Name: Model pęcherza moczowego in vitro infekcji dróg moczowych związanej z cewnikiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj model pęcherza moczowego in vitro do badania zakażeń dróg moczowych związanych z cewnikiem i oceny działania środków przeciwdrobnoustrojowych na biofilm bakteryjny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Jonathanowi Nzakizwanayo i Dr. Anthony'emu J. Slate'owi za ich wspólną wiedzę w rozwijaniu tego protokołu. Praca na Uniwersytecie w Bath została sfinansowana przez Radę Badań Medycznych GW4 Biomed DTP jako stypendium dla V.B. (MR/N0137941/1). B. V. J. jest również wspierany przez fundusze z Dunhill Medical Trust (RPGF1906\171). Badania przeprowadzone przez O.E.C. zostały sfinansowane przez Kidney Research Northwest (RCN: 1144798). Rysunek 1 jest tworzony za pomocą Biorender.com.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Cewnikowane drogi moczowe stanowią złożoną niszę biologiczną, która może być trudna do odtworzenia w środowisku laboratoryjnym. Model pęcherza moczowego in vitro został zaprojektowany w celu symulacji CAUTI i wykorzystuje standardowe cewniki moczowe do odtworzenia sterylnego, zamkniętego systemu drenażu stosowanego w praktyce klinicznej. Cewnikowane drogi moczowe są bardzo podatne na infekcje, o czym świadczą cewniki moczowe będące największym pojedynczym czynnikiem ryzyka rozwoju CAUTI 6,55. Proporcjonalnie, staranna technika aseptyczna ma kluczowe znaczenie dla powodzenia badania modeli pęcherza in vitro. Zmętnienie AUM jest wyraźnym wskaźnikiem sterylności, ponieważ zanieczyszczone lub przeterminowane pożywki z czasem staną się mętne, co będzie wymagało wyrzucenia wszystkich powtórzeń. Podczas zaszczepiania i pobierania próbek z modelu pęcherza moczowego in vitro należy również stosować staranną technikę aseptyczną, ponieważ otwarcie centralnej komory w celu dodania przygotowanego inokulum przerywa sterylny, zamknięty system drenażowy, co sprawia, że model pęcherza in vitro jest podatny na zanieczyszczenie. Aby uniknąć zanieczyszczenia komory centralnej, cewniki o potrójnym prześwicie mogą być używane do pobierania próbek populacji komórek planktonowych (poprzez zaciśnięcie światła odpadowego i opróżnienie przez dodatkowe światło). Oczekuje się, że w ciągu 4 godzin nastąpi pewne wypłukanie, ale może być konieczne rozwiązywanie problemów, jeśli w tym momencie nie zostaną wyliczone żadne żywotne komórki planktonowe. Jeśli po 4 godzinach nie zostaną zliczone żadne żywe komórki, może być konieczne zoptymalizowanie gęstości inokulum lub preparatu AUM, aby lepiej wspierać kolonizację bakteryjną. Dodatkowo, wypłukiwanie inokulum może wskazywać na problem z obwodem pożywki; Załamania w rurkach mogą uniemożliwić odpowiedni drenaż, powodując gromadzenie się toksycznych metabolitów, które mogą utrudniać rozwój bakterii, podczas gdy wszelkie resztki środka dezynfekującego używane do przepłukiwania przewodów mediów mogą mieć działanie bakteriobójcze.
Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie AUM, jak wcześniej opisali Nzakizwanayo i wsp., ponieważ został on wcześniej zatwierdzony do stosowania w modelu pęcherza in vitro z widocznymi patogenami CAUTI, w tym Proteus mirabilis i Escherichia coli 43,45,46,48 . Istnieje jednak możliwość modyfikacji preparatu AUM zastosowanego w protokole w celu selekcji pod kątem wzrostu innych patogenów. Opublikowano wiele różnych formuł AUM, które mogą być stosowane w obiegu medialnym 28,56,57,58,59,60. Dodatkowo AUM w zbiorniku pożywki może być uzupełniany składnikami odżywczymi lub antybiotykami w celu selekcji do wzrostu określonych patogenów. Historycznie rzecz biorąc, modele pęcherza moczowego in vitro były również dostarczane z kałużą ludzkiego moczu, jednak duże ilości pożywki wymagane do przeprowadzenia replikacji modelu pęcherza in vitro mogą sprawić, że pobieranie próbek ludzkich będzie niepraktyczne53,54. Co więcej, skład ludzkiego moczu może się znacznie różnić między próbkami pobranymi od pacjentów, wpływając na odtwarzalność eksperymentu, ponieważ wykazano, że różnice w stężeniu hormonów, soli i białek, a także stan nawodnienia, wpływają na wzrost bakterii i tworzenie biofilmu 38,39,61,62.
Powyższy protokół szczegółowo opisuje inokulację modelu pęcherza in vitro za pomocą ~1010 CFU/ml replikujących CAUTI w późnym stadium. Jednak miejsce inokulacji modelu pęcherza moczowego in vitro może zostać zmodyfikowane w przyszłych testach, aby lepiej odtworzyć wcześniejsze etapy CAUTI, tj. początkową kolonizację cewnika moczowego i wzniesienie do pęcherza moczowego. Ręczne zanieczyszczenie cewników Foleya znanym inokulum bakteryjnym przed skonfigurowaniem modeli in vitro może dostarczyć informacji na temat wczesnych stadiów CAUTI. Rzeczywiście, gęstość inokulum została zmodyfikowana w poprzednich pracach w celu odtworzenia infekcji we wcześniejszym stadium; na przykład Nzakizwanayo i wsp. inokulowane modele pęcherza moczowego in vitro z niższym wyjściowym CFU/ml (ok. 103 CFU/ml) w celu replikacji infekcji we wcześniejszym stadium47. Warto jednak zauważyć, że zmiana gęstości inokulum może spowodować wydłużenie czasu do zablokowania i wymaga dodatkowej walidacji przed eksperymentami.
Ponadto, podczas gdy protokół szczegółowo opisuje inokulację modelu in vitro monokulturą bakteryjną, istnieje możliwość inokulacji modeli patogenami grzybowymi. Wcześniejsze badania sugerowały, że do 8% CAUTI wynika z zakażenia Candida spp., który jest zdolny do wytwarzania biofilmów, które często są oporne na leczenie przeciwgrzybicze27,63. Co więcej, model pęcherza moczowego in vitro może być modyfikowany w celu uwzględnienia badania wielodrobnoustrojowego CAUTI. Rzeczywiście, zasugerowano, że do 86% CAUTI to infekcje wielodrobnoustrojowe, a infekcje te często wiążą się z poważniejszymi objawami i wyższą śmiertelnością niż infekcje jednogatunkowe 27,64,65,69. Modele in vitro mogą być inokulowane wieloma gatunkami w celu zbadania powstawania biofilmów polimikrobiologicznych i progresji CAUTI, ale przed inokulacją należy przeprowadzić staranną walidację społeczności polimikrobiologicznych i modyfikację gęstości inokulum. W poprzednich badaniach wykorzystano model pęcherza in vitro do monitorowania różnic w tworzeniu biofilmu u pojedynczych gatunków P. mirabilis CAUTI w porównaniu z dwugatunkowymi CAUTI z E. faecalis, podkreślając wzajemne oddziaływanie metaboliczne między szczepami, co skutkowało zwiększonym tworzeniem biofilmu w porównaniu z infekcją pojedynczym gatunkiem70.
Główną zaletą wykorzystania modelu pęcherza moczowego in vitro do badania CAUTI, jest możliwość obserwacji powstawania biofilmu na powierzchni standardowego cewnika moczowego. Tworzenie biofilmów w CAUTI jest często inicjowane przez tworzenie się filmów kondycjonujących na świetle cewnika, składających się z organicznych składników moczu, do których mogą przylegać uropatogeny, przed proliferacją i utworzeniem dojrzałych biofilmów 2,18,71,72,73 . Standardowe testy stosowane do badania tworzenia biofilmu często wykorzystują standardowe pożywki bakteryjne zamiast AUM i często opierają się na przyleganiu do mikropłytek lub kołków polistyrenowych, tj. urządzenia z Calgary; jednak wcześniejsze prace sugerowały, że środowisko odżywcze, pH i poziom tlenu w systemie, a także właściwości fizyczne, takie jak przepływ i różnica w strukturze powierzchni (silikon kontra tworzywa sztuczne), mogą wpływać na tworzenie biofilmu 36,37,74,75,76,77,78. Dodatkowo, hodowla bakterii o dużej aktywności ureazy, takich jak P. mirabilis w systemie zamkniętym w AUM, może powodować gromadzenie się toksycznych metabolitów, co może prowadzić do śmierci komórki78,79. Jest to złagodzone w modelu pęcherza in vitro, ponieważ AUM w komorze centralnej jest stale zastępowane świeżymi pożywkami za pośrednictwem obwodu pożywki, co pozwala na badanie biofilmów CAUTI w bardziej istotnych klinicznie warunkach45. Codzienny przebieg modelu pęcherza moczowego in vitro i punkt końcowy wybrany dla modeli w dużej mierze zależy od tego, czy modele są inokulowane organizmami ureazowo-dodatnimi czy ujemnymi. Teoretycznie modele in vitro mogą działać w nieskończoność, jeśli są dostarczane z odpowiednią ilością AUM i jeśli zachowana jest sterylność modelu; Zaleca się jednak, aby przed eksperymentowaniem wybrać punkt końcowy, niezależnie od tego, czy jest to blokada, czy dowolna liczba dni. Ogólnie zaleca się, aby modele in vitro zaszczepione organizmami ureazowo-ujemnymi były uruchamiane przez ≤7 dni w celu symulacji środowiska klinicznego, ponieważ jest to zazwyczaj wystarczające do zaobserwowania tworzenia się biofilmu w większości organizmów, przy jednoczesnym zachowaniu zgodności z interwencjami klinicznymi, ponieważ standardowa najlepsza praktyka wskazuje, że cewniki należy wymienić po widocznym zakażeniu1, 2,3,47,48. Chociaż organizmy ureazowo-dodatnie mogą wytwarzać krystaliczne biofilmy, istnieje duża zmienność wśród szczepów ureazo-dodatnich w czasie do zablokowania modelu pęcherza in vitro, przy czym niektóre szczepy Proteus mirabilis powodują zablokowanie cewnika w czasie krótszym niż 10 godzin, a inne potrzebują ponad 30 godzin na zablokowanie39,46. Standardowy test ureazy może być stosowany przed eksperymentami z modelami pęcherza in vitro w celu określenia, czy należy uruchomić modele do zatkania, czy też do wstępnie zdefiniowanego punktu końcowego80.
Być może głównym ograniczeniem stosowania modelu pęcherza moczowego in vitro do badania tworzenia biofilmu jest to, że pomiary biofilmu są odczytem końcowym, ponieważ wymagają usunięcia i wypreparowania cewnika moczowego. I odwrotnie, próbki planktonu można pobrać z modelu pęcherza in vitro w dowolnym momencie podczas eksperymentów. Dodatkowo, po pobraniu próbek biofilmu z modeli pęcherza moczowego in vitro, można zastosować wiele dodatkowych technik dalszych w celu lepszego ilościowego określenia produkcji biofilmu. W poprzednich badaniach wykorzystano fotometrię płomieniową do ilościowego określenia ilości wapnia i magnezu obecnych w krystalicznych biofilmach, a bardziej złożone barwienia można wykorzystać do dokładnej identyfikacji składników matrycy EPS biofilmów ureazowo-ujemnych 45,73,81,82,83,84.
W pracy opisano również zastosowanie modelu pęcherza moczowego in vitro do badania efektów terapii ukierunkowanych na leczenie CAUTI. Model pęcherza moczowego in vitro symuluje ważne aspekty niszy CAUTI, takie jak zastosowanie AUM, a także klinicznie istotne tworzenie biofilmu i zwiększone obciążenie organiczne obserwowane w CAUTI. Środki terapeutyczne, takie jak antybiotyki, mogą być dodawane bezpośrednio do zbiornika AUM, aby symulować klinicznie istotną biodostępność leku, a wcześniejsze badania wykorzystywały leki o zmienionym przeznaczeniu, takie jak tiorydazyna i fluoksetyna, aby wykazać działanie przeciwbiofilmowe81. Ponadto testy minimalnego stężenia hamującego i testy zawiesiny bakteryjnej są często stosowane w celu wywnioskowania aktywności przeciwdrobnoustrojowej biocydów, chociaż istnieje niewiele dowodów sugerujących, że testy korelują z wrażliwością biocydów w świecie rzeczywistym 41,85,86,87,88. Model pęcherza moczowego in vitro jest korzystny dla testowania produktów biobójczych mających na celu leczenie lub zapobieganie CAUTI, ponieważ obecność cewnika moczowego i bardziej reprezentatywna symulacja niszy CAUTI oznaczają, że produkty takie jak przeciwdrobnoustrojowe żele smarowe i roztwory do irygacji mogą być testowane zgodnie z instrukcjami producenta. W poprzednich badaniach wykorzystano również model pęcherza in vitro w celu określenia skuteczności terapii fagowej i wykazano, że leczenie fagami może wydłużyć czas blokowania modelu pęcherza in vitro o ponad 100 godzin47. Zastosowanie cewnika Foleya o standardowej wielkości w modelu pęcherza moczowego in vitro oznacza również, że nowatorskie, powlekane cewniki mogą być testowane pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Wcześniejsze prace Slate i wsp. wykazano, że cewniki pokryte teranotyczną powłoką cyprofloksacyny mogą wydłużyć czas do zablokowania P. mirabilis o ~60 godzin w pęcherzu in vitro model48. Podkreśla to potencjalne zastosowanie modelu pęcherza moczowego in vitro w badaniach nad nowymi terapiami mającymi na celu leczenie CAUTI, co pozwoli na dokładniejszą ocenę środków przeciwdrobnoustrojowych w biologicznie istotnej symulowanej niszy CAUTI.

Cewniki moczowe są jednymi z najczęściej stosowanych urządzeń medycznych, z szacowanym rozpowszechnieniem 19% w placówkach intensywnej terapii1,2,3. Cewniki są stosowane przede wszystkim w celu pomocy w zarządzaniu wydalaniem moczu w przypadku dysfunkcji pęcherza moczowego i są wprowadzane bezpośrednio do pęcherza, umożliwiając oddawanie moczu z pęcherza przez centralny lumen2,3. Cewniki moczowe mogą być używane z przerwami, gdzie są okresowo wprowadzane do pęcherza moczowego w celu odprowadzenia moczu, lub można stosować cewniki na stałe, w których cewniki są pozostawiane na miejscu w pęcherzu moczowym w celu ciągłego odprowadzania moczu3,4. Pomimo ich powszechnego stosowania, cewniki moczowe są największym czynnikiem ryzyka rozwoju zakażeń dróg moczowych (ZUM), które stanowią około jednej piątej zakażeń związanych z opieką zdrowotną5,6. Rzeczywiście, sam cewnik często działa jako początkowe miejsce kolonizacji drobnoustrojów, zapewniając powierzchnię dla uropatogenów, do których mogą przylegać i dalej kolonizować drogi moczowe1,6,7,8. Praktycznie wszyscy pacjenci poddawani długotrwałemu ciągłemu cewnikowaniu (gdzie cewnik pozostaje na miejscu przez ≥28 dni) doświadczą bakteriurii, przy czym ryzyko wzrasta o ~5% na każdy dzień, w którym cewnik znajduje się na miejscu2,9,10,11. Proporcjonalnie, około 80% infekcji dróg moczowych jest związanych z użyciem cewnika moczowego6.
Zakażenia dróg moczowych związane z cewnikiem (CAUTIs) stanowią znaczne obciążenie dla służby zdrowia i często wiążą się z poważniejszymi objawami górnego odcinka przewodu moczowego (takimi jak zapalenie moczowodu i odmiedniczkowe zapalenie nerek) niż niepowikłane ZUM, a także zwiększonym ryzykiem wtórnych infekcji krwi1,7,12,13,14. Standardowe leczenie CAUTI obejmuje antybiotykoterapię, jednak infekcje te są często oporne na leczenie przeciwbakteryjne w wyniku rozwoju złożonych zbiorowisk biofilmu na powierzchni cewnika15,16,17,18,19,20. Rzeczywiście, szacuje się, że ~80% CAUTI wynika z patogenów dróg moczowych tworzących biofilm19. Tworzenie biofilmu charakteryzuje się przyłączaniem komórek bakteryjnych do powierzchni cewnika i rozwojem zbiorowisk osadzonych w rozległej matrycy zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS)21,22,23,24. Produkcja EPS jest cechą charakterystyczną społeczności biofilmu i jest odpowiedzialna za wiele wyłaniających się właściwości wykazywanych przez komórki związane z biofilmem, takich jak podwyższona odporność na środki przeciwdrobnoustrojowe i klirens immunologiczny21,22,24. EPS może odgrywać bezpośrednią rolę w tych fenotypach, fizycznie osłaniając komórki i chroniąc je przed środkami przeciwdrobnoustrojowymi lub efektorami immunologicznymi, a także pośrednio ułatwiając rozwój szerszych aspektów zbiorowisk biofilmu, takich jak fizykochemiczne mikrośrodowisko biofilmu i tworzenie trwałych komórek23,24,25,26. Co więcej, niektóre uropatogeny, w tym Proteus spp., które stanowią ~11% CAUTI, posiadają silne enzymy ureazy, umożliwiające im hydrolizę mocznika obecnego w moczu i powodujące ogólny wzrost pH moczu 2,27,28,29,30. Wzrostowi pH towarzyszy wytrącanie się kryształów fosforanu wapnia i magnezu, które mogą zostać włączone do rosnącego biofilmu, co powoduje biomineralizację i tworzenie gęstych krystalicznych struktur biofilmu, które mogą blokować cewniki. Te krystaliczne biofilmy nie tylko sprawiają, że leczenie jest problematyczne, ale mogą również inicjować poważne powikłania, takie jak odmiedniczkowe zapalenie nerek i posocznica2,28,31,32,33,34.
Złożona nisza środowiskowa w cewnikowanych drogach moczowych i ważna rola tworzenia biofilmu w tych infekcjach, stanowią szczególne wyzwanie w badaniu patogenezy CAUTI. Proste i szeroko stosowane modele laboratoryjne do badania i ilościowego określania powstawania biofilmu, takie jak testy na 96-dołkowych płytkach, są nieodpowiednie do badania tworzenia biofilmu w CATUI, w szczególności biofilmów krystalicznych. Na przykład takie modele nie uwzględniają kluczowych aspektów niszy CAUTI, takich jak złożone środowisko odżywcze dostarczane przez mocz, sposób, w jaki powierzchnia cewnika wpływa na adhezję i późniejszą produkcję biofilmu oraz ciągły przepływ pożywki moczu35,36,37,38,39,40. Ponadto standardowe testy stosowane do określania wrażliwości uropatogenów na środki przeciwdrobnoustrojowe często nie odzwierciedlają rzeczywistej podatności klinicznej. Testy minimalnego stężenia hamującego i testy zawiesiny mikrobiologicznej są często stosowane do wnioskowania o podatności patogenów CAUTI na środki przeciwdrobnoustrojowe, ale zazwyczaj nie symulują ważnych zmiennych środowiska CAUTI, takich jak wpływ, jaki obecność cewnika moczowego i późniejsze tworzenie biofilmu może mieć na wrażliwość na środki przeciwdrobnoustrojowe41,42,43.
To badanie szczegółowo opisuje konfigurację i działanie modelu pęcherza in vitro, który symuluje środowisko cewnikowanego układu moczowego i replikuje standardowy system zamkniętego drenażu cewnika, stosowany w praktyce klinicznej, po raz pierwszy opisany przez Stickler et al.44 w 1999 roku (Rysunek 1). Model ten wykorzystuje cewniki Foleya o standardowych rozmiarach (które są obecnie dostępne w łańcuchu dostaw NHS) oraz sztuczne podłoża moczowe (AUM), jak wcześniej opisano przez Nzakizwanayo i wsp.45do symulacji CAUTI i tworzenia biofilmu. Model pęcherza in vitro składa się z dwuściennej szklanej komory, która działa jak "pęcherz" i ma wylot, przez który można wprowadzić cewnik Foleya do centralnej szklanej komory. W górnej części centralnej szklanej komory znajduje się wlot, przez który AUM może być dostarczane do "pęcherza" z biologicznie odpowiednim natężeniem przepływu za pomocą pompy perystaltycznej, która przepływa przez cewnik przez otwory drenażowe do worka na odpady. Dodatkowo komora zewnętrzna podłączona jest do obwodu łaźni wodnej, co pozwala na utrzymanie modeli w stałej temperaturze. Model pęcherza moczowego in vitro może być inokulowany przez centralną komorę, co pozwala na badanie patogenów CAUTI w biologicznie reprezentatywnej niszy. Ponadto, ponieważ modele są cewnikowane i stale zaopatrywane w świeże AUM, można badać wzrost i dynamikę populacji zarówno komórek planktonowych, jak i komórek związanych z biofilmem.
Poprzednie badania wykorzystywały modele pęcherza in vitro do kilku zastosowań, w tym do fundamentalnego badania tworzenia biofilmu u głównych patogenów CAUTI, w tym Proteus mirabilis i Escherichia coli 43,45,46,47,48,49. Dodatkowo, model in vitro został wykorzystany do oceny skuteczności produktów przeznaczonych do kontroli CAUTI lub zapobiegania blokadom50,51,52. Ostatnio modele zostały wykorzystane do określenia, czy adaptacje i mutacje związane z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe wpływają na tworzenie biofilmu i patogenezę CAUTI u P. mirabilis43,46. Model pęcherza moczowego in vitro został również wykorzystany do badania nowych terapii przeciwdrobnoustrojowych mających na celu leczenie CAUTI, w tym nowo opracowanych powłok cewników teranotycznych i terapii fagowej47,48. Protokół ten obejmuje przygotowanie i przeprowadzenie modeli pęcherza moczowego in vitro, zliczenie żywotnych komórek planktonowych i związanych z biofilmem odpowiednio z powierzchni modelu i cewnika moczowego oraz pomiar pH moczu w celu monitorowania produkcji ureazy. Szczegółowo opisano również protokoły oceny produktów przeciwdrobnoustrojowych mających na celu leczenie lub zapobieganie CAUTI, w tym roztworów do irygacji pęcherza moczowego i przeciwdrobnoustrojowych żeli nawilżających, które są obecnie dostępne w łańcuchu dostaw NHS.

<table><tbody><tr><td>313 Przedłużenie głowicy pompy Rapid-Load</td><td>Pompa perystaltyczna Watson-Marlow</td><td>313</td><td>- dodatkowe przedłużenie głowicy&nbsp;</td></tr><tr><td>323S/D Pompa o zmiennej prędkości sterowana ręcznie</td><td>Watson-Marlow</td><td>323S/D</td><td>Pompa perystaltyczna</td></tr><tr><td>3L Worki na łóżka, sterylne z kranami dźwigniowymi&nbsp;</td><td>Opieka zdrowotna dla niedźwiedzi Great Bear&nbsp;</td><td>GDW173</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa utwardzana platyną o średnicy wewnętrznej 3 mm</td><td>Fisher</td><td>10111801</td><td>Rurka z małym obwodem AUM (podłącz rurkę pompy do modeli)</td></tr> <tr><td>Rurka silikonowa utwardzana platyną o średnicy wewnętrznej 5 mm</td><td>Rurka</td><td></td><td>obwodu Fisher 10539201 Medium AUM (podłącz rurkę pompy do zbiornika AUM</td></tr><tr><td>) chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Fisher</td><td>11473713</td><td></td></tr><tr><td>bezwodny siarczan sodu (Na2SO4)</td><td>Złącze</td><td></td> stożkowe Fisher 11498717 <td></td></tr><tr><td>Azlon&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>10712807</td><td>Służy do łączenia różnych długości przewodów w obwodzie AUM</td></tr><tr><td>Wieszaki na torby na łóżko&nbsp;</td><td>Opieka zdrowotna dla niedźwiedzi Great Bear&nbsp;</td><td>10705P</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski rurki kurka Bochem, średnica 25 mm</td><td>Fisher</td><td>11805101</td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Fisher</td><td>10021681</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat kwasu cytrynowego&nbsp;</td><td>Merck</td><td>C1909-500G</td><td>Służy do usuwania krystalicznego biofilmu z modeli po eksperymentach&nbsp;</td></tr><tr><td>Marka rybacka&nbsp; Pipety z podziałką szklaną klasy B typu 1</td><td>Fisher</td><td>11992168</td><td>Służy do dostarczania modeli łopatek in vitro z AUM za pomocą zwierciadlanej</td></tr><tr><td>żelatyny</td><td>VWR</td><td>24360.233</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad prism 10</td><td>GraphPad</td><td>V10.0</td><td>Oprogramowanie analityczne służące do tworzenia wykresów wyników modeli pęcherza moczowego in vitro i analizy statystycznej.&nbsp;</td></tr><tr><td>Miernik pH Hanna HI 2211-02</td><td>Phillip Harris&nbsp;</td><td>PP00057414</td><td></td></tr><tr><td>Model pęcherza moczowego < in vitro></td><td>-</td><td></td> <td>Sprzęt na zamówienie, jak wcześniej opisano przez Nzakizwanayo i in. (2019).</td></tr><tr><td>Instillagel 6 ml żel nawilżający</td><td>mydoctorshop.co.uk</td><td>40-006</td><td>Żele smarujące stosowane w sekcji 7.1.; inni dostawcy są dostępni.</td></tr><tr><td>Kartell Plastilab Nierówny łącznik stożkowy</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>11914289</td><td>Służy do łączenia przewodów o różnych średnicach</td></tr><tr><td>Agar MacConkey bez soli (odwodniony)</td><td>Fisher</td><td>10472643</td><td>Do oznaczania liczby pojedynczych kolonii bakterii rojowych, tj. Proteus mirabilis</td></tr><tr><td>chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2.6H2O)</td><td>Fisher</td><td>10386743</td><td></td></tr><tr><td>fosforan monopotasowy (KH2PO4)</td><td>Złącze Fisher</td><td>10573181</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene w kształcie litery Y</td><td>Fisher</td><td>10186070</td><td>Służy do uruchamiania wielu obwodów AUM z jednego zbiornika AUM (1-4 modele na zbiornik)&nbsp;</td></tr>chlorek <tr><td>potasu (KCl)</td><td></td><td></td>Butelka z aspiratorem Fisher 10375810 <td></td></tr><tr><td>Pyrex z bocznym gniazdem ze szkła szlifowanego, Pojemność: 5000 ml</td><td>Zbiornik Fisher</td><td>11347884</td><td>AUM</td></tr><tr><td>Korki gumowe z otworem, Średnica zewnętrzna: 37mm, Czerwona, Średnica: 37mm</td><td>Fisher</td><td>11517612</td><td>Stosowany w zbiorniku AUM oraz do zasilania modeli in vitro z AUM</td></tr><tr><td>Rozmiar 14 francuski 100% silikonowy cewnik Foleya ze sterylną strzykawką z wodą do pompowania&nbsp;</td><td>Opieka zdrowotna dla niedźwiedzi Great Bear&nbsp;</td><td>4833-0514</td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>10735921</td><td></td></tr><tr><td>szczawian sodu (Na2C2O4)</td><td>Fisher</td><td>10442211</td><td></td></tr><tr><td>Teknon Biocleanse koncentrat biobójczy środek czyszczący 5L&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12447580</td><td>Służy do sterylizacji modeli po eksperymentach</td></tr><tr><td>cytrynian trisodowy (Na3C6H5O7)</td><td>Fisher</td><td>11434993</td><td></td></tr><tr><td>bulion sojowy tryptonowy</td><td>Fisher</td><td>10198002</td><td></td></tr><tr><td>mocznik (CH4N2O)</td><td>Fisher</td><td>10404185</td><td></td></tr><tr><td>Uro-Tainer M NaCl 0,9%</td><td>B.Braun</td><td>FB99833</td><td>Worek do irygacji pęcherza soli fizjologicznej stosowany w sekcji 7.2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Watson-Marlow Pumpsil 1,6 mm rurka silikonowa utwardzana platyną o średnicy wewnętrznej</td><td>Fisher</td><td>12406280</td><td>Grube rurki obwodu AUM (do stosowania w pompie perstaltycznej)</td></tr></tbody></table>

model pęcherza moczowego in vitro infekcji dróg moczowych związanej z cewnikiem

An In Vitro Bladder Model of Catheter-Associated Urinary Tract Infection

Infekcje dróg moczowych związane z cewnikiem (CAUTIs) należą do najczęstszych infekcji związanych z opieką zdrowotną. Tworzenie się biofilmu na cewnikach moczowych jest kluczowym aspektem patogenezy tych zakażeń i często prowadzi do zablokowania cewników i poważnych powikłań, takich jak odmiedniczkowe zapalenie nerek i posocznica. Podejścia do modelowania i badania powstawania biofilmu w tym otoczeniu są niezbędne zarówno dla podstawowego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw patogenezy CAUTI, jak i dla opracowania i solidnej oceny przedklinicznej skutecznych strategii terapeutycznych w celu kontrolowania CAUTI i zablokowania cewnika. Protokół ten opisuje model in vitro cewnikowanych dróg moczowych, który replikuje system zamkniętego drenażu cewnika stosowany w praktyce klinicznej, ułatwiając badanie CAUTI i tworzenia biofilmu cewnika w reprezentatywnych warunkach. Ponadto protokół ten szczegółowo opisuje zastosowanie modelu pęcherza moczowego in vitro do oceny skuteczności produktów do konserwacji cewnika przeciwdrobnoustrojowego, w tym produktów dostępnych obecnie w łańcuchu dostaw NHS.

Prawidłowe funkcjonowanie modelu pęcherza in vitro zależy od stosowania zasad aseptyki oraz uważnego monitorowania mętności medium podczas całego eksperymentu (Rycina 3). Przed inokulacją sterylny AUM w komorze centralnej modelu pęcherza in vitro miał bladożółty kolor i był przejrzysty (Rycina 3A). AUM w zbiorniku z medium powinno pozostać klarowne przez cały czas trwania eksperymentu, ponieważ wszelkie zmiany mętności mogą wskazywać na wytrącanie się soli z roztworu lub kontaminację medium. Jeśli AUM w zbiorniku lub w przewodach obiegu medium stanie się mętne lub wykaże drastyczną zmianę barwy, replikaty należy odrzucić i powtórzyć badanie. Po inokulacji wyraźnie widoczny jest wzrost mętności AUM w komorze centralnej modelu pęcherza in vitro (Rycina 3B). Zmiany mętności są często bardziej wyraźne w przypadku organizmów ureazy-dodatnich, takich jak P. mirabilis, jednak powinny być widoczne po inokulacji również w przypadku organizmów ureazy-ujemnych. Po uruchomieniu przepływu AUM często obserwuje się zmniejszenie jego mętności w wyniku wypłukiwania komórek planktonicznych, co nie oznacza braku żywych komórek w modelu. Monitorowanie poziomu medium w komorze centralnej może służyć również do określenia czasu wystąpienia blokady w przypadku użycia organizmów ureazy-dodatnich (Rycina 3C). Podczas pracy modelu otwór boczny oraz czubek cewnika powinny być całkowicie widoczne, co świadczy o prawidłowym odpływie do worków z odpadami. W momencie wystąpienia blokady poziom AUM w komorze centralnej podniesie się powyżej otworu bocznego i czubka cewnika, co oznacza, że eksperyment jest gotowy do końcowych pomiarów i zakończenia. Podczas eksperymentu efekty ciśnienia w obwodzie medium modelu pęcherza in vitro mogą sprawiać wrażenie, że modele są zablokowane. W przypadku podejrzenia blokady, przed zakończeniem testu należy sprawdzić, czy obwód AUM, cewnik i przewody worka z odpadami są napięte, ponieważ wszelkie pęcherzyki powietrza lub załamania przewodów mogą powodować powstanie „korków powietrznych” i uniemożliwiać drenaż przez cewnik.
Podczas eksperymentów z wykorzystaniem modelu pęcherza in vitro, pobieranie próbek planktonicznych może dostarczyć cennych informacji na temat dynamiki wzrostu w modelu, a także przebiegu CAUTI. Wzrost komórek, pH oraz tworzenie się biofilmu mogą być monitorowane przez cały czas trwania eksperymentu bez konieczności przerywania pracy z modelami (Rycina 4). W przypadku stosowania organizmów ureazy-dodatnich, obliczenia czasu zablokowania mogą służyć jako miara tempa tworzenia biofilmu i być wykorzystane do porównania właściwości różnych szczepów bakteryjnych (Rycina 4). Porównanie szczepu dzikiego P. mirabilis oraz mutanta LPS (insercja mini-tn5 do waaC) wykazało wydłużenie czasu do zablokowania, a tym samym zmniejszenie tworzenia biofilmu u mutanta (Rycina 4). Organizmy ureazy-ujemne zazwyczaj nie blokują modeli pęcherza in vitro, dlatego zaleca się ustalenie określonego punktu końcowego przed rozpoczęciem eksperymentu. W niektórych przypadkach organizmy ureazy-ujemne mogą doprowadzić do zablokowania cewnika. Na przykład szczepy Klebsiella pneumoniae ureazy-ujemne mogą wytwarzać rozległe, śluzowate biofilmy, jednak zazwyczaj zajmuje im to znacznie więcej czasu niż biofilmom ureazy-dodatnim w celu zablokowania odpływu, w związku z czym nadal zaleca się wyznaczenie punktu końcowego.
Pomiar pH podczas eksperymentów z modelem pęcherza może również dostarczyć informacji o różnicach między poszczególnymi szczepami, a także o postępach CAUTI. W przypadku wykorzystania organizmów ureazy-ujemnych, pH w komorze centralnej modelu pęcherza in vitro powinno pozostać w dużej mierze stabilne przez cały okres eksperymentu, choć spodziewane są niewielkie wahania pH wraz ze zmianami dynamiki populacji w czasie trwania doświadczenia. Inokulacja modeli in vitro organizmami ureazy-dodatnimi prowadzi do znacznego wzrostu pH w czasie, przy czym najwyższe wartości pH obserwuje się zazwyczaj w momencie zablokowania, kiedy odczyty pH mogą osiągać wartości rzędu ~8-9 (Rycina 4B).
Wyznaczenie liczby jednostek tworzących kolonie (CFU/mL) w planktonie jest istotnym elementem in vitro modelowanie pęcherza moczowego, co pozwala operatorom ocenić, czy inokulacja przebiegła pomyślnie oraz monitorować postępy eksperymentu. Pomiar CFU/ml na koniec eksperymentu może wykazać różnice w kolonizacji pęcherza moczowego pomiędzy różnymi szczepami bakterii. Podczas porównywania mini-Tn5 szczep mutanty P. mirabilis w porównaniu do typu dzikiego zaobserwowano istotny spadek liczby JCF/ml w momencie blokady (Rycina 4C). Ponadto wyliczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) z biofilmu na powierzchni cewnika oraz kwantyfikacja biomasy biofilmu mogą dostarczyć informacji na temat zdolności różnych patogenów do kolonizacji cewnikowanych dróg moczowych. Do określenia różnic w tworzeniu biofilmu między szczepem typu dzikiego a P. mirabilis szczep HI4320 oraz izolaty pasażowane w chlorheksydynie (Rycina 5). Pomiary gęstości optycznej przy 595 nm wykazały, że izolaty pasażowane w obecności chlorheksydyny wykazywały zmniejszenie tworzenia biofilmu w porównaniu z typem dzikim oraz kontrolami pasażowanymi bez chlorheksydyny.
Ponieważ celem modelu pęcherza in vitro jest dokładne odtworzenie niszy CAUTI, modele te mogą być również wykorzystywane do badania efektów terapeutyków przeciwdrobnoustrojowych ukierunkowanych na leczenie CAUTI w środowisku istotnym klinicznie. W przypadku organizmów ureazy-dodatnich, porównanie czasu wystąpienia niedrożności w modelach leczonych i nieleczonych może dostarczyć cennych informacji na temat skuteczności terapii. Leczenie modeli pęcherza in vitro zaszczepionych P. mirabilis roztworem do irygacji pęcherza zawierającym 0,02% chlorheksydyny znacząco wydłużyło czas do wystąpienia niedrożności w porównaniu z modelami nieleczonymi lub leczonymi 0,9% solą fizjologiczną (Rysunek 6A). Ponadto model pęcherza in vitro może być wykorzystany do badania aktywności bakteriobójczej terapeutyków przeciwdrobnoustrojowych. Monitorowanie zmian w CFU/mL komórek planktonicznych i związanych z biofilmem po zastosowaniu leczenia przeciwdrobnoustrojowego może wskazać, czy terapie są skuteczne. Leczenie modeli pęcherza in vitro zaszczepionych P. mirabilis wykazało redukcję planktonicznych CFU/mL o &gt;7-log natychmiast po zastosowaniu preparatu zgodnie z instrukcją producenta, w porównaniu z modelami nieleczonymi i irygowanymi 0,9% solą fizjologiczną (Rysunek 6B).
<img alt="Schemat zestawu bioreaktora; schemat pokazujący przepływ mediów i wody, metodologia bioprocesu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat głównych komponentów modelu pęcherza in vitro. (A) Model pęcherza (zamknięty system drenażu): (1) dwuścienna komora szklana symulująca pęcherz (2) wlot mediów, AU jest dostarczane poprzez pompę perystaltyczną do wewnętrznej komory modelu pęcherza (3) wlot wody dostarczanej poprzez cyrkulacyjną łaźnię wodną do komory zewnętrznej (4) wylot wody (5) cewnik Foleya, wprowadzony do komory wewnętrznej (6) punkt połączenia światła drenażowego; punkt połączenia dla worka na odpady/worków do irygacji (7) worek drenażowy zbierający odpływ moczu. (B) Schemat przedstawiający konfigurację modelu pęcherza in vitro oraz kierunek przepływu mediów i wody przez model. Sztuczny mocz jest przechowywany w zbiorniku z mediami (1) w temperaturze pokojowej i dostarczany do modelu poprzez pompę perystaltyczną (2) ze stałą prędkością przepływu ~ 0,75 mL min-1 przez cały czas trwania eksperymentu. Media wpływają do centralnej komory dwuściennego naczynia szklanego reprezentującego pęcherz (3) i odpływają poprzez otwór cewnika Foleya (4) do worka drenażowego (5), co dopełnia sterylny zamknięty system drenażu. Model pęcherza in vitro jest utrzymywany w stałej temperaturze 37 °C poprzez cyrkulacyjną łaźnię wodną (6), która przepływa przez komorę zewnętrzną dwuściennego naczynia szklanego. Linie przerywane reprezentują rurki silikonowe, a strzałki reprezentują kierunek przepływu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat cewnika balonowego, ustawienie w stanie spłaszczonym z kanałami drenażowymi i nadmuciania do procedury medycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Sekcjonowanie cewników moczowych w celu przetworzenia komórek związanych z biofilmem. Przykładowe punkty na cewniku moczowym do wycięcia w celu późniejszej kwantyfikacji biofilmu. (A) Cewniki są najpierw sekcjonowane poprzecznie w obszarze 8 cm proksymalnie od końcówki/otworów odpływowych (gdzie obserwuje się największą formację biofilmu). Za pomocą skalpela wycina się fragmenty o długości 1 cm, zazwyczaj unikając obszaru zawierającego spłaszczony balon cewnika ze względu na trudności w powtarzalności przetwarzania (1-3). (B) Po wstępnym pocięciu cewników na kawałki o długości 1 cm, wykonuje się kolejne cięcie wzdłuż centralnego światła, aby odsłonić obecny biofilm do dalszej kwantyfikacji, np. oznaczania CFU/mL lub barwienia fioletem krystalicznym. Linie przerywane reprezentują punkty sekcjonowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do chromatografii kolumnowej z buforami, elucją białek, etapami procesu oczyszczania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Etapy eksperymentu z wykorzystaniem modelu pęcherza in vitro. Zdjęcia komory centralnej modelu pęcherza in vitro na różnych etapach eksperymentu. (A) AUM w komorze centralnej modelu pęcherza in vitro przed inokulacją. Pożywka w komorze centralnej jest całkowicie przezroczysta, co świadczy o pomyślnej sterylizacji, a końcówka cewnika i otwory boczne są widoczne powyżej poziomu pożywki, co wskazuje na prawidłowe drenażowanie przez cewnik. (B) Pożywka w komorze centralnej modelu pęcherza in vitro po inokulacji P. mirabilis (4 h po inokulacji). Pomyślna inokulacja objawia się zwiększoną mętnością pożywki. Widoczność końcówki cewnika i otworów bocznych wskazuje, że AUM jest skutecznie odprowadzane przez cewnik i nie doszło do jego zablokowania. (C) Przykład zablokowanego modelu pęcherza in vitro. Inokulacja P. mirabilis oraz następujące po niej tworzenie biofilmu i mineralizacja doprowadziły do zablokowania otworów bocznych cewnika, co uniemożliwiło drenaż i spowodowało podniesienie się poziomu pożywki w komorze centralnej powyżej końcówki cewnika. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe porównujące szczepy WT i mutanty: czas zablokowania, pH, CFU/mL, wraz z analizą statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Pomiary końcowe dla modelu pęcherza in vitro prowadzonego do momentu zablokowania. Przykładowe pomiary końcowe w momencie zablokowania w modelu pęcherza in vitro zaszczepionego klinicznym szczepem P. mirabilis, RS47 (WT) oraz szczepem mutantem o osłabionej zdolności tworzenia biofilmu, RS47-2 (Mutant). (A) Czas zablokowania (h) szczepów WT i mutantów P. mirabilis. (B) pH w modelach pęcherza in vitro w momencie zablokowania. (C) CFU/mL komórek planktonicznych w komorze modelu pęcherza in vitro w momencie zablokowania. Wszystkie dane reprezentują średnią z pięciu powtórzeń biologicznych. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy średniej (SEM). *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Clarke et al.46. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający wyniki absorbancji OD_595nm w eksperymencie fotometrycznym wraz z analizą statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Pomiary komórek związanych z biofilmem w modelu pęcherza in vitro . Ilościowe oznaczenie tworzenia biofilmu przez P. mirabilis , porównujące szczep dziki HI4320 z populacjami adaptowanymi, pasażowanymi z dodatkiem lub bez dodatku chlorheksydyny (CHD), poprzez barwienie fioletem krystalicznym i pomiar gęstości optycznej (OD) przy 595 nm. WT: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: kontrole pasażowania bez ekspozycji na CHD; 2, 4, 6: HI4320 pasażowany w 4 µg/ mL CHD. Wszystkie dane przedstawiają średnią z pięciu powtórzeń biologicznych. Słupki błędów przedstawiają SEM. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający czas zablokowania i CFU/mL; próbki nieleczone i leczone, istotność statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Pomiary z modeli pęcherza moczowego in vitro po leczeniu przeciwdrobnologicznym. Próbki planktoniczne pobrano z modelu pęcherza moczowego in vitro zaszczepionego P. mirabilis, po płukaniu 0,02% roztworem przeciwdrobnologicznym chlorheksydyny (100 mL) lub kontrolnym roztworem soli fizjologicznej 0,9%. (A) Czas zablokowania modeli pęcherza moczowego in vitro po płukaniu. (B) Planktoniczne CFU/mL bezpośrednio po leczeniu poprzez płukanie. Wszystkie dane przedstawiają średnią z pięciu powtórzeń biologicznych. Słupki błędów wskazują SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół szczegółowo opisuje model in vitro cewnikowanego układu moczowego, który może być wykorzystany do badania zarówno planktonowych, jak i związanych z biofilmem populacji komórek bakteryjnych w symulowanych infekcjach dróg moczowych związanych z cewnikiem. Model ten może być dalej wykorzystywany do badania skuteczności produktów przeciwdrobnoustrojowych mających na celu kontrolowanie infekcji dróg moczowych.

Model pęcherza moczowego in vitro infekcji dróg moczowych związanej z cewnikiem

Catheter-associated urinary tract infections (CAUTIs) are among the most common healthcare-associated infections. Biofilm formation on urinary catheters ...

- Nasze badania koncentrują się na infekcjach dróg moczowych związanych z cewnikiem. Używamy modeli in vitro, takich jak model pęcherza moczowego, aby lepiej zrozumieć patogeny wywołujące CAUTI.Model pęcherza moczowego in vitro zapewnia kontrolowane środowisko do testowania praktycznych zastosowań narzędzi diagnostycznych i interwencji terapeutycznych do stosowania w leczeniu CAUTI.Cewnikowane drogi moczowe to złożona nisza środowiskowa o ważnych parametrach, takich jak powierzchnia cewnika i środowisko odżywcze moczu, które utrudniają jego replikację in vitro.Kluczowym celem naszych badań jest znalezienie sposobów kontrolowania tworzenia się biofilmu na wyrobach medycznych, takich jak cewniki moczowe, w celu poprawy wyników leczenia pacjentów. Używamy również naszych modeli do badania rozwoju oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w społecznościach bakteryjnych, aby odpowiedzieć na pytania o to, jak to powstaje i co możemy zrobić, aby temu zapobiec.[Narrator] Aby rozpocząć, włóż cewnik Foleya do centralnej szklanej komory modelu pęcherza in vitro i zabezpiecz cewnik na miejscu po napompowaniu balonu za pomocą dostarczonej strzykawki ze sterylną wodą. Następnie przymocuj worek na odpady do portu cewnika przed podłączeniem modelu pęcherza in vitro do zbiornika AUM. Teraz przymocuj modele pęcherzy in vitro do stojaków zaciskowych. Podłącz rurkę obwodu mediów do pompy perystaltycznej i zabezpiecz worki na odpady w stojakach umieszczonych pod modelami. Podłącz zewnętrzną komorę modelu pęcherza do kąpieli wodnej z krążącą wodą za pomocą silikonowej rurki. Nastaw łaźnię wodną na podgrzanie do 37 stopni Celsjusza i włącz cyrkulatory zbiornika. Wysterylizuj model pęcherza in vitro przy użyciu 70% etanolu. Usuń korek na wlocie nośnika, aby umożliwić dostęp do komory wewnętrznej. Za pomocą pipety serologicznej usuń 10 mililitrów AUM z objętości modelu pęcherza. Zaszczepić modele pęcherza in vitro przez centralną komorę przy użyciu całej znormalizowanej 10-mililitrowej zawiesiny i dokładnie wymieszać. Za pomocą pipety wyjmij 10 mililitrów zaszczepionej próbki z centralnej komory i podziel je na porcje do 15-mililitrowej probówki uniwersalnej do późniejszych testów. Po odkażeniu powierzchni zewnętrznych wymień korek i na krótko wznów przepływ mediów, aby upewnić się, że poziom AUM w komorze centralnej dotrze do otworu na oczy, a następnie zatrzymaj przepływ. Po godzinnej inkubacji włącz przepływ pożywki za pomocą pompy perystaltycznej, aby rozpocząć pracę z modelami pęcherza in vitro. Po odkażeniu korka modelu pęcherza wyjmij go, aby uzyskać dostęp do centralnej komory. Za pomocą pipety serologicznej delikatnie wymieszaj zawartość komory centralnej, omijając końcówkę cewnika i balon. Następnie usuń jeden mililitr z próbki za pomocą pipety i podziel go na 1,5 mililitra w probówce mikrowirówkowej do seryjnych rozcieńczeń. Zmierzyć pH pozostałej próbki za pomocą pH-metru. Odłącz worek na odpady od cewnika i spuść resztki moczu z modelu, opróżniając balon. Usuń cewnik z dolnej części modelu za pomocą sterylnych kleszczy. Teraz umieść usunięty cewnik na sterylnej desce i za pomocą sterylnego skalpela przetnij cewnik w wymaganych punktach do przekrojenia. Za pomocą sterylnych kleszczy zanurz fragment cewnika trzykrotnie w sterylnym PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki i inkubuj przygotowany fragment cewnika w 0,25% trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji sonikować roztwór zawierający cewnik przez 10 minut. Stosując technikę aseptyczną, włóż koniec strzykawki zawierającej środek smarujący do szyjki modelu pęcherza moczowego i wstrzyknij pięć mililitrów żelu. Obróć model, aby upewnić się, że podstawa jest równomiernie pokryta żelem. Aby wprowadzić cewnik Foleya do modelu, przepchnij końcówkę cewnika przez żel i zabezpiecz ją po napełnieniu balonu w normalny sposób. Połącz model z resztą konfiguracji. Następnie napełnij światło modelu moczem, aż zacznie on odpływać przez otwór na oko cewnika. Gdy tylko mocz zacznie odpływać, należy zatrzymać pompę, aby zapobiec utracie żelu przed inokulacją. W momencie włączenia pompy po inokulacji, zlicza się rozcieńczenia do tworzenia kolonii. W przypadku korzystania z indywidualnego woreczka do irygacji odłącz worek na odpady od cewnika i użyj nasadki dostarczonej z woreczkiem, aby uszczelnić worek na odpady. Natychmiast przymocuj woreczek z roztworem do irygacji do cewnika i lekko uciskając wyciśnij produkt do centralnego światła, postępując zgodnie z instrukcjami producenta przez 15 minut. Po upływie zalecanego czasu leczenia pozwól, aby pozostały roztwór spłynął z komory wewnętrznej przez otwór na oczko cewnika do woreczka irygacyjnego, a następnie odłącz woreczek. Wysterylizuj port drenażu cewnika i port połączenia worka na odpady 70% etanolem przed ich ponownym podłączeniem. Aby zakończyć eksperyment, wyłącz przepływ kąpieli wodnej i odłącz obwód mediów i rurki obwodu łaźni wodnej od modeli pęcherzy in vitro. Po wyjęciu korków zbierz całą objętość resztek moczu, opróżnij worki na odpady i wyrzuć wszelkie resztki mediów. Następnie odłącz worki na odpady cewnika od portu cewnika i wyrzuć je. Na koniec, za pomocą strzykawki, powoli opróżnij balony cewnika przed wyjęciem cewników z modeli. Po zaszczepieniu modelu pęcherza moczowego czas blokady został znacznie wydłużony w zmutowanym szczepie Proteus mirabilis mini-Tn5 w porównaniu ze szczepem typu dzikiego, co wskazuje na zmniejszone tworzenie biofilmu. Jednostki tworzące kolonie planktonowe na mililitr w momencie zablokowania były znacznie zmniejszone w zmutowanym szczepie mini-Tn5 w porównaniu z typem dzikim. Barwienie fioletem krystalicznym wykazało, że izolaty Proteus mirabilis pasażowane w chlorheksydynie wykazywały znaczne zmniejszenie biomasy biofilmu w porównaniu z tymi, które pasażowały bez chlorheksydyny. Leczenie modeli pęcherza in vitro irygacją 0,02% chlorheksydyną znacznie wydłużyło czas do zablokowania i zmniejszyło liczbę jednostek tworzących kolonie planktonowe na mililitr w porównaniu z kontrolami nieleczonymi i traktowanymi solą fizjologiczną.

an-vitro-bladder-model-catheter-associated-urinary-tract

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: O'Brien, V. P., i in., Nawracająca infekcja dróg moczowych Escherichia coli wywołana ekspozycją pęcherza pochwowego Gardnerella u myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje wykorzystanie skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji kolonizacji bakterii oraz interakcji gospodarz–patogen w nabłonku pęcherza moczowego modelu myszy przed zakażeniem.

Przygotowanie tkanek pęcherza myszy do wizualizacji infekcji bakteryjnej

Źródło: Conover, M. S. i in., J. Ustanowienie i charakterystyka ZUM i CAUTI w modelu myszym. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje procedurę montażu i wszczepienia cewnika transurethralnego u samicy myszy, po czym następuje szczepienie bakteryjne w celu wywołania zakażenia dróg moczowych związanych z cewnikami oraz badania interakcji gospodarza z patogenem wygenerowanym przez biofilm.

Zakażenie dróg moczowych związane z cewnikami w modelu mysim

Źródło: Conover, M. S. i in., Ustanowienie i charakterystyka ZUM i CAUTI w modelu myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje wykrywanie wewnątrzkomórkowych społeczności bakteryjnych (IBC) w tkance pęcherza myszy zakażonej Escherichia coli ekspresującą β-galaktozydazę. Po utrwaleniu tkanek, permeabilizacji i barwieniu X-gal, IBC pojawiają się jako niebieskie punkty pod mikroskopem rozcinającym, co potwierdza inwazję bakterii podczas infekcji dróg moczowych.

Wizualizacja społeczności bakteryjnych wewnątrzkomórkowych w zakażonym pęcherzu myszy

W tym filmie opisujemy technikę dopęcherzowego podawania bakterii uropatogennych w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u myszy. Model ten może być wykorzystany do zrozumienia rozprzestrzeniania się uropatogennej infekcji bakteryjnej w obrębie układu moczowego oraz mechanizmów określających podatność na ZUM.

Generowanie modelu infekcji dróg moczowych: technika podawania bakterii uropatogennych u myszy w celu opracowania modelu infekcji dróg moczowych

Ten film pokazuje proces zapoczątkowania uropatogennej infekcji Escherichia coli u samicy pęcherza myszy poprzez przezcewkowe wkroplenie cewnika. Wstrzyknięte bakterie z powodzeniem wywołują infekcję dróg moczowych w obrębie pęcherza moczowego, stanowiąc cenną platformę do badania chorób związanych z opieką zdrowotną związanych z drogami moczowymi.

Cewnikowanie przezcewkowe i inokulacja bakteryjna w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u samców myszy

Opracowanie modelu infekcji dróg moczowych u samic myszy

Zdolność do modelowania infekcji dróg moczowych (ZUM) jest kluczowa, aby móc zrozumieć patogenezę bakterii i zapoczątkować rozwój nowych terapii. Celem tej pracy jest zademonstrowanie mysich modeli eksperymentalnego ZUM i ZUM związanego z cewnikiem, które podsumowują i przewidują wyniki obserwowane u ludzi.

Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim

Ustalony model przezcewkowego cewnikowania myszy pozwala na badanie patologii pęcherza moczowego, w tym infekcji dróg moczowych, ale może być wykonywane tylko u samic. Zaprezentowany tu nowy model wkraplania przezcewkowego u mężczyzn umożliwi prowadzenie badań w obszarze charakteryzującym się silnymi różnicami klinicznymi i epidemiologicznymi między płciami.

Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania pojedynczych, zainfekowanych komórek nabłonka pęcherza moczowego od mysiego modelu infekcji dróg moczowych.

Izolacja pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych wygenerowanych z mysiego modelu infekcji dróg moczowych do dalszej analizy pojedynczych komórek

Pokazano mysi model przezcewkowej inokulacji uropatogennej E. coli (UPEC) w celu stworzenia utajonych wewnątrzkomórkowych zbiorników pęcherza moczowego, a następnie ekspozycji pęcherza moczowego na G. vaginalis w celu wywołania nawrotu UPEC UTI. Zademonstrowano również liczenie bakterii, cytologię moczu oraz utrwalanie i przetwarzanie pęcherza moczowego in situ w skaningowej mikroskopii elektronowej.

Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy

Poznaj model pęcherza moczowego in vitro do badania zakażeń dróg moczowych związanych z cewnikiem i oceny działania środków przeciwdrobnoustrojowych na biofilm bakteryjny.

Model pęcherza moczowego in vitro infekcji dróg moczowych związanej z cewnikiem

Przeglądaj więcej filmów