Szybkie zubożenie makrofagów nerkowych przy użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek CD59 / Intermedialysin

Używamy pośredniej oblacji ludzkiej komórki wyrażającej CD59 za pośrednictwem pośredniej lizyny u myszy do badania regeneracji mikrofagów nerkowych, koncentrując się na odzyskiwaniu monocytów napędzanym przez chemokiny i tworzeniu niszy nadzoru immunologicznego po urazie. Ostatnie odkrycia w naszej dziedzinie ujawniają mechanizm regeneracji makrofagów nerkowych, podkreślając specyficzną chemokinę, która rekrutuje makrofagi i sposób, w jaki nadzór immunologiczny jest przywracany po ostrym uszkodzeniu nerek. Łączymy kriogenetykę indukowaną tamoksyfenem, ablację pośrednią lizyną, wieloparametrową cytometrię przepływową i mikroskopię przyżyciową, aby ablować, śledzić i wizualizować makrofagi nerkowe w czasie rzeczywistym.

Kluczowymi wyzwaniami są unikanie ogólnoustrojowych stanów zapalnych, celowanie tylko w rezydujące makrofagi oraz pomiar szybkiej regeneracji bez naruszania delikatnego środowiska nerkowego. Wykazaliśmy, że monocyty przywracają 88% makrofagów nerkowych w ciągu siedmiu dni po ablacji, co jest procesem krytycznie zależnym od osi sygnalizacyjnej CX3 CR1, CX3 CL1. Na początek rozgrzej olej kukurydziany do 42 stopni Celsjusza.

Rozpuść 100 miligramów tamoksyfenu w pięciu mililitrach podgrzanego oleju kukurydzianego, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 20 miligramów na mililitr. Tamoksyfen należy podawać dootrzewnowo 10 do 12-tygodniowym samcom myszy w dawce 100 mikrogramów na gram masy ciała. Po 15 dniach należy wstrzyknąć myszom pojedynczą dożylną dawkę pośredniej lizyny w dawce 120 nanogramów na gram masy ciała.

Monitoruj i potwierdź rezydentną ablację makrofagów i późniejszą regenerację, wykonując cytometrię przepływową po jednym, trzech i siedmiu dniach po podaniu pośredniej. Do pobrania nerki użyj cienkich kleszczy i nożyczek, aby wykonać poziome nacięcie w dolnej części brzucha myszy poddanej eutanazji. Przedłuż nacięcie pionowo wzdłuż linii środkowej aż do momentu tuż poniżej klatki piersiowej lub mostka.

Delikatnie cofnij skórę i mięśnie, aby odsłonić klatkę piersiową. Rozetnij prawy przedsionek, aby krew mogła spłynąć z krążenia. Włóż igłę o rozmiarze od 21 do 23 do lewej komory.

Rozpocznij perfuzję od 10 do 20 mililitrów zimnego PBS, aby wypłukać krew. Kontynuuj perfuzję, aż nerki staną się blade, co wskazuje na skuteczne oczyszczanie krwi. Umieść nerki przy grzbietowej ścianie ciała i delikatnie oddziel je od otaczających tkanek za pomocą kleszczy i nożyczek.

Wyciąć kapsułki nerkowe i natychmiast umieścić nerki w zimnym PBS, aby zapobiec degradacji. Przygotuj 100 mililitrów koktajlu enzymów trawiennych, mieszając HBSS bez wapnia i magnezu, kolagenazę IV i DNazę I. Przygotuj świeży roztwór enzymu i trzymaj go na lodzie do czasu użycia. Za pomocą sterylnych nożyczek zmiel nerki na drobne fragmenty na szalce Petriego zawierającej pięć mililitrów HBSS.

Przenieś zmieloną tkankę nerkową do 15-mililitrowych probówek zawierających 10 mililitrów przygotowanego roztworu enzymu. Teraz inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, delikatnie mieszając, aby zdysocjować tkankę. Delikatnie rozcierać tkankę za pomocą pipety lub tłoka strzykawki, aby jeszcze bardziej rozbić grudki komórek.

Usuń zanieczyszczenia, przepuszczając zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 700 G przez 10 minut w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie zdekantuj bufor.

Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu do lizy przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez pięć minut w celu lizy czerwonych krwinek. Dodaj PBS, aby przemyć komórki i usunąć bufor do lizy. Powstałą zawiesinę jednokomórkową należy utrzymywać na lodzie do czasu dalszego użycia.

W przypadku wirowania w gradiacji gęstości należy najpierw ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach roztworu gradientu gęstości 30%. Ostrożnie ułóż to na trzech mililitrach roztworu gradientu o gęstości 70% w probówce wirówkowej. Odwirować gradient o sile 500 g przez 30 minut bez robienia przerwy.

Po odwirowaniu ostrożnie zbierz warstwę interfejsu między roztworami 30% i 70%. Zebrane komórki przemyć dwukrotnie 10 mililitrami PBS i odwirować każde przepłukanie przy 500 G przez 10 minut. Zawiesić ostatnią osadkę komórkową w jednym mililitrze buforu FACS w 1,5-mililitrowej probówce.

Policz komórki za pomocą hemocytometru pod mikroskopem jasnego pola i dostosuj stężenie komórek do dwa razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr. Osadzaj komórki w 1,5-mililitrowych probówkach, wirując przy 650 G przez pięć minut, a następnie ponownie zawieś osad komórek w jednym mililitrze buforu FACS. Dodać przeciwciało anty CD 16 lub 32 w rozcieńczeniu od jednego do 200, aby zablokować wiązanie niespecyficznego receptora FC.

Po inkubacji komórek przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wybarwić komórki żywym/martwym barwnikiem wodnym i wstępnie sprzężonym koktajlem przeciwciał, w tym CD45 E 450, CD11 B PE SI7, HCD59 PE i F4/80 BV 605. Dodaj koktajl przeciwciał bezpośrednio do zawiesiny komórek. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, aby chronić fluorofory.

Następnie dwukrotnie umyj komórki buforem FACS. Utrwal komórki w 1% paraformaldehydzie przez 30 minut na lodzie. Następnie dwukrotnie przemyj komórki buforem FACS, aby usunąć resztki utrwalacza.

Uzyskaj barwione i utrwalone komórki za pomocą cytometru przepływowego. Analizuj dane za pomocą oprogramowania. Zidentyfikuj makrofagi i mikroglej rezydujące w nerkach i innych tkankach za pomocą markerów CD45, CD11B i F4/80.

Wykonaj początkowe bramkowanie, aby wybrać aktywne komórki przy użyciu profili rozproszenia do przodu i z boku. Wyeliminuj dublety za pomocą obszaru rozproszenia do przodu w porównaniu z bramkowaniem wysokości. Wyklucz martwe komórki za pomocą barwnika żywotności.

Wzbogać komórki odpornościowe poprzez bramkowanie w populacjach CD45 dodatnich. Zdefiniuj makrofagi rezydujące w nerkach jako komórki CD11b + F4 / 80hi w bramce dodatniej CD45, jak pokazano w strategii bramkowania. Zdefiniuj populacje mikrogleju jako komórki pośrednie CD11b+CD45 i przeprowadź końcową analizę.

Pojedyncze wyraźne prążki białkowe zaobserwowano w pobliżu 54 kilodaltonów w żelu strony SDS, potwierdzając czystość i oczekiwaną masę cząsteczkową rekombinowanej intermedilizyny. Oczyszczona pośrednia lizyna wykazywała silną aktywność hemolityczną w sposób zależny od dawki, osiągając 50% lizy czerwonych krwinek przy 7,24 nanograma na mililitr i prawie całkowitą lizę przy 650 nanogramach na mililitr. Analiza cytometrii przepływowej potwierdziła udane i selektywne zubożenie makrofagów nerkowych u indukowalnych ludzkich myszy cre-R ze związkiem CD59 jeden dzień po podaniu pośredniej lizyny, bez wyczerpania u myszy kontrolnych.

Makrofagi nerkowe zaczęły ponownie zasiedlać się w trzecim dniu i odzyskały około 88% swojej pierwotnej populacji w siódmym dniu. Tylko 5% nowo zregenerowanych makrofagów nerkowych wykazywało ekspresję ludzkiego CD59 do siódmego dnia, co wskazuje, że ponowne zasiedlenie nastąpiło głównie poprzez rekrutację monocytów, a nie proliferację in situ.