Name: Szybkie zubożenie makrofagów nerkowych przy użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek CD59 / Intermedialysin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj metodę ablacji makrofagów nerkowych za pomocą ludzkiego CD59/intermedialysyny u myszy. Technika ta pozwala badać regenerację komórek odpornościowych po ostrym uszkodzeniu nerki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy naszą wdzięczność zarówno byłym, jak i obecnym członkom Qin Lab za ich wkład w rozwój i udoskonalenie protokołów wykorzystanych w tym badaniu. Dziękujemy również grupie dr R. K. Twetena z Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Oklahomy za hojne dostarczenie rekombinowanego plazmidu ILY, który odegrał kluczową rolę w tych badaniach. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health (NIH) poprzez grant NIH 5 P51OD011104-58, R01DK129881 (X.Q.) i R21OD024931 (X.Q.).

<ol><li>Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+functions+of+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Origin and functions of tissue macrophages.</a> Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).</li>
<li>Nelson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renal+mononuclear+phagocytic+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">The renal mononuclear phagocytic system.</a> J Am Soc Nephrol. 23 (2), 194-203 (2012).</li>
<li>Wang, Y., Harris, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophages in renal disease.</a> J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).</li>
<li>Islamuddin, M., Qin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+macrophages+and+NLRP3+inflammasomes+in+kidney+diseases+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Renal macrophages and NLRP3 inflammasomes in kidney diseases and therapeutics.</a> Cell Death Discov. 10 (1), 229(2024).</li>
<li>Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li>
<li>Mily, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+M1+and+M2+Human+Monocyte-Derived+Cells+and+Analysis+with+Flow+Cytometry+upon+Mycobacterium+tuberculosis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection.</a> J Vis Exp. (163), e61807(2020).</li>
<li>Huen, S. C., Cantley, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+Renal+Injury+and+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macrophages in Renal Injury and Repair.</a> Annu Rev Physiol. 79, 449-469 (2017).</li>
<li>Tang, P. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+versatile+players+in+renal+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophages: versatile players in renal inflammation and fibrosis.</a> Nat Rev Nephrol. 15 (3), 144-158 (2019).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fate%2C+dynamics+and+niches+of+renal+macrophages+of+bone+marrow+or+embryonic+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Distinct fate, dynamics and niches of renal macrophages of bone marrow or embryonic origins.</a> Nat Commun. 11 (1), 2280(2020).</li>
<li>Chew, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+resident+macrophages+have+distinct+subsets+and+multifunctional+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Kidney resident macrophages have distinct subsets and multifunctional roles.</a> Matrix Biol. 127, 23-37 (2024).</li>
<li>Cheung, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+macrophage+subpopulations+occupy+distinct+microenvironments+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Resident macrophage subpopulations occupy distinct microenvironments in the kidney.</a> JCI Insight. 7 (20), 161078(2022).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-inducible+human+CD59+mediates+rapid+cell+ablation+after+intermedilysin+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Cre-inducible human CD59 mediates rapid cell ablation after intermedilysin administration.</a> J Clin Invest. 126 (6), 2321-2333 (2016).</li>
<li>Hu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+conditional+targeted+ablation+of+cells+expressing+human+CD59+in+transgenic+mice+by+intermedilysin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid conditional targeted ablation of cells expressing human CD59 in transgenic mice by intermedilysin.</a> Nat Med. 14 (1), 98-103 (2008).</li>
<li>Giddings, K. S., Zhao, J., Sims, P. J., Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD59+is+a+receptor+for+the+cholesterol-dependent+cytolysin+intermedilysin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human CD59 is a receptor for the cholesterol-dependent cytolysin intermedilysin.</a> Nat Struct Mol Biol. 11 (12), 1173-1178 (2004).</li>
<li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li>
<li>Cao, Q., Harris, D. C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+kidney+injury%2C+inflammation%2C+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophages in kidney injury, inflammation, and fibrosis.</a> Physiology. 30 (3), 183-194 (2015).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophages+in+fibrosis+of+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">The role of macrophages in fibrosis of chronic kidney disease.</a> Biomed Pharmacother. 177, 117079(2024).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+cell+ablation+tools+and+their+applications+to+study+loss+of+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Versatile cell ablation tools and their applications to study loss of cell functions.</a> Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4725-4743 (2019).</li>
<li>Yashchenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx3cr1+kidney+resident+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cx3cr1 kidney resident macrophage heterogeneity.</a> Front Immunol. 14, 1082078(2023).</li>
<li>Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+immunologic+inflammation+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Macrophages and immunologic inflammation of the kidney.</a> Semin Nephrol. 30 (3), 234-254 (2010).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+phenotypes+contribute+to+kidney+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair.</a> J Am Soc Nephrol. 22 (2), 317-326 (2011).</li>
<li>Wynn, T. A., Vannella, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+Tissue+Repair%2C+Regeneration%2C+and+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophages in Tissue Repair, Regeneration, and Fibrosis.</a> Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+proximal+tubular+epithelial+cells+and+other+interstitial+cells+in+tubulointerstitial+fibrosis+after+renal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between proximal tubular epithelial cells and other interstitial cells in tubulointerstitial fibrosis after renal injury.</a> Front Endocrinol. 14, 1256375(2023).</li>
<li>Guillot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid-activated+macrophages+promote+biliary+epithelial+cell+proliferation+through+integrin+%CE%B1v%CE%B26+upregulation+following+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Bile acid-activated macrophages promote biliary epithelial cell proliferation through integrin αvβ6 upregulation following liver injury.</a> J Clin Invest. 131 (9), 132305(2021).</li>
<li>Kim, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+Death+Preferentially+Induces+Liver+Injury+and+Inflammation+Through+the+Activation+of+Chemokine+%28C-C+Motif%29+Receptor+2-Positive+Macrophages+and+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Adipocyte Death Preferentially Induces Liver Injury and Inflammation Through the Activation of Chemokine (C-C Motif) Receptor 2-Positive Macrophages and Lipolysis.</a> Hepatology. 69 (5), 1965-1982 (2019).</li>
<li>Saxena, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Atp6v1g3-Cre+mice+for+investigation+of+intercalated+cells+and+the+collecting+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Generation of Atp6v1g3-Cre mice for investigation of intercalated cells and the collecting duct.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 325 (6), F770-F778 (2023).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani powiązań osobistych, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym manuskrypcie. Żadne konflikty interesów, w tym powiązania finansowe, niefinansowe, zawodowe lub osobiste, nie wpłynęły na projekt, przeprowadzenie, interpretację lub prezentację badania.

Udana ekspresja, oczyszczenie i walidacja funkcjonalna rekombinowanego ILY znakowanego przez Hisa w tym badaniu przebiegała zgodnie z dobrze ugruntowanym protokołem15. Proces ten obejmował jednak kilka kluczowych etapów, które zapewniły wysoką wydajność białka, czystość i aktywność biologiczną. Indukcja komórek E. coli BL21 (DE3) za pomocą IPTG została zoptymalizowana w celu zrównoważenia poziomów ekspresji białek przy jednoczesnym zminimalizowaniu tworzen...

Makrofagi nerkowe (RM) są niezbędnymi komórkami odpornościowymi, które utrzymują homeostazę nerek, regulują odpowiedzi immunologiczne i wspomagają naprawę tkanek po urazie. Pełnią one różne funkcje, w tym fagocytozę, prezentację antygenu oraz orkiestrację odpowiedzi zarówno zapalnych, jak i przeciwzapalnych 1,2,3. W zależności od lokalnego środowiska, RM mogą polaryzować się w fenotypy prozapalne (M1) lub przeciwzapalne (M2), pogarszając uraz lub ułatwiając gojenie 4,5,6. Dysregulacja RM jest związana z wystąpieniem i progresją ostrego uszkodzenia nerek (AKI) i przewlekłej choroby nerek (PChN), co czyni je kluczowymi graczami w zdrowiu i patologii nerek 7,8. RM powstają z różnych źródeł, w tym makrofagów pochodzących z woreczka żółtkowego podczas embriogenezy, monocytów wątroby płodu i monocytów pochodzących ze szpiku kostnego w wieku dorosłym. RM rozszerzają się i dojrzewają równolegle ze wzrostem nerek po urodzeniu, głównie pochodzące z monocytów wątroby płodu przed urodzeniem, z samozachowaniem przez dorosłość uzupełnionym przez monocyty obwodowe9. U dorosłych krążące monocyty są rekrutowane do nerki przez sygnały homeostatyczne lub urazowe, różnicując się w makrofagi pod wpływem lokalnych wpływów mikrośrodowiska. Utrzymanie RM jest utrzymywane poprzez miejscową proliferację i okresowe uzupełnianie z krążących monocytów 9,10,11,12.
Wcześniej wykazaliśmy zastosowanie ludzkiego systemu ablacji komórek CD59 (hCD59) / intermedialysin (ILY) jako narzędzia13,14 do badania odrębnych losów, dynamiki i nisz mikrośrodowiskowych RM pochodzących ze szpiku kostnego lub pochodzenia embrionalnego9. ILY selektywnie lizuje ludzkie komórki w ciągu kilku sekund, tworząc pory w docelowych błonach komórkowych15. Ta specyficzność wynika z wyłącznego powinowactwa ILY do ludzkiego CD59 (hCD59), bez interakcji lub wpływu litycznego na komórki innych gatunków pozbawionych tego receptora15. Opierając się na tej koncepcji, opracowaliśmy narzędzie umożliwiające szybką, warunkową i celowaną ablację ludzkich komórek wykazujących ekspresję CD59 w transgenicznych modelach myszy poprzez zastosowanie pośredniej lizyny (ILY)14. Aby ułatwić korzystanie z tego narzędzia, opracowaliśmy model warunkowej i celowanej ablacji komórek, generując myszy knockin STOP-CD59 z floksacją (ihCD59), w której ekspresja ludzkiego CD59 występuje dopiero po rekombinacji za pośrednictwem Cre13. Wcześniej stwierdzono, że gen CX3CR1cre-EFP ulega ekspresji wyłącznie na CD11bintF480hi, zdefiniowany jako makrofagi nerkowe9. Dlatego użyliśmy linii CX3CR1CreER2 + / + do krzyżowania z myszami ihCD59 w celu ekspresji hCD59 na makrofagach nerkowych. Udało nam się wygenerować myszy złożone z genotypem ihCD59 +/-/CX3CR1CreER+/-9 (+/-, +/+ i -/- wskazują odpowiednio myszy transgeniczne homozygoty, hemizygotę i niebędące nosicielami). Podawanie tamoksyfenu myszom ze związkiem ihCD59 +/-/CX3CR1CreER+/- warunkowo znakowanym i oznaczanym RM przez ekspresję hCD599. Po wyczerpaniu niszy RM poprzez leczenie ILY, monocyty obwodowe szybko różnicowały się w RM pochodzące ze szpiku kostnego, skutecznie ponownie zasiedlając niszę, jak opisano wcześniej w9. Regeneracja ta była krytycznie zależna od osi sygnalizacyjnej CX3CR1/CX3CL1, co podkreśla jej zasadniczą rolę zarówno w utrzymaniu, jak i odbudowie populacji RM9. Pokazujemy również, że ze względu na ich wyraźne zdolności glikolityczne, RM pochodzenia embrionalnego mają większą zdolność do wymiatania kompleksów immunologicznych i są bardziej wrażliwe na wyzwania immunologiczne niż RM pochodzące ze szpiku kostnego9.
Przedstawiamy szczegółowy protokół selektywnej ablacji RM w celu zbadania ich regeneracji za pomocą szybkiej ablacji komórek za pośrednictwem indukowanej przez Cre hCD59 (ihCD59) po podaniu ILY. Wstrzyknięcie ILY spowodowało celowaną ablację RM, które warunkowo i swoiście eksprymują hCD59 u myszy ze związkiem CX3CR1CreER+/-/ihCD59+/-. Po ablacji monitorowaliśmy dynamiczne zmiany makrofagów za pomocą cytometrii przepływowej i stwierdziliśmy szybkie zubożenie makrofagów, a następnie regenerację RM. Rekombinowany ILY ulegał ekspresji w komórkach E. coli BL21(DE3) i został oczyszczony za pomocą chromatografii powinowactwa niklowo-NTA. Czystość i funkcjonalność rekombinowanego ILY potwierdzono za pomocą SDS-PAGE, spektrofotometrii i testu hemolizy, wykazując jego charakterystyczną aktywność cytolizyny zależnej od cholesterolu. Użyliśmy ILY do wyczerpania RM u myszy, osiągając skuteczną ablację makrofagów w ciągu 1 dnia od podania ILY. Regeneracja makrofagów nerek rozpoczęła się w 3 dniu po ablacji, z ~85% powrotem do 7 dnia. Dane sugerują, że regeneracja jest napędzana przede wszystkim przez rekrutację monocytów. Model ten stanowi potężne narzędzie do badania biologii makrofagów i ma potencjał terapeutyczny w zakresie ukierunkowanej manipulacji populacjami makrofagów w chorobach nerek. Narzędzie do ablacji komórek ihCD59/ILY może być używane do badania funkcji i regeneracji komórek w nerkach, wątrobie, tkance tłuszczowej i innych narządach.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mikro; M Filtr strzykawkowy</td><td>Milipory</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>4-15% TGX Bezplamne żele białkowe</td><td>Bio-Rad</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>6X Bufor załadowczy</td><td>Rybak</td><td>50-103-6570</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>WWR Nauki przyrodnicze</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizujący ACK (chlorek amonu-potasu)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki z żywicy Affinity</td><td>Milipory</td><td>69670</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina roztwór sodowy</td><td>Badania Zymo</td><td>A1001-5</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD11b-PE-CY7 (klon M1/70)</td><td>Invitrogen</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD16/32 (Fc&gamma; RIII/II, Klon 93)</td><td>eBionauka</td><td>48-0161-80</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD45-e450 (klon 30-F11)</td><td>eBionauka</td><td>48-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Anty-F4 / 80-BV605 (klon BM8)</td><td>Legenda biologiczna&nbsp;</td><td>123133</td><td></td></tr><tr><td>Anty-hCD59-PE (klon OV9A2)</td><td>Invitrogen</td><td>12-0596-42</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik Aqua Alive/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; L34957A</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki (żywica)</td><td>Milipory</td><td>69670</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazy</td><td>Milipory</td><td>70664-10KUN</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do ekstrakcji białek BugBuster</td><td>Milipory</td><td>70584-4</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do mikroprobówek</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do probówek</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-001-241</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Korporacja Biochemiczna Worthington</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Zobacz materiał C8267</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza (DNAzy) I</td><td>Korporacja Biochemiczna Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna z żywicą Detoxi-Gel</td><td>Milipory</td><td>69670</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco' s roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Rurki EDTA</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Rybak</td><td>Zobacz materiał BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hank' s Zbalansowany roztwór soli)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd)&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>206-703-0</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Kształcenie i szkolenie zawodowe pierwsze</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Nośniki LB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy LSRFortessa</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES [kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy]</td><td>Rybak</td><td>50-488-796</td><td></td></tr><tr><td>MOPS [kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy]</td><td>Rybak</td><td>50-213-522</td><td></td></tr><tr><td>Media gradientowe o gęstości Percoll</td><td>Cytiva (Cytiwa)</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Fisher Naukowy</td><td></td><td>Wycofane teraz, użyj alternatywy</td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehyd)</td><td>Thermo Scientific</td><td>I28800 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna oczyszczająca</td><td>Milipory</td><td>UFC900308</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór rLizozymu</td><td>Novagen</td><td>20C71110 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna z wytrząsaniem&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Zobacz materiał TSSB15</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dializy Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo</td><td>66107</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Rybak</td><td>Zobacz materiał BP349-100</td><td>Świeżo wyprodukowane lub krócej niż miesiąc</td></tr><tr><td>Sterylne sitko do komórek (40 &mu; m)</td><td>Fisher Naukowy</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksyfen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6734</td><td></td></tr><tr><td>Filtr ultra odśrodkowy</td><td>Milipory</td><td>UFC900308</td><td></td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>Thermo</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Fisher Naukowy</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-ME (&beta;-merkaptoetanol)</td><td>Rybak</td><td>Zobacz materiał BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie zubożenie makrofagów nerkowych przy użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek cd59 / intermedialysin

Rapid Depletion of Renal Macrophages Using Human CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool

Makrofagi nerkowe (RM) są niezbędne dla zdrowia nerek, koordynowania nadzoru immunologicznego, homeostazy tkanek i reakcji na urazy. Wcześniej informowaliśmy o użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek CD59 (hCD59) / pośredniej lizyny (ILY) w celu zbadania odrębnego losu, dynamiki i nisz RM szpiku kostnego lub pochodzenia embrionalnego. RM pochodzą z makrofagów pochodzących z woreczka żółtkowego, monocytów wątroby płodu i monocytów pochodzących ze szpiku kostnego i są utrzymywane w wieku dorosłym poprzez lokalną proliferację i rekrutację krążących monocytów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół selektywnej ablacji RM w celu zbadania ich regeneracji, w tym 1) generowanie i charakterystykę indukowanej przez Cre ekspresji hCD59 w RM myszy, 2) oczyszczanie ILY i charakterystykę aktywności ILY, 3) indukcję ekspresji hCD59 na RM u myszy złożonych oraz 4) charakterystykę regeneracji po ablacji RM za pośrednictwem ILY. ILY specyficznie i szybko wyczerpuje RM u myszy złożonych, zapewniając skuteczną ablację makrofagów w ciągu 1 dnia po podaniu ILY. Regeneracja makrofagów nerek rozpoczęła się w 3 dniu po ablacji, z ~88% powrotem do 7 dnia. Model ten stanowi potężne narzędzie do badania biologii makrofagów i może być wykorzystany do selektywnej ablacji innych populacji komórek w nerkach, wątrobie i tkankach tłuszczowych w celu zbadania ich funkcji i regeneracji.

Oczyszczanie rekombinowanego ILY His-Tag przebiegało zgodnie z tym samym protokołem, który opisano wcześniej wpunkcie 14. ILY został pomyślnie poddany ekspresji w komórkach E. coli BL21(DE3), transformowanych plazmidem kodującym gen ILY ze Streptococcus intermedius. Po indukcji za pomocą IPTG widoczna była nadekspresja białka docelowego. Po ekspresji, ILY oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa niklowo-NTA, wykorzystując C-końcowy znacznik His do specyficznego wiązania....

Podano tutaj protokół selektywnej ablacji makrofagów nerkowych w celu zbadania ich regeneracji przy użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek CD59 / intermedialyzyny. Metoda ta ma również zastosowanie do badania funkcji i regeneracji innych populacji komórek w nerkach, wątrobie i tkance tłuszczowej.

Szybkie zubożenie makrofagów nerkowych przy użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek CD59 / Intermedialysin

Renal macrophages (RMs) are essential for kidney health, orchestrating immune surveillance, tissue homeostasis, and responses to injury. Previously, we ...

Używamy pośredniej oblacji ludzkiej komórki wyrażającej CD59 za pośrednictwem pośredniej lizyny u myszy do badania regeneracji mikrofagów nerkowych, koncentrując się na odzyskiwaniu monocytów napędzanym przez chemokiny i tworzeniu niszy nadzoru immunologicznego po urazie. Ostatnie odkrycia w naszej dziedzinie ujawniają mechanizm regeneracji makrofagów nerkowych, podkreślając specyficzną chemokinę, która rekrutuje makrofagi i sposób, w jaki nadzór immunologiczny jest przywracany po ostrym uszkodzeniu nerek. Łączymy kriogenetykę indukowaną tamoksyfenem, ablację pośrednią lizyną, wieloparametrową cytometrię przepływową i mikroskopię przyżyciową, aby ablować, śledzić i wizualizować makrofagi nerkowe w czasie rzeczywistym.Kluczowymi wyzwaniami są unikanie ogólnoustrojowych stanów zapalnych, celowanie tylko w rezydujące makrofagi oraz pomiar szybkiej regeneracji bez naruszania delikatnego środowiska nerkowego. Wykazaliśmy, że monocyty przywracają 88% makrofagów nerkowych w ciągu siedmiu dni po ablacji, co jest procesem krytycznie zależnym od osi sygnalizacyjnej CX3 CR1, CX3 CL1. Na początek rozgrzej olej kukurydziany do 42 stopni Celsjusza.Rozpuść 100 miligramów tamoksyfenu w pięciu mililitrach podgrzanego oleju kukurydzianego, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 20 miligramów na mililitr. Tamoksyfen należy podawać dootrzewnowo 10 do 12-tygodniowym samcom myszy w dawce 100 mikrogramów na gram masy ciała. Po 15 dniach należy wstrzyknąć myszom pojedynczą dożylną dawkę pośredniej lizyny w dawce 120 nanogramów na gram masy ciała.Monitoruj i potwierdź rezydentną ablację makrofagów i późniejszą regenerację, wykonując cytometrię przepływową po jednym, trzech i siedmiu dniach po podaniu pośredniej. Do pobrania nerki użyj cienkich kleszczy i nożyczek, aby wykonać poziome nacięcie w dolnej części brzucha myszy poddanej eutanazji. Przedłuż nacięcie pionowo wzdłuż linii środkowej aż do momentu tuż poniżej klatki piersiowej lub mostka.Delikatnie cofnij skórę i mięśnie, aby odsłonić klatkę piersiową. Rozetnij prawy przedsionek, aby krew mogła spłynąć z krążenia. Włóż igłę o rozmiarze od 21 do 23 do lewej komory.Rozpocznij perfuzję od 10 do 20 mililitrów zimnego PBS, aby wypłukać krew. Kontynuuj perfuzję, aż nerki staną się blade, co wskazuje na skuteczne oczyszczanie krwi. Umieść nerki przy grzbietowej ścianie ciała i delikatnie oddziel je od otaczających tkanek za pomocą kleszczy i nożyczek.Wyciąć kapsułki nerkowe i natychmiast umieścić nerki w zimnym PBS, aby zapobiec degradacji. Przygotuj 100 mililitrów koktajlu enzymów trawiennych, mieszając HBSS bez wapnia i magnezu, kolagenazę IV i DNazę I. Przygotuj świeży roztwór enzymu i trzymaj go na lodzie do czasu użycia. Za pomocą sterylnych nożyczek zmiel nerki na drobne fragmenty na szalce Petriego zawierającej pięć mililitrów HBSS.Przenieś zmieloną tkankę nerkową do 15-mililitrowych probówek zawierających 10 mililitrów przygotowanego roztworu enzymu. Teraz inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, delikatnie mieszając, aby zdysocjować tkankę. Delikatnie rozcierać tkankę za pomocą pipety lub tłoka strzykawki, aby jeszcze bardziej rozbić grudki komórek.Usuń zanieczyszczenia, przepuszczając zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 700 G przez 10 minut w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie zdekantuj bufor.Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu do lizy przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez pięć minut w celu lizy czerwonych krwinek. Dodaj PBS, aby przemyć komórki i usunąć bufor do lizy. Powstałą zawiesinę jednokomórkową należy utrzymywać na lodzie do czasu dalszego użycia.W przypadku wirowania w gradiacji gęstości należy najpierw ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach roztworu gradientu gęstości 30%. Ostrożnie ułóż to na trzech mililitrach roztworu gradientu o gęstości 70% w probówce wirówkowej. Odwirować gradient o sile 500 g przez 30 minut bez robienia przerwy.Po odwirowaniu ostrożnie zbierz warstwę interfejsu między roztworami 30% i 70%. Zebrane komórki przemyć dwukrotnie 10 mililitrami PBS i odwirować każde przepłukanie przy 500 G przez 10 minut. Zawiesić ostatnią osadkę komórkową w jednym mililitrze buforu FACS w 1,5-mililitrowej probówce.Policz komórki za pomocą hemocytometru pod mikroskopem jasnego pola i dostosuj stężenie komórek do dwa razy 10 do mocy sześciu komórek na mililitr. Osadzaj komórki w 1,5-mililitrowych probówkach, wirując przy 650 G przez pięć minut, a następnie ponownie zawieś osad komórek w jednym mililitrze buforu FACS. Dodać przeciwciało anty CD 16 lub 32 w rozcieńczeniu od jednego do 200, aby zablokować wiązanie niespecyficznego receptora FC.Po inkubacji komórek przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wybarwić komórki żywym/martwym barwnikiem wodnym i wstępnie sprzężonym koktajlem przeciwciał, w tym CD45 E 450, CD11 B PE SI7, HCD59 PE i F4/80 BV 605. Dodaj koktajl przeciwciał bezpośrednio do zawiesiny komórek. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, aby chronić fluorofory.Następnie dwukrotnie umyj komórki buforem FACS. Utrwal komórki w 1% paraformaldehydzie przez 30 minut na lodzie. Następnie dwukrotnie przemyj komórki buforem FACS, aby usunąć resztki utrwalacza.Uzyskaj barwione i utrwalone komórki za pomocą cytometru przepływowego. Analizuj dane za pomocą oprogramowania. Zidentyfikuj makrofagi i mikroglej rezydujące w nerkach i innych tkankach za pomocą markerów CD45, CD11B i F4/80.Wykonaj początkowe bramkowanie, aby wybrać aktywne komórki przy użyciu profili rozproszenia do przodu i z boku. Wyeliminuj dublety za pomocą obszaru rozproszenia do przodu w porównaniu z bramkowaniem wysokości. Wyklucz martwe komórki za pomocą barwnika żywotności.Wzbogać komórki odpornościowe poprzez bramkowanie w populacjach CD45 dodatnich. Zdefiniuj makrofagi rezydujące w nerkach jako komórki CD11b + F4 / 80hi w bramce dodatniej CD45, jak pokazano w strategii bramkowania. Zdefiniuj populacje mikrogleju jako komórki pośrednie CD11b+CD45 i przeprowadź końcową analizę.Pojedyncze wyraźne prążki białkowe zaobserwowano w pobliżu 54 kilodaltonów w żelu strony SDS, potwierdzając czystość i oczekiwaną masę cząsteczkową rekombinowanej intermedilizyny. Oczyszczona pośrednia lizyna wykazywała silną aktywność hemolityczną w sposób zależny od dawki, osiągając 50% lizy czerwonych krwinek przy 7,24 nanograma na mililitr i prawie całkowitą lizę przy 650 nanogramach na mililitr. Analiza cytometrii przepływowej potwierdziła udane i selektywne zubożenie makrofagów nerkowych u indukowalnych ludzkich myszy cre-R ze związkiem CD59 jeden dzień po podaniu pośredniej lizyny, bez wyczerpania u myszy kontrolnych.Makrofagi nerkowe zaczęły ponownie zasiedlać się w trzecim dniu i odzyskały około 88% swojej pierwotnej populacji w siódmym dniu. Tylko 5% nowo zregenerowanych makrofagów nerkowych wykazywało ekspresję ludzkiego CD59 do siódmego dnia, co wskazuje, że ponowne zasiedlenie nastąpiło głównie poprzez rekrutację monocytów, a nie proliferację in situ.

rapid-depletion-renal-macrophages-using-human-cd59intermedilysin-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Makrofagi odgrywają centralną rolę w homeostazie i patologii wielu tkanek. Przedstawiony tutaj protokół opisuje metody usuwania makrofagów in vivo, otrzymywania spolaryzowanych makrofagów z aspiratów szpiku kostnego oraz adoptywnego transferu makrofagów do myszy. Techniki te pozwalają na określenie roli, jaką spolaryzowane makrofagi odgrywają w zdrowiu i chorobie.

Wyczerpanie i rekonstytucja makrofagów u myszy

Makrofagi to plastyczne komórki układu krwiotwórczego, które odgrywają kluczową rolę w ochronnej odporności i homeostazie. W tym raporcie opisujemy zoptymalizowane techniki in vitro do fenotypowego i funkcjonalnego charakteryzowania makrofagów regulatorowych naciekających przeszczepy, które gromadzą się w przeszczepionym narządzie w warunkach tolerogennych.

Charakterystyka funkcjonalna makrofagów regulatorowych, które hamują odporność reaktywną przeszczepu

Techniki, które są niezawodne i skuteczne w izolacji komórek odpornościowych nerek, są potrzebne do dalszych zastosowań. Wymaga to znakowania powierzchniowego przeciwciałami niewielkiej liczby komórek odpornościowych nerek. W niniejszym artykule opisujemy zwięzłą metodę izolacji komórek odpornościowych nerek, która pozornie osiąga ten cel.

Niezawodna i wysokowydajna izolacja komórek odpornościowych nerek

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół analizy fenotypowej i ilościowej makrofagów rezydentnych z nerek szczurów za pomocą cytometrii przepływowej. Powstałe w ten sposób wybarwione komórki mogą być również wykorzystane do innych zastosowań, w tym do sortowania komórek, analizy ekspresji genów lub badań funkcjonalnych, zwiększając w ten sposób informacje uzyskane w modelu eksperymentalnym.

Charakterystyka fenotypowa makrofagów z nerki szczura za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół pozwala badaczowi na wyizolowanie i scharakteryzowanie makrofagów rezydujących w tkankach w różnych charakterystycznych tkankach objętych stanem zapalnym, pobranych z modeli zaburzeń metabolicznych wywołanych dietą.

Izolacja, charakterystyka i oczyszczanie makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania apoptotycznych tymocytów i makrofagów otrzewnowych oraz analizy skuteczności efferocytozy i specyficznego blokowania apoptotycznych tymocytów za pośrednictwem inhibitorów. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w usuwaniu innych cząstek, w tym sztucznych kulek i bakterii, za pośrednictwem komórek.

Eksperymentalna analiza apoptotycznego pochłaniania tymocytów przez makrofagi

Tutaj prezentujemy protokół mechanicznej dysocjacji do szybkiego izolowania makrofagów z grzbietowego zwoju korzenia w celu fenotypowania i analizy funkcjonalnej.

Szybka izolacja makrofagów zwoju korzenia grzbietowego

Biorąc pod uwagę ograniczone modele ksenoprzeszczepów dostępne do badania interakcji między ludzkim CART-em a komórkami szpikowymi, stworzyliśmy modele in vitro i in vivo , aby zrozumieć wpływ ludzkich makrofagów na komórki CART. Wyniki można potencjalnie uogólnić, aby ocenić rolę makrofagów w mikrośrodowisku guza i przetestować immunoterapie ukierunkowane na makrofagi.

Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo

Za pomocą modelu eksplantacji ex vivo, małe fragmenty części rostralnej tkanki tłuszczowej białej trzewnej od szczupłych myszy są hodowane przez 7–10 dni, co umożliwia indukcję i badanie zapalenia tkanki tłuszczowej, jak to ma miejsce podczas karmienia dietą wysokotłuszczową.

Ex vivo model myszy na zapaleniu tkanki tłuszczowej podobnym do diety wysoko tłuszczowej

Poznaj metodę ablacji makrofagów nerkowych za pomocą ludzkiego CD59/intermedialysyny u myszy. Technika ta pozwala badać regenerację komórek odpornościowych po ostrym uszkodzeniu nerki.

Szybkie zubożenie makrofagów nerkowych przy użyciu ludzkiego narzędzia do ablacji komórek CD59 / Intermedialysin

Przeglądaj więcej filmów