną kontrolę dla każdego markera. Wykresy punktowe wykazały wyraźną zmianę w populacji płytek krwi. Z heminą tworzącą więcej płytek krwi z niskim rozproszeniem do przodu niż inni agoniści. Leczenie trombiną ADP i CRPXL spowodowało, że od 40 do 60% płytek krwi było dodatnich w CD42, podczas gdy hemina znacznie zmniejszyła tę populację. Wszyscy agoniści płytek krwi nie mieli wpływu na ekspresję powierzchniową CD41 i CD61. Tylko hemen znacząco zwiększył ekspresję powierzchni CXCR4 i CXCR7. Ponadto ekspozycja na fosfatydyloserynę była również zwiększona podczas leczenia heminą, co skutkowało wzmocnieniem komórek dodatnich aneksyny V. Analizy UMAP i wykresów fenolowych zdefiniowały 27 odrębnych klastrów płytek krwi, które różniły się w zależności od typu agonisty. Hemin spowodował najbardziej dramatyczną zmianę we wzorcach klastrów. Subpopulacje spoczynkowych płytek krwi były najbardziej zachowane z ADP i wydzierżawione z heminą.