Model pęcherza moczowego in vitro infekcji dróg moczowych związanej z cewnikiem

- Nasze badania koncentrują się na infekcjach dróg moczowych związanych z cewnikiem. Używamy modeli in vitro, takich jak model pęcherza moczowego, aby lepiej zrozumieć patogeny wywołujące CAUTI.

Model pęcherza moczowego in vitro zapewnia kontrolowane środowisko do testowania praktycznych zastosowań narzędzi diagnostycznych i interwencji terapeutycznych do stosowania w leczeniu CAUTI.

Cewnikowane drogi moczowe to złożona nisza środowiskowa o ważnych parametrach, takich jak powierzchnia cewnika i środowisko odżywcze moczu, które utrudniają jego replikację in vitro.

Kluczowym celem naszych badań jest znalezienie sposobów kontrolowania tworzenia się biofilmu na wyrobach medycznych, takich jak cewniki moczowe, w celu poprawy wyników leczenia pacjentów. Używamy również naszych modeli do badania rozwoju oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe w społecznościach bakteryjnych, aby odpowiedzieć na pytania o to, jak to powstaje i co możemy zrobić, aby temu zapobiec.

[Narrator] Aby rozpocząć, włóż cewnik Foleya do centralnej szklanej komory modelu pęcherza in vitro i zabezpiecz cewnik na miejscu po napompowaniu balonu za pomocą dostarczonej strzykawki ze sterylną wodą. Następnie przymocuj worek na odpady do portu cewnika przed podłączeniem modelu pęcherza in vitro do zbiornika AUM. Teraz przymocuj modele pęcherzy in vitro do stojaków zaciskowych. Podłącz rurkę obwodu mediów do pompy perystaltycznej i zabezpiecz worki na odpady w stojakach umieszczonych pod modelami. Podłącz zewnętrzną komorę modelu pęcherza do kąpieli wodnej z krążącą wodą za pomocą silikonowej rurki. Nastaw łaźnię wodną na podgrzanie do 37 stopni Celsjusza i włącz cyrkulatory zbiornika. Wysterylizuj model pęcherza in vitro przy użyciu 70% etanolu. Usuń korek na wlocie nośnika, aby umożliwić dostęp do komory wewnętrznej. Za pomocą pipety serologicznej usuń 10 mililitrów AUM z objętości modelu pęcherza. Zaszczepić modele pęcherza in vitro przez centralną komorę przy użyciu całej znormalizowanej 10-mililitrowej zawiesiny i dokładnie wymieszać. Za pomocą pipety wyjmij 10 mililitrów zaszczepionej próbki z centralnej komory i podziel je na porcje do 15-mililitrowej probówki uniwersalnej do późniejszych testów. Po odkażeniu powierzchni zewnętrznych wymień korek i na krótko wznów przepływ mediów, aby upewnić się, że poziom AUM w komorze centralnej dotrze do otworu na oczy, a następnie zatrzymaj przepływ. Po godzinnej inkubacji włącz przepływ pożywki za pomocą pompy perystaltycznej, aby rozpocząć pracę z modelami pęcherza in vitro. Po odkażeniu korka modelu pęcherza wyjmij go, aby uzyskać dostęp do centralnej komory. Za pomocą pipety serologicznej delikatnie wymieszaj zawartość komory centralnej, omijając końcówkę cewnika i balon. Następnie usuń jeden mililitr z próbki za pomocą pipety i podziel go na 1,5 mililitra w probówce mikrowirówkowej do seryjnych rozcieńczeń. Zmierzyć pH pozostałej próbki za pomocą pH-metru. Odłącz worek na odpady od cewnika i spuść resztki moczu z modelu, opróżniając balon. Usuń cewnik z dolnej części modelu za pomocą sterylnych kleszczy. Teraz umieść usunięty cewnik na sterylnej desce i za pomocą sterylnego skalpela przetnij cewnik w wymaganych punktach do przekrojenia. Za pomocą sterylnych kleszczy zanurz fragment cewnika trzykrotnie w sterylnym PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki i inkubuj przygotowany fragment cewnika w 0,25% trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji sonikować roztwór zawierający cewnik przez 10 minut. Stosując technikę aseptyczną, włóż koniec strzykawki zawierającej środek smarujący do szyjki modelu pęcherza moczowego i wstrzyknij pięć mililitrów żelu. Obróć model, aby upewnić się, że podstawa jest równomiernie pokryta żelem. Aby wprowadzić cewnik Foleya do modelu, przepchnij końcówkę cewnika przez żel i zabezpiecz ją po napełnieniu balonu w normalny sposób. Połącz model z resztą konfiguracji. Następnie napełnij światło modelu moczem, aż zacznie on odpływać przez otwór na oko cewnika. Gdy tylko mocz zacznie odpływać, należy zatrzymać pompę, aby zapobiec utracie żelu przed inokulacją. W momencie włączenia pompy po inokulacji, zlicza się rozcieńczenia do tworzenia kolonii. W przypadku korzystania z indywidualnego woreczka do irygacji odłącz worek na odpady od cewnika i użyj nasadki dostarczonej z woreczkiem, aby uszczelnić worek na odpady. Natychmiast przymocuj woreczek z roztworem do irygacji do cewnika i lekko uciskając wyciśnij produkt do centralnego światła, postępując zgodnie z instrukcjami producenta przez 15 minut. Po upływie zalecanego czasu leczenia pozwól, aby pozostały roztwór spłynął z komory wewnętrznej przez otwór na oczko cewnika do woreczka irygacyjnego, a następnie odłącz woreczek. Wysterylizuj port drenażu cewnika i port połączenia worka na odpady 70% etanolem przed ich ponownym podłączeniem. Aby zakończyć eksperyment, wyłącz przepływ kąpieli wodnej i odłącz obwód mediów i rurki obwodu łaźni wodnej od modeli pęcherzy in vitro. Po wyjęciu korków zbierz całą objętość resztek moczu, opróżnij worki na odpady i wyrzuć wszelkie resztki mediów. Następnie odłącz worki na odpady cewnika od portu cewnika i wyrzuć je. Na koniec, za pomocą strzykawki, powoli opróżnij balony cewnika przed wyjęciem cewników z modeli. Po zaszczepieniu modelu pęcherza moczowego czas blokady został znacznie wydłużony w zmutowanym szczepie Proteus mirabilis mini-Tn5 w porównaniu ze szczepem typu dzikiego, co wskazuje na zmniejszone tworzenie biofilmu. Jednostki tworzące kolonie planktonowe na mililitr w momencie zablokowania były znacznie zmniejszone w zmutowanym szczepie mini-Tn5 w porównaniu z typem dzikim. Barwienie fioletem krystalicznym wykazało, że izolaty Proteus mirabilis pasażowane w chlorheksydynie wykazywały znaczne zmniejszenie biomasy biofilmu w porównaniu z tymi, które pasażowały bez chlorheksydyny. Leczenie modeli pęcherza in vitro irygacją 0,02% chlorheksydyną znacznie wydłużyło czas do zablokowania i zmniejszyło liczbę jednostek tworzących kolonie planktonowe na mililitr w porównaniu z kontrolami nieleczonymi i traktowanymi solą fizjologiczną.