Name: Podawanie lotnych środków znieczulających larwom danio pręgowanego w celu obserwacji behawioralnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Poznaj metodę podawania lotnych środków znieczulających larwom Danio rerio w zamkniętej komorze do badań behawioralnych. Protokół umożliwia badanie farmakologii znieczulenia przy niskich kosztach sprzętowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana przez Fundację Edukacji i Badań Anestezjologicznych (FAER). Rysunek 1 jest tworzony w BioRender.com.

Wszystkie eksperymenty z danio pręgowanym przeprowadzono zgodnie z protokołami wykorzystania zwierząt zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC). Dorosłe rybo pręgowane były utrzymywane w ośrodku wodnym Uniwersytetu Pensylwanii pod nadzorem Uniwersyteckich Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych (ULAR). Danio pręgowany długopłetwy w Tybindze był hodowany we własnym zakresie na potrzeby wszystkich eksperymentów i utrzymywany w standardowych warunkach hodowlanych z 13/11-godzinnym cyklem światła/ciemności aż do osiągnięcia 5 dni po zapłodnieniu (dpf). Eksperymenty prowadzono z wykorzystaniem replik biologicznych, z lęgami pochodzącymi z odrębnych par godowych, aby zapewnić odpowiednią różnorodność biologiczną. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Produkcja samoprzylepnych arkuszy silikonowych
UWAGA: Odpowiedniki tego materiału (arkusz silikonowy plus klej) mogą być pozyskiwane komercyjnie, ale często przy większych kosztach i mniejszej dostępności.
<ol>
	<li>Rozłóż arkusz silikonu o grubości 0,5 mm na czystej, płaskiej powierzchni.</li>
	<li>Sprawdź arkusze pod kątem zagnieceń i unikaj ich, jeśli to możliwe. UWAGA: Arkusze silikonowe z zagięciami mogą nie przylegać odpowiednio do taśmy i mogą skutkować nieodpowiednim uszczelnieniem studzienek i/lub słabą wizualizacją danio pręgowanego.</li>
	<li>Wyczyść prześcieradła 70% alkoholem, aby usunąć olej lub zanieczyszczenia i pozostaw do wyschnięcia.</li>
	<li>Za pomocą aplikatora, takiego jak pędzel, nałóż cienką, równą warstwę podkładu adhezyjnego na arkusz silikonu. Aby uniknąć nadmiernej aplikacji, pracuj w mniejszych sekcjach, ponieważ promotor kleju szybko schnie (zastyga w ciągu 1-5 sekund). UWAGA: Bez tego promotora przyczepności taśma nie będzie odpowiednio przylegać do arkusza silikonu.</li>
	<li>Po nałożeniu promotora kleju wyrównaj podwójnie powlekaną taśmę z arkuszem silikonowym z papierowym spodem skierowanym do góry.</li>
	<li>Stopniowo nakładaj taśmę na silikon za pomocą wałka, aby wygładzić powierzchnię i usunąć pęcherzyki powietrza (po wstępnym nałożeniu, praca silikonową stroną do góry pomoże w wizualizacji i usunięciu pęcherzyków powietrza).</li>
	<li>Pozostawić promotor kleju do całkowitego utwardzenia przez 24 godziny na płaskiej powierzchni.</li>
	<li>Pokrój silikon samoprzylepny na paski o szerokości co najmniej 10 mm (średnica dołka 7,5 mm plus zakładka z każdej strony). UWAGA: W przypadku stosowania co drugiego rzędu płytki studziennej, szersza rozbieżność pasków nie wpłynie negatywnie na studzienki w sąsiednich rzędach, co może nie tylko ułatwić aplikację, ale także być konieczne do uzyskania uszczelnienia na całym obwodzie studni.<ol>
		<li>Upewnij się, że paski są wystarczająco długie, aby pokryć co najmniej szerokość jednego rzędu płytki studzienki. UWAGA: W przypadku korzystania z płytki dołkowej, która nie jest 96-dołkowa, takiej jak płytka 24-dołkowa lub 48-dołkowa, rozmiary pasków można dostosować lub przyciąć tak, aby pasowały do określonych wymiarów płytki, zapewniając odpowiednie pokrycie niezależnie od rozmiaru płytki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów
UWAGA: Wszystkie roztwory podstawowe i testowe lotnych środków znieczulających zostały przygotowane tuż przed eksperymentem, aby uniknąć utraty stężenia lotnych związków.
<ol>
	<li>Dla każdego roztworu (roztworu podstawowego lub roboczego) dodać objętość nielotnego rozpuszczalnika (E3 woda z zarodków, DMSO itp.) do fiolki HPLC lub scyntylacyjnej, która w połączeniu z końcowym rozcieńczeniem lotnego środka znieczulającego, całkowita objętość wystarczająco wypełni fiolkę, pozostawiając minimalną przestrzeń nad fiolką (patrz rysunek 1A).</li>
	<li>Dodaj lotny środek znieczulający za pomocą gazoszczelnej strzykawki Hamiltona i szybko zamknij fiolkę. UWAGA: Roztwory podstawowe w fiolkach z pokrywkami z przegrodą mogą być używane w celu ułatwienia dalszego rozcieńczania poprzez przenoszenie roztworu za pomocą gazoszczelnych strzykawek.</li>
	<li>Następnie wymieszaj fiolki (wir, sonikacja) w razie potrzeby i tymczasowo przechowuj je podczas przygotowywania talerzy danio pręgowanego.</li>
</ol>
3. Przygotowanie eksperymentu behawioralnego
UWAGA: Ten krok protokołu może wymagać pewnej praktyki. Zaleca się pracę bez ryb lub roztworów zawierających cenny materiał, dopóki nie poczujesz się komfortowo z techniką.
<ol>
	<li>Przenieść jedną larwę danio pręgowanego (5 dpf) do co drugiego rzędu szklanej płytki 96-dołkowej. UWAGA: Pozostawienie co drugiego rzędu pustego pozwala na zmniejszenie ryzyka zanieczyszczenia sąsiednich studni w wyniku rozlania, ponieważ studzienki są uszczelniane w kroku 3.4.</li>
	<li>Ostrożnie usuń roztwór E3 z każdej studzienki. Można to zrobić pojedynczo rząd na raz lub na całej płycie, jeśli jest w stanie szybko pracować. UWAGA: Czas, przez jaki larwy znajdowały się poza roztworem, został zminimalizowany, aby zmniejszyć potencjalny stres. Alternatywne procedury mogą być stosowane w oparciu o różne potrzeby eksperymentalne, w tym tylko częściowe usunięcie roztworu przed dodaniem roztworu zawierającego lek w celu zminimalizowania stresu. Protokół powinien być dostosowany do potrzeb doświadczenia, w tym czasu równowagi danego zwierzętom w celu skompensowania potencjalnego stresu, skuteczności mieszania roztworu i dokładności stężeń roztworu zawierającego lek, jeżeli nie całość E3 zostanie usunięta przed dodaniem roztworu roboczego.</li>
	<li>Następnie użyj pipety transferowej, aby napełnić każdą studzienkę w rzędzie roztworem eksperymentalnym. Uważaj, aby nie wprowadzać bąbelków. Przepełnij każdą studzienkę (Rysunek 1B).</li>
	<li>Za pomocą samoprzylepnych pasków silikonowych wykonanych w kroku 1 szybko dociśnij pasek w dół (Rysunek 1C). Pomaga to zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków i zapobiega przelewaniu się ryb do sąsiednich studni.</li>
	<li>Mocno dociśnij górną część płytki, aby upewnić się, że każda studzienka jest uszczelniona.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 2-5, aż roztwór zostanie wymieniony, a studzienki co drugi rząd płytki studzienki zostaną uszczelnione (rysunek 1D).</li>
	<li>Delikatnie odwróć płytkę i sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza. UWAGA: Obecność pęcherzyków powietrza zaciemni wizualizację ruchu danio pręgowanego.</li>
	<li>Umieść płytkę w jednostce obserwacji zachowania (klejem silikonowym do dołu) i przeprowadź eksperyment behawioralny (szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji Wyniki).</li>
</ol>

<ol><li>Wasilczuk, A. Z., Maier, K. L., Kelz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+as+a+model+organism+for+assessing+anesthetic+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The mouse as a model organism for assessing anesthetic sensitivity.</a> Methods Enzymol. 602, 211-228 (2018).</li>
<li>Shortal, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+brain+target-controlled+infusion+of+propofol+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and validation of brain target-controlled infusion of propofol in mice.</a> PLoS One. 13, 1-14 (2018).</li>
<li>Halbach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yolk+sac+of+zebrafish+embryos+as+backpack+for+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Yolk sac of zebrafish embryos as backpack for chemicals.</a> Environ Sci Technol. 54 (16), 10159-10169 (2020).</li>
<li>Bedell, V. M., Meng, Q. C., Pack, M. A., Eckenhoff, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vertebrate+model+to+reveal+neural+substrates+underlying+the+transitions+between+conscious+and+unconscious+states%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A vertebrate model to reveal neural substrates underlying the transitions between conscious and unconscious states.</a> Sci Rep. 10, 1-10 (2020).</li>
<li>Stetter, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+anesthesia+in+amphibians%3A+Comparison+of+five+application+methods%5BTitle%5D)+AND+%22In+American+Association+of+Zoo+Veterinarians%22%5BJournal%5D)">Isoflurane anesthesia in amphibians: Comparison of five application methods.</a> In American Association of Zoo Veterinarians. , Puerto Vallarta, Mexico. 255-257 (1996).</li>
<li>Woll, K. A., Eckenhoff, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+to+identify+anesthetic+ligands+using+Xenopus+laevis+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening to identify anesthetic ligands using Xenopus laevis tadpoles.</a> Methods Enzymol. 602, 177-187 (2018).</li>
<li>Meyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+Theorie+der+Alkoholnarkose%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Exp+Pathol+Pharmakol%22%5BJournal%5D)">Zur Theorie der Alkoholnarkose.</a> Arch Exp Pathol Pharmakol. 46, 338-346 (1901).</li>
<li>Downes, H., Courogen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+effects+of+anesthetics+in+tadpole+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Contrasting effects of anesthetics in tadpole bioassays.</a> J Pharmacol Exp Ther. 278, 284-296 (1996).</li>
<li>Kalueff, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+comprehensive+catalog+of+zebrafish+behavior+1.0+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond.</a> Zebrafish. 10, 70-86 (2013).</li>
<li>Abramova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pregnanolone+glutamate+and+its+metabolites+on+GABAA+and+NMDA+receptors+and+zebrafish+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of pregnanolone glutamate and its metabolites on GABAA and NMDA receptors and zebrafish behavior.</a> ACS Chem Neurosci. 14, 1870-1883 (2023).</li>
<li>Germann, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+behavioral+effects+of+GABAergic+low-and+high-efficacy+neuroactive+steroids+in+the+zebrafish+larvae+assay%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparison of behavioral effects of GABAergic low-and high-efficacy neuroactive steroids in the zebrafish larvae assay.</a> ACS Chem Neurosci. 15, 909-915 (2024).</li>
<li>Hoyt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomotor+responses+in+zebrafish+and+electrophysiology+reveal+varying+interactions+of+anesthetics+targeting+distinct+sites+on+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Photomotor responses in zebrafish and electrophysiology reveal varying interactions of anesthetics targeting distinct sites on gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> Anesthesiology. 137, 568(2022).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+locomotor+activities+of+zebrafish+larvae+under+the+influence+of+various+neuroactive+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Trans+Med%22%5BJournal%5D)">Characterization of the locomotor activities of zebrafish larvae under the influence of various neuroactive drugs.</a> Annals Trans Med. 6, 173(2018).</li>
<li>McCarroll, M. N., Gendelev, L., Kinser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+behavioural+profiling+identifies+GABA+and+serotonin+receptor+ligands+related+to+sedation+and+paradoxical+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Zebrafish behavioural profiling identifies GABA and serotonin receptor ligands related to sedation and paradoxical excitation.</a> Nat Commun. 10, 4078(2019).</li>
<li>Plasencia, D. M., Rodgers, L. H., Knighton, A. R., Eckenhoff, R. G., White, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+propofol+anesthesia+by+alkyl-fluorobenzene+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Antagonism of propofol anesthesia by alkyl-fluorobenzene derivatives.</a> Sci Rep. 14, 15943(2024).</li>
<li>Dash, S. N., Lipika, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flight+for+fish+in+drug+discovery%3A+A+review+of+zebrafish-based+screening+of+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Lett%22%5BJournal%5D)">Flight for fish in drug discovery: A review of zebrafish-based screening of molecules.</a> Biology Lett. 19, 20220541(2023).</li>
<li>Nelson, J. C., Michael, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+behavior+as+a+gateway+to+nervous+system+assembly+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish behavior as a gateway to nervous system assembly and plasticity.</a> Development. 149, 177998(2022).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sevoflurane+postconditioning+ameliorates+cerebral+hypoxia%2Freoxygenation+injury+in+zebrafish+involving+the+Akt%2FGSK-3%CE%B2+pathway+activation+and+the+microtubule-associated+protein+2+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Sevoflurane postconditioning ameliorates cerebral hypoxia/reoxygenation injury in zebrafish involving the Akt/GSK-3β pathway activation and the microtubule-associated protein 2 promotion.</a> Biomed Pharmacother. 175, 116693(2024).</li>
<li>Abdallah, S. J., Thomas, B. S., Jonz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+surface+respiration+and+swimming+behaviour+in+adult+and+developing+zebrafish+exposed+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia.</a> J Exp Biol. 218, 1777-1786 (2015).</li>
<li>Targ, A. G., Yasuda, N., Eger, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubility+of+I-653%2C+sevoflurane%2C+isoflurane%2C+and+halothane+in+plastics+and+rubber+composing+a+conventional+anesthetic+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Solubility of I-653, sevoflurane, isoflurane, and halothane in plastics and rubber composing a conventional anesthetic circuit.</a> Anesth Analg. 69, 218-225 (1989).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-selective+Anesthetic+insensitivity+of+zebrafish+lacking+%CE%B3-aminobutyric+acid+Type+A+receptor+%CE%B23+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Drug-selective Anesthetic insensitivity of zebrafish lacking γ-aminobutyric acid Type A receptor β3 subunits.</a> Anesthesiology. 131, 1276-1291 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

W artykule opisano metodę łatwego podawania lotnych środków znieczulających, takich jak sewofluran, larwom danio pręgowanego, która została wykorzystana do ilościowego określenia siły działania lotnego środka znieczulającego u ryb typu dzikiego. Chociaż technika ta jest koncepcyjnie prosta, może wymagać praktyki, aby zapewnić odpowiednio uszczelniony, wolny od pęcherzyków rząd studni w krótkim czasie, aby zminimalizować utratę czynników lotnych. Ponieważ metoda ta jest przeznaczona do związków lotnych, wymaga nie tylko s...

Modele zwierząt niewodnych (robaki, muchy, gryzonie, króliki, naczelne itp.) były historycznie modelami najczęściej używanymi do badania farmakologii anestezjologicznej. U każdego z tych gatunków lotne środki znieczulające (podawane przez wdychanie gazu) są znacznie mniej trudne niż podawanie dożylnych środków znieczulających (podawanych drogą dożylną lub dootrzewnową)1. Oprócz wyzwania technicznego, jakim jest proste podawanie leków dożylnie, osiągnięcie stałego stanu znieczulenia jest znacznie łatwiejsze w przypadku środków lotnych niż środków dożylnych2.
Dożylne podawanie środków znieczulających larwom organizmów wodnych może być osiągnięte poprzez dyfuzję z otaczającego je środowiska wodnego 3,4, a zatem jest bardziej zbliżone do podawania lotnych środków znieczulających dla gatunków niewodnych. Przez wiele lat kijanki (Xenopus laevis) były modelem z wyboru do badań nad środkami znieczulającymi ze względu na łatwość podawania leków i farmakokinetykę w stanie ustalonym osiągniętą przez proste dodanie środka znieczulającego do sztucznej wody w stawie w kąpieli 5,6. Istnieje jednak stosunkowo niewiele przykładów badania lotnych środków znieczulających w tym modelu ze względu na wymóg stosowania gazoszczelnych aparatów, które często są specjalnie skonstruowane i mogą być kłopotliwe w użyciu 7,8.
W ostatnich latach danio pręgowany stał się preferowanym modelem do badania dożylnych środków znieczulających ze względu na tę samą łatwość podawania leków, a także inne zalety, takie jak dobrze opisane złożone zachowania i dostępność komercyjnych jednostek do obserwacji tych zachowań9. W wielu ostatnich badaniach wykorzystano takie komercyjnie dostępne jednostki obserwacyjne do badań przesiewowych pod kątem związków neuroaktywnych, w tym środków znieczulających, przy użyciu 96-dołkowych i 24-dołkowych formatów płytek do ilościowego określenia zachowania larw danio pręgowanego 4,10,11,12,13,14,15 . Stadia larwalne szczególnie dobrze nadają się do badań farmakologicznych ze względu na ich zdolność do oceny wielu reakcji behawioralnych, ich mały rozmiar, wysoką kompatybilność przepustową i dobrze scharakteryzowane obwody neuronalne 9,16,17. Jednak jednym z istotnych ograniczeń w tych badaniach środków znieczulających w modelu danio pręgowanego jest względna trudność w podawaniu lotnych środków znieczulających. To ograniczenie doprowadziło do powstania nielicznych przykładów porównań między środkami lotnymi i dożylnymi 4,15,18. Możliwość łatwego badania i porównywania obu klas środków znieczulających w jednym modelu zwierzęcym stanowi ważne narzędzie ułatwiające badanie farmakologii anestezjologicznej we wszystkich klasach.
Tradycyjnie, badanie dożylnych środków znieczulających u gatunków wodnych wymagało specjalistycznego, często niestandardowego sprzętu, który może być trudny w użyciu lub może nie być wystarczająco gazoszczelny, aby zapobiec utracie środka znieczulającego na czas trwania eksperymentu. Opisana tutaj procedura przedstawia łatwo dostępny alternatywny sposób wytwarzania gazoszczelnego uszczelnienia w szklanej komorze, która jest odpowiednia do obserwacji zachowania larw danio pręgowanego za pomocą komercyjnego urządzenia obserwacyjnego (patrz Tabela materiałów).

<table><tbody><tr><td>Mikropłytki szklane 96-dołkowe</td><td>Zinsser Ameryka Północna</td><td>3600500</td><td>"Te szklane mikropłytki są wykonane ze specjalnego, odpornego na temperaturę szkła borokrzemianowego o wysokiej czystości, a powierzchnie są polerowane kwasem. Płytki są prostokątne w standardowym śladzie mikropłytki SBS (85 x 127 mm). Te szklane płytki reaktorowe są przeznaczone głównie do zastosowań chemicznych i są odporne na temperatury do 530 stopni Celsjusza. C. Mogą być sterylizowane w autoklawie. Są one obrabiane z jednorodnej tafli szkła i charakteryzują się jednolitą geometrią i kształtem, aby zapewnić stałą temperaturę od studni do studni (zwykle w granicach 0,2 stopnia C)".</td></tr><tr><td>2,0 ml przezroczyste, duży otwór, fiolki z gwintem 9 mm&nbsp;</td><td>Chemglass Nauki przyrodnicze</td><td>CV-1150-1232</td><td>"Dzięki otworowi większemu o 40% fiolki te są specjalnie zaprojektowane do pracy w automatycznych próbnikach z ramieniem robota. Zawierają one również unikalną konstrukcję Step Vial, która precyzyjnie centruje wkładkę o ograniczonej objętości w szyjce fiolki. "</td></tr><tr><td>Taśma podwójnie powlekana 3M 9490LE</td><td>AbbVie Inc</td><td>Zobacz materiał 24WG90 TGL</td><td>"Taśma podwójnie powlekana 3M 9490LE z klejem do laminowania 3M 300LSE zapewnia wysoką siłę wiązania do większości powierzchni, w tym wielu tworzyw sztucznych o niskiej energii powierzchniowej, takich jak polipropylen i farby malowane proszkowo. Klej akrylowy zapewnia również doskonałą przyczepność do powierzchni lekko zabrudzonych olejem, zwykle stosowanych w przypadku części maszyn. Taśma 3M z podwójną powłoką 9490LE oferuje dodatkową funkcję kleju do laminowania 3M 300MP z jednej strony, aby zapewnić doskonałą siłę wiązania z różnymi materiałami piankowymi i tkaninowymi (6 cali x 5 jardów)"</td></tr><tr><td>Komora obserwacyjna DanioVision</td><td>Noldus powiedział:</td><td>DVOC-0041 (wersja angielska)</td><td>"DanioVision to kompletny system, przeznaczony do wysokoprzepustowego badania larw danio pręgowanego na płytkach wielodołkowych. Obejmuje komorę obserwacyjną i renomowane oprogramowanie do śledzenia wideo EthoVision XT".</td></tr><tr><td>Regulator temperatury DanioVision</td><td>Noldus powiedział:</td><td>DVTCU-0011 (rejestrator DVTCU-0011)</td><td>"Jednostka kontroli temperatury DanioVision to system przepływowy: woda przepływa równomiernie pod płytą studzienki w wybranej przez Ciebie temperaturze. Temperatura jest taka sama na całej płycie studzienki".</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Ethovision XT16</td><td>Noldus powiedział:</td><td>BAZA NSE-EV</td><td>"EthoVision XT to najczęściej stosowane oprogramowanie do śledzenia wideo, które śledzi i analizuje zachowanie, ruch i aktywność dowolnego zwierzęcia, będące znakiem towarowym Noldus"</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Intensywna terapia Piramal</td><td>NDC # 66794-017-10</td><td>Płyn do inhalacji, niepalny, niewybuchowy środek znieczulający do inhalacji, zawierający 100 ml izofluranu. Przechowywany w kontrolowanej temperaturze pokojowej 20&ordm; do 25&ordm; C</td></tr><tr><td>Scotch-Weld Podkład klejowy błyskawiczny AC79 bezbarwny</td><td>3 mln</td><td>"62-3916-0860-1 (ID produktu) C2103N (partia)"</td><td>"3M Scotch-Weld Instant Adhesive Primer AC79 jest przeznaczony do stosowania na trudnych do sklejenia elastomerach o niskiej energii powierzchniowej, takich jak EPDM, silikon i inne gumy. Przygotowanie powierzchni i aplikacja są proste, a podkład adhezyjny szybko schnie, dzięki czemu prace przebiegają szybko".</td></tr><tr><td>Arkusze silikonowe o grubości 0,5 mm</td><td>Różni dostawcy</td><td>N/A</td><td>Półprzezroczyste arkusze silikonowe zostały zakupione od wielu dostawców</td></tr><tr><td>Brayer z twardej gumy Speedball Pop-in z plastikową ramą, 4 cale"</td><td>Speedball</td><td>793728</td><td>"Speedball Pop-In Hard Brayer ma wałek, który wysuwa się, co ułatwia czyszczenie. Plastikowa, jednoczęściowa rama z odpinanym wałkiem o szerokości 4 cali. Wykonane z czystej naturalnej gumy gumowej o szlifowanym wykończeniu. Brayer z twardej gumy ma 4 cale szerokości z solidną plastikową ramą i doskonale nadaje się do nakładania kleju"</td></tr><tr><td>SureSTART 9 mm Nakrętki do zastosowań o wysokiej przepustowości, poziom 2, Typ: AVCS Nakrętka PP, Biała Silikon/CZERWONY PTFE Septa 1,0 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>6ASC9ST1B</td><td>"Używaj zakrętek Thermo Scientific SureSTART 9 mm z zakręcanymi fiolkami z otworem 9 mm. Nasadki poziomu wydajności 2 są produkowane i testowane w celu zapewnienia niskiego krwawienia, solidności i powtarzalności wyników rutynowych analiz GC-MS i LC-MS. Wybieraj spośród nasadek polipropylenowych z uniwersalnymi przegrodami silikonowo-PTFE o różnych wartościach twardości, zaprojektowanych w celu zmniejszenia problemów z igłą automatycznego podajnika próbników. Nasze nakrętki AVCS zawierają technologię zaawansowanego systemu zamykania fiolek, aby zapewnić optymalną kompresję uszczelnienia podczas zamykania fiolki".</td></tr><tr><td>Ultan Sewofluran</td><td>AbbVie Inc</td><td>NDC # 0074-4456-04</td><td>Lotny płyn do inhalacji jest pakowany w bursztynowe butelki zawierające 250 ml sewofluranu. Przechowywany w kontrolowanej temperaturze pokojowej 15&ordm; do 30&ordm; C</td></tr><tr><td>Fiolki scyntylacyjne Wheaton Liquid, nakrętki dołączone do fiolek, szkło, folia metalowa / miazga, 24-400, 20 mL&nbsp;</td><td>DWK Nauki Przyrodnicze</td><td>986561</td><td>Fiolki scyntylacyjne o pojemności 20 ml przekształcone z rurki ze szkła borokrzemianowego typu I, PET lub HDPE. Dostępny z dołączoną nasadką.</td></tr></tbody></table>

podawanie lotnych środków znieczulających larwom danio pręgowanego w celu obserwacji behawioralnej

Administration of Volatile Anesthetics to Zebrafish Larvae for Behavioral Observation

Badanie to opisuje unikalną metodę podawania lotnych środków znieczulających, takich jak izofluran i sewofluran, larwom danio pręgowanego podczas eksperymentów behawioralnych. Podczas gdy danio pręgowany oferuje wiele zalet jako organizm modelowy kręgowców - w tym złożone zachowania, podatność genetyczną, przezroczyste zarodki i szybki rozwój - ich zastosowanie w badaniu lotnych środków znieczulających było ograniczone. Podawanie lotnych środków znieczulających często wymaga skomplikowanych lub nieporęcznych aparatów, które mogą nie być powszechnie dostępne, co stwarza bariery dla badań farmakologicznych lotnych środków znieczulających w wodnych organizmach modelowych. Ta metoda przedstawia prostą technikę wykorzystującą samoprzylepne arkusze silikonu do stworzenia gazoszczelnego uszczelnienia na szklanych płytkach 96-dołkowych. Walidację przeprowadzono poprzez ocenę spontanicznego ruchu, który nie wykazał istotnych różnic między odwiertami uszczelnionymi i otwartymi w okresie 90 minut. Ponadto stężenie środka znieczulającego pozostawało stabilne w czasie, mierzone za pomocą HPLC. Reprezentatywne wyniki obejmują eksperymentalne oznaczenie średnich wartości skutecznego stężenia (EC50) sewofluranu. Badanie to zapewnia proste i przystępne podejście do eksperymentów farmakologicznych z wykorzystaniem lotnych środków znieczulających, które można łatwo dostosować do badania innych czynników lotnych i eksperymentalnych punktów końcowych.

Porównanie z tradycyjną obserwacją w studni otwartej Aby ocenić, czy uszczelnianie adhezyjne ma jakikolwiek wpływ na ruch spontaniczny, porównano kontrole w studniach otwartych i uszczelnionych. Jak widać na rysunku 2A, nie zaobserwowano statystycznie istotnej różnicy w ruchu między tymi grupami przez standardowy czas trwania ~30 minut stosowany w eksperymentach opisanych w tym artykule. Uznając, że inne paradygmaty eksperymentalne mogą wymagać dłuższej ekspozycji ekspery...

Protokół ten przedstawia dostępną metodę tworzenia gazoszczelnego środowiska do podawania lotnych środków znieczulających larwom danio pręgowanego w eksperymentach behawioralnych.

Podawanie lotnych środków znieczulających larwom danio pręgowanego w celu obserwacji behawioralnej

This study describes a unique method for administering volatile anesthetics, such as isoflurane and sevoflurane, to larval zebrafish during behavioral ...

Nasze badania koncentrują się na farmakologii anestezjologicznej, która obejmuje zainteresowanie mechanizmami znieczulającymi, a także mechanizmami działania niepożądanego znieczulenia. Wykorzystanie larw danio pręgowanego jako modelu behawioralnego do badania farmakologii anestezjologicznej szybko się rozwija i ma wiele zalet, w tym ich przydatność do stosowania w eksperymentach przesiewowych na dużą skalę. Porównanie lotnych i dożylnych środków znieczulających pozostaje wyzwaniem, ponieważ podawanie lotnych środków znieczulających zwierzętom niewodnym jest znacznie łatwiejsze niż znieczulenia dożylnego.Przeciwnie, znieczulenie dożylne jest łatwiejsze do podania zwierzętom wodnym niż lotne środki znieczulające. Protokół ten zapewnia stosunkowo niedrogi i dostępny sposób podawania lotnych środków znieczulających w zamkniętej komorze w celu przeprowadzenia eksperymentów behawioralnych na larwach danio pręgowanego. Inne protokoły tego rodzaju często wymagają jakiejś formy dostosowanej aparatury, która może być kosztowna lub nie jest łatwo dostępna dla tych, którzy nie mają środków na stworzenie lub nabycie tego typu sprzętu.Na początek ułóż 0,5-milimetrowy arkusz silikonu na czystej, płaskiej powierzchni. Sprawdź arkusze pod kątem zagnieceń i unikaj ich, jeśli to możliwe. Wyczyść pościel 70% alkoholem, aby usunąć olej lub zanieczyszczenia.Gdy arkusz całkowicie wyschnie, użyj aplikatora, takiego jak pędzel, aby nałożyć cienką, równą warstwę podkładu adhezyjnego na arkusz silikonowy. Po nałożeniu podkładu samoprzylepnego wyrównaj podwójnie powlekaną taśmę z arkuszem silikonowym z papierowym spodem skierowanym do góry. Stopniowo nakładaj taśmę na silikon za pomocą wałka, aby wygładzić powierzchnię i usunąć pęcherzyki powietrza.W razie potrzeby ponownie nałóż podkład małymi sekcjami i kontynuuj nakładanie taśmy, gdy podkład wyschnie w ciągu jednej do pięciu sekund. Odwróć arkusz silikonowy, aby działał silikonową stroną do góry, aby pomóc w wizualizacji i usuwaniu pęcherzyków powietrza. Następnie pokrój silikon samoprzylepny na paski o szerokości co najmniej 10 milimetrów.Upewnij się, że paski są wystarczająco długie, aby pokryć co najmniej szerokość jednego rzędu płytki studzienki. Aby przygotować lotne środki znieczulające, należy dodać objętość nielotnego rozpuszczalnika do fiolki HPLC lub scyntylacyjnej, zapewniając minimalną przestrzeń nad roztworem po dodaniu ostatecznego rozcieńczenia lotnego środka znieczulającego. Użyj gazoszczelnej strzykawki Hamiltona, aby dodać lotny środek znieczulający i szybko zamknij fiolkę.Wymieszać fiolki przez wirowanie lub sonikację w zależności od potrzeb. Tymczasowo przechowuj je podczas przygotowywania talerzy danio pręgowanego. Aby przygotować eksperyment behawioralny, przenieś jedną larwę danio pręgowanego po pięciu dniach od zapłodnienia do co drugiego rzędu szklanej płytki 96-dołkowej.Ostrożnie usuń roztwór E-3 z każdej studzienki. Użyj pipety transferowej, aby napełnić każdą studzienkę w rzędzie roztworem eksperymentalnym. Za pomocą samoprzylepnych pasków silikonowych szybko dociśnij pasek w dół, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków i przelaniu się ryb do sąsiednich studzienek.Następnie mocno dociśnij górną część płytki, aby upewnić się, że każda studzienka jest uszczelniona. Powtarzaj proces uszczelniania, aż roztwór zostanie wymieniony i wszystkie studzienki w co drugim rzędzie płytki zostaną uszczelnione. Delikatnie odwróć płytkę i sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza.Umieść płytkę w jednostce obserwacyjnej zachowania stroną z klejem silikonowym do dołu i przeprowadź eksperyment behawioralny. W szczelnie zamkniętych studzienkach stężenie sewofluranu wykazywało minimalny spadek w ciągu trzech godzin, a izofluran wykazywał 4% spadek stężenia. Żaden ze środków znieczulających nie wykazał znaczącej utraty w ciągu pierwszych 30 do 60 minut.Mediana skutecznego stężenia sewofluranu wynosiła 62 mikromole dla ruchu spontanicznego i 126 mikromolów dla ruchu wywołanego, przy czym drabinka była znacznie niższa niż wcześniej zgłaszane 240 mikromolowców, co może być spowodowane poprawą w tworzeniu gazoszczelnego uszczelnienia tą metodą. Zaobserwowano znaczącą różnicę w spontanicznym ruchu między odwiertami otwartymi i zamkniętymi, które pojawiły się po dwóch godzinach, prawdopodobnie z powodu wyczerpania tlenu w studni, i stanowią ważne ograniczenie tej techniki.

administration-volatile-anesthetics-to-zebrafish-larvae-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Prezentujemy technikę wstrzykiwania dosytniewnego u dorosłych rybek danio-ostrobramkowych. Używamy mikrosyringi NanoFil o pojemności 10 μl, sterowanej za pomocą kontrolera Micro4 oraz pompy UltraMicroPump III. Demonstracja obejmuje wykorzystanie zimnej wody jako środka znieczulającego.

Wtryskiwanie doszpikowe u dorosłych danio prążkowanych

Źródło: Morsch, M.,  , Wywoływanie stresu i śmierci komórki za pomocą konwencjonalnej laserowej mikroskopii konfokalnej UV. J. Vis. Exp. (2017)...

Selektywna ablacja laserowa pojedynczego neuronu u larwy danio pręgowanego przy użyciu mikroskopu konfokalnego

Źródło: Schramm, P. et al. Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw danio pręgowanego i osobników młodocianych poprzez usunięcie czaszki i skóry. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo neuronów móżdżku u transgenicznych larw danio pręgowanego, które wyrażają białka fluorescencyjne w neuronach Purkinjego. Proces polega na znieczuleniu larw, unieruchomieniu ich w agarozie i ostrożnym usunięciu pigmentowanej skóry w celu zwiększenia penetracji...

Obrazowanie in vivo mózgu larw danio pręgowanego w celu wizualizacji neuronów móżdżku

Opisana jest prosta metoda rejestrowania potencjałów pola zewnątrzkomórkowego w przodomózgowiu larwy danio pręgowanego. Metoda ta zapewnia solidny odczyt in vivo aktywności podobnej do napadowej. Technika ta może być stosowana w przypadku genetycznie zmodyfikowanych larw danio pręgowanego będących nosicielami genów związanych z padaczką lub napadów wywołanych podawaniem leków przeciwdrgawkowych.

Zapis elektrofizjologiczny przodomózgowia u larw danio pręgowanego

Nasze laboratorium opracowało nowatorski system automatycznego obrazowania o wysokiej przepustowości, który jest przydatny do wykrywania kilku różnych zachowań u 7-dniowych larw danio pręgowanego. System może być używany do wykrywania subtelnych zmian w zachowaniu po wystawieniu larw na działanie toksyn środowiskowych lub farmaceutyków.

Zautomatyzowane, wysokoprzepustowe analizy behawioralne larw danio pręgowanego

Ukierunkowane manipulacje mające na celu wywołanie ukierunkowanego stresu lub śmierci w poszczególnych komórkach były stosunkowo trudne do osiągnięcia. W tym artykule opisano metodę ablacji w rozdzielczości pojedynczej komórki, polegającą na selektywnym stresowaniu i zabijaniu pojedynczych komórek w hodowli komórkowej i żywych zwierzętach, w oparciu o standardowy konfokalny laser UV.

Wyzwalanie stresu i śmierci komórek za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej z laserem UV

Tutaj prezentujemy niezawodną, minimalnie inwazyjną i opłacalną metodę rejestrowania i interpretacji elektrokardiogramów u żywych, znieczulonych dorosłych ryb pręgowanych.

Elektrokardiografia powierzchniowa in vivo u dorosłych danio pręgowanych

Ten artykuł opisuje metodę montowania delikatnych zarodków danio pręgowanego do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta tania metoda jest łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod dowolnym mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Laserowa ablacja jest szeroko stosowaną technologią do badania regeneracji w systemach biologicznych. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie standardowego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego do ablacji laserowej, a następnie obrazowania poklatkowego regenerujących się komórek międzynerwowych w linii bocznej danio pręgowanego.

Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę podawania lotnych środków znieczulających larwom Danio rerio w zamkniętej komorze do badań behawioralnych. Protokół umożliwia badanie farmakologii znieczulenia przy niskich kosztach sprzętowych.

Podawanie lotnych środków znieczulających larwom danio pręgowanego w celu obserwacji behawioralnej

Przeglądaj więcej filmów