Name: Test laboratoryjny bezpieczeństwa prionowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Poznaj metodę wymazową z RT-QuIC do wykrywania pryonów na powierzchniach laboratoryjnych. Technika ta pozwala skutecznie ocenić zanieczyszczenie i skuteczność dezynfekcji w środowisku badawczym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została wsparta grantem z Fundacji Choroby Jacoba Creutzfeldta. Grantodawcy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu pracy do publikacji.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone i zgodne z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Creighton.
UWAGA: Schematyczny przegląd testu laboratoryjnego bezpieczeństwa prionów jest pokazany w Rysunek 1.
1. Wybór miejsc pobierania wymazów i przygotowanie do pobierania wymazów powierzchniowych
<ol>
	<li>Zidentyfikuj i oznacz odpowiednie obszary nadzoru do pobierania wymazów. Zapoznaj się z dostarczonym szablonem w celu uzyskania dokumentacji i odniesienia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający 1).</li>
	<li>Przygotuj dwie probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml dla każdego ze zidentyfikowanych obszarów. Dodać 250 μl buforowanej fosforanem soli fizjologicznej firmy Dulbecco do pierwszego zestawu probówek do mikrowirówek do użycia w kroku 3.2. Niech drugi zestaw probówek do mikrowirówek pozostanie pusty do użycia w kroku 4.3.</li>
	<li>Wyjmij waciki z piankową końcówką z przechowywania w miejscu wolnym od zanieczyszczenia prionowego.</li>
	<li>Przygotuj butelkę do wyciskania z wodą Milli-Q (MQ H2O) do użycia w kroku 2.1.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wymazu z kontroli dodatniej i ujemnej
<ol>
	<li>Przygotować rozcieńczenia do kontroli wymazów dodatnich i ujemnych, stosując odpowiednie typy kontroli. Przykład: W celu kontroli pozytywnej przygotuj 1% rozcieńczenie homogenatu mózgu zakażonego prionami w buforowanym fosforanami soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS). Do celów kontroli ujemnej należy przygotować 0,1% rozcieńczenie niezakażonego (UN) homogenatu mózgu (BH) tego samego gatunku, co kontrola pozytywna w DPBS.</li>
	<li>Używając czystych rękawiczek, wyjmij odpowiednią liczbę wacików z czystego opakowania i umieść uchwyt do dołu w stojaku na probówki, uważając, aby rozmieścić waciki piankowe tak, aby końcówki nie stykały się z innymi wacikami lub powierzchniami. Dla każdej próbki kontrolnej należy przygotować trzy waciki. Zmieniaj rękawice między każdą próbką.</li>
	<li>Trzymając za uchwyt czysty wacik piankowy, nałóż 50 μl odpowiednich próbek kontroli dodatniej i ujemnej na końcówki wacika piankowego. Upewnij się, że nakładasz na obie strony końcówki wacika, aby zapewnić całkowite wchłonięcie. 
	UWAGA: Zawsze zmieniaj rękawiczki przed wyjęciem czystego wacika ze stojaka na probówki.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek odetnij nadmiar uchwytu wacika (około 1/2 długości) i umieść wacik w wstępnie załadowanej probówce do mikrowirówki z piankową końcówką skierowaną w dół. Upewnij się, że piankowa końcówka jest zanurzona w DPBS i że uchwyt jest odpowiednio przycięty, aby całkowicie zamknąć pokrywę probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Kontynuować nakładanie próbek kontrolnych po zmianie rękawiczek, aż wszystkie próbki zostaną nałożone.</li>
</ol>
3. Wymazywanie powierzchni
<ol>
	<li>Trzymając czysty wacik z piankową końcówką za uchwyt, zwilż piankową końcówkę MQH 2O i strząśnij nadmiar. Umieść zwilżoną piankową końcówkę wacika na obszarze wybranym do nadzoru i przetrzyj obszar w przód iw tył około dziesięć razy, jednocześnie obracając końcówkę wacika na powierzchni.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek odetnij nadmiar uchwytu wacika (około 1/2 długości) i umieść wacik w wstępnie załadowanej probówce do mikrowirówki z piankową końcówką skierowaną w dół. Upewnij się, że piankowa końcówka jest zanurzona w DPBS i że uchwyt jest odpowiednio przycięty, aby całkowicie zamknąć pokrywę probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Wyrzuć rękawice i załóż nowe rękawice przed każdym odpowiednim miejscem pobrania wymazu, aby zminimalizować prawdopodobieństwo zanieczyszczenia krzyżowego.</li>
	<li>Powtarzaj procedurę, aż wszystkie obszary wybrane do nadzoru zostaną pobrane wymazy.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja wymazów i zagęszczenie próżni
UWAGA: Włącz koncentrator podciśnienia 30 minut przed użyciem, aby umożliwić rozgrzanie instrumentu.
<ol>
	<li>Umieść probówki do mikrowirówek w okrągłym stojaku na probówki. Umieść stojak na probówki do mikrofuge w łaźni wodnej z tubą kubkową. Upewnij się, że waciki piankowe w DPBS w probówkach do mikrowirówek znajdują się pod powierzchnią wody w rogu kubka (część uchwytu nie musi być zanurzona). Zastosuj następujące ustawienia: Całkowity czas pracy 15 s (5 s wł., 5 s wyłączony) przy ~75-85 watach.</li>
	<li>Po sonikacji należy odwirować probówki przez około 15 sekund, aby zebrać DPBS na dnie probówki przed przeniesieniem.</li>
	<li>Za pomocą pipety P1000 ustawionej na 250 μl ostrożnie zebrać cały płyn (ekstrakt z wacika) z dna probówki do mikrowirówki i przenieść do odpowiedniej probówki do mikrowirówki z drugiego, pustego, wstępnie oznakowanego zestawu. Użyj końcówki pipety, aby wycisnąć nadmiar płynu z końcówki piankowej. Wyrzuć puste probówki zawierające waciki.</li>
	<li>Ustaw następujące ustawienia koncentratora próżniowego: Temperatura: 45 °C, Czas nagrzewania: 15 min, Czas pracy: 2 h, Próżnia: 5.1.</li>
	<li>Umieść probówki do mikrowirówek zawierające ekstrakty wacików w koncentratorze próżniowym, upewniając się, że probówki są wyważone, a wszystkie nakrętki probówek otwarte.</li>
	<li>Po zakończeniu cyklu upewnić się, że próbki są całkowicie zagęszczone (pozostaje tylko osad). Przechowuj granulki w temperaturze -80 °C do momentu wykorzystania w RT-QuIC. 
	UWAGA: W niektórych przypadkach może być wymagany dodatkowy czas koncentracji próżni, aby zapewnić pełne stężenie. Usunąć wszystkie skoncentrowane próbki, pozostawiając tylko probówki, które nadal zawierają płyn. Zrównoważyć pozostałe probówki w koncentratorze i pracować w dodatkowych odstępach 1-godzinnych, aż próbki zostaną całkowicie zagęszczone.</li>
</ol>
5. Przygotowanie kontroli pobierania wymazów do użycia w RT-QuIC
UWAGA: Kontrole RT-QuIC powinny być przeprowadzone przed testem ekstraktów z wymazów środowiskowych, aby upewnić się, że nie doszło do zanieczyszczenia podczas procedur pobierania wymazów, ekstrakcji lub koncentracji. Aby zapoznać się z przykładowymi układami, zobacz Rysunek 3 i <silna klasa="xfig">Rysunek 4.
<ol>
	<li>Przygotować odpowiednią ujemną płytkę kontrolną RT-QuIC (np. niezakażony homogenat mózgu [UN BH]) przez rozcieńczenie do odpowiedniego stężenia w roztworze rozcieńczania tkanek (N2-0,1%SDS/PBS). Przygotować dodatnie rozcieńczenie kontrolne płytki, rozcieńczając homogenat mózgu zakażony prionami do rozcieńczenia 10-3 w roztworze rozcieńczania tkanek.</li>
	<li>Usunąć wcześniej przechowywane granulki ekstraktu z wacika kontrolnego z temperatury -80 °C i ponownie zawiesić każdy z 50 μl MQ H2O, pipetując w górę i w dół około 10 razy, a następnie krótko wirując. Pozostawić próbki w temperaturze pokojowej (RT) podczas wykonywania pozostałych kroków.</li>
	<li>Załadować 2 μl określonych kontrolnych płytek, w tym kontroli ujemnych na płytkach (sam roztwór rozcieńczający tkanki i niezakażony homogenat mózgu) oraz dodatniej kontroli płytki (zakażony homogenat mózgu).</li>
	<li>Załadować 2 μl każdej dodatniej i ujemnej ekstrakcji technicznej ekstraktu wymazu do co najmniej czterech powtórzonych dołków płytkowych RT-QuIC. 
	UWAGA: Jeśli ujemne kontrole wymazu wykazują wysiewanie RT-QuIC powyżej standardu laboratoryjnego dla pozytywnego oznaczenia, oznaczałoby to, że zanieczyszczenie zostało wprowadzone podczas procesu pobierania wymazów, ekstrakcji i zagęszczania i że eksperyment z wymazem powinien zostać przeprowadzony ponownie</li>
</ol>
6. Przygotowanie próbek do użycia w RT-QuIC
<ol>
	<li>Przygotować odpowiednią ujemną płytkę kontrolną (np. niezakażony homogenat mózgu, niezakażony węzeł chłonny itp.) poprzez rozcieńczenie do odpowiedniego stężenia w roztworze rozcieńczania tkanek (N2-0,1% SDS/PBS). Przygotować pozytywne kontrole płytki, rozcieńczając zakażony homogenat mózgu do rozcieńczenia 10-3 w roztworze rozcieńczania tkanek.</li>
	<li>Usunąć wcześniej przechowywane granulki ekstraktu z wacika z temperatury -80 °C i ponownie zawiesić z 20-50 μl roztworu rozcieńczającego tkanki (w zależności od podejrzewanej ilości zanieczyszczenia), pipetując w górę iw dół około dziesięciu razy, a następnie krótko wirując. Pozwól próbkom usiąść w RT podczas wykonywania pozostałych kroków.</li>
	<li>Załadować 2 μl określonych kontrolnych płytek, w tym ujemnych kontroli płytkowych (sam roztwór rozcieńczający tkanki i niezakażony homogenat mózgu) oraz dodatniej kontroli płytki (zakażony homogenat mózgu) do studzienek na płytki RT-QuIC.</li>
	<li>Załadować 2 μl każdego ekstraktu z wymazu do czterech studzienek replikacji.</li>
</ol>
7. Analiza i wyniki RT-QuIC
<ol>
	<li>Wykonaj RT-QuIC zgodnie z indywidualnymi protokołami laboratoryjnymi (protokoły opcjonalne38,40).</li>
	<li>Zdefiniuj parametry wymagane do określenia dodatniej wartości próbki (patrz reprezentatywne wyniki, <silna klasa="xfig">Rysunek 5). 
	UWAGA: Te parametry są definiowane przez każde laboratorium.</li>
	<li>Zapisz wyniki w podanej tabeli i podejmij odpowiednie działania w oparciu o najlepsze praktyki laboratoryjne (Tabela 1 i Rysunek uzupełniający 2).</li>
</ol>

<ol><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216 (4542), 136-144 (1982).</li>
<li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).</li>
<li>Oesch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40 (4), 735-746 (1985).</li>
<li>Caughey, B., Raymond, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scrapie-associated+form+of+PrP+is+made+from+a+cell+surface+precursor+that+is+both+protease-+and+phospholipase-sensitive%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive.</a> J Biol Chem. 266 (27), 18217-18223 (1991).</li>
<li>Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+native+prions+from+minimal+components+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formation of native prions from minimal components in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (23), 9741-9746 (2007).</li>
<li>Gajdusek, D. C., Zigas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerative+disease+of+the+central+nervous+system+in+New+Guinea%3A+the+endemic+occurrence+of+%26%2334%3Bkuru%26%2334%3B+in+the+native+population%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Degenerative disease of the central nervous system in New Guinea: the endemic occurrence of &#34;kuru&#34; in the native population.</a> N Engl J Med. 257, 974-978 (1957).</li>
<li>Centers for Disease Control. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+degenerative+neurologic+disease+in+patients+who+received+pituitary-derived+human+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb+Mortal+Wkly+Rep%22%5BJournal%5D)">Fatal degenerative neurologic disease in patients who received pituitary-derived human growth hormone.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 34, 359-361 (1985).</li>
<li>Duffy, P., Wolf, J., Collins, G., DeVoe, A. G., Streeten, B., Cowen, D. Letter: possible person-to-person transmission of Creutzfeldt-Jakob disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuffy%2C+P+%22N+Engl+J+Med%22">N Engl J Med</a>. 290 (12), 692-693 (1974).</li>
<li>Brown, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iatrogenic+Creutzfeldt-Jakob+disease+at+the+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease at the millennium.</a> Neurology. 55 (8), 1075-1081 (2000).</li>
<li>Huillard d'Aignaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubation+period+of+Creutzfeldt-Jakob+disease+in+human+growth+hormone+recipients+in+France%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Incubation period of Creutzfeldt-Jakob disease in human growth hormone recipients in France.</a> Neurology. 53 (6), 1197-1201 (1999).</li>
<li>Marzewski, D. J., Towfighi, J., Harrington, M. G., Merril, C. R., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creutzfeldt-Jakob+disease+following+pituitary-derived+human+growth+hormone+therapy%3A+a+new+American+case%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Creutzfeldt-Jakob disease following pituitary-derived human growth hormone therapy: a new American case.</a> Neurology. 38, 1131-1133 (1988).</li>
<li>Hannah, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creutzfeldt-Jakob+disease+after+receipt+of+a+previously+unimplicated+brand+of+dura+mater+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Creutzfeldt-Jakob disease after receipt of a previously unimplicated brand of dura mater graft.</a> Neurology. 56 (8), 1080-1083 (2001).</li>
<li>Shimizu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creutzfeldt-Jakob+disease+with+florid-type+plaques+after+cadaveric+dura+mater+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Neurol%22%5BJournal%5D)">Creutzfeldt-Jakob disease with florid-type plaques after cadaveric dura mater grafting.</a> Arch Neurol. 56 (3), 357-362 (1999).</li>
<li>Antoine, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creutzfeldt-Jakob+disease+after+extracranial+dura+mater+embolization+for+a+nasopharyngeal+angiofibroma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Creutzfeldt-Jakob disease after extracranial dura mater embolization for a nasopharyngeal angiofibroma.</a> Neurology. 48 (5), 1451-1453 (1997).</li>
<li>Esmonde, T., Lueck, C. J., Symon, L., Duchen, L. W., Will, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creutzfeldt-Jakob+disease+and+lyophilised+dura+mater+grafts%3A+report+of+two+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Creutzfeldt-Jakob disease and lyophilised dura mater grafts: report of two cases.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 56, 999-1000 (1993).</li>
<li>Willison, H. J., Gale, A. N., McLaughlin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creutzfeldt-Jakob+disease+following+cadaveric+dura+mater+graft%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Creutzfeldt-Jakob disease following cadaveric dura mater graft.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 54, 940(1991).</li>
<li>Diringer, H., Braig, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+unconventional+viruses+in+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Infectivity of unconventional viruses in dura mater.</a> Lancet. 334, 439-440 (1989).</li>
<li>Peden, A. H., Head, M. W., Ritchie, D. L., Bell, J. E., Ironside, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+vCJD+after+blood+transfusion+in+a+PRNP+codon+129+heterozygous+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Preclinical vCJD after blood transfusion in a PRNP codon 129 heterozygous patient.</a> Lancet. 364 (9433), 527-529 (2004).</li>
<li>Will, R. G., Matthews, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+case-to-case+transmission+of+Creutzfeldt-Jakob+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Evidence for case-to-case transmission of Creutzfeldt-Jakob disease.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 45, 235-238 (1982).</li>
<li>el Hachimi, K. H., Chaunu, M. P., Cervenakova, L., Brown, P., Foncin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+neurosurgical+transmission+of+Creutzfeldt-Jakob+disease+with+analysis+of+donor+and+recipient%3A+agent+strains%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+III%22%5BJournal%5D)">Putative neurosurgical transmission of Creutzfeldt-Jakob disease with analysis of donor and recipient: agent strains.</a> C R Acad Sci III. 320 (4), 319-328 (1997).</li>
<li>Alper, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+the+agent+of+scrapie+replicate+without+nucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid.</a> Nature. 214, 764-766 (1967).</li>
<li>Casassus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((France+halts+prion+research+amid+safety+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">France halts prion research amid safety concerns.</a> Science. 373 (6554), 475-476 (2021).</li>
<li>Brandel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+Creutzfeldt-Jakob+disease+diagnosed+7.5+years+after+occupational+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Variant Creutzfeldt-Jakob disease diagnosed 7.5 years after occupational exposure.</a> N Engl J Med. 383 (1), 83-85 (2020).</li>
<li>Flechsig, E., Hegyi, I., Enari, M., Schwarz, P., Collinge, J., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+scrapie+by+steel-surface-bound+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Transmission of scrapie by steel-surface-bound prions.</a> Mol Med. 7 (10), 679-684 (2001).</li>
<li>Zobeley, E., Flechsig, E., Cozzio, A., Enari, M., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+scrapie+prions+bound+to+a+stainless+steel+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Infectivity of scrapie prions bound to a stainless steel surface.</a> Mol Med. 5 (4), 240-243 (1999).</li>
<li>Brown, P., Gajdusek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+scrapie+virus+after+3+years%27+interment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Survival of scrapie virus after 3 years' interment.</a> Lancet. 337 (8736), 269-270 (1991).</li>
<li>Seidel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie+agent+%28strain+263K%29+can+transmit+disease+via+the+oral+route+after+persistence+in+soil+over+years%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Scrapie agent (strain 263K) can transmit disease via the oral route after persistence in soil over years.</a> PLoS One. 2 (5), e435(2007).</li>
<li>Maddison, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of scrapie prions.</a> J Virol. 84 (21), 11560-11562 (2010).</li>
<li>Pritzkow, S., Morales, R., Lyon, A., Concha-Marambio, L., Urayama, A., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+prion+disease+transmission+through+common+environmental+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Efficient prion disease transmission through common environmental materials.</a> J Biol Chem. 293 (9), 3363-3373 (2018).</li>
<li>Alper, T., Cramp, W., Haig, D., Clarke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+the+agent+of+scrapie+replicate+without+nucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid.</a> Nature. 214 (90), 764-766 (1967).</li>
<li>Bernoulli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danger+of+accidental+person-to-person+transmission+of+Creutzfeldt-Jakob+disease+by+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Danger of accidental person-to-person transmission of Creutzfeldt-Jakob disease by surgery.</a> Lancet. 309 (8009), 478-479 (1977).</li>
<li>Brown, P., Rohwer, R. G., Green, E. M., Gajdusek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+chemicals%2C+heat%2C+and+histopathologic+processing+on+high-+infectivity+hamster-adapted+scrapie+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Effect of chemicals, heat, and histopathologic processing on high- infectivity hamster-adapted scrapie virus.</a> J Infect Dis. 145 (5), 683-687 (1982).</li>
<li>Brown, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+disinfection+of+Creutzfeldt-Jakob+disease+virus%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Chemical disinfection of Creutzfeldt-Jakob disease virus.</a> N Engl J Med. 306, 1279-1282 (1982).</li>
<li>Dickinson, A. G., Taylor, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+scrapie+agent+to+decontamination%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Resistance of scrapie agent to decontamination.</a> N Engl J Med. 299, 1413-1414 (1978).</li>
<li>Hunter, G. D., Millson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+heat+stability+and+chromatographic+behavior+of+the+scrapie+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Studies on the heat stability and chromatographic behavior of the scrapie agent.</a> J Gen Microbiol. 37, 251-258 (1964).</li>
<li>Pattison, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+the+scrapie+agent+to+formalin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Resistance of the scrapie agent to formalin.</a> J Comp Pathol. 75, 159-164 (1965).</li>
<li>Fraser, H., Farquhar, C., McConnell, I., Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scrapie+disease+process+is+unaffected+by+ionising+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Clin+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">The scrapie disease process is unaffected by ionising radiation.</a> Prog Clin Biol Res. 317, 653-658 (1989).</li>
<li>Yuan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+chronic+wasting+disease+prions+recovered+from+environmentally+relevant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of chronic wasting disease prions recovered from environmentally relevant surfaces.</a> Environ Int. 166, 107347(2022).</li>
<li>Simmons, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+determination+of+residual+prion+infectivity+from+prion-decontaminated+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive determination of residual prion infectivity from prion-decontaminated surfaces.</a> mSphere. 9, e00504-e00524 (2024).</li>
<li>Orru, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+pathological+seeds+of+alpha-synuclein%2C+tau+and+prion+protein+on+solid+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of pathological seeds of alpha-synuclein, tau and prion protein on solid surfaces.</a> PLoS Pathog. 20 (4), e1012175(2024).</li>
<li>Wilham, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+end-point+quantitation+of+prion+seeding+activity+with+sensitivity+comparable+to+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays.</a> PLoS Pathog. 6 (12), e1001217(2010).</li>
<li>Srivastava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+quantitation+of+pathological+alpha-synuclein+in+patient+biospecimens+by+RT-QuIC+seed+amplification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Enhanced quantitation of pathological alpha-synuclein in patient biospecimens by RT-QuIC seed amplification assays.</a> PLoS Pathog. 20 (9), e1012554(2024).</li>
<li>Hughson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+prions+and+amyloid+seeds+with+hypochlorous+acid%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inactivation of prions and amyloid seeds with hypochlorous acid.</a> PLoS Pathog. 12 (9), e1005914(2016).</li>
<li>Williams, K., Hughson, A. G., Chesebro, B., Race, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+chronic+wasting+disease+prions+using+sodium+hypochlorite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inactivation of chronic wasting disease prions using sodium hypochlorite.</a> PLoS One. 14 (10), e0223659(2019).</li>
<li>Taylor, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoclaving+standards+for+Creutzfeldt-Jakob+disease+agent+%5Bletter%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoclaving standards for Creutzfeldt-Jakob disease agent [letter].</a> Ann Neurol. 22 (4), 557-558 (1987).</li>
<li>Brown, P., Rohwer, R. G., Gajdusek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newer+data+on+the+inactivation+of+scrapie+virus+or+Creutzfeldt-Jakob+disease+virus+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Newer data on the inactivation of scrapie virus or Creutzfeldt-Jakob disease virus in brain tissue.</a> J Infect Dis. 153 (6), 1145-1148 (1986).</li>
</ol>

J.C.B. i Q.Y. są wynalazcami w zgłoszeniu patentowym dotyczącym technologii wymazywania powierzchni prionów.

Opisana metoda bezpiecznego pobierania wymazów prionowych może być wykorzystana do wzmocnienia istniejących środków bezpieczeństwa prionowego. Metoda ta może monitorować przestrzenie i sprzęt laboratoryjny prionów, a także współdzielone przestrzenie laboratoryjne, pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia prionami. Co ważne, metoda ta może być zaadaptowana do testowania laboratoryjnych technik dezynfekcji w celu weryfikacji dekontaminacji powierzchni zanieczyszczonych prionami. Ponieważ różne szczepy prionów wykazują różną wrażliwość na techniki dezynfekcji, metoda ta może potwierdzić, że techniki te są skuteczne w obecnych eksperymentach laboratoryjnych, takich jak leczenie wodorotlenkiem sodu lub podchlorynem sodu (wybielaczem)43,44.
Kluczowe kroki w ramach tej metodologii obejmują identyfikację odpowiednich miejsc pobierania wymazów, które dostarczą próbki zarówno z obszarów o dużym natężeniu ruchu, jak i obszarów do monitorowania, które mogą być związane z dalszym zanieczyszczeniem krzyżowym eksperymentów. Ponadto laboratoria powinny stosować kontrole pozytywne i negatywne, które ściśle odzwierciedlają te powszechnie stosowane w danym laboratorium lub klinice. Na przykład, jeśli pracujesz z prionami gryzoni, kontrole pozytywne i ujemne powinny pasować do tego gatunku. Wreszcie, dane z nadzoru powinny być aktualizowane i organizowane w taki sposób, aby można było łatwo zidentyfikować tendencje w zakresie pozytywności, co pozwoli na łagodzenie skutków i ponowne szkolenie personelu laboratoryjnego w przypadku konsekwentnych pozytywnych wyników dla danego obszaru.
Jednym z ograniczeń tego protokołu jest potencjalne generowanie błędnych wyników RT-QuIC. Biorąc pod uwagę wrażliwy charakter RT-QuIC, obecność pozostałości detergentów, soli i innych substancji na powierzchniach laboratoryjnych może mieć wpływ na wynik reakcji39. Ogólnie rzecz biorąc, biorąc pod uwagę tę obserwację, korzystne jest, aby powierzchnie pozostały wolne od substancji, które mogą zakłócać działanie RT-QuIC, takich jak resztki soli, detergenty i kurz. Przewidujemy, że wraz z wprowadzaniem ulepszeń do metodologii RT-QuIC wiele z obecnych ograniczeń RT-QuIC zostanie rozwiązanych. W związku z tym zachęcamy użytkowników końcowych do śledzenia literatury w celu skorzystania z najnowszych ulepszeń w RT-QuIC.
Kluczową zaletą tej metody dla laboratoriów badających priony jest możliwość zminimalizowania zanieczyszczeń, które mogą mieć wpływ na wyniki czułych testów amplifikacji. Narzędzia do sekcji zwłok są zwykle dezynfekowane przed ponownym użyciem do przyszłych sekcji zwłok. Opisana metoda pobierania wymazów zapewnia metodę oceny narzędzi do sekcji zwłok pod kątem resztkowej zakaźności prionów, która może mieć wpływ na dalsze wyniki. Może to zapewnić dodatkowy poziom rygoru eksperymentów, aby wykluczyć możliwość, że wykrycie prionów w tkankach nie było spowodowane zanieczyszczeniem narzędziami do sekcji zwłok.

Choroby prionowe są niezmiennie śmiertelnymi chorobami neurodegeneracyjnymi, na które nie ma znanego leczenia ani lekarstwa. Choroby prionowe są wywoływane przez PrPSc, nieprawidłowo sfałdowaną i patogenną formę normalnej komórkowej formy białka prionowego1,2,3,4,5, PrPC. Wiadomo, że choroby prionowe dotykają ludzi i kilka innych gatunków zwierząt. Jedna z ludzkich chorób prionowych, choroba Creutzfeldta-Jakoba (CJD), ma trzy znane etiologie: sporadyczną, dziedziczną i nabytą. Nabyta CJD może wystąpić w wyniku przypadkowej transmisji (jatrogennej i zawodowej) i uważa się, że jest przyczyną Kuru u ludów Fore z Papui-Nowej Gwinei6.
Transmisja prionów została powiązana z urządzeniami medycznymi skażonymi prionami i materiałami do przeszczepów7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17. Jatrogenne przenoszenie CJD może nastąpić przez krew, tkankę lub z powierzchni skażonych prionami18,19,20. Na przykład, jatrogenna CJD może rozwinąć się u pacjentów po elektroencefalogramie z elektrodami wcześniej stosowanymi u osoby w fazie przedklinicznej CJD, która następnie uległa CJD21. Nowsze przypadki przenoszenia zawodowego w laboratoriach miały również miejsce, gdy pracownik laboratorium zaraził się chorobą prionową poprzez nakłucie skóry kleszczami używanymi do dotykania wycinków mózgu zwierzęcia zarażonego zaadaptowanym przez owce BSE22,23. Takie scenariusze transmisji mogą wystąpić w warunkach klinicznych, laboratoryjnych i diagnostycznych, w których przetwarzane są próbki prionów.
Priony są odporne na powszechne techniki dezynfekcji i mogą utrzymywać się i pozostawać zakaźne na powierzchniach przez dłuższy czas24,25,26,27,28,29. Powszechne techniki dezynfekcji, takie jak stosowanie etanolu, fenolowych środków czyszczących, nadtlenku wodoru, różnych form promieniowania i formaldehydu, są niewystarczające do inaktywacji prionów, co pozwala powierzchniom zachować zakaźność30,31,32,33,34,35,36,37. Cechy te przyczyniają się do przenoszenia prionów podczas narażenia jatrogennego i zawodowego.
Metody wykrywania prionów środowiskowych zostały opracowane dopiero niedawno. Metoda pobierania wymazów środowiskowych w połączeniu z konwersją wywołaną wstrząsem w czasie rzeczywistym (RT-QuIC) może ocenić resztkową zakaźność prionów z powierzchni środowiskowych, a także zwykłych powierzchni laboratoryjnych po nieskutecznej dezynfekcji38,39,40,41,42. Tutaj opisujemy, w jaki sposób ta technika może zostać włączona do szerszego programu bezpieczeństwa prionowego. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może pozwolić na monitorowanie protokołów dezynfekcji zależnych od laboratorium, badanie i właściwe dokumentowanie stanu skażenia, co może pomóc w zapewnieniu ważności eksperymentów poprzez minimalizację zanieczyszczenia krzyżowego, ocenę przestrzeni wspólnego użytku pod kątem zanieczyszczenia prionami i pozwala na kierunkowe przeszkolenie personelu w oparciu o powszechnie skażone obszary.

<table><tbody><tr><td>Marka rybacka&nbsp; Waciki piankowe PurSwab Marka</td><td>Fisher</td><td>Katalog #14-960-3E</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q IQ 7005 System wody ultraczystej</td><td>MilliporeSigma</td><td>Q7005T0C</td><td></td></tr><tr><td>Mini-wirówka, 6000 obr./min</td><td>Southern Labware</td><td>MLX-306</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Czytnik</td><td></td>płytek</tr><tr><td>Omega Q700 sonikator</td><td>QSonica</td><td>Q700-110</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko prionowe chomika</td><td>MNPRO</td><td>MNPROteina-chomik</td><td>chomik syryjski, aminokwasy 90-231</td></tr><tr><td>Savant speedvac&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD1030-230</td><td></td></tr><tr><td>Nanosfery krzemionkowe (50 nm)</td><td>nano Composix&nbsp;</td><td>SISN50-25M</td><td></td></tr></tbody></table>

test laboratoryjny bezpieczeństwa prionowego

Prion Safety Laboratory Swipe Test

Przeniesienie jatrogennej choroby prionowej nastąpiło z zanieczyszczonych narzędzi neurochirurgicznych, materiałów do przeszczepów i narażenia zawodowego na narzędzia laboratoryjne skażone prionami. Priony wywołują chorobę poprzez nieprawidłowe fałdowanie normalnej formy komórkowej białka prionowego, PrPC, do nieprawidłowo sfałdowanej i patogennej formy PrPSc i są niezmiennie śmiertelne. Ograniczenie jatrogennej i zawodowej transmisji prionów jest wyzwaniem. Po pierwsze, priony mogą wiązać się z powierzchniami i utrzymywać się na nich przez długi czas. Po drugie, priony są wysoce odporne na inaktywację. Biorąc to pod uwagę, powierzchnie mogą zachować zakaźność przez długi czas po nieskutecznej dekontaminacji. Może to nie tylko stanowić potencjalne ryzyko zawodowe dla pracowników laboratoriów prionowych, ale może potencjalnie zanieczyścić krzyżowo eksperymenty laboratoryjne wykorzystujące wrażliwe techniki amplifikacji prionów. Opisany tutaj protokół laboratoryjnego testu bezpieczeństwa prionów obejmuje kroki identyfikacji i dokumentowania obszarów laboratoryjnych o dużym natężeniu ruchu, zalecane kontrole wymazów w celu zapewnienia ważności wyników, kroki mające na celu określenie właściwych reakcji na dodatnie miejsca pobierania wymazów powierzchniowych, reprezentatywne wyniki testów prionowych, a także potencjalne wyniki artefaktów. Ogólnie rzecz biorąc, laboratoryjny test bezpieczeństwa prionów może być wdrożony jako część szerszego programu bezpieczeństwa prionów w celu oceny dekontaminacji powierzchni, monitorowania przestrzeni wspólnych pod kątem zanieczyszczenia prionami i wdrożenia dokumentacji stanu dekontaminacji prionowej.

Opis pisemny wyników pozytywnych i negatywnych (w tym kontroli pozytywnych i negatywnych dla płytek i wymazów)
W ramach wymazów nadzorczych stosuje się wymazy kontrolne ujemne, aby monitorować potencjalne zanieczyszczenie prionami, które mogłoby wystąpić podczas procesu pobierania wymazów, ekstrakcji i zagęszczania. Pierwsza płytka RT-QuIC wykonana w ramach danego miesięcznego nadzoru powinna zawierać kontrolne wymazy dodatnie i ujemne. Prawidłowe kontrole ujemne nie przekraczają progu fluorescencji dodatniej (Rysunek 6A). Taki wynik wskazywałby, że podczas procedur eksperymentalnych nie wprowadzono zanieczyszczeń. Prawidłowe ekstrakty z wymazów kontrolnych dodatnich wykazałyby dodatnie zasiewanie we wszystkich powtórzonych studzienkach dla danej próbki (wymazy kontrolne dodatnie zanieczyszczono homogenatem mózgu z hodowlanym u chomików szczepem Hyper (HY TME) transmisyjnej encefalopatii norki). Włączenie serii rozcieńczeń kontroli dodatniej pozwala na określenie czułości detekcji prionów w danym eksperymencie (Rysunek 6A).
Podczas badania próbek z wymazów z powierzchni, powierzchnie, w których nie stwierdzono namnażania powyżej ustalonego progu fluorescencji dodatniej, można uznać za wolne od prionów (Rycina 6B). Z kolei wymazy z powierzchni zanieczyszczonych prionami wykażą zdolność do namnażania powyżej progu fluorescencji dodatniej, choć stosunek maxpoint (MPR) oraz czas do wystąpienia fluorescencji mogą różnić się w porównaniu z dołączoną dodatnią kontrolą na płytce (Rycina 6B). Zdolność tej metody do oceny prawidłowej dezynfekcji została podkreślona w przypadku powierzchni zanieczyszczonych prionami i potraktowanych wybielaczem, które obecnie nie wykazują zdolności do namnażania w teście RT-QuIC (Rycina 6B).
Warto zaznaczyć, że choć w naszym laboratorium próbkę dodatnią definiuje się jako taką, która przekracza ustalony próg fluorescencji dodatniej w co najmniej połowie powtórzeń, każde laboratorium powinno ustalić własne standardy. Szybkość tworzenia amyloidu (RAF) oraz czas do wystąpienia fluorescencji mogą również pomóc w ustaleniu specyficznych dla danego laboratorium progów dodatniości.
Zaobserwowaliśmy wyniki będące artefaktami powierzchniowymi, które przekraczały próg dodatniej fluorescencji, lecz charakteryzowały się zmienionymi krzywymi kinetycznymi oraz nienaturalnie długim czasem do wystąpienia fluorescencji w porównaniu z próbkami kontrolnymi dodatnimi (Rysunek 6C). Wyniki te należy interpretować z ostrożnością, ponieważ mogą być one spowodowane obecnością kurzu lub pozostałości chemikaliów na powierzchni. Wnioski te podkreślają konieczność zachowania ogólnej czystości laboratoryjnej, a także potrzebę ustalenia kryteriów pozwalających na rozróżnienie prawdziwego dodatniego zasiewu od wyników fałszywie dodatnich.
Utylizację stałych i ciekłych odpadów biologicznych należy przeprowadzać zgodnie z aktualnymi wytycznymi danej instytucji dotyczącymi utylizacji materiałów niebezpiecznych biologicznie. Powszechne techniki dezynfekcji prionów obejmująy traktowanie wodorotlenkiem sodu, podchlorynem sodu (wybielem) lub autoklawowanie w temperaturze 134 °C przez 18 min43,44,45,46.
<img alt="Proces testu wymazowego bezpieczeństwa prionów: identyfikacja, pobieranie wymazów, analiza RT-QuIC, schemat prowadzenia dokumentacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67889/67889fig01.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przegląd testu wymazowego bezpieczeństwa prionów w laboratorium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67889/67889fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat organizacji stanowiska laboratoryjnego z opisanym sprzętem do przygotowania i analizy próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67889/67889fig02.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Układ miejsca pobierania wymazów z próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67889/67889fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat serii rozcieńczeń mikrobiologicznych z zestawem kontrolnym wymazów do analizy zanieczyszczeń." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67889/67889fig03.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Projekt przykładowego eksperymentu dla kontroli wymazów w ramach testu wymazowego w laboratorium bezpieczeństwa prionów. (A) Przykładowy układ dla ujemnych i dodatnich kontroli ekstraktów z wymazów. (B) Ujemne i dodatnie kontrole ekstraktów z wymazów należy resuspendować w 50 µL H2O. 10-krotne rozcieńczenie resuspendowanego ekstraktu z wymazu powinno zostać przygotowane poprzez rozcieńczenie go w roztworze do rozcieńczania tkanek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67889/67889fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ mikro płytki do analizy ekstraktów z wymazów z powierzchni; obejmuje próbki kontrolne i instrukcje rozcieńczania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67889/67889fig04.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przykładowy projekt eksperymentu dla ekstraktów z wymazów z powierzchni w ramach testu wymazowego w laboratorium bezpieczeństwa prionów. (A) Układ próbek dla ekstraktów z wymazów z powierzchni. (B) Próbki ekstraktów z wymazów z powierzchni należy resuspender w 20 µL roztworu do rozcieńczania tkanek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67889/67889fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat testu wymazowego w laboratorium bezpieczeństwa prionów; wyniki RT-QuIC dla procedury dekontaminacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67889/67889fig05.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Comiesięczny test wymazowy w laboratorium bezpieczeństwa prionów. Schemat służący do interpretacji wyników i określenia odpowiedniej reakcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67889/67889fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy przedstawiające wyniki liczenia kolonii drobnoustrojów na płytkach oraz fluorescencję ThT w czasie w eksperymentach z rozcieńczeniami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67889/67889fig06.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Reprezentatywny eksperyment z wymazami z powierzchni. (A) Kontrolna płytka z wymazami powierzchniowymi zawierająca w trzech powtórzeniach negatywne kontrole ekstraktów z wymazów (DPBS, homogenat mózgu chomika niezakażonego 10-4 i 10-10) oraz w trzech powtórzeniach pozytywne kontrole ekstraktów z wymazów (homogenat mózgu HY 10-3). (B) Reprezentatywne ekstrakty z wymazów z powierzchni blatu, szkła i stali nierdzewnej (S.S.), które zostały pobrane przed kontaminacją, po kontaminacji HY 10-3 oraz po traktowaniu skażonych powierzchni wybielaczem. (C) Porównanie krzywych fluorescencji dla homogenatu mózgu niezakażonego 10-4, homogenatu mózgu HY 10-3 oraz ekstraktu z wymazu z blatu pokrytego cienką warstwą kurzu. Negatywne kontrole płytek dla paneli A i B obejmują próbkę ślepą (roztwór do rozcieńczania tkanek) oraz homogenat mózgu chomika niezakażonego 10-4. Panel B zawiera dodatek homogenatu mózgu niezakażonego 10-4 oraz pozytywną kontrolę płytkową w postaci homogenatu mózgu HY 10-3. Pozytywny próg fluorescencji (oznaczony czerwoną przerywaną linią) określono na poziomie 2. Raportowany stosunek punktu maksymalnego (MPR) to maksymalna fluorescencja podzielona przez początkowy odczyt fluorescencji uzyskany za pomocą czytnika płytek. Każdy punkt reprezentuje jeden techniczny powtórzenie w studzience dla danego typu próbki. Przedstawiono średnią i odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67889/67889fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Miesięczny formularz dokumentacji miejsc pobierania wymazów z próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67889/Table%201.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Szablon układu miejsc wymazowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67889/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Miesięczny formularz dokumentacji miejsca pobierania wymazów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67889/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Brakuje metody oceny powszechnie używanych obszarów w warunkach laboratoryjnych pod kątem zanieczyszczenia prionami i skutecznej dekontaminacji. Opisany tutaj protokół zawiera kluczowe podstawy do wdrożenia laboratoryjnego testu bezpieczeństwa prionów, który można łatwo modyfikować w celu spełnienia indywidualnych potrzeb określonych laboratoriów.

Test laboratoryjny bezpieczeństwa prionowego

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to ...

Nasza multidyscyplinarna grupa stara się zrozumieć, w jaki sposób zakaźne białko, prion, może wykonywać złożone zadania biologiczne. Interesuje nas również, w jaki sposób priony mogą przetrwać w środowisku przez lata lub dziesięciolecia. Po przeprowadzeniu procedur odkażania prionami nie była dostępna solidna metoda określania skuteczności inaktywacji prionów.Staramy się rozwiązać ten problem za pomocą naszych badań. Metoda wymazu, w połączeniu z RT-QuIC, pozwala na pobieranie próbek z szerokiego zakresu powierzchni w celu wykrycia aktywności wysiewu prionów. Może to być wykorzystane do wykrywania prionów związanych z powierzchnią w warunkach laboratoryjnych, klinicznych lub środowiskowych.Interesuje mnie zrozumienie, w jaki sposób priony oddziałują z powierzchniami i jakie są wymagania prionów związanych z powierzchnią do wywołania infekcji. Na początek zidentyfikuj i oznacz odpowiednie obszary nadzoru do pobierania wymazów. Przygotuj dwie mikroprobówki wirówkowe o pojemności 1,5 mililitra dla każdego zidentyfikowanego obszaru i dodaj 250 mikrolitrów DPBS do pierwszej probówki, pozostawiając drugą pustą.Wyjmij waciki z piankową końcówką z magazynu w miejscu wolnym od zanieczyszczenia prionowego. Przygotować kontrole dodatnie i ujemne przy użyciu odpowiednich homogenatów mózgu lub BH w DPBS. Używając czystych rękawiczek, wyjmij wymaganą liczbę wacików piankowych z opakowania i umieść je uchwytem do dołu w stojaku na probówki.Upewnij się, że końcówki nie stykają się z innymi powierzchniami. Trzymając za uchwyt czysty wacik piankowy, nałóż 50 mikrolitrów odpowiednich dodatnich i ujemnych próbek kontrolnych na końcówki wacika. Za pomocą nożyczek odetnij nadmiar uchwytu wacika do około połowy jego długości i umieść wacik w wstępnie załadowanej probówce z mikrowirówką, aby zanurzyć piankową końcówkę w DPBS.Trzymając czysty wacik z pianką za uchwyt, wstępnie zwilż piankową końcówkę wodą molekularną i strząśnij nadmiar wody. Umieść zwilżoną piankową końcówkę na obszarze wybranym do nadzoru i przetrzyj obszar w przód iw tył około 10 razy, jednocześnie obracając końcówkę wacika po powierzchni. Za pomocą nożyczek odetnij nadmiar uchwytu wacika do około połowy jego długości i umieść wacik w wstępnie załadowanej probówce mikrowirówki, aby zanurzyć piankową końcówkę w DPBS, upewniając się, że pokrywka może się całkowicie zamknąć.Wyrzuć rękawice i zastąp je nowymi przed przejściem do następnego miejsca pobierania wymazów, aby zminimalizować zanieczyszczenie krzyżowe. W celu ekstrakcji wymazu umieść probówkę mikrowirówki w okrągłym stojaku na probówki i zanurz stojak w łaźni wodnej sonicater z tubą kubkową. Upewnij się, że wacik piankowy w DPBS w rurce znajduje się poniżej powierzchni wody, pozostawiając części uchwytu niezanurzone.Sonikuj próbkę łącznie przez 15 sekund z pięcioma sekundami włączenia i pięcioma sekundami wyłączenia. Po sonikacji należy odwirować probówkę przez około 15 sekund, aby zebrać DPBS na dnie probówki przed przeniesieniem. Używając pipety P 1000 ustawionej na 250 mikrolitrów, ostrożnie zbierz cały płynny ekstrakt wacika z dna do odpowiedniej, wstępnie oznakowanej pustej probówki.Wyrzuć zużytą probówkę zawierającą wacik. Zagęścić próbkę w koncentratorze próżniowym, upewniając się, że nakrętka probówki jest otwarta, po zakończeniu cyklu upewnić się, że próbka jest całkowicie zagęszczona, a pozostała tylko osadka. Przechowuj granulat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia.Do analizy RT-QuIC należy przygotować ujemną i dodatnią płytkę kontrolną z odpowiednimi homogenatami mózgu rozcieńczonymi w roztworze rozcieńczania tkanek. Teraz rozmrozić przechowywany granulat ekstraktu z wacika z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i ponownie zawiesić wysuszony ekstrakt z wacika z 50 mikrolitrami wody molekularnej przez pipetowanie. Krótko odwirować i pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej.Załaduj dwa mikrolitry ujemnych i dodatnich kontrolnych płytek, a następnie ekstrakty wacikowe do odpowiednich dołków płytkowych RT-QuIC. Wymazy z kontroli ujemnej nie przekroczyły progu dodatniej fluorescencji, co potwierdza brak zanieczyszczenia podczas zabiegów. Ekstrakty wymazów z kontroli dodatniej wykazywały spójne wysiewanie we wszystkich dołkach replikowanych, wykazując właściwą czułość wykrywania.Próbki wymazów powierzchniowych z obszarów nieskażonych nie wykazały wysiewu powyżej progu, co potwierdza ujemność prionów. Powierzchnie zanieczyszczone prionami wykazywały wysiew powyżej progu z różnymi maksymalnymi stosunkami punktowymi i czasami fluorescencji w porównaniu z kontrolami. Powierzchnie zanieczyszczone wybielaczem i prionami nie były w stanie wysiewać RT-QuIC, co świadczy o skutecznej dezynfekcji.Niektóre artefakty powierzchniowe wykazywały zmienione krzywe kinetyczne i dłuższe czasy fluorescencji, co wskazuje na potencjalne fałszywe alarmy, prawdopodobnie z powodu obecności kurzu lub pozostałości chemikaliów na powierzchni.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy nową metodę monitorowania pobierania i transportu prionów przez komórki odpornościowe bezpośrednio po inokulacji doprzewnowej, polegającą na oczyszczaniu i znakowaniu fluorescencyjnym zagregowanych prętów prionowych z zakażonego materiału mózgowego, a następnie śledzeniu ich pobierania i przemieszczania się z miejsca wstrzyknięcia oraz charakteryzacji komórek pośredniczących w tych zdarzeniach.

Monitorowanie przemieszczania się komórek odpornościowych do fluorescencyjnych pręcików prionowych w godzinach po zakażeniu drogą dosytrychialną

Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek (PMCA) jest testem in vitro służącym do badania konwersji prionów oraz barier szczepowych i gatunkowych. Może być również wykorzystywana jako test detekcji prionów.

Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek prionów

Padlinożercy mają potencjał do przenoszenia zakaźnych prionów gąbczastej encefalopatii w swoim kale do obszarów wolnych od chorób.  Szczegółowo opisujemy metody stosowane do określenia, czy priony trzęsawki przystosowane do myszy pozostają zakaźne po przejściu przez przewód pokarmowy wron amerykańskich (Corvus brachyrhynchos), powszechnego konsumenta martwych zwierząt.

Procedury identyfikacji zakaźnych prionów po przejściu przez układ pokarmowy gatunku ptaków

Pomiar bariery dla międzygatunkowego przenoszenia chorób prionowych jest trudny i zazwyczaj wiąże się z wyzwaniami zwierzęcymi lub testami biochemicznymi. W tym miejscu przedstawiamy test konwersji białka prionowego in vitro z możliwością przewidywania barier gatunkowych.

Ocena barier gatunkowych pasażowalnej encefalopatii gąbczastej za pomocą testu konwersji białka prionowego in vitro

Przeprowadzanie testów wirusowych w laboratorium BSL-4 jest bardziej skomplikowane w porównaniu do pracy w laboratorium BSL-2 ze względu na wymagane dodatkowe środki ostrożności. W tym miejscu przedstawiamy przegląd praktyk i procedur stosowanych w laboratorium BSL-4, ilustrujących prawidłowe użytkowanie szafy bezpieczeństwa biologicznego klasy II, gospodarowanie odpadami/usuwanie ich oraz usuwanie próbek.

Środki ostrożności i procedury operacyjne w laboratorium (a)BSL-4: 2. Praktyki ogólne

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

Tutaj prezentujemy protokół opisujący prostą, szybką i efektywną technikę wzmacniania prionów, metodę konwersji indukowanej wstrząsami w czasie rzeczywistym (RT-QuIC).

Test konwersji wywołany wstrząsem w czasie rzeczywistym do wykrywania prionów CWD w materiale kałowym

Bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT) stanowi uznaną przez Światową Organizację Zdrowia Zwierząt i Światową Organizację Zdrowia (OIE/WHO) alternatywę dla testu na przeciwciała fluorescencyjne (DFA) do diagnozowania wścieklizny. Test ten pozwala na zastosowania w terenie, które można wykonać w ciągu około 1 godziny po pobraniu wycisków mózgu za pomocą mikroskopii świetlnej.

Wzmocniony nadzór nad wścieklizną za pomocą bezpośredniego szybkiego testu immunohistochemicznego

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Immunoznakowanie nieprawidłowego białka prionowego za pomocą protokołów immunohistochemicznych wymaga specyficznych metod przygotowania próbki i przeciwciał anty-PrP. Niniejszy protokół opisuje kluczowe etapy demaskowania epitopów w celu zapewnienia prawidłowego znakowania immunologicznego PrP i zminimalizowania niespecyficznego barwienia tła. Podejście to uwzględnia również środki bezpieczeństwa biologicznego podczas prowadzenia badań immunohistochemicznych na tkankach zakażonych prionami.

Wykrywanie nieprawidłowego białka prionowego za pomocą immunohistochemii

Poznaj metodę wymazową z RT-QuIC do wykrywania pryonów na powierzchniach laboratoryjnych. Technika ta pozwala skutecznie ocenić zanieczyszczenie i skuteczność dezynfekcji w środowisku badawczym.

Test laboratoryjny bezpieczeństwa prionowego

Przeglądaj więcej filmów