Badanie indukowanej przez nanocząstki miedzi programowanej śmierci komórek u bakterii

W tym badaniu zbadano skuteczność bakteriobójczą nanocząstki miedzi przeciwko trzem powszechnym bakteriom o znaczeniu klinicznym. Bada przypadki, w tym generowanie ROS i potencjalne zaangażowanie w zaprogramowaną śmierć komórki.

Jednym z obecnych wyzwań jest osiągnięcie spójnej liczby kolonii. Uważam, że wynika to z interwencji. Modernizacja komórek podczas rozcieńczania powoduje fałszywe liczenie z lokalizacją w porównaniu z bardziej doświadczonym liczeniem.

Nasza grupa była pierwszą, która użyła modulatora komórkowego do badania mechanizmów bakteriobójczych nanocząstek miedzi, ujawniając, że śmierć bakterii obejmuje procesy komórkowe, takie jak wytwarzanie ROS i autofagia.

Protokół odpowiada na potrzebę głębszego zrozumienia mechanizmu, za pomocą którego nanocząsteczki miedzi zabijają bakterie, koncentrując się w szczególności na niedostatecznie zbadanym obszarze bakteryjnych szlaków programowanej śmierci komórki.

Korzystając z różnych modulatorów komórkowych, potwierdziliśmy, że śmierć bakteryjna wywołana przez nanocząstki miedzi wiąże się z autofagią i przeciążeniem ROS oraz zidentyfikowaliśmy kluczowe szlaki wspierane przez wiarygodne eksperymenty oparte na trzech próbach z prostym projektem

[Narrator] Aby rozpocząć uzyskiwanie komercyjnych nanoproszków miedzi o średnicach 25 nanometrów i 60 do 80 nanometrach od komercyjnego dostawcy. Użyj jednego mililitra jednego milimolowego SDS jako dyspergatora dla każdej wielkości nanocząstek. Następnie rozproszyć nanocząstki za pomocą kąpieli ultradźwiękowej przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy pozyskać szczepy Escherichia coli, Acinetobacter baumannii i Staphylococcus aureus z odpowiednich centrów zasobów biologicznych. Hoduj każdą bakterię w 10 mililitrach bulionu LB w warunkach tlenowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć kultury bakteryjne w pożywce LB, aby osiągnąć gęstość optyczną około 0,5 przy 600 nanometrach. Teraz użyj podstawowych roztworów nanocząstek miedzi, aby przygotować zakres stężeń od zera do 100 mikrogramów na mililitr obu rozmiarów. Odpipetować 500 mikrolitrów kultur bakteryjnych do probówek do mikrowirówek i odwirować przy 3 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odpipetowaniu supernatantu dodaj do każdej probówki różne stężenia nanocząstek obu rozmiarów. Traktuj grupy kontrolne z 500 mikrolitrami PBS jako kontrolą negatywną i 500 mikrolitrami 70% alkoholu jako kontrolą pozytywną. Następnie inkubować wszystkie próbki, wytrząsając z prędkością 200 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji umyj bakterie PBS i rozprowadź je na płytkach agarowych LB. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia policz kolonie na każdej płytce dla wszystkich grup leczenia. Traktuj bakterie pięcioma mikromolowymi SBI przez dwie godziny, 0,5 mikromolowym nekrosulfonamidem przez jedną godzinę, 100 nanomolowymi wortmanninami przez 30 minut lub 100 nanomolowymi Z-VAD przez 30 minut. Po zakończeniu wszystkich procesów obróbki wstępnej należy odwirować wszystkie probówki o stężeniu 3 300 G przez 10 minut. Następnie ponownie zawiesić granulat w 800 mikrolitrach PBS, aby umyć modulator obróbki wstępnej. Rozprowadź zawieszone granulki. Odwirować każdą probówkę, a następnie wyrzucić supernatant. Zawiesić granulki w mieszaninach modulatorów nanocząstek przed inkubacją z mieszaniem. Teraz dodaj 70% etanolu i PBS jako kontrole pozytywne i negatywne. Uwzględnij ślepe grupy kontrolne leczone inhibitorami, ale bez nanocząstek. Po inkubacji odpipetować odczynnik do żywotności komórek w stosunku objętościowym od jednego do dziesięciu i inkubować. Po ponownym odwirowaniu kultur przenieść supernatanty na płytki 96-dołkowe. Zmierz fluorescencję przy wzbudzeniu 560 nanometrów i emisji 590 nanometrów za pomocą czytnika mikropłytek. Rozcieńczyć pozostałe supernatanty do 10 do potęgi ujemnej 5 i 10 do potęgi ujemnej czwórki i rozprowadzić na płytkach agarowych LB do hodowli. Policz pojedyncze kolonie następnego dnia. Pipetować kultury bakterii do probówek mikrowirówek. Następnie wystaw kultury na działanie światła ultrafioletowego o długości 405 nanometrów przez trzy godziny. Następnie inkubuj kultury w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie inkubuj bakterie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po leczeniu na zimno inkubuj bakterie w 3% nadtlenku wodoru przez 30 minut. Utrzymuj grupę kontrolną w temperaturze 37 stopni Celsjusza w bulionie LB. Teraz traktuj bakterie cząstkami o wielkości 20 lub 60 nanometrów w stężeniach od jednego do 100 mikrogramów na mililitr przez 24 godziny. Następnie dwukrotnie umyj leczone bakterie PBS. Po odwirowaniu ponownie zawieś granulki bakteryjne w pięciomikromolowym roztworze barwnika dioctanu dichlorodihydrofluoresceiny o średnicy 2',7'. Przeanalizuj intensywność fluorescencji przy emisji 520 lub 530 nanometrów. Liczba kolonii Escherichia coli została znacznie zmniejszona o 20 nanonanocząstek miedzi przy jednym mikrogramie na mililitr i o 60 nanonanocząstek miedzi przy pięciu mikrogramach na mililitr. Staphylococcus aureus wykazał znaczne zmniejszenie liczby kolonii we wszystkich stężeniach obu wielkości nanocząstek. W przypadku Acinetobacter baumannii zmniejszenie liczby kolonii wymagało pięciu mikrogramów na mililitr 20-nanometrowych nanocząstek miedzi i 10 mikrogramów na mililitr 60-nanometrowych nanocząstek miedzi. Leczenie nanocząstkami miedzi wywołało produkcję reaktywnych form tlenu u wszystkich bakterii, przy czym cząstki o wielkości 20 nanometrów wykazały najwyższe frakcje komórek dodatnich przy niższych stężeniach. Z kolei obróbka nanocząstkami miedzi w procesie technologicznym 60 nanometrów doprowadziła do spójnego generowania reaktywnych form tlenu we wszystkich stężeniach. Zaprogramowany modulator śmierci komórkowej Z-VAD zwiększył przeżywalność Escherichia coli potraktowanej cząstkami o obu rozmiarach w niskich lub umiarkowanych stężeniach. Leczenie NSA poprawiło przeżywalność Staphylococcus aureus we wszystkich 20-nanometrowych stężeniach nanocząstek miedzi. Acinetobacter baumannii wykazywał lepszą żywotność z Z-VAD przy 1, 5 i 10 mikrogramach na mililitr zarówno 20, jak i 60 nanometrowych cząstek miedzi, podczas gdy NSA zwiększyła żywotność przy zaledwie 10 mikrogramach na mililitr z 20-nanometrowej ekspozycji na nanocząstki miedzi.