Test laboratoryjny bezpieczeństwa prionowego

Nasza multidyscyplinarna grupa stara się zrozumieć, w jaki sposób zakaźne białko, prion, może wykonywać złożone zadania biologiczne. Interesuje nas również, w jaki sposób priony mogą przetrwać w środowisku przez lata lub dziesięciolecia. Po przeprowadzeniu procedur odkażania prionami nie była dostępna solidna metoda określania skuteczności inaktywacji prionów.

Staramy się rozwiązać ten problem za pomocą naszych badań. Metoda wymazu, w połączeniu z RT-QuIC, pozwala na pobieranie próbek z szerokiego zakresu powierzchni w celu wykrycia aktywności wysiewu prionów. Może to być wykorzystane do wykrywania prionów związanych z powierzchnią w warunkach laboratoryjnych, klinicznych lub środowiskowych.

Interesuje mnie zrozumienie, w jaki sposób priony oddziałują z powierzchniami i jakie są wymagania prionów związanych z powierzchnią do wywołania infekcji. Na początek zidentyfikuj i oznacz odpowiednie obszary nadzoru do pobierania wymazów. Przygotuj dwie mikroprobówki wirówkowe o pojemności 1,5 mililitra dla każdego zidentyfikowanego obszaru i dodaj 250 mikrolitrów DPBS do pierwszej probówki, pozostawiając drugą pustą.

Wyjmij waciki z piankową końcówką z magazynu w miejscu wolnym od zanieczyszczenia prionowego. Przygotować kontrole dodatnie i ujemne przy użyciu odpowiednich homogenatów mózgu lub BH w DPBS. Używając czystych rękawiczek, wyjmij wymaganą liczbę wacików piankowych z opakowania i umieść je uchwytem do dołu w stojaku na probówki.

Upewnij się, że końcówki nie stykają się z innymi powierzchniami. Trzymając za uchwyt czysty wacik piankowy, nałóż 50 mikrolitrów odpowiednich dodatnich i ujemnych próbek kontrolnych na końcówki wacika. Za pomocą nożyczek odetnij nadmiar uchwytu wacika do około połowy jego długości i umieść wacik w wstępnie załadowanej probówce z mikrowirówką, aby zanurzyć piankową końcówkę w DPBS.

Trzymając czysty wacik z pianką za uchwyt, wstępnie zwilż piankową końcówkę wodą molekularną i strząśnij nadmiar wody. Umieść zwilżoną piankową końcówkę na obszarze wybranym do nadzoru i przetrzyj obszar w przód iw tył około 10 razy, jednocześnie obracając końcówkę wacika po powierzchni. Za pomocą nożyczek odetnij nadmiar uchwytu wacika do około połowy jego długości i umieść wacik w wstępnie załadowanej probówce mikrowirówki, aby zanurzyć piankową końcówkę w DPBS, upewniając się, że pokrywka może się całkowicie zamknąć.

Wyrzuć rękawice i zastąp je nowymi przed przejściem do następnego miejsca pobierania wymazów, aby zminimalizować zanieczyszczenie krzyżowe. W celu ekstrakcji wymazu umieść probówkę mikrowirówki w okrągłym stojaku na probówki i zanurz stojak w łaźni wodnej sonicater z tubą kubkową. Upewnij się, że wacik piankowy w DPBS w rurce znajduje się poniżej powierzchni wody, pozostawiając części uchwytu niezanurzone.

Sonikuj próbkę łącznie przez 15 sekund z pięcioma sekundami włączenia i pięcioma sekundami wyłączenia. Po sonikacji należy odwirować probówkę przez około 15 sekund, aby zebrać DPBS na dnie probówki przed przeniesieniem. Używając pipety P 1000 ustawionej na 250 mikrolitrów, ostrożnie zbierz cały płynny ekstrakt wacika z dna do odpowiedniej, wstępnie oznakowanej pustej probówki.

Wyrzuć zużytą probówkę zawierającą wacik. Zagęścić próbkę w koncentratorze próżniowym, upewniając się, że nakrętka probówki jest otwarta, po zakończeniu cyklu upewnić się, że próbka jest całkowicie zagęszczona, a pozostała tylko osadka. Przechowuj granulat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia.

Do analizy RT-QuIC należy przygotować ujemną i dodatnią płytkę kontrolną z odpowiednimi homogenatami mózgu rozcieńczonymi w roztworze rozcieńczania tkanek. Teraz rozmrozić przechowywany granulat ekstraktu z wacika z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i ponownie zawiesić wysuszony ekstrakt z wacika z 50 mikrolitrami wody molekularnej przez pipetowanie. Krótko odwirować i pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej.

Załaduj dwa mikrolitry ujemnych i dodatnich kontrolnych płytek, a następnie ekstrakty wacikowe do odpowiednich dołków płytkowych RT-QuIC. Wymazy z kontroli ujemnej nie przekroczyły progu dodatniej fluorescencji, co potwierdza brak zanieczyszczenia podczas zabiegów. Ekstrakty wymazów z kontroli dodatniej wykazywały spójne wysiewanie we wszystkich dołkach replikowanych, wykazując właściwą czułość wykrywania.

Próbki wymazów powierzchniowych z obszarów nieskażonych nie wykazały wysiewu powyżej progu, co potwierdza ujemność prionów. Powierzchnie zanieczyszczone prionami wykazywały wysiew powyżej progu z różnymi maksymalnymi stosunkami punktowymi i czasami fluorescencji w porównaniu z kontrolami. Powierzchnie zanieczyszczone wybielaczem i prionami nie były w stanie wysiewać RT-QuIC, co świadczy o skutecznej dezynfekcji.

Niektóre artefakty powierzchniowe wykazywały zmienione krzywe kinetyczne i dłuższe czasy fluorescencji, co wskazuje na potencjalne fałszywe alarmy, prawdopodobnie z powodu obecności kurzu lub pozostałości chemikaliów na powierzchni.