Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

W przypadku pacjentów, u których zdiagnozowano guzy lite piersi lub trzustki, istnieje silna korelacja między zdarzeniami progresji choroby, takimi jak przerzuty lub oporność na leczenie, a słabymi wynikami. Wiadomo, że komórkowe mechanizmy molekularne, które regulują homeostazę i zwłóknienie tkanek, kontrolują również progresję guza litego. Moje laboratorium jest zainteresowane zrozumieniem tych mechanizmów, abyśmy mogli lepiej opracowywać terapie i środki diagnostyczne, które pomogą pacjentom.

Jednym z głównych wyzwań eksperymentalnych jest to, że istnieje krytyczne zapotrzebowanie na modele 3D raka, które mogą uchwycić interakcje międzykomórkowe podczas procesów fizjologicznych i patofizjologicznych, a następnie, dzięki zrozumieniu tych interakcji, można uzyskać dodatkowe informacje na temat chorób, aby następnie opracować nowe strategie leczenia. Nasz protokół zapewni opłacalną i powtarzalną metodę hodowli komórek 3D, która replikuje cechy mikrośrodowiska tkanek in vivo. Nasz protokół zapewni łatwe i szybkie metody hodowli komórek 3D bez rusztowań i oparte na rusztowaniach, w których możemy określić ilościowo heterogeniczne interakcje komórkowe.

Odkryliśmy sposób na efektywne formułowanie kultur sferoidalnych 3D, które mogą być używane z modelami bez rusztowań, ale mogą być również łączone z systemami opartymi na rusztowaniach w celu pomiaru inwazji i zachowania komórek. Aby rozpocząć, włącz światło ultrafioletowe, aby zdezynfekować wnętrze szafy bezpieczeństwa biologicznego przez 15 minut. Otwórz skrzydło okienne szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby ustabilizować przepływ powietrza i włącz system aspiracji próżniowej.

Oczyść wewnętrzną powierzchnię okapu i rurki systemu zasysania próżniowego 70% etanolem. Podgrzej pożywkę do hodowli komórkowych, PBS i 0,25% trypsyny EDTA do 37 stopni Celsjusza w kąpieli perełkowej. Teraz zbadaj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić 70 do 80% zbieżności.

Za pomocą aspiratora próżniowego odessać i wyrzucić pożywkę hodowlaną z posianych komórek. Umyj pozostałą pożywkę raz dwoma mililitrami PBS, a następnie odessać i wyrzucić PBS po umyciu. Następnie za pomocą mikropipety dodaj jeden mililitr trypsyny do naczynia do hodowli komórkowej i umieść płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut.

Teraz dodaj jeden mililitr inhibitora trypsyny sojowej w PBS do płytki, aby dezaktywować trypsynę. Aby rozproszyć klastry komórek, należy pipetować płynną mieszaninę za pomocą mikropipety P-1000. Zebrać zawiesinę komórek z dna płytki i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Odwirować probówkę o sile 100 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant za pomocą aspiratora próżniowego. Pozwól molekularnym sondom fluorescencyjnym ogrzać się do temperatury pokojowej przez 15 minut w kąpieli perełkowej zahartowanej do 37 stopni Celsjusza. Za pomocą mikropipety ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach odpowiednich roztworów barwników do śledzenia komórek roboczych

Inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Po 30 minutach inkubacji odwirować probówki o stężeniu 100 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie użyj aspiratora próżniowego, aby zassać i wyrzucić supernatant.

Dokładnie zawiesić osad w jednym mililitrze 10% DMEM zawierającego FBS za pomocą mikropipety. Teraz zbierz 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i przenieś ją do mikroprobówki zawierającej równą objętość błękitu trypanowego. Po wymieszaniu komórek dodać 20 mikrolitrów roztworu trypana komórkowego do szkiełka komory do liczenia komórek.

Włóż szkiełko do automatycznego licznika komórek, aby określić numer komórki. Oblicz średnią całkowitą liczbę komórek na żywo na podstawie dwóch odczytów. Przygotuj robocze zapasy komórek dla każdego typu ogniwa w stężeniu 6,67 razy 10 do mocy trzech komórek na mililitr, co odpowiada 2 000 ogniw na 300 mikrolitrów.

Za pomocą mikropipety przenieść do mikroprobówki objętość wymaganą dla trzech kontrprób technicznych oraz jednej dodatkowej. Po dokładnym wymieszaniu pipetą przenieść 300 mikrolitrów próbki do dołka z 96-dołkową mikropłytką o bardzo niskim nasadce w kształcie litery U. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Obraz wzrostu i morfologii sferoidów co 24 godziny, do 96 godzin, przy użyciu mikroskopu z kontrastem fazowym. Włącz urządzenia do obrazowania i automatycznego inkubatora. Utwórz nowy protokół obrazowania w menedżerze zadań oprogramowania do obrazowania, aby uchwycić 48-godzinny wzrost sferoidów BT-474 hodowanych wspólnie z fibroblastami BJ-5ta i komórkami śródbłonka EA.hy926 barwionymi barwnikami śledzenia komórek odpowiednio na niebiesko, pomarańczowo i ciemnoczerwono.

Napełnij wiadro na lód lodem, aby roztwór ekstraktu z błony podstawnej był zimny i umieść roztwór na lodzie. Za pomocą pipety wielokanałowej odessać około 170 mikrolitrów pożywki z naczynia hodowlanego. Zaopatrz się w lupę i mini kaseton świetlny, aby dokładnie obserwować małe sferoidy.

Umieść 96-dołkową płytkę sferoidalną nad kasetonem świetlnym i umieść szkło powiększające nad głową. Ustaw pipetę P-200 na 30 mikrolitrów i zbierz ekstrakt z błony podstawnej, aby utworzyć trzy mikrokropelki. Upewnij się, że 96-dołkowa płytka jest płaska i ustaw pipetę pionowo nad sferoidą.

Teraz wypuść kroplę, nie dotykając dna studzienki. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut. Po inkubacji nałożyć na sferoidy dodatkowe 50 mikrolitrów roztworu ekstraktu z błony podstawnej na dołek i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie za pomocą mikropipety dodaj 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki. Po 72 godzinach od posiewu komórki MCF-10A, MCF-10Ca1H i BT-474 hodowane jednocześnie z EA.hy926 i THP-1 lub z BJ5-ta i THP-1 wykazywały znaczny wzrost obszaru sferoidalnego w porównaniu ze sferoidami nabłonkowymi monokultury. Natomiast współhodowane komórki MDA-MB-468 wykazały znaczny spadek powierzchni sferoidalnej w porównaniu z monokulturą.

Zastosowanie barwnika śledzącego komórki do rakotwórczych komórek nabłonka BT-474 i komórek zrębu przed ustanowieniem sferoidów wykazało, że komórki zrębu, w tym EA.hy926 i BJ-5ta, utworzyły pączkujące struktury na obwodzie centralnych sferoid BT-474. Po 24 godzinach od posiewu błona podstawna została nałożona na rakotwórcze komórki nabłonkowe BT-474 hodowane wspólnie z komórkami zrębu, wykazując tworzenie się struktur inwazyjnych.