Name: Badanie indukowanej przez nanocząstki miedzi programowanej śmierci komórek u bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Poznaj mechanizm działania nanocząstek miedzi przeciwko bakteriom poprzez generowanie reaktywnych form tlenu i indukcję programowanej śmierci komórek. Metoda obejmuje testowanie na szczepach E. coli, A. baumannii i S. aureus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony Core Facility Center, Tzu Chi University, Taiwan.

Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie nanocząstek miedzi
<ol>
	<li>Pozyskaj komercyjne nanoproszki miedzi (25 nm i 60-80 nm) ze źródła komercyjnego.</li>
	<li>Użyj 1,0 mM dodecylosiarczanu sodu (SDS) jako dyspergatora dla dwóch wielkości nanocząstek 1 mg/ml.</li>
	<li>Rozproszyć nanocząstki w kąpieli ultradźwiękowej przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. W pełni zdyspergowane nanocząstki są następnie gotowe do wykorzystania w kolejnych eksperymentach.</li>
</ol>
2. Przygotowanie bakterii
<ol>
	<li>Pozyskać szczep E. coli (Migula) Castellani i Chalmers 25922 oraz szczep A. baumannii Bouvet i Grimont z American Type Culture Collection. Zdobądź S. aureus z Centrum Zbierania i Badań nad Zasobami Biologicznymi.</li>
	<li>Wyhodować bakterie w bulionie Luria-Bertani (LB) w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć kultury bakteryjne w pożywce LB do gęstości optycznej około 0,5 przy długości fali 600 nm (OD600).</li>
</ol>
3. Ocena żywotności komórek
<ol>
	<li>Test kolonii
	<ol>
		<li>Użyj podstawowych roztworów CuNP (1 mg/ml) do przygotowania różnych stężeń dwóch rozmiarów CuNP, w tym 0 μg/ml, 1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml i 100 μg/ml.</li>
		<li>Podzielić kultury bakterii przygotowane w kroku 2.3 na probówki do mikrowirówek i odwirować przy 3300 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zachowaj granulki bakteryjne i dodaj różne stężenia odpowiednio dwóch rozmiarów CuNP, delikatnie pipetując.</li>
		<li>Traktuj granulki bakteryjne z PBS i 70% alkoholem jako odpowiednio kontrolę negatywną i pozytywną.</li>
		<li>Inkubować wszystkie poddane działaniu substancji bakterie, wytrząsając z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Po inkubacji umyj wszystkie leczone bakterie PBS i rozprowadź je na płytkach agarowych LB. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 24 godziny.</li>
		<li>Następnego dnia należy policzyć liczebność kolonii w każdej grupie poddanej działaniu substancji i przeprowadzić analizę statystyczną. Zaleca się przeprowadzenie tego w trzech egzemplarzach w celu uzyskania dokładności statystycznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie mechanizmu bakteriobójczego
	<ol>
		<li>Przygotować bakterie zgodnie z opisem w kroku 3.1.2 i potraktować je 5 μM SBI-0206965 (SBI) przez 2 godziny, 0,5 μM nekrosulfonamidu (NSA) przez 1 godzinę, 100 nM wortmanniny (Wort) przez 30 minut lub 100 nM Z-VAD-FMK (Z-VAD) przez 30 minut.</li>
		<li>Bakterie należy traktować jednocześnie różnymi stężeniami roztworów CuNP o dwóch rozmiarach, jak opisano w kroku 3.1.1, w obecności lub bez obecności 5 μM SBI, 0,5 μM NSA, 100 nM brzeczki i 100 nM Z-VAD.</li>
		<li>Odwirować bakterie po zabiegach z modulatorem (etap 3.2.1) i usunąć supernatanty.</li>
		<li>Zawiesić osady bakteryjne w roztworach przygotowanych w kroku 3.2.2 i inkubować je wytrząsając z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Potraktuj bakterie odpowiednio 70% etanolem i PBS jako kontrolą pozytywną i negatywną. Użyć roztworu bez CuNP jako ślepej próby kontrolnej CuNP (0 μg/ml; próba) w tych samych warunkach inhibitora dla każdej grupy. Inkubować wszystkie próbki przez dodatkowe 24 godziny.</li>
		<li>Po inkubacji dodać do kultur odczynnik żywotności komórek w stosunku objętościowym 1:10. Inkubować kultury przez kolejne 2 godziny, wytrząsając w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odwirować kultury (etap 3.1.2) po 2 godzinach inkubacji. Przenieść fluorescencyjne supernatanty na płytki 96-dołkowe. Zmierz fluorescencję przy użyciu długości fali wzbudzenia 560 nm i długości fali emisji 590 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
		<li>Rozcieńczyć pozostały supernatant do 10-5 i 10-4 i rozprowadzić go na płytkach agarowych LB w celu hodowli.</li>
		<li>Policz pojedyncze kolonie następnego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wykrywanie reaktywnych form tlenu
<ol>
	<li>Przygotuj kultury bakterii zgodnie z opisem w kroku 2.3 i podziel je na probówki do mikrowirówek.</li>
	<li>Traktuj bakterie w różnych warunkach stresu jako dodatnie grupy kontrolne indukujące ROS (dane nie są pokazane w wynikach). Zabiegi są opisane w krokach 4.2.1-4.2.4.
	<ol>
		<li>Wystawić bakterie na działanie światła UV o długości fali 405 nm przez 3 godziny. Inkubować bakterie w temperaturze 45 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Następnie inkubować bakterie w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Traktować bakterie 3%H2O2 przez 30 min.</li>
		<li>Utrzymywać bakterie w temperaturze 37 °C w bulionie LB jako kontrolę ujemną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować różne stężenia CuNP zgodnie z opisem w kroku 3.1.1 i traktować bakterie CuNP o długości fali 20 nm lub 60 nm w stężeniach 1 μg/ml, 5 μg/mL, 10 μg/ml i 100 μg/ml przez 24 godziny.</li>
	<li>Umyj inkubowane bakterie dwukrotnie PBS, aby usunąć wszelkie pozostałe nanocząsteczki.</li>
	<li>Przygotować barwnik dioctanu 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceiny (H2DCFDA) w PBS o końcowym stężeniu 5 μM.</li>
	<li>Zawiesić osady bakteryjne w 5 μMH2DCFDA i zmierzyć intensywność fluorescencji przy emisji 520/30 nm za pomocą cytometru przepływowego. 
	UWAGA: Intensywność zielonej fluorescencji FL1 koreluje z poziomem ROS w kulturze poddanej działaniu substancji. Zaleca się wykonanie tego w trzech egzemplarzach w celu uzyskania dokładności statystycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Anees Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+activity+of+silver+nanoparticles%3A+A+mechanistic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Energy+Technol%22%5BJournal%5D)">Bactericidal activity of silver nanoparticles: A mechanistic review.</a> Mater Sci Energy Technol. 3, 756-769 (2020).</li>
<li>Zhang, Y., Shareena Dasari, T. P., Deng, H., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activity+of+gold+nanoparticles+and+ionic+gold%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Sci+Health+C+Environ+Carcinog+Ecotoxicol+Rev%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activity of gold nanoparticles and ionic gold.</a> J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev. 33 (3), 286-327 (2015).</li>
<li>Solioz, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolioz%2C+M+%22Copper+and+Bacteria%3A+Evolution%2C+Homeostasis+and+ToxicitySpringerBriefs+in+Molecular+Science%22">Copper and Bacteria: Evolution, Homeostasis and ToxicitySpringerBriefs in Molecular Science</a>. Ch 2, Springer Cham. 11-19 (2018).</li>
<li>Ma, X., Zhou, S., Xu, X., Du, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-containing+nanoparticles%3A+Mechanism+of+antimicrobial+effect+and+application+in+dentistry-a+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Surg%22%5BJournal%5D)">Copper-containing nanoparticles: Mechanism of antimicrobial effect and application in dentistry-a narrative review.</a> Front Surg. 9, 905892(2022).</li>
<li>Draviana, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+charge+effects+of+metal+nanoclusters+on+antibacterial+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Size and charge effects of metal nanoclusters on antibacterial mechanisms.</a> J Nanobiotechnology. 21 (1), 428(2023).</li>
<li>Hasanuzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ROS+metabolism+in+plants+under+environmental+stress%3A+A+review+of+recent+experimental+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of ROS metabolism in plants under environmental stress: A review of recent experimental evidence.</a> Int J Mol Sci. 21 (22), ijms21228695(2020).</li>
<li>Lai, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+size+and+concentration+of+copper+nanoparticles+on+the+antimicrobial+activity+in+Escherichia+coli+through+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Effect of size and concentration of copper nanoparticles on the antimicrobial activity in Escherichia coli through multiple mechanisms.</a> Nanomaterials (Basel). 12 (21), 12213715(2022).</li>
<li>Sai, D. L., Lee, J., Nguyen, D. L., Kim, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+photosensitive+ROS+for+advanced+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Tailoring photosensitive ROS for advanced photodynamic therapy.</a> Exp Mol Med. 53 (4), 495-504 (2021).</li>
<li>Peeters, S. H., de Jonge, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+greater+good%3A+Programmed+cell+death+in+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">For the greater good: Programmed cell death in bacterial communities.</a> Microbiol Res. 207, 161-169 (2018).</li>
<li>Allocati, N., Masulli, M., Di Ilio, C., De Laurenzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+for+the+community%3A+An+overview+of+programmed+cell+death+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Die for the community: An overview of programmed cell death in bacteria.</a> Cell Death Dis. 6 (1), e1609(2015).</li>
<li>Kolodkin-Gal, I., Sat, B., Keshet, A., Engelberg-Kulka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+communication+factor+EDF+and+the+toxin-antitoxin+module+mazEF+determine+the+mode+of+action+of+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The communication factor EDF and the toxin-antitoxin module mazEF determine the mode of action of antibiotics.</a> PLoS Biol. 6 (12), e319(2008).</li>
<li>Lai, M. J., Huang, Y. W., Wijaya, J., Liu, B. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLai%2C+MJ+%22Copper+Overview%22">Copper Overview</a>. Fernández, G. D. Ch 4, IntechOpen. (2024).</li>
<li>Macomber, L., Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iron-sulfur+clusters+of+dehydratases+are+primary+intracellular+targets+of+copper+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (20), 8344-8349 (2009).</li>
<li>Ramos-Zúñiga, J., Bruna, N., Pérez-Donoso, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+mechanisms+of+copper+nanoparticles+and+copper+surfaces+on+bacterial+cells+and+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Toxicity mechanisms of copper nanoparticles and copper surfaces on bacterial cells and viruses.</a> Int J Mol Sci. 24 (13), ijms241310503(2023).</li>
<li>Ihara, M., Shichijo, K., Takeshita, S., Kudo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wortmannin%2C+a+specific+inhibitor+of+phosphatidylinositol-3-kinase%2C+induces+accumulation+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Wortmannin, a specific inhibitor of phosphatidylinositol-3-kinase, induces accumulation of DNA double-strand breaks.</a> J Radiat Res. 61 (2), 171-176 (2020).</li>
<li>Yang, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+and+interpretation+of+current+autophagy+inhibitors+and+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Application and interpretation of current autophagy inhibitors and activators.</a> Acta Pharmacol Sin. 34 (5), 625-635 (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+caspase+inhibitor+Z-VAD-FMK+alleviates+endotoxic+shock+via+inducing+macrophages+necroptosis+and+promoting+MDSCs-mediated+inhibition+of+macrophages+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The caspase inhibitor Z-VAD-FMK alleviates endotoxic shock via inducing macrophages necroptosis and promoting MDSCs-mediated inhibition of macrophages activation.</a> Front Immunol. 10, 1824(2019).</li>
<li>Solioz, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolioz%2C+M+%22Copper+and+Bacteria%3A+Evolution%2C+Homeostasis+and+ToxicitySpringerBriefs+in+Molecular+Science%22">Copper and Bacteria: Evolution, Homeostasis and ToxicitySpringerBriefs in Molecular Science</a>. Chapter 3, Springer. Cham. 21-48 (2018).</li>
<li>Greene, N. P., Koronakis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metal+resistance%3A+Coping+with+copper+without+cooperativity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Bacterial metal resistance: Coping with copper without cooperativity.</a> mBio. 12 (3), e0065321(2021).</li>
<li>Butsyk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+nanoparticle+loaded+electrospun+patches+for+infected+wound+treatment%3A+from+development+to+in-vivo+application%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Copper nanoparticle loaded electrospun patches for infected wound treatment: from development to in-vivo application.</a> Polymers (Basel). 16 (19), polym16192733(2024).</li>
</ol>

Autor deklaruje, że nie występuje w konflikcie interesów, finansowym lub innym.

W badaniu tym zbadano działanie przeciwdrobnoustrojowe i mechanizmy CuNP w dwóch rozmiarach i różnych stężeniach przeciwko E. coli, S. aureus i A. baumannii. Korzystając z ustalonych protokołów, zaobserwowano, że działanie bakteriobójcze wywołane przez CuNP obejmuje stres oksydacyjny i potencjalną aktywację PCD. Jednak wzajemne oddziaływanie między homeostazą metali a reakcjami bakterii na stres pozostaje w dużej mierze niezbadane. Wcześniejsze badania zidentyfikowały strategie oporności bakter...

Bakterie oporne na leki są poważnym powodem do niepokoju w medycynie. Ich szybkie pojawienie się zmniejszyło skuteczność konwencjonalnych antybiotyków, powodując więcej powikłań klinicznych. Stanowią one poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego i stwarzają pilne zapotrzebowanie na nowe środki przeciwdrobnoustrojowe. Jednym z kierunków badań są nanomateriały. Nanomateriały mają unikalne właściwości fizykochemiczne, które pozwalają im wchodzić w interakcje z drobnoustrojami w sposób zagrażający ich żywotności. Na przykład nanocząstki srebra (AgNPs) indukują stres oksydacyjny u bakterii, powodując dysfunkcję białek, rozerwanie błony, uszkodzenie DNA i ostatecznie śmierć komórki1. Z drugiej strony nanocząstki złota (AuNPs) są znane ze swoich właściwości przeciwgrzybiczych i mogą wzmacniać bakteriobójcze działanie antybiotyków, służąc jako nośniki2.
Dodatkowo, nanocząstki miedzi (CuNPs) również przyciągnęły znaczną uwagę ze względu na ich silne działanie przeciwbakteryjne i niskie koszty produkcji. Badania sugerują, że CuNP wykazują szerokie spektrum działania bakteriobójczego poprzez zakłócenie aktywności enzymatycznej i wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS)3. Dodatni ładunek CuNPs ułatwia ich przenikanie do bakterii, zwiększając ich wychwyt komórkowy4. Mechanizm ten sprawia, że CuNPs są obiecującą opcją do powlekania powierzchni, np. na implantach, w celu zapobiegania infekcjom3. Interesującym odkryciem jest jednak to, że bakteriobójcze działanie CuNP wydaje się być zależne od wielkości. Niektóre badania wykazały, że mniejsze CuNP wykazują wyższą aktywność przeciwbakteryjną, prawdopodobnie ze względu na lepszy stosunek powierzchni do objętości5.
Generacja ROS powoduje rozległe uszkodzenia komórek i bakterii, w tym peroksydację lipidów, dysfunkcję białek, fragmentację DNA i hamowanie glukoneogenezy/glikogenolizy, a także bierze udział w martwicy lub programowanej śmierci komórki (PCD)6,7,8. Ostatnie badania wykazały, że u bakterii istnieją systemy PCD o trybach działania i efektorach podobnych do tych w systemach eukariotycznych9. Społeczności bakteryjne mogą indukować PCD w odpowiedzi na stres, w tym stres oksydacyjny, poprzez system toksyna-antytoksyna (TA)10. Mówiąc prościej, układ toksyna-antytoksyna składa się z toksyn, które mogą zakłócać podstawowe procesy komórkowe i antytoksyn, które mogą tworzyć stabilne kompleksy z toksynami, aby zahamować ich toksyczność w normalnych warunkach wzrostu. Większość bakterii i archeonów zawiera loci TA w swoich genomach, często obecne w wielu kopiach pozachromosomalnego i chromosomalnego DNA. Istnieje kilka rodzajów systemów TA, przy czym szczególnym zainteresowaniem cieszy się TA typu II (znany jako moduł MazE/MazF). W warunkach stresu antytoksyny ulegają degradacji, dzięki czemu toksyny mogą hamować swoje cele komórkowe. U E. coli i S. aureus toksyna MazF jest aktywowana w odpowiedzi na warunki stresowe, takie jak stres oksydacyjny, wysoka temperatura i głód aminokwasów. W konsekwencji ekspresja antytoksyny MazE ulega zmniejszeniu, uwalniając toksynę MazF10. Badania wykazały, że MazF umożliwia syntezę białek, które pozwalają małej subpopulacji przetrwać w niesprzyjających warunkach, podczas gdy większość populacji ulega śmierci komórki za pośrednictwem mazEF. Ta śmierć komórki może być albo zależna od ROS, gdzie ROS indukuje hamowanie transkrypcji lub translacji, albo niezależna od ROS, gdzie uszkodzenie DNA wyzwala szlaki śmierci11.
To badanie bada mechanizmy, za pomocą których CuNP wywołują śmierć bakterii. Zamiast skupiać się wyłącznie na systemie TA, cztery modulatory PCD, wcześniej używane w naszych badaniach7,12, zostały wykorzystane do zbadania potencjalnych szlaków PCD u bakterii.
Badając bakteriobójcze działanie CuNP o dwóch różnych rozmiarach (20 i 60 nm) przy różnych stężeniach, oraz wykorzystując metody takie jak testy kolonii, wykrywanie ROS i modulatory PCD (SBI, Z-VAD, NSA i Wortmannin), badania te podkreślają, że PCD nie występuje wyłącznie w organizmach wielokomórkowych, ale występuje również w społecznościach bakteryjnych pod wpływem stresu. Dostarczając szczegółowych protokołów, prace te mają na celu umożliwienie naukowcom oceny skuteczności CuNP i mechanizmów bakteriobójczych w ich własnych systemach. Co więcej, odkrycia te pogłębiają wiedzę na temat bakteryjnej PCD i wspierają rozwój terapii opartych na CuNP w celu zwalczania bakterii opornych na antybiotyki.

<table><tbody><tr><td>Acinetobacter baumannii Szczep Bouvet i Grimont&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA</td><td>17978</td><td>Bakterie do eksperymentu z toksojnością CuNP</td></tr><tr><td>Bio-Rad iMark Microplate Reader</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA</td><td>168-1130</td><td>Służy do pomiaru absorbancji w testach żywotności bakterii.</td></tr><tr><td>Przepuszczalny komórkowo dioctan 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny&nbsp; (H2DCFDA)</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA</td><td>D6883</td><td>Służy do wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w leczonych komórkach bakteryjnych.</td></tr><tr><td>Nanocząstki miedzi (CuNPs) 25 nm</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>774081</td><td>Służy do przygotowania roztworu podstawowego CuNP</td></tr><tr><td>Nanocząstki miedzi (CuNPs) 60-80 nm</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>774103</td><td>Służy do przygotowania roztworu podstawowego CuNP</td></tr><tr><td>Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA</td><td>25922</td><td>Bakterie do eksperymentu z toksowalnością CuNP</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Gallios</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td><td></td><td>Używany do analizy cytometrii przepływowej w wielu eksperymentach, w tym wykrywania reaktywnych form tlenu.</td></tr><tr><td>Agar LB</td><td>FocusBio, Miaoli, Tajwan</td><td>LBA500</td><td>Używany do hodowli bakterii</td></tr><tr><td>Bulion Luria-Bertani (LB)</td><td>Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA</td><td>244620</td><td>Używany do hodowli bakterii</td></tr><tr><td>Necrosulfonamid (NSA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>480073</td><td>Stosowany jako modulator do wstępnego leczenia w badaniach szlaku śmierci bakteryjnej.</td></tr><tr><td>Odczynnik do żywotności komórek PrestoBlue</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>P50200</td><td>Służy do oceny żywotności komórek za pomocą fluorescencji.</td></tr><tr><td>SBI-0206965 (SBI)</td><td>BioVision, Milpitas, CA, USA</td><td>9580</td><td>Stosowany jako modulator do leczenia wstępnego w badaniach szlaku śmierci bakteryjnej.</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>L4509</td><td>Stosowany jako dyspergator nanocząstek miedzi w celu zmniejszenia agregacji.</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA Centrum Zbierania i Badań nad Zasobami Biologicznymi (BCRC), Hsinchu, Tajwan</td><td>13567</td><td>Bakterie do eksperymentu toksowalności CuNP</td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik mikropłytek Varioskan LUX</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>VLBLATGD2</td><td>Służy do pomiaru fluorescencji w testach żywotności komórek</td></tr><tr><td>Wortmannin (Wort)</td><td>Abcam, MA, USA</td><td>ab120148</td><td>Stosowany jako modulator do wstępnego leczenia w badaniach szlaku śmierci bakteryjnej.</td></tr><tr><td>Z-VAD-FMK (Z-VAD)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>V116</td><td>Stosowany jako modulator do leczenia wstępnego w badaniach szlaku śmierci bakteryjnej.</td></tr></tbody></table>

badanie indukowanej przez nanocząstki miedzi programowanej śmierci komórek u bakterii

Studying Copper Nanoparticle-Induced Programmed Cell Death in Bacteria

Ostatnio, obawy związane z wielolekoopornymi patogenami i nieuleczalnymi infekcjami wzrosły z powodu nadużywania i niewłaściwego stosowania antybiotyków. Nanomateriały, takie jak nanocząstki metali i tlenków metali, zyskały popularność w dziedzinie biomedycyny jako potencjalne nowe strategie zwalczania patogenów wielolekoopornych. W badaniu tym zbadano zastosowanie nanocząstek miedzi (CuNPs) jako środka bakteriobójczego przeciwko trzem powszechnym patogenom oportunistycznym nabytym w szpitalu - Escherichia coli (E. coli), Acinetobacter baumannii (A. baumannii) i Staphylococcus aureus (S. aureus) - które w coraz większym stopniu rozwijają oporność na leki. Przedstawiono szczegółowe protokoły syntezy CuNP o dwóch rozmiarach (20 nm i 60 nm) i oceny ich skuteczności bakteriobójczej za pomocą testów kolonii. Zbadano mechanizmy działania przeciwdrobnoustrojowego leżącego u podstaw CuNP, oceniając zmiany w produkcji reaktywnych form tlenu. Ponadto zastosowano cztery modulatory, które hamują funkcje ludzkich białek, w celu zbadania potencjalnego udziału szlaków programowanej śmierci komórki (PCD) w zabijaniu bakterii. Dzięki takiemu podejściu sugeruje się potencjalne pojawienie się szczepów opornych na miedź, opierając się na badaniach nad białkami homeostazy miedzi, w tym zależnymi od miedzi regulatorami transkrypcji. Odkrycia te zapewniają kompleksową metodologię badania bakteriobójczego działania CuNP i ich potencjalnej roli w zwalczaniu oporności na antybiotyki.

Działanie przeciwdrobnoustrojowe nanocząsteczek miedzi (CuNPs) o dwóch rozmiarach wobec trzech patogenów 
Do przetestowania działania bakteriobójczego CuNPs wykorzystano trzy patogeny oportunistyczne (E. coli, S. aureus oraz A. baumannii). Bakterie poddano działaniu stężeń 0 µg/mL, 1 µg/mL, 5 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL oraz 100 µg/mL CuNPs o rozmiarach 20 nm lub 60 nm, a ich działanie bakteriobójcze określono na podstawie minimalnego stężenia bakteriobójczego (MBC) wyznaczone...

Nanocząsteczki miedzi działają jak środki przeciwdrobnoustrojowe, generując reaktywne formy tlenu. W tym miejscu przedstawiono procedury wykazujące, że nanocząstki miedzi są skuteczne przeciwko trzem klinicznie istotnym patogenom i że pewne zaprogramowane szlaki śmierci komórki są zaangażowane w ten proces bakteriobójczy.

Badanie indukowanej przez nanocząstki miedzi programowanej śmierci komórek u bakterii

Recently, concerns over multidrug-resistant pathogens and incurable infections have increased due to the overuse and misuse of antibiotics. Nanomaterials, ...

W tym badaniu zbadano skuteczność bakteriobójczą nanocząstki miedzi przeciwko trzem powszechnym bakteriom o znaczeniu klinicznym. Bada przypadki, w tym generowanie ROS i potencjalne zaangażowanie w zaprogramowaną śmierć komórki.Jednym z obecnych wyzwań jest osiągnięcie spójnej liczby kolonii. Uważam, że wynika to z interwencji. Modernizacja komórek podczas rozcieńczania powoduje fałszywe liczenie z lokalizacją w porównaniu z bardziej doświadczonym liczeniem.Nasza grupa była pierwszą, która użyła modulatora komórkowego do badania mechanizmów bakteriobójczych nanocząstek miedzi, ujawniając, że śmierć bakterii obejmuje procesy komórkowe, takie jak wytwarzanie ROS i autofagia.Protokół odpowiada na potrzebę głębszego zrozumienia mechanizmu, za pomocą którego nanocząsteczki miedzi zabijają bakterie, koncentrując się w szczególności na niedostatecznie zbadanym obszarze bakteryjnych szlaków programowanej śmierci komórki.Korzystając z różnych modulatorów komórkowych, potwierdziliśmy, że śmierć bakteryjna wywołana przez nanocząstki miedzi wiąże się z autofagią i przeciążeniem ROS oraz zidentyfikowaliśmy kluczowe szlaki wspierane przez wiarygodne eksperymenty oparte na trzech próbach z prostym projektem[Narrator] Aby rozpocząć uzyskiwanie komercyjnych nanoproszków miedzi o średnicach 25 nanometrów i 60 do 80 nanometrach od komercyjnego dostawcy. Użyj jednego mililitra jednego milimolowego SDS jako dyspergatora dla każdej wielkości nanocząstek. Następnie rozproszyć nanocząstki za pomocą kąpieli ultradźwiękowej przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy pozyskać szczepy Escherichia coli, Acinetobacter baumannii i Staphylococcus aureus z odpowiednich centrów zasobów biologicznych. Hoduj każdą bakterię w 10 mililitrach bulionu LB w warunkach tlenowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć kultury bakteryjne w pożywce LB, aby osiągnąć gęstość optyczną około 0,5 przy 600 nanometrach. Teraz użyj podstawowych roztworów nanocząstek miedzi, aby przygotować zakres stężeń od zera do 100 mikrogramów na mililitr obu rozmiarów. Odpipetować 500 mikrolitrów kultur bakteryjnych do probówek do mikrowirówek i odwirować przy 3 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odpipetowaniu supernatantu dodaj do każdej probówki różne stężenia nanocząstek obu rozmiarów. Traktuj grupy kontrolne z 500 mikrolitrami PBS jako kontrolą negatywną i 500 mikrolitrami 70% alkoholu jako kontrolą pozytywną. Następnie inkubować wszystkie próbki, wytrząsając z prędkością 200 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji umyj bakterie PBS i rozprowadź je na płytkach agarowych LB. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia policz kolonie na każdej płytce dla wszystkich grup leczenia. Traktuj bakterie pięcioma mikromolowymi SBI przez dwie godziny, 0,5 mikromolowym nekrosulfonamidem przez jedną godzinę, 100 nanomolowymi wortmanninami przez 30 minut lub 100 nanomolowymi Z-VAD przez 30 minut. Po zakończeniu wszystkich procesów obróbki wstępnej należy odwirować wszystkie probówki o stężeniu 3 300 G przez 10 minut. Następnie ponownie zawiesić granulat w 800 mikrolitrach PBS, aby umyć modulator obróbki wstępnej. Rozprowadź zawieszone granulki. Odwirować każdą probówkę, a następnie wyrzucić supernatant. Zawiesić granulki w mieszaninach modulatorów nanocząstek przed inkubacją z mieszaniem. Teraz dodaj 70% etanolu i PBS jako kontrole pozytywne i negatywne. Uwzględnij ślepe grupy kontrolne leczone inhibitorami, ale bez nanocząstek. Po inkubacji odpipetować odczynnik do żywotności komórek w stosunku objętościowym od jednego do dziesięciu i inkubować. Po ponownym odwirowaniu kultur przenieść supernatanty na płytki 96-dołkowe. Zmierz fluorescencję przy wzbudzeniu 560 nanometrów i emisji 590 nanometrów za pomocą czytnika mikropłytek. Rozcieńczyć pozostałe supernatanty do 10 do potęgi ujemnej 5 i 10 do potęgi ujemnej czwórki i rozprowadzić na płytkach agarowych LB do hodowli. Policz pojedyncze kolonie następnego dnia. Pipetować kultury bakterii do probówek mikrowirówek. Następnie wystaw kultury na działanie światła ultrafioletowego o długości 405 nanometrów przez trzy godziny. Następnie inkubuj kultury w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie inkubuj bakterie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po leczeniu na zimno inkubuj bakterie w 3% nadtlenku wodoru przez 30 minut. Utrzymuj grupę kontrolną w temperaturze 37 stopni Celsjusza w bulionie LB. Teraz traktuj bakterie cząstkami o wielkości 20 lub 60 nanometrów w stężeniach od jednego do 100 mikrogramów na mililitr przez 24 godziny. Następnie dwukrotnie umyj leczone bakterie PBS. Po odwirowaniu ponownie zawieś granulki bakteryjne w pięciomikromolowym roztworze barwnika dioctanu dichlorodihydrofluoresceiny o średnicy 2',7'. Przeanalizuj intensywność fluorescencji przy emisji 520 lub 530 nanometrów. Liczba kolonii Escherichia coli została znacznie zmniejszona o 20 nanonanocząstek miedzi przy jednym mikrogramie na mililitr i o 60 nanonanocząstek miedzi przy pięciu mikrogramach na mililitr. Staphylococcus aureus wykazał znaczne zmniejszenie liczby kolonii we wszystkich stężeniach obu wielkości nanocząstek. W przypadku Acinetobacter baumannii zmniejszenie liczby kolonii wymagało pięciu mikrogramów na mililitr 20-nanometrowych nanocząstek miedzi i 10 mikrogramów na mililitr 60-nanometrowych nanocząstek miedzi. Leczenie nanocząstkami miedzi wywołało produkcję reaktywnych form tlenu u wszystkich bakterii, przy czym cząstki o wielkości 20 nanometrów wykazały najwyższe frakcje komórek dodatnich przy niższych stężeniach. Z kolei obróbka nanocząstkami miedzi w procesie technologicznym 60 nanometrów doprowadziła do spójnego generowania reaktywnych form tlenu we wszystkich stężeniach. Zaprogramowany modulator śmierci komórkowej Z-VAD zwiększył przeżywalność Escherichia coli potraktowanej cząstkami o obu rozmiarach w niskich lub umiarkowanych stężeniach. Leczenie NSA poprawiło przeżywalność Staphylococcus aureus we wszystkich 20-nanometrowych stężeniach nanocząstek miedzi. Acinetobacter baumannii wykazywał lepszą żywotność z Z-VAD przy 1, 5 i 10 mikrogramach na mililitr zarówno 20, jak i 60 nanometrowych cząstek miedzi, podczas gdy NSA zwiększyła żywotność przy zaledwie 10 mikrogramach na mililitr z 20-nanometrowej ekspozycji na nanocząstki miedzi.

studying-copper-nanoparticle-induced-programmed-cell-death-in-bacteria

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Nanocząstki, takie jak półprzewodnikowe kropki kwantowe (QDs), mogą być wykorzystywane do tworzenia agentów fotoaktywowalnych w zastosowaniach przeciwdrobnoustrojowych lub przeciwnowotworowych. Niniejsza technika przedstawia sposób nadawania rozpuszczalności w wodzie kropkom kwantowym z tellurku kadmu (CdTe), ich sprzęganie z antybiotykiem oraz przeprowadzanie testu inhibicji bakteryjnej w oparciu o krzywe wzrostu i liczenie kolonii na płytkach.

Solubilizacja i biokoniugacja kropek kwantowych oraz analizy toksyczności bakteryjnej za pomocą krzywej wzrostu i metody przeliczania kolonii na płytkach

Źródło: Zhang, Y., et al. Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do wizualizacji endolizosomalnej przebudowy w ludzkich komórkach nabłonka zakażonych przez bakterie wewnątrzkomórkowe. Po inwazji bakteryjnej patogeny manipulują cytoszkieletem gospodarza i układem endolizosomalnym, tworząc wakuole z wypustkami rurkowymi, które...

Wizualizacja endo-lizosomalnej przebudowy za pośrednictwem nanocząstek w komórkach zakażonych bakteriami

Weźmy rurki z medium zawierającym kompozyt nanocząsteczkowy, zaprojektowany z połączenia metali przejściowych i węgla.Wprowadź antybiotykooporne bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne do oddzielnych probek jako próbki testowe.Uwzględnij nieleczone bakterie jako środek negatywny, a bakterie leczone antybiotykami jako pozytywne.Inkubuj próbki poprzez potrząsanie.U bakterii Gram-ujemnych porowata błona zewnętrzna i cienka warstwa peptydoglikanu ułatwiają przedostawanie się nanocząstek, prowadząc do...

Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej kompozytu nanocząsteczkowego przeciwko bakteriom patogennym

W przeciwieństwie do tego, co obserwuje się u eukariontów, istnieje niedostatek badań, które szczegółowo opisują depolaryzację błony i zmiany stężenia jonów u bakterii, przede wszystkim dlatego, że ich mały rozmiar utrudnia konwencjonalne metody pomiaru. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokoły monitorowania takich zdarzeń w znaczącym patogenie Gram-dodatnim Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem technik fluorescencyjnych.

Monitorowanie zmian polarności błony, integralności błony i stężeń jonów wewnątrzkomórkowych w Streptococcus pneumoniae przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Produkcja wody odpływowej (PBW) została potraktowana nanocząstkami tlenku miedzi (CuO-NPs) i oceniono toksyczność komórkową w hodowanych komórkach ludzkich. Celem tego protokołu było zintegrowanie rodzimej próbki środowiskowej z formatem hodowli komórkowej oceniającym zmiany toksyczności spowodowane traktowaniem CuO-NP.

Usuwanie pierwiastków śladowych przez nanocząstki tlenku miedzi z wody upustowej z odzysku uranu in situ i jej wpływ na żywotność komórek

Tutaj prezentujemy protokół syntezy nowatorskich biokompozytów o wysokim współczynniku proporcji w warunkach biologicznych i w płynnych podłożach. Biokompozyty skalują się odpowiednio od nanometrów do mikrometrów pod względem średnicy i długości. Nanocząstki miedzi (CNP) i siarczan miedzi w połączeniu z cystyną są kluczowymi składnikami syntezy.

Wytwarzanie skalowalnych, metalicznych nanokompozytów o wysokim współczynniku kształtu w biologicznym ciekłym ośrodku

Populacje mikroorganizmów zawierają znaczną heterogeniczność komórek, która może dyktować ogólne zachowanie. Analiza sondy molekularnej za pomocą cytometrii przepływowej może określić stany fizjologiczne komórek, jednak jej zastosowanie różni się w zależności od gatunku. Badanie to zapewnia protokół do dokładnego określenia śmiertelności komórek w populacji cyjanobakterii, bez niedoceniania lub rejestrowania wyników fałszywie dodatnich.

Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) za pomocą cytometrii przepływowej

Właściwości przeciwbakteryjne metali takich jak miedź i srebro są znane od wieków. Protokół ten opisuje pulsacyjną ablację laserową w cieczach, metodę syntezy nanocząstek metali, która zapewnia możliwość precyzyjnego dostrojenia właściwości tych nanocząstek w celu optymalizacji ich działania przeciwdrobnoustrojowego.

Wytwarzanie nanocząstek metali metodą pulsacyjnej ablacji laserowej w cieczach: narzędzie do badania właściwości przeciwbakteryjnych nanocząstek

Tutaj prezentujemy protokół do badania szybkości inicjacji programowanej śmierci komórki poprzez ciągłe obrazowanie zaszczepionych liści po indukcji śmierci komórki.

Badanie inicjacji śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego

Poznaj mechanizm działania nanocząstek miedzi przeciwko bakteriom poprzez generowanie reaktywnych form tlenu i indukcję programowanej śmierci komórek. Metoda obejmuje testowanie na szczepach E. coli, A. baumannii i S. aureus.

Badanie indukowanej przez nanocząstki miedzi programowanej śmierci komórek u bakterii

Przeglądaj więcej filmów