Name: Podawanie bleomycyny w jamie ustnej i gardłowej w mysim modelu zwłóknienia płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Poznaj metodę podawania bleomycyny drogą dojelitową w mysim modelu zwłóknienia płuc. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów immunologicznych i ocenę zmian włóknieniowych w tkance płucnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH Ruth L. Kirchstein National Research Service Award (NRSA) Institutional Research Training Grant (T32) przyznany RW (2T32HL072752-16). Autorzy pragną również podziękować za wsparcie Centrum Zdrowia Płuc Fundacji Saula i Joyce Brandmanów.

Badania na zwierzętach opisane w tych eksperymentach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami (ARC-2021-025, ARC-2010-039) zatwierdzonymi przez Komitet Badań nad Zwierzętami UCLA (ARC) oraz Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Instytucjonalnego (IACUC). Zachowano pełną zgodność ze wszystkimi stanowymi i federalnymi przepisami i politykami dotyczącymi wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych. Zwierzęta były trzymane w Zakładzie Opieki nad Zwierzętami UCLA i opiekowały się nimi wykwalifikowany personel Wydziału Medycyny Laboratoryjnej i Zwierzęcej UCLA (DLAM) w warunkach wolnych od patogenów. Myszy typu dzikiego C57BL/6 uzyskano komercyjnie i pozwolono im się zaaklimatyzować przez co najmniej 14 dni. Do badań wykorzystano samce myszy w wieku 8-12 tygodni, o średniej masie ciała 20-25 g. Samice myszy mogą być również wykorzystywane, choć ważne jest, aby dopasować płeć i wiek zwierząt w różnych grupach eksperymentalnych i warunkach27. Szczegóły handlowe dotyczące zwierząt, odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Podawanie bleomycyny w jamie ustnej i gardle
<ol>
	<li>Przygotowanie bleomyciny 
	UWAGA: Użyj bleomycyny klasy farmaceutycznej, aby zapewnić spójność i odtwarzalność między zwierzętami i eksperymentami. Dawkę bleomycyny należy podawać w jednostkach leku na kg zwierzęcia (U/kg), a nie w miligramach (mg) na kg.
	<ol>
		<li>Rozpuść bleomycynę w proszku w sterylnym PBS klasy farmaceutycznej do stężenia 10 U/ml. Bleomycyna powinna być przygotowywana pod kapturem chemicznym z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności chemoterapeutycznych. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
		<li>Przygotować końcowe stężenie robocze. Dawka zależy od masy ciała (0,5-3 j./kg), a w razie potrzeby dokonuje się jej dostosowania w zależności od zastosowanej bleomycyny i celu eksperymentu (np. przeżycia lub dawki śmiertelnej).</li>
		<li>W razie potrzeby dostosuj końcową objętość podawania. W tych badaniach rozcieńczyć bleomycynę do 0,375 U/ml, co odpowiada 50 μl dla myszy o wadze 25 g, co daje końcowe stężenie robocze 0,75 U/kg.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Indukcja znieczulenia
<ol>
	<li>Przygotuj koktajl znieczulający, rozcieńczając ketaminę i ksylazynę w PBS do stężeń roboczych odpowiednio 10 mg/ml i 1 mg/ml. Wykonaj ten krok w sterylnych warunkach, używając odczynników klasy farmaceutycznej i zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.</li>
	<li>Podawać 10 μl koktajlu na gram masy ciała zwierzęcia (stężenie robocze: ketamina 100 mg/kg, ksylazyna 10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym za pomocą igły 27,5 G i strzykawki o pojemności 1 ml.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona i nie reaguje na szkodliwe bodźce, takie jak szczypanie palców u stóp. Efekty powinny być widoczne w ciągu 5 minut. Jeśli nadal reaguje, podawaj dodatkową ketaminę/ksylazynę w odstępach co 20 μl, aż do osiągnięcia pożądanego poziomu znieczulenia. Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec suchości oczu podczas znieczulenia. 
		UWAGA: Ketamina jest preferowana w stosunku do innych wstrzykiwanych środków znieczulających i uspokajających ze względu na korzystny profil skutków ubocznych. Ma minimalny wpływ na hemodynamikę, w tym tętno i częstość oddechów. Wziewny izofluran może być stosowany jako alternatywny środek znieczulający. W tych badaniach preferowana jest ketamina/ksylazyna, ponieważ powoduje przedłużoną sedację i minimalny kaszel lub refluks bleomycyny po podaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Podawanie ustno-gardłowe
<ol>
	<li>Po odpowiednim uspokojeniu zawieś mysz na platformie zabiegowej pod kątem 60°-80°, zawieszając ją za przednie siekacze, aby skutecznie otworzyć część ustno-gardłową (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Zatkaj przewód nosowy za pomocą gładkiego zacisku mikronaczyniowego, zmuszając mysz do oddychania przez ustno-gardło.</li>
	<li>Wycofaj język z jamy ustnej gardła za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Za pomocą pipety krokowej z końcówką typu stub leur-stub delikatnie umieść żądaną objętość bleomycyny lub kontroli soli fizjologicznej w tylnej części jamy ustnej gardła. Upewnij się, że bąbelek cieczy jest wyraźnie widoczny (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Kontynuuj trzymanie języka na miejscu, aż zwierzę zaaspiruje roztwór. Powinno to być widoczne i często słyszalne. 
	UWAGA: Jeśli zwierzę szybko zasysa roztwór, wizualizacja w tylnej części jamy ustnej gardła może być przejściowa w ciągu kilku sekund. Niezależnie od tego, jeśli się powiedzie, zwierzę wykaże nagłą i przejściową zmianę w swoim wzorcu oddychania, biorąc szybkie, płytkie oddechy. Może wystąpić bulgotanie płynu, co dodatkowo wskazuje, że płyn pomyślnie dostał się do dolnych dróg oddechowych. Sporadycznie może również wystąpić kaszel. Jest to zwykle znikoma objętość roztworu bleomycyny i nie powinna wpływać na wyniki doświadczalne, pozwalając zwierzęciu pozostać w badaniu. Należy unikać wielokrotnego dawkowania, ponieważ zwiększa to ryzyko uduszenia i zmienia ostateczne dawkowanie w zależności od masy.</li>
	<li>Po potwierdzeniu aspiracji ostrożnie zdejmij zacisk na nos.</li>
	<li>Obserwuj zwierzę w pozycji wiszącej przez 15-30 sekund, aby upewnić się, że roztwór bleomycyny nie cofa się, a następnie włóż je z powrotem do klatki. 
	UWAGA: Zalecana jest maksymalna objętość 50 μl, aby zminimalizować ryzyko uduszenia. W zależności od pożądanej dawki bleomycyny i wagi myszy, w razie potrzeby należy dostosować stężenie roztworu bleomycyny. Ćwicząc tę technikę, użyj barwnika na bazie wody, takiego jak Evans blue, aby potwierdzić, że roztwór jest podawany do dolnych dróg oddechowych, a nie do żołądka14.</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie zwierząt
<ol>
	<li>Po zabiegu umieść zwierzę na boku w klatce z poduszką grzewczą pod spodem, aby zachować neutralność termiczną.</li>
	<li>Monitoruj myszy, aż będą w pełni przytomne. Trwa to zwykle 1-2 godziny, w zależności od zastosowanej dawki ketaminy i metabolizmu zwierzęcia. Delikatnie uszczypnij palce u nóg i utrzymuj zwierzęta w eutermii, aby ułatwić przebudzenie.</li>
	<li>Klinicznie monitoruj myszy codziennie pod kątem zmian w masie ciała, pielęgnacji, poziomie aktywności i stanie oddechowym. Podobnie jak w przypadku innych metod dostarczania bleomycyny, zwierzęta mogą doświadczyć znacznej utraty masy ciała w ciągu 14-21 dni, co jest kluczowym wskaźnikiem skuteczności modelu.</li>
	<li>Zgodnie z protokołami ARC i IACUC zwierzęta należy poddać eutanazji, jeśli utrata masy ciała przekracza 20% początkowej wagi zwierzęcia. Częstość występowania i nasilenie utraty masy ciała zależą od zastosowanej dawki bleomycyny i danych demograficznych myszy (patrz wyżej).</li>
</ol>
5. Pobieranie tkanek, przetwarzanie i analiza punktu końcowego
<ol>
	<li>W zależności od pytania eksperymentalnego i pożądanego punktu czasowego, należy poddać myszy eutanazji zgodnie z protokołami IACUC i pobrać ich płuca 28 w odpowiednim czasie. Efekty bleomycyny są często rażąco widoczne wizualnie w porównaniu z kontrolą, co wskazuje na skuteczne podanie. W tych badaniach myszy zostały uśmiercone w dniach 7, 14 i 21.</li>
	<li>W przypadku histologii należy wypreparować płuca en bloc i utrwalić je w 4% PFA przez 24 godziny. Kontynuuj osadzanie parafiny, sekcję, hematoksylinę i eozynę (H&E) i/lub barwienie trichromowe Massona, jak opisano wcześniej28,29,30.</li>
	<li>Do pomiaru kolagenu należy homogenizować prawe płuco i użyć dostępnego na rynku zestawu (patrz Tabela Materiałów) do pomiaru zawartości hydroksyproliny, jak opisano wcześniej31.</li>
	<li>W przypadku cytometrii przepływowej trawić prawe płuco za pomocą dysocjatora tkanek i roztworu enzymatycznego w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Wykonaj barwienie i analizę metodą cytometrii przepływowej zgodnie z wcześniejszym opisem32,33,34.</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Dostępny jest szczegółowy protokół wideo dotyczący techniki aspiracji jamy ustnej i gardła do podawania bleomycyny do stosowania w mysim modelu zwłóknienia płuc. Ponadto zwracamy uwagę na potencjalne dalsze zastosowania do ilościowego określania zmian zwłóknieniowych i zapalnych wywołanych przez bleomycynę w chorobie zwyrodnieniowej stawów.
Chociaż żadne zwierzę nie oddaje w pełni złożoności chorób u ludzi, mysi model bleomycyny jest używany od pięciu dekad i pozostaje najszerzej stosowanym mo...

Śródmiąższowa choroba płuc (ILD) odnosi się do niejednorodnej grupy zaburzeń charakteryzujących się postępującym i nieodwracalnym bliznowaceniem przestrzeni pęcherzyków płucnych, śródmiąższu i dystalnych dróg oddechowych1. Idiopatyczne zwłóknienie płuc (IPF) jest najczęstszą postacią ILD i charakteryzuje się medianą przeżycia wynoszącą około trzech lat2. IPF jest ostatecznie stanem terminalnym, a ortotopowy przeszczep płuc jest terapią ratunkową dla wybranych pacjentów. Obecnie istnieją dwie zatwierdzone przez FDA terapie IPF, z których obie jedynie spowalniają tempo postępu, a nie stabilizują lub poprawiają czynność płuc u pacjentów3,4. Prowadzone są intensywne prace badawcze mające na celu wyjaśnienie podstaw IPF i zidentyfikowanie nowych celów terapeutycznych. Istnieją niezliczone modele zwierzęce do badania patogenezy IPF, z których każdy ma swoje zalety i wady5. Chociaż żaden model nie jest w stanie w pełni odtworzyć złożoności chorób u ludzi, podejścia te oferują istotny wgląd w mechanizmy molekularne IPF i mogą uzupełniać badania translacyjne.
Mysi model bleomycyny pozostaje najczęściej używanym i najlepiej scharakteryzowanym modelem in vivo IPF6. Bleomycyna jest środkiem peptydowym, który indukuje pęknięcia jedno- i dwuniciowego DNA. Po odkryciu w 1962 roku bleomycyna okazała się skuteczna w leczeniu wielu nowotworów, w tym guzów jąder i chłoniaka, jednak jej stosowanie było ograniczone przez zależne od dawki zapalenie płuc i wynikające z niego zwłóknienie płuc7,8. Ta toksyczność płucna jest rekapitulowana u myszy. Po podaniu w pojedynczej dawce, po początkowej fazie zapalnej, zwłóknienie można zaobserwować od około 5 dnia, osiągając szczyt w dniach 14-219,10,11 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Samoistne ustąpienie następuje po około 6 tygodniach, chociaż trwałe zmiany zwłóknieniowe można osiągnąć przy wielokrotnym dawkowaniu12. Biorąc pod uwagę przejściowy i zapalny charakter, istnieją pewne nieodłączne wady modelu bleomycyny13, jednak oferuje on szybki, solidny i powtarzalny system, który zaczyna odpowiadać na niektóre z głównych luk w zrozumieniu ILD w naszej dziedzinie i pozwala badaczom porównywać wyniki z ostatnich pięciu dekad. Inne podejścia do instalacji obejmują modele azbestozy i krzemionki mysej, które oferują podobne kursy czasowe (dni 14-28)6,14,15,16. Jednak modele te generują wzorzec histologiczny bardziej zgodny z pylicą płuc niż IPF i wymagają użycia cząstek unoszących się w powietrzu, co wymaga ostrożnego obchodzenia się z nimi. Alternatywnie istnieją modele zwierzęce, które wykorzystują ekspresję transgenu sterowaną przez nabłonek, takie jak toksyna błonicza i TGF-β1. Przypominają one niezapalne uszkodzenie komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 obserwowane w IPF, jednak trwa nieco dłużej (21-30d) i wymaga użycia wyspecjalizowanych zwierząt, które muszą zostać skrzyżowane wstecznie z dowolnymi istniejącymi modelami transgenicznymi. Wreszcie, wykazano, że nadekspresja cytokin za pośrednictwem adenowirusa, w tym TGF-β1, IL-β1 i TNF-α, indukuje zwłóknienie płuc u gryzoni, zwykle w dniu 1417,18,19. Te modele nadekspresji cytokin pozwalają na wygodne podawanie donosowe, choć wymagają starannego oczyszczania i obchodzenia się z nimi.
Istnieje wiele podejść do dostarczania bleomycyny, w tym drogą dotchawiczą (IT), donosową, dootrzewnową, podskórną i dożylną6. Podawanie IT jest najpowszechniejszą metodą, tradycyjnie obejmującą intubację dotchawiczą lub tracheostomię chirurgiczną20, z których obie wymagają głębokiej sedacji, technicznej finezji i wiążą się z okołooperacyjną chorobowością i śmiertelnością. Ostatnio wykazano, że technika aspiracji ustno-gardłowej (OA) jest równie skuteczna jak IT, ze znacznie mniejszą liczbą skutków ubocznych i łatwiejszą drogą porodu14,21,22,23,24,25,26. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wizualny dla metody dostarczania bleomycyny do płuca myszy za pomocą metody OA i podkreślamy różne potencjalne zastosowania do kwantyfikacji danych.

<table><tbody><tr><td>anty-mysie CD45, Brlliant Violet 605</td><td>BioLegend</td><td>103155</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie CD64, AlexaFluor 647</td><td>BioLegend</td><td>139322</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie Ly6G, AlexaFluor 700</td><td>BioLegend</td><td>127622</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie MerTK, PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>151522</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie SiglecF, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552126</td><td></td></tr><tr><td>Adaptery BD Luer-Stub</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-21</td><td></td></tr><tr><td>Bleomycin</td><td>McKesson</td><td>1129996</td><td>firmy NorthStar Rx 16714088601</td></tr><tr><td>zestaw do intubacji myszy dotchawiczej</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Live/Dead Violet</td><td>Thermo</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo v10</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dysocjator</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania hydroksyproliny</td><td>Sigma</td><td>MAK463</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>Moria Zacisk do naczyń Fine</td><td>Science Tools</td><td>18350-11</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do intubacji dotchawiczej myszy</td><td>Kent</td><td>ETI-MSE</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta krokowa</td><td>Dymax</td><td>TI15469</td><td></td></tr><tr><td>Myszy Wildtype C57BL/6&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>JAX, plama #000664</td><td></td></tr></tbody></table>

podawanie bleomycyny w jamie ustnej i gardłowej w mysim modelu zwłóknienia płuc

Oropharyngeal Administration of Bleomycin in the Murine Model of Pulmonary Fibrosis

Śródmiąższowa choroba płuc (ILD) reprezentuje szerokie spektrum zaburzeń charakteryzujących się postępującym i często nieodwracalnym bliznowaceniem miąższu płuc, z których najczęstszym jest idiopatyczne zwłóknienie płuc (IPF). Opracowano kilka zwierzęcych modeli IPF, z których najpowszechniej stosowany jest mysi model bleomycyny. Bleomycyna jest chemioterapeutykiem, o którym wiadomo, że indukuje uszkodzenie DNA w nabłonku pęcherzyków płucnych, powodując ostre uszkodzenie płuc i zwłóknienie płuc u ludzi. Modele IPF u gryzoni wykorzystują podawanie bleomycyny różnymi metodami, z których najczęstszą jest dotchawicza (IT). Ostatnio wykazano, że technika aspiracji ustno-gardłowej (OA) jest równie skuteczna jak IT w przypadku wielu czynników zwłókniejących, ze znacznie mniejszą liczbą skutków ubocznych i łatwiejszą drogą podawania. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę dostarczania bleomycyny do płuca myszy w chorobie zwyrodnieniowej stawów i przedstawia przykłady potencjalnych zastosowań do kwantyfikacji danych. Metodologia ta oferuje prosty, szybki i bezpieczny sposób wykorzystania tego szeroko stosowanego modelu zwierzęcego do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw IPF.

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu podsumowuje drogę podania przez aspirację orofaringealną w mysim modelu bleomycyny. W badaniach tych zwierzęta otrzymywały bleomycynę (0,75U/kg masy ciała) lub PBS jako kontrolę pozorowaną. W dniach 7, 14 i 21 myszy zostały poddane eutanazji, a ich płuca wyekstrahowane i utrwalone, zgodnie z wcześniejszym opisem35. Włóknienie oceniano za pomocą barwienia histologicznego hematoksyliną i eozyną (H&amp;E). Do 7. dnia, w porównaniu z kontrolą PBS, można zaobse...

Ten protokół demonstruje technikę aspiracji ustno-gardłowej do użycia w mysim modelu zwłóknienia płuc z bleomycyną.

Podawanie bleomycyny w jamie ustnej i gardłowej w mysim modelu zwłóknienia płuc

Interstitial lung disease (ILD) represents a broad spectrum of disorders characterized by the progressive and often irreversible scarring of the lung ...

Nasze badania mają na celu zrozumienie mechanizmów immunologicznych leżących u podstaw patogenezy zwłóknienia płuc. Jednym z największych wyzwań w tej dziedzinie pozostaje przełożenie modeli in vitro i in vivo na ludzkie zwłóknienie płuc. Istnieje wiele modeli zwierzęcych do badania zwłóknienia płuc.Dążymy do standaryzacji jednego z najczęściej używanych modeli, mysiego modelu bleomycyny, tak aby można go było łatwo dostosować do innych laboratoriów. Przedstawiamy małoinwazyjną, wysoce powtarzalną i bezpieczną metodę podawania bleomycyny w mysim modelu włóknienia płuc. Ten model zwierzęcy uzupełnia badania in vitro na ludziach.Polega na uruchomieniu typów komórek krytycznych dla patogenezy i fizjologicznie replikuje zmiany w wentylacji, perfuzji i wymianie gazowej, które zachodzą podczas urazu. Przewidujemy, że interwencje, które znacznie zmniejszają nasilenie histopatologiczne in vivo, mogą wskazywać na lepsze wyniki kliniczne. Przystąp do przygotowywania roztworów bleomycyny w kapturze chemicznym, przestrzegając odpowiednich środków ostrożności związanych z chemioterapeutykami.Najpierw rozpuść proszek bleomycyny w sterylnym PBS, aby przygotować stężenie wyjściowe 10 jednostek na mililitr. W zależności od konkretnego zastosowanego bleomycyny i celu doświadczalnego, należy przygotować końcowe stężenie robocze zgodnie z wymaganą dawką w oparciu o masę ciała. Aby dostosować ostateczną objętość podawania, rozcieńczyć bleomycynę do 0,375 jednostki na mililitr, zapewniając całkowitą objętość 50 mililitrów dla myszy o wadze 25 gramów.Zawieś odpowiednio znieczuloną mysz na platformie zabiegowej pod kątem od 60 do 80 stopni, zawieszając ją za przednie siekacze, aby skutecznie otworzyć część ustno-gardłową. Zatkaj przewód nosowy za pomocą gładkiego zacisku mikronaczyniowego, aby wymusić oddychanie przez część ustno-gardłową. Za pomocą kleszczy wycofaj język z jamy ustnej gardła.Za pomocą pipety krokowej z końcówką do przynęty delikatnie umieść żądaną objętość bleomycyny lub roztworu soli fizjologicznej w tylnej części jamy ustnej gardła. Upewnij się, że widoczny pęcherzyk cieczy jest wyraźnie widoczny. Kontynuuj trzymanie języka w miejscu, aż mysz zaaspiruje roztwór, co jest widoczne i często słyszalne.Po potwierdzeniu aspiracji ostrożnie zdejmij zacisk na nos. Obserwuj mysz w pozycji wiszącej przez 15 sekund, aby upewnić się, że roztwór bleomycyny nie cofa się przed powrotem do klatki. Następnie umieść zwierzę na boku w klatce z poduszką grzewczą pod spodem, aby zachować neutralność termiczną.Delikatnie ściśnij palce u nóg i upewnij się, że zwierzęta pozostają w eutermii, aby ułatwić przebudzenie. Monitoruj myszy, aż odzyskają pełną świadomość, co zwykle trwa od jednej do dwóch godzin, w zależności od dawki ketaminy oraz wielkości i metabolizmu zwierzęcia. Klinicznie monitoruj myszy codziennie pod kątem zmian w masie ciała, pielęgnacji, poziomie aktywności i stanie oddechowym.Śledź wagę jako kluczowy wskaźnik skuteczności modelu. W odpowiednim czasie pobierz płuca od prawidłowo poddanych eutanazji myszy. W celu badania histologicznego należy wypreparować płuca na bloku i utrwalić je w 4% paraformaldehydzie na 24 godziny.Kontynuuj osadzanie, cięcie i barwienie parafiny za pomocą hematoksyliny i eozyny lub trichromu Massona. Aby zmierzyć rozpuszczalny kolagen, homogenizuj prawe płuco. W przypadku cytometrii przepływowej należy trawić prawe płuco za pomocą dysocjatora tkanek i roztworu enzymatycznego, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.Wykonaj barwienie i analizę metodą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami. W porównaniu z kontrolą PBS, zmiany zwłóknieniowe w przegrodach pęcherzykowych i małe obszary zapalne lub zwłóknieniowe obserwowano w próbkach płuc leczonych bleomycyną do siódmego dnia. Do 14 dnia pojawiły się większe i bardziej zlewające się obszary zwłóknieniowe ze znacznym zniszczeniem normalnej architektury pęcherzyków płucnych.Do 21 dnia zmiany zwłóknieniowe utrzymywały się bez znaczącego wzrostu. Zmodyfikowany system punktacji Ashcrofta potwierdził, że poziomy zwłóknienia były podobne między 14 a 21 dniem. Testy hydroksyproliny przeprowadzone w 14 dniu wykazały wzrost całkowitej zawartości rozpuszczalnego kolagenu w płucach leczonych bleomycyną w porównaniu z kontrolą.Ilościowa analiza reakcji łańcuchowej polimerazy wykazała regulację w górę genów profibrotycznych Col1A1 i TGFB w odpowiedzi na bleomycynę. Analiza cytometrii przepływowej wykazała silny naciekanie komórek szpikowych, w tym makrofagów śródmiąższowych, makrofagów pęcherzykowych pochodzących z monocytów i neutrofili w płucach.

oropharyngeal-administration-bleomycin-murine-model-pulmonary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten artykuł przedstawia szybką i prostą metodę podawania bleomycyny bezpośrednio do tchawicy myszy poprzez intubację. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest wysoce powtarzalna, łatwa do opanowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani długiego czasu rekonwalescencji.

Ulepszona metoda szybkiej intubacji tchawicy u myszy

Opisujemy nieinwazyjne podejście do obrazowania multimodalnego oparte na Micro-CT i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny modelu zwłóknienia płuc myszy wywołanego podwójnym wkropleniem dotchawiczym bleomycyny.

Multimodalne podejście do obrazowania oparte na mikrotomografii komputerowej i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną u myszy

Opisujemy metodę znacznego zwiększenia ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc do płuc myszy poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych z uszkodzeniem. Podejście to może być również stosowane do badania interakcji zrębu w mikrośrodowisku płuc, rozsiewu przerzutów, chorób współistniejących raka płuc oraz do bardziej efektywnego generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą bleomycyny zwiększa skuteczność ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc

Tutaj prezentujemy skuteczną metodę badania aktywności przeciwzwłóknieniowej ludzkich mezenchymalnych komórek zrębu podawanych dożylnie, uzyskanych z całej pępowiny po indukcji uszkodzenia płuc przez wstrzyknięcie dotchawicze bleomycyny u myszy C57BL/6. Protokół ten można łatwo rozszerzyć na badania przedkliniczne innych środków terapeutycznych.

Indukcja uszkodzenia płuc myszy przez wstrzyknięcie dotchwiaczą bleomycyny

Różne modele zwierzęce zwłóknienia płuc zostały stworzone przy użyciu bleomycyny, aby wyjaśnić patogenezę zwłóknienia płuc i znaleźć nowe cele leków. Jednak większość modeli zwłóknienia płuc ukierunkowanych na tkankę płucną ma nierównomierne podawanie leków. W tym miejscu proponujemy model jednolitego zwłóknienia płuc wywołanego nebulizacją bleomycyny nosowej.

Mysi model zwłóknienia płuc wywołanego nebulizacją bleomycyny w nosie

Ten protokół opisuje izolację makrofagów śródmiąższowych płuc (IM) i ich adoptywny transfer po stymulacji pęcherzyków płucnych przez IL-33 w modelu mysim, co może ułatwić badanie in vivo idiopatycznego zwłóknienia płuc (IPF).

Adoptywny transfer makrofagów stymulowanych przez IL-33 do modeli mysich indukowanych bleomycyną w celu zbadania ich wpływu na idiopatyczne zwłóknienie płuc in vivo

W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) do ilościowego oznaczania wentylowanych regionów w jednostronnym modelu zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną poprzez wkroplenie dotchawicze po stronie zmiany.

Jednostronna analiza objętości płuc za pomocą mikrotomografii komputerowej w celu lepszej oceny zwłóknienia płuc w modelach przedklinicznych

Protokół ten określa metodę wywoływania zwłóknienia płuc u myszy poprzez wielokrotne podawanie bleomycyny do jamy ustnej i gardła, uzyskując cechy patologiczne bardzo podobne do idiopatycznego zwłóknienia płuc.

Wyrafinowany mysi model idiopatycznego włóknienia płuc

Przedstawiamy protokół modelowania włóknienia płuc u myszy z wykorzystaniem aerozozolizowanej bleomycyny podanej przez tchawicę. Ta zoptymalizowana metoda umożliwia jednolite, ilościowe i precyzyjne podanie bez nacięcia chirurgicznego, zwiększając powtarzalność i wiarygodność włóknienia wywołanego bleomycyną.

Udoskonalona metoda podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej oparta na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych modeli myszy z włóknieniem płuc

Przedstawiono procedurę chirurgiczną indukcji jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej, z potwierdzeniem niedokrwienia za pomocą obrazowania perfuzji metodą laserowego Dopplera.

Mysi model niedokrwienia kończyny dolnej

Poznaj metodę podawania bleomycyny drogą dojelitową w mysim modelu zwłóknienia płuc. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów immunologicznych i ocenę zmian włóknieniowych w tkance płucnej.

Podawanie bleomycyny w jamie ustnej i gardłowej w mysim modelu zwłóknienia płuc

Przeglądaj więcej filmów