Name: Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Poznaj metody optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster. Wykorzystaj narzędzia CsChrimson i GtACR2 do badania termotaksji i zachowań smakowych z precyzją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Schematy ideowe dla wszystkich rysunków zostały stworzone za pomocą Biorender.com. Praca ta była wspierana przez NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) do L.N. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowywaniu manuskryptu.

<ol><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+neuronal+silencing+in+drosophila+during+visual+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optogenetic neuronal silencing in drosophila during visual processing.</a> Sci Rep. 7 (1), 13823(2017).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience.+Natural+light-gated+anion+channels%3A+A+family+of+microbial+rhodopsins+for+advanced+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroscience. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics.</a> Science. 349 (6248), 647-650 (2015).</li>
<li>Castaneda, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+labeling+of+individualized+postsynaptic+neurons+using+optogenetics+and+trans-tango+in+drosophila+%28flipsot%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional labeling of individualized postsynaptic neurons using optogenetics and trans-tango in drosophila (flipsot).</a> PLoS Genet. 20 (3), e1011190(2024).</li>
<li>Fischer, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+versatile+model+organism+to+study+genetic+epilepsies%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a versatile model organism to study genetic epilepsies: An overview.</a> Front Mol Neurosci. 16, 1116000(2023).</li>
<li>Aragon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+neural+structure+and+activity+in+drosophila+through+the+intact+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of neural structure and activity in drosophila through the intact cuticle.</a> Elife. 11, e69094(2022).</li>
<li>Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+for+light+control+of+drosophila+behaviors+through+channelrhodopsin+2-mediated+photoactivation+of+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox for light control of drosophila behaviors through channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons.</a> Eur J Neurosci. 26 (9), 2405-2416 (2007).</li>
<li>Kono, M., Goletz, P. W., Crouch, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((11-cis-+and+all-trans-retinols+can+activate+rod+opsin%3A+Rational+design+of+the+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">11-cis- and all-trans-retinols can activate rod opsin: Rational design of the visual cycle.</a> Biochemistry. 47 (28), 7567-7571 (2008).</li>
<li>Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coding+of+temperature+in+the+drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The coding of temperature in the drosophila brain.</a> Cell. 144 (4), 614-624 (2011).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gustatory+receptor+paralogue+controls+rapid+warmth+avoidance+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in drosophila.</a> Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).</li>
<li>Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+bitter+taste+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of bitter taste in drosophila.</a> Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).</li>
<li>Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+taste+coding+in+the+legs+of+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of drosophila.</a> J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).</li>
<li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDethier%2C+VG+%22The+Hungry+Fly%3A+A+Physiological+Study+of+the+Behavior+Associated+with+Feeding%22">The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding</a>. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1976).</li>
<li>Shiu, P. K., Sterne, G. R., Engert, S., Dickson, B. J., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+quality+and+hunger+interactions+in+a+feeding+sensorimotor+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Taste quality and hunger interactions in a feeding sensorimotor circuit.</a> Elife. 11, e79887(2022).</li>
<li>Kim, H., Kirkhart, C., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+projection+neurons+in+the+taste+circuit+of+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Long-range projection neurons in the taste circuit of drosophila.</a> Elife. 6, e23386(2017).</li>
<li>Sayeed, O., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetics+of+thermosensation+and+hygrosensation+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 6079-6084 (1996).</li>
<li>Coya, R., Martin, F., Calvin-Cejudo, L., Gomez-Diaz, C., Alcorta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+optogenetic+approach+to+the+study+of+olfactory+behavior+in+the+t-maze+of+drosophila+melanogaster+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Validation of an optogenetic approach to the study of olfactory behavior in the t-maze of drosophila melanogaster adults.</a> Insects. 13 (8), 662(2022).</li>
<li>Chu, L. A., Tai, C. Y., Chiang, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirst-driven+hygrosensory+suppression+promotes+water+seeking+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Thirst-driven hygrosensory suppression promotes water seeking in drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (34), e2404454121(2024).</li>
<li>Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+gr5a+encodes+a+taste+receptor+tuned+to+trehalose%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drosophila gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (Suppl 2), 14526-14530 (2003).</li>
<li>Dunipace, L., Meister, S., Mcnealy, C., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+candidate+taste+receptors+in+the+drosophila+gustatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the drosophila gustatory system.</a> Curr Biol. 11 (11), 822-835 (2001).</li>
<li>Ratnayake, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light+excited+retinal+intercepts+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Blue light excited retinal intercepts cellular signaling.</a> Sci Rep. 8 (1), 10207(2018).</li>
<li>Huda, A., Omelchenko, A. A., Vaden, T. J., Castaneda, A. N., Ni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+different+drosophila+species+to+temperature+changes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Responses of different drosophila species to temperature changes.</a> J Exp Biol. 225 (11), jeb243708(2022).</li>
<li>Tyrrell, J. J., Wilbourne, J. T., Omelchenko, A. A., Yoon, J., Ni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionotropic+receptor-dependent+cool+cells+control+the+transition+of+temperature+preference+in+drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Ionotropic receptor-dependent cool cells control the transition of temperature preference in drosophila larvae.</a> PLoS Genet. 17 (4), e1009499(2021).</li>
<li>Fu, Z., Huda, A., Kimbrough, I. F., Ni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+drosophila+two-choice+assay+to+study+optogenetics+in+hands-on+neurobiology+laboratory+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Undergrad+Neurosci+Educ%22%5BJournal%5D)">Using drosophila two-choice assay to study optogenetics in hands-on neurobiology laboratory activities.</a> J Undergrad Neurosci Educ. 22 (1), A45-A50 (2023).</li>
<li>Joseph, R. M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+activation+of+a+single+gustatory+receptor+produces+opposing+behavioral+responses+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific activation of a single gustatory receptor produces opposing behavioral responses in drosophila.</a> Genetics. 192 (2), 521-532 (2012).</li>
<li>Riemensperger, T., Kittel, R. J., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+drosophila+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in drosophila neuroscience.</a> Methods Mol Biol. 1408, 167-175 (2016).</li>
<li>Dorkenwald, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+wiring+diagram+of+an+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal wiring diagram of an adult brain.</a> Nature. 634 (8032), 124-138 (2024).</li>
<li>Schlegel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+annotation+and+multi-connectome+cell+typing+of+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Whole-brain annotation and multi-connectome cell typing of drosophila.</a> Nature. 634 (8032), 139-152 (2024).</li>
<li>Talay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transsynaptic+mapping+of+second-order+taste+neurons+in+flies+by+trans-tango%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transsynaptic mapping of second-order taste neurons in flies by trans-tango.</a> Neuron. 96 (4), 783-795.e4 (2017).</li>
<li>Shiraiwa, T., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proboscis+extension+response+%28per%29+assay+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Proboscis extension response (per) assay in drosophila.</a> J Vis Exp. (3), e193(2007).</li>
<li>Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+the+teaching+laboratory%3A+Using+channelrhodopsin-2+to+study+the+neural+basis+of+behavior+and+synaptic+physiology+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Physiol+Educ%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in the teaching laboratory: Using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in drosophila.</a> Adv Physiol Educ. 35 (1), 82-91 (2011).</li>
<li>Titlow, J. S., Johnson, B. R., Pulver, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activated+escape+circuits%3A+A+behavior+and+neurophysiology+lab+module+using+drosophila+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Undergrad+Neurosci+Educ%22%5BJournal%5D)">Light activated escape circuits: A behavior and neurophysiology lab module using drosophila optogenetics.</a> J Undergrad Neurosci Educ. 13 (3), A166-A173 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów w związku z publikacją niniejszego artykułu. Wszyscy autorzy ujawnili wszelkie potencjalne konflikty i zapewniają, że nie mają żadnych powiązań finansowych ani osobistych, które mogłyby wpłynąć na pracę przedstawioną w tym badaniu.

Manipulacje optogenetyczne przekształciły dziedzinę neurobiologii, umożliwiając precyzyjną kontrolę obwodów neuronalnych z dokładnością czasoprzestrzenną27. Obwód neuronalny obejmuje populacje neuronów połączonych ze sobą synapsami, pełniących określone funkcje po aktywacji. Konektom całego mózgu Drosophila został ukończony, oferując kompleksowy wgląd w szlaki synaptyczne w mózgu Drosophila 28,29. Chociaż konektom może pr...

Optogenetyka pojawiła się jako potężna technika łącząca optykę i genetykę w neurobiologii, zapewniająca precyzyjną, nieinwazyjną kontrolę nad aktywnością neuronalną poprzez stymulację światłem1. W Drosophila melanogaster, szeroko stosowanym organizmie modelowym, narzędzia optogenetyczne umożliwiają aktywację i hamowanie określonych neuronów, umożliwiając naukowcom modulowanie obwodów neuronalnych. Wśród zastosowanych narzędzi CsChrimson i GtACR (rodopsyny kanału anionowego Guillardia theta) zapewniają uzupełniające się podejścia do celowania neuronalnego. CsChrimson kanałrrodopsyna, wrażliwy na światło czerwone kanał kationowy z zielonych alg, ułatwia aktywację neuronów poprzez depolaryzację pod wpływem światła czerwonego, ze szczytową aktywacją przy około 590 nm2. CsChrimson oferuje lepszą penetrację tkanek niż poprzednie rodopsyny kanałowe i redukuje artefakty behawioralne wywołane światłem w badaniach Drosophila2. Natomiast GtACR, który obejmuje warianty takie jak GtACR2, jest kanałem chlorkowym bramkowanym światłem, który wycisza neurony poprzez hiperpolaryzację3,4. GtACR2 przewodzi aniony i jest aktywowany przez niebieskie światło z aktywacją szczytową około 470 nm4. CsChrimson i GtACR2 są aktywowane przez różne długości fal świetlnych, zapewniając precyzyjną i niezależną kontrolę aktywności neuronalnej bez aktywacji krzyżowej5.
Drosophila jest skutecznym modelem do badań neurobiologicznych ze względu na swoją opłacalność, łatwość hodowli i silne reakcje behawioralne na bodźce środowiskowe, w tym zachowania atrakcyjne i unikające6. Jego niewielki rozmiar i półprzezroczysty naskórek zwiększają przenikanie światła, zwłaszcza światła czerwonego o dużej długości fali, umożliwiając skuteczną manipulację optogenetyczną7,8. Podczas gdy komórki Drosophila nie są w stanie wyprodukować wystarczającej ilości siatkówki, kluczowego kofaktora dla funkcjonalności rodopsyn kanałowych, dodanie siatkówki do ich diety kompensuje to ograniczenie, zapewniając skuteczną aktywację narzędzi optogenetycznych9.
Aby zbadać efekty manipulacji optogenetycznej u Drosophila, opisujemy cztery eksperymenty ukierunkowane na różne obwody neuronalne i zachowania, z których każdy wykorzystuje różne metody do oceny unikania lub atrakcyjnych odpowiedzi, począwszy od testów na pojedynczej muchy, a skończywszy na ocenach grupowych. Komórki grzewcze (HC) u Drosophila to neurony termoczuciowe zlokalizowane w arista, reagujące na wzrost temperatury10. Te neurony wyrażają wrażliwe na ciepło kanały jonowe, które wyzwalają zachowanie unikające, kierując muchy z dala od źródeł ciepła10,11. W podejściu 1 zastosowaliśmy optogenetyczny test preferencji położeniowej termotaktycznej w świetle niebieskim w celu manipulowania neuronami HC. Poprzez ekspresję GtACR2 w tych neuronach, zahamowaliśmy ich aktywność po ekspozycji na światło niebieskie. Muchy poddano dwóm opcjom temperatury: 25 °C i 31 °C. W świetle pomieszczenia muchy omijały stronę o temperaturze 31 °C, wykazując typową reakcję termotaktyczną. Jednak aktywacja GtACR2 światłem niebieskim wyciszyła neurony HC. W rezultacie, muchy nie wykazywały znaczącej preferencji temperaturowej, co sugeruje skuteczne hamowanie optogenetyczne. Oprócz oceny funkcji neuronów czuciowych, ekspresja GtACR2 w neuronach czuciowych umożliwia podobne manipulacje optogenetyczne w celu zbadania obwodów neuronalnych niezbędnych dla określonych modalności sensorycznych5.
Receptor smakowy GR66a u Drosophila jest wyrażany w palpach wargowych na dystalnym końcu trąbki i na nogach, pośrednicząc w wykrywaniu gorzkiego smaku12,13. Neurony te wyzwalają zachowania unikające w odpowiedzi na gorzkie substancje. W podejściu 2 użyliśmy testu preferencji pozycyjnej optogenetycznej dla pojedynczej muchy z czerwonym światłem, aby manipulować neuronami wykazującymi ekspresję GR66a. Poprzez ekspresję CsChrimson w tych neuronach, aktywowaliśmy je po ekspozycji na światło czerwone. Muchy umieszczono na arenie, z której jedna połowa była wystawiona na działanie czerwonego światła, a druga połowa filtrowała czerwone światło. Przy braku czerwonego światła muchy nie wykazywały preferencji. Jednak aktywacja CsChrimson światłem czerwonym stymulowała neurony wyczuwające gorycz, co skutkowało znacznym unikaniem oświetlonego obszaru, potwierdzając udaną optogenetyczną aktywację neuronów GR66a. Podobne podejścia zostały zastosowane do zidentyfikowania dalszych obwodów ogniw grzewczych wystarczających do zachowania unikania5.
Skupiliśmy się na optogenetycznej aktywacji zachowań apetytywnych w podejściu 3. Neurony wykazujące ekspresję GR5a, zlokalizowane w czubku smakowym na etykiecie i nogach, wykrywają cukry i kierują zachowaniami żywieniowymi. Aktywacja tych neuronów wyzwala odpowiedź na rozszerzenie trąbki (PER)14. Użyliśmy testu odpowiedzi na wydłużenie trąbki optogenetycznej w czerwonym świetle, aby aktywować neurony GR5a. Poprzez ekspresję CsChrimson w tych neuronach, stymulowaliśmy je czerwonym światłem. Muchy nie wysuwały trąbki w warunkach oświetlenia pomieszczenia. Jednak aktywacja CsChrimson światłem czerwonym doprowadziła do rozszerzenia trąbki bez słodkiego bodźca, wykazując udaną optogenetyczną aktywację neuronów GR5a. Podejście to zostało wykorzystane do zbadania obwodu neuronalnego, w tym neuronów czuciowych smakowych, neuronów projekcji smaku i neuronów ruchowych trąbki15,16.
W podejściu 4 badaliśmy optogenetyczną aktywację zachowań unikających w grupach much, używając testu optogenetycznego labiryntu much, który był testowany na neuronach GR66a za pomocą czerwonego światła. Muchy umieszczono na przecięciu dwóch rur: jednej oświetlonej światłem czerwonym, a drugiej zacienionej. Ekspresja CsChrimson w neuronach GR66a wywołała unikanie. W przypadku braku czerwonego światła, muchy nie wykazywały preferencji, ale aktywacja czerwonego światła doprowadziła do ekspresji GR66a, aby uniknąć czerwonego światła, co sugeruje pomyślną aktywację szlaku. Testy labiryntu much są szeroko stosowane do badania różnych modalności sensorycznych, w tym temperatury, wilgotności i węchu. W połączeniu z optogenetyką, podejście to jest skuteczne w badaniu zarówno zachowań atrakcyjnych, jak i unikających17,18,19.
Te metody dostarczają powtarzalnego szkieletu do badania optogenetycznej aktywacji i hamowania obwodów nerwowych Drosophila. Wykorzystując kombinację różnych rodopsyn kanałowych i dostępnych testów behawioralnych, to badanie potwierdzające słuszność koncepcji pokazuje skuteczność manipulacji optogenetycznej, dostarczając prostych metod manipulowania funkcjami obwodów nerwowych z potencjalnymi szerszymi zastosowaniami w badaniach neurobiologicznych.

<table><tbody><tr><td>Sterownik LED 1000 mA</td><td>Luxeon Star</td><td>3021-D-E-1000</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Probówki hodowlane VWR, plastikowe, z dwupozycyjnymi nasadkami Filtr</td> długoprzepustowy <td>VWR</td><td>60818-664</td><td></td></tr><tr><td>780 / IR 780 nm 100 mm x 100 mm</td><td>Lee Filters</td><td>BH #LE8744</td><td>Przycięte do około 47 x 100 pasuje do plastikowej osłony</td></tr><tr><td>Agfabric 6,5 stopy x 15 stóp Siatka na owady Siatka ogrodowa do ochrony roślin Warzywa Kwiaty Owoce</td><td>Home Depot</td><td>EIBNW6515</td><td></td></tr><tr><td>Wszystkie trans siatkówkowe</td><td>Aluminiowa płyta Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td></td></tr><tr><td>(30,5 cm x 30,5 cm x 0,6 cm)</td><td>Amazon</td><td></td><td>zakupiony od Amazon</td></tr><tr><td>Czarne plastikowe pudełko</td><td>LI-COR</td><td>929-97101</td><td></td></tr><tr><td>CHLOREK WAPNIA ANHYDRO 25GR</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AC297150250</tr><tr><td>CX405 Kamera ręczna z przetwornikiem CMOS Exmor R</td><td>SONY</td><td>HDR-CX405</td><td></td></tr><tr><td> s &ldquo; Klej szkolny"</td>Alkohol etylowy <td>Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, czysty (200 proof)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło do gorącej płyty Fisherbrand Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>Linia muchowa: Gr5a-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>57592</td><td></td></tr><tr><td>Linia muchowa: Gr66a-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>Linia muchowa: HC-Gal4 (II)</td><td>Dr. Marco Gallio Lab</td><td></td><td>Miły prezent</td></tr><tr><td>Linia muchowa: UAS-CsChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55136</td><td></td></tr><tr><td>Linia muchowa: UAS-GtACR2/TM6B</td><td>Dr. Quentin Gaudry Lab</td><td></td><td>Miły prezent</td></tr><tr><td>Flystuff 62-101 Żółta mąka kukurydziana (11,3 kg), żółta, 11,3 kg / jednostkę</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-101</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff 62-107 Nieaktywne suche drożdże, 10 kg, płatki odżywcze, 10 kg/jednostkę</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-107</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 mesh, 5 kg (11,02 lbs)/szt.</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>FreeMascot OD 8+ 190 nm&ndash; 420 nm / 600 nm&ndash; Długość fali 1100 nm Fioletowe / czerwone / podczerwone laserowe okulary ochronne&nbsp;</td><td>Bezpłatna maskotka&nbsp;</td><td>B08LGMQ65S</td><td>zakupiony od Amazon</td></tr><tr><td>GoPro Hero8 Black</td><td>GoPro</td><td>6365359</td><td></td></tr><tr><td>filtry LEE 100 i razy; 100 mm Infra Red #87 Filtr poliestrowy na podczerwień</td><td>B& H Photo</td><td>LE8744</td><td></td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy, kolorowe szkło, 50.8 x 50.8 mm, 830 nm Cut-on, RG830</td><td>Newport</td><td>FSQ-RG830</td><td></td></tr><tr><td>4-hydroksybenzoesan metylu, 99%, Thermo Scientific Chemicals</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>126960025</tr><tr><td>MicroWell Mini Taca 60 dołków, niskoprofilowa NS PS</td><td>Thermal Scientific&nbsp;</td><td>NUNC 439225</td><td>Pokrywki są używane jako "plastikowa osłona"</td></tr><tr><td>Olympus Plastics 24-160RS, 1000 i mikro; L Ergonomiczne końcówki do pipet Olympus Low Binding, Racked, Sterylne, 8 stojaków po 96 końcówek/jednostkę</td><td>Eppendorf</td><td>24-160RS</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Folia uszczelniająca</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS234526B</td><td>4 cale x 125 stóp</td></tr><tr><td>Chlorek potasu, ACS, 99,0-100,5%,&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>AA1159530</tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>Version 9</td><td>oprogramowanie do analizy danych</td></tr><tr><td>Samco Pipety z podziałką</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>225</td><td>Szkiełka podstawowe 3 ml</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td>&nbsp; 5 mm x 75 mm x 1,0 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>OLYMPUS</td><td>CZ61</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko styropianowe (27 cm wysokości i razy; 22 cm szerokości i razy 16 cm długości)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>225911</td><td></td></tr><tr><td>Sonda temperatury powierzchni</td><td>Fluke</td><td>80PK-3A</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD Integra</td><td>305270</td><td></td></tr><tr><td>Tate & Lyle 457 Dekstroza, Tate & Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 Dekstroza, Tate & Lyle, proszek, 50 funtów / jednostkę</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-113</td><td></td></tr><tr><td>Identyfikowalny kalibrowany termometr termoparowy z dużymi cyframi</td><td>Identyfikowalny przez cple-parmer</td><td>&nbsp; UX-91210-07</td><td>Fisherbrand Identable BigDigit Type K Termometr</td></tr><tr><td>Potrójne niebieskie diody LED na prawą burtęDostawa</td><td></td><td>07007-PB000-D</td><td>470 nm</td></tr><tr><td>Potrójna czerwona dioda LED na prawą burtęZasilacz</td><td></td><td>07007-PD000-F</td><td>627 nm</td></tr><tr><td>Przezroczysta rurka PVC Tygon 1/4" ID, 3/8" OD, 5 stóp Długość&nbsp;</td><td>Firma zaopatrzeniowa McMaster Carr&nbsp;</td><td>6516T21&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz podczerwieni Univivi, 850nm 12 diod LED Szerokokątny oświetlacz podczerwieni do noktowizora</td><td>Univivi</td><td>4331910725</td><td></td></tr><tr><td>Wakefield Termiczny okrągły radiator 25,4 mm Gwiazda LED - 882-100AB</td><td>Wakefield-Vette</td><td>882-100AB</td><td></td></tr><tr><td>Bezprzewodowy prezenter</td><td>DinoFire Store</td><td>B01410YNAM</td><td>zakupiony w Amazon</td></tr></tbody></table>

testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u drosophila melanogaster

Behavioral Assays for Optogenetic Manipulation of Neural Circuits in Drosophila melanogaster

Optogenetyka stała się podstawową techniką w neurobiologii, umożliwiając precyzyjną kontrolę aktywności neuronalnej poprzez stymulację światłem. W niniejszym badaniu przedstawiono łatwe do wdrożenia konfiguracje do stosowania metod optogenetycznych u Drosophila melanogaster. Dwa narzędzia optogenetyczne, CsChrimson, kanał kationowy aktywowany światłem czerwonym i GtACR2, kanał anionowy aktywowany światłem niebieskim, zastosowano w czterech podejściach eksperymentalnych. Trzy z tych podejść obejmują eksperymenty na pojedynczej muchy: (1) optogenetyczny test preferencji położeniowej termotaktycznej światła niebieskiego ukierunkowany na wrażliwe na temperaturę komórki grzewcze, (2) test preferencji pozycyjnej optogenezy światła czerwonego aktywujący neurony wyczuwające gorycz oraz (3) test odpowiedzi na rozszerzenie trąbki aktywujący neurony wyczuwające słodycze. Czwarte podejście (4) to konfiguracja labiryntu much w celu oceny zachowań unikających przy użyciu wielu much. Możliwość manipulowania aktywnością neuronalną w czasie i przestrzeni oferuje potężny wgląd w przetwarzanie sensoryczne i podejmowanie decyzji, podkreślając potencjał optogenetyki w pogłębianiu naszej wiedzy na temat funkcji neuronalnych. Metody te zapewniają dostępne i solidne ramy dla przyszłych badań w neuronauce w celu lepszego zrozumienia określonych ścieżek neuronowych i ich wyników behawioralnych.

Test preferencji pozycyjnej termotaktycznej pojedynczej muchy z wykorzystaniem optogenetyki światłem niebieskim 
Przetestowano cztery warunki: światło pokojowe bez suplementacji ATR (room light, ATR -), światło pokojowe z suplementacją ATR (room light, ATR +), światło niebieskie bez suplementacji ATR (blue, ATR -) oraz światło niebieskie z suplementacją ATR (blue, ATR +). Pierwsze trzy warunki służyły jako kontrole. W eksperymentach kontrolnych muchy unikały strony o temperaturze 31 °C. W warunkach św...

Ten artykuł przedstawia metody manipulacji optogenetycznej u Drosophila melanogaster, wykorzystując CsChrimson i GtACR2 do aktywacji i wyciszania określonych neuronów. Opisano cztery eksperymenty wykorzystujące optogenetykę do badania zachowań termotaktycznych i smakowych, dostarczając wglądu w podstawowe mechanizmy neuronalne rządzące tymi procesami.

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study ...

W naszych badaniach wykorzystujemy narzędzia optogenetyczne do zbadania, w jaki sposób obwody neuronalne u Drosophila melanogaster regulują zachowania, takie jak termotaksja i ciąża. Kontrolując określone neurony za pomocą światła, staramy się zrozumieć, w jaki sposób te obwody napędzają reakcje sensoryczne i wpływają na podejmowanie decyzji z dużą precyzją. Optogenetyka to cenna technologia w neurobiologii, oferująca precyzyjną kontrolę aktywności neuronalnej za pomocą światła.U Drosophila melanogaster narzędzia takie jak CsChrimson i GtACR2 umożliwiają ukierunkowaną aktywację i hamowanie neuronów. Narzędzia te pozwalają naukowcom manipulować obwodami neuronalnymi, badać zachowania i badać reakcje czujników z wysoką specyficznością. Nasz protokół oferuje proste, opłacalne i powtarzalne podejście do manipulacji optogenetycznej u Drosophila.Wykorzystuje materiały dostępne na rynku, dzięki czemu jest dostępny w laboratoriach i salach lekcyjnych o ograniczonych zasobach. Metody te są również wysoce elastyczne, umożliwiając badanie zachowań atrakcyjnych i unikających przy minimalnych wyzwaniach technicznych. Na początek uzyskaj samce i samice much Drosophila, wyrażające GtACR2 w komórkach grzewczych.Wyrównaj dwie stalowe płyty na oddzielnych płytach grzejnych tak, aby ich krawędzie się stykały. Umieść plastikową osłonę arkusza na górze i zabezpiecz ją taśmą, aby zminimalizować ruch. Teraz umieść kawałek białego papieru na ochraniaczu arkusza, aby zredukować sygnały szumów tła, i umieść przezroczystą plastikową osłonę na białym papierze.Następnie wytnij otwór w dnie pudełka z pianki polistyrenowej, aby pomieścić kamerę i niebieskie światło około 12 centymetrów nad powierzchnią eksperymentalną. Ustaw kamerę i niebieskie światło, aby zminimalizować odblaski, zapewniając jednocześnie aktywację. Ustaw kamerę tak, aby nagrywała z jednosekundowym upływem czasu, wąskim polem i rozdzielczością 4 000 na 3 000 pikseli.Dostosuj ustawienia płyty grzejnej, aby utrzymać temperaturę powierzchni 25 plus minus jeden stopień Celsjusza i 31 plus minus jeden stopień Celsjusza na odpowiednich płytach stalowych. Monitoruj temperaturę blach stalowych za pomocą sondy temperatury powierzchni przed i po każdej próbie. Następnie umieść plastikową osłonę na stalowej płycie o temperaturze 25 stopni Celsjusza.Teraz za pomocą aspiratora much delikatnie wypuść pojedynczą muchę pod pokrywę. Umieść pudełko nad obszarem eksperymentalnym, aby wytworzyć słabe światło poniżej 10 luksów i pozwól muszce zaaklimatyzować się przez minutę. Po okresie aklimatyzacji podnieś pudełko i szybko wyreguluj plastikową pokrywę tak, aby środek pokrywy zrównował się z granicą płyty stalowej.Rozpocznij próbę, włącz kamerę i niebieskie światło o natężeniu 20 kiloluksów. Uchwyć aktywność much przez dwie minuty. Po dwóch minutach wyłącz aparat i światło.Wyrzuć muchy za pomocą aspiratora. Znieczulenie wygłodzonych samców i samic much wykazujących ekspresję CsChrimson w neuronach receptorów słodkiego smaku na lodzie. Nałóż od siedmiu do 10 małych kropek kleju na szklane szkiełko.Umieść jedną muchę brzuszną stroną do góry na każdej kropce kleju, upewniając się, że klatka piersiowa i skrzydła stykają się z klejem, aby zminimalizować ruch. Rozchyl skrzydła na każdą stronę, aby zwiększyć powierzchnię kleju. Umieść mokre ręczniki papierowe w pojemniku na wilgoć i przenieś szkiełka do pudełka.Po dwóch godzinach rekonwalescencji umieść szkiełko pod mikroskopem. Użyj strzykawki, aby dostarczyć kroplę wody, aby nasycić muchy, zapobiegając rozszerzeniu się trąbki wywołanemu pragnieniem. Ręcznie przytrzymaj czerwony wskaźnik laserowy i świec czerwonym światłem na trąbkę lub głowę pojedynczej muchy o natężeniu 700 luksów.Obserwuj reakcję na wyprost trąbki przez mikroskop w ciągu 30 sekund. Po przetestowaniu wywołanego światłem wydłużenia trąby, zbadaj reakcję na 4% sacharozy. Usunąć kroplę sacharozy na końcu igły strzykawki i zbliżyć ją do trąbki muchy.Najpierw złóż labirynt much do eksperymentu. W ciemności lub przy słabym oświetleniu umieść 10 samców i 10 samic much odciągających ekspresję CsChrimson w rurze załadowczej i podłącz ją do komory przetrzymu. Przechyl windę i delikatnie postukaj w rurkę, aby przenieść muchy do komory przetrzymywania.Po przeniesieniu much do komory przetrzymującej, należy za pomocą windy opuścić je między rurę załadowczą a otwory probówki testowej. Następnie wyjmij rurkę ładującą. Umieść labirynt much w odległości około 13 centymetrów od źródła czerwonego światła o natężeniu 1 000 miliamperów bez włączania światła.Opuść windę, aż komora trzymająca zrówna się z otworami probówek, umożliwiając muchom swobodne poruszanie się między owiniętymi folią i odkrytymi probówkami testowymi. Jednocześnie włącz czerwone światło o natężeniu około 40 kiloluksów, aby aktywować CsChrimson. Pozwól muchom wybrać między rurką naświetlaną na czerwone światło a rurką zacienioną przez minutę.Po minucie podnieś podnośnik między rurą załadowczą a otworami rury testowej. Usuń muchy z każdej tuby. Policz je i zapisz liczby.Po każdej próbie wyczyść windę i labirynt muchowy za pomocą wody destylowanej. W teście preferencji położeniowej w świetle niebieskim, optogenetycznym, termotaktycznym, muchy unikały strony 31 stopni Celsjusza w warunkach kontrolnych, podczas gdy w świetle niebieskim z suplementacją ATR muchy nie wykazywały preferencji między 25 a 31 stopniami Celsjusza, co wskazuje na hamowanie neuronów HC poprzez aktywację GtACR2. W warunkach kontrolnych muchy wykazywały minimalną odpowiedź na wydłużenie trąbki, podczas gdy aktywacja światłem czerwonym z suplementacją ATR skutkowała znacznym wydłużeniem trąbki, demonstrując aktywację neuronów wyczuwających słodycz przez CsChrimson.W teście labiryntu much, optogenetycznym, grupy kontrolne nie wykazały preferencji, podczas gdy aktywacja czerwonego światła z suplementacją ATR spowodowała, że muchy unikały odkrytej rurki, co wskazuje na aktywację neuronów przez CsChrimson w gorzkim wyczuwaniu.

behavioral-assays-for-optogenetic-manipulation-neural-circuits

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Optogenetyka umożliwia użycie światła do manipulowania neuronami, które są genetycznie modyfikowane do wyrażania specyficznych opsyn, wrażliwych na światło białek, których aktywacja światłem powoduje zmianę stanu neuronu. Tutaj opisujemy podejście optogenetyczne u Drosophila przy użyciu opsyny Channelrhodopsin2. Przykładowy protokół zawiera test optogenetyczny ustawiony do badania obwodów neuronalnych stojących za zachowaniem ucieczki muchy.

Drosophila Optogenetyka: metoda manipulowania obwodami neuronalnymi

Ten film pokazuje badanie zachowania nawigacyjnego larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację węchowych neuronów czuciowych (ORN). Transgeniczne larwy Drosophila wykazujące ekspresję światłoczułych kanałów jonowych w ORN są umieszczane na agarozie w obrębie areny behawioralnej. Stymulacja optogenetyczna światłem otwiera kanały, powodując napływ kationów, który wyzwala przekazywanie sygnału do mózgu, a zachowanie nawigacyjne jest rejestrowane.

Zachowania nawigacyjne larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację węchowych neuronów czuciowych

Genetycznie kodowane narzędzia optogenetyczne umożliwiają nieinwazyjną manipulację specyficznymi neuronami w mózgu Drosophila. Takie narzędzia mogą identyfikować neurony, których aktywacja jest wystarczająca do wywołania lub stłumienia określonych zachowań. W tym miejscu przedstawiamy metodę aktywacji rodopsyny kanałowej2, która ulega ekspresji w docelowych neuronach u swobodnie chodzących muszek.

Optogenetyczna stymulacja zachowań ucieczkowych u Drosophila melanogaster

Tutaj opisujemy test preferencji jasno-ciemnej dla larw Drosophila. Test ten dostarcza informacji na temat wrodzonej i okołodobowej regulacji wykrywania światła i przetwarzania fotozachowania.

Test preferencji świetlnej w celu zbadania wrodzonego i okołodobowego regulowanego fotozachowania u larw Drosophila

Tutaj opisujemy protokół optogenetycznej manipulacji aktywnością motoneuronalną podczas monitorowania zmian w wydatkach motorycznych (skurczu mięśni) u częściowo nienaruszonych larw Drosophila za pomocą laserów w konwencjonalnym mikroskopie konfokalnym. Technika ta umożliwia naukowcom osiągnięcie lokalnych zaburzeń aktywności neuronalnej w kilku neuromerach, aby wyjaśnić dynamikę obwodów motorycznych.

Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu

W tym artykule wideo opisujemy zautomatyzowany test do pomiaru wpływu głodu lub sytości na zależne od węchu zachowanie związane z poszukiwaniem pokarmu u dorosłej muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

Opisujemy tutaj konfigurację behawioralną i metodę analizy danych do oceny reakcji węchowych do 100 muszek octowych (Drosophila melanogaster). System ten może być stosowany z pojedynczymi lub wieloma bodźcami węchowymi i może być przystosowany do optogenetycznej aktywacji lub wyciszania podzbiorów neuronów.

Zachowania węchowe oceniane za pomocą komputerowego śledzenia Drosophila w czterokwadrantowym olfaktometrze

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Ten protokół wprowadza test plamki świetlnej do zbadania fototaktycznego zachowania larw Drosophila. W tym teście plamka świetlna jest generowana jako stymulacja światłem, a proces unikania światła larwalnego jest rejestrowany przez system obrazowania oparty na świetle podczerwonym.

Test punktowy świetlny do analizy fototaksji larw Drosophila

Obecny protokół opisuje wytwarzanie opsyn Drosophila melanogaster wykazujących ekspresję opsyn eNpHR2.0 lub ReaChR w sercu do obrazowania OCT i optogenetycznej stymulacji serca. Podano szczegółowe instrukcje dotyczące obrazowania OCT Drosophila i modulacji bicia serca, w tym symulacji możliwego do przywrócenia zatrzymania akcji serca, bradykardii i tachykardii u żywych zwierząt na różnych etapach rozwoju.

Opracowanie modeli Drosophila melanogaster do obrazowania i optogenetycznej kontroli funkcji serca

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

Poznaj metody optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster. Wykorzystaj narzędzia CsChrimson i GtACR2 do badania termotaksji i zachowań smakowych z precyzją.

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów