Identyfikacja mikrogleju i makrofagów naciekających obwodowo w uszkodzonym rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej
24 czerwca 2025
Identyfikacja mikrogleju (MG) i obwodowych naciekających makrofagów (Mø) w uszkodzonym rdzeniu kręgowym jest trudna. W tym protokole zastosowano cytometrię przepływową (FCM) do identyfikacji odpowiednio MG podobnego do M1, MG podobnego do M2, M1-podobnego Mø i M2-podobnego Mø. Technologia ta może być również stosowana w innych chorobach ośrodkowego układu nerwowego, aby zrozumieć rolę MG i Mø.
Nasze badania identyfikują mikroglej i naciekające makrofagi w uszkodzeniu rdzenia kręgowego, aby wyjaśnić ich rolę w zapaleniu nerwów przy użyciu zoptymalizowanej cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa i wirowanie w gradionym spadku gęstości mają kluczowe znaczenie dla izolacji i fenotypowania komórek odpornościowych ośrodkowego układu nerwowego z wysoką swoistością i wydajnością. Rozróżnienie morfologicznie podobnych mikrogleju i makrofagów, zminimalizowanie utraty komórek podczas izolacji oraz gorsza mikrospecyficzność w dynamicznych mikrośrodowiskach urazów pozostają kluczowymi przeszkodami. Istniejące metody nie są w stanie niezawodnie oddzielić osiadłego mikrogleju od infiltrujących makrofagów. Nasze podejście oparte na markerach rozwiązuje to krytyczne ograniczenie w badaniach nad urazami rdzenia kręgowego.
[Prezenter] Aby rozpocząć, przeanalizuj rurkę kontrolną izotypu za pomocą cytometru przepływowego z kompatybilnym oprogramowaniem. Dostosuj napięcia rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego, aby ustawić populację komórek w odpowiednim zakresie. Ustaw dwa dodatkowe wykresy, jeden z IgG APC na osi X i IgG PE na osi Y, drugi z IgG-FITC na osi X i IgG APC-Cy7 na osi Y. Następnie dostosuj napięcia kanału fluorescencji dla IgG APC, IgG PE, IgG FITC i IgG APC-Cy7, aby ustawić populację komórek w zakresie od 10 do potęgi trzech z obszaru podwójnie ujemnego. Po potwierdzeniu zoptymalizowanych napięć za pomocą rurki kontrolnej izotypu, zachowaj wszystkie ustawienia. Przystąp do analizy probówek eksperymentalnych wybarwionych przeciwciałami. Ustal wykres z CD11b PE na osi X i rozproszeniem bocznym na osi Y. Skonfiguruj kolejny wykres z CD68 FITC i CCR7 APC-Cy7. Używając kontrolki izotypu jako odniesienia, nakreśl region dodatni CD11b i zdefiniuj go jako bramkę P1. Wybierz wykres CD68 FITC i CCR7 APC-Cy7. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby otworzyć Pokaż populację, a następnie przypisz kolumnę F4 do P1. Po uzyskaniu danych dostosuj kompensację fluorescencji zgodnie z potrzebami. Analizuj i rejestruj procent populacji komórek CD11b, CD68 CCR7-dodatnich i CD11b CD68-dodatnich CCR7-ujemnych. Rozpocznij analizę probówek eksperymentalnych przy użyciu ustawień napięcia z probówki kontrolnej izotypu. Utwórz wykres za pomocą CD45 APC i CD11b PE. Następnie skonfiguruj dwa wykresy z CD68 FITC i CCR7 APC-Cy7. Rejestruj 50 000 zdarzeń na próbkę i dostosuj kompensację fluorescencji po zebraniu danych. Na pseudokolorowych wykresach CD45 i CD11b zidentyfikuj i przeanalizuj regiony dla CD11b-dodatnich, CD45-ujemnych niskich i CD11b-dodatnich komórek CD45. Następnie przeanalizuj populacje CD68-dodatnich CCR7-dodatnich i CD68-dodatnich CCR7-ujemnych w każdym regionie. Zintegruj wszystkie analizy, aby określić procent mikrogleju i makrofagów podobnych do M1 i M2 w zdefiniowanych regionach. Uruchom oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej. Przeciągnij pliki eksperymentu cytometrii przepływowej do sekcji Wszystkie próbki interfejsu. Kliknij dwukrotnie próbkę kontrolną izotypu, aby otworzyć dwuwymiarowy wykres punktowy. Wybierz FSCA dla osi X i SSCA dla osi Y, a następnie kliknij przycisk prostokątnej bramki i użyj go, aby wybrać obszar z wyłączeniem zanieczyszczeń komórkowych. Kliknij dwukrotnie obszar bramkowany, aby otworzyć nowy wykres histogramu. Następnie wybierz FITC dla osi X i histogram dla osi Y. Kliknij przycisk bramki regionu, aby zdefiniować próg między ujemnymi i dodatnimi sygnałami fluorescencyjnymi. Dla każdego z czterech przeciwciał fluorescencyjnych określić próg między sygnałami ujemnymi i dodatnimi, używając próbki kontrolnej izotypu. Sekwencyjnie zmieniaj fluorochrom osi X na PE-APC i APC-Cy7, zachowując histogram osi Y. Użyj narzędzia bramki regionu w każdym histogramie, aby sfinalizować bramki do rozróżniania ujemnych i dodatnich sygnałów fluorescencyjnych dla czterech przeciwciał. Następnie kliknij dwukrotnie próbkę eksperymentalną, aby otworzyć wykres kropkowy. Wybierz FSCA dla osi X i SSCA dla osi Y, kliknij przycisk prostokątnej bramy, aby przebramować populację po usunięciu gruzu. Kliknij dwukrotnie region bramkowany, aby otworzyć nowy wykres punktowy. Wybierz CD11b PE dla osi X i SSCA dla osi Y. Kliknij przycisk bramki prostokątnej i użyj progu PE z kontrolki isotype, aby zdefiniować bramkę dodatnią CD11b. Teraz kliknij dwukrotnie region dodatni CD11b, aby otworzyć kolejny wykres punktowy, wybierz CD68 FITC dla osi X i CCR7 APC-Cy7 dla osi Y. Kliknij przycisk krzyża i użyj progów FITC i APC-Cy7 pochodzących od izotypu, aby skategoryzować komórki na typy podobne do M1 i M2. Odsetek komórek CD45 o wysokim CD11b-dodatnim CD68-dodatnim CCR7 był znacznie zwiększony w grupie nośnej z uszkodzeniem rdzenia kręgowego lub SCI w porównaniu z grupą pozorowaną, a leczenie CRID3 nie zmieniło tego poziomu. Odsetek komórek CCR7-dodatnich CD45-ujemnych i nisko CD11b-dodatnich CD68-dodatnich był znacznie wyższy w grupie nośnika SCI w porównaniu z pozorami i był znacznie zmniejszony po leczeniu CRID3. Proporcje CD11b-dodatnich CD68-dodatnich komórek CCR7-dodatnich były znacznie zwiększone w grupie nośnika SCI w porównaniu z pozorowanym i znacznie zmniejszyły się po leczeniu CRID3. CD11b-dodatnie, CD68-dodatnie, CCR7-ujemne i CD45-ujemne, niskie CD11b-dodatnie, CD68-dodatnie proporcje komórek CCR7-ujemnych były znacznie zmniejszone w obu grupach nośników SCI w porównaniu z pozorowanymi i zwiększone po leczeniu CRID3.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje identyfikację mikrogleju oraz naciekających makrofagów obwodowych w uszkodzonym rdzeniu kręgowym z wykorzystaniem zoptymalizowanej cytometrii przepływowej. Poprzez badanie fenotypów typu M1 i M2, praca ma na celu wyjaśnienie ich roli w neuroinflamacji oraz potencjalnych implikacji dla innych chorób ośrodkowego układu nerwowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Mikroglej to rezydentne komórki odpornościowe w ośrodkowym układzie nerwowym.
- Infiltrujące makrofagi przyczyniają się do odpowiedzi neurozapalnych.
- Rozróżnienie między tymi typami komórek jest kluczowe dla zrozumienia ich roli w urazach rdzenia kręgowego.
- Obecne metody są niewystarczające do niezawodnego odróżnienia mikrogleju od makrofagów.
Cel badania
- Opracowanie metody cytometrii przepływowej opartej na markerach w celu dokładnej identyfikacji typów komórek odpornościowych w urazach rdzenia kręgowego.
- Ocena proporcji mikrogleju i makrofagów typu M1 oraz M2.
- Zbadanie wpływu leczenia CRID3 na te populacje.
Zastosowane metody
- Do izolacji i fenotypowania komórek odpornościowych wykorzystano cytometrię przepływową.
- Model biologiczny koncentrował się na urazie rdzenia kręgowego i wynikającym z niego neurozapaleniu.
- Analizie poddano probówki z kontrolą izotypową w celu optymalizacji ustawień fluorescencji.
- Dane zebrano w celu określenia procentowej zawartości komórek odpornościowych typu M1 i typu M2.
Główne wyniki
- Odnotowano istotne różnice w populacjach komórek odpornościowych pomiędzy grupą z urazem rdzenia kręgowego a grupą pozorowaną.
- Leczenie CRID3 zmieniło populacje komórek CD11b-dodatnich, wykazując jego potencjalne działanie terapeutyczne.
- Badanie dostarczyło niezawodnej metody identyfikacji odrębnych populacji mikrogleju i makrofagów in vivo.
Wnioski
- Niniejsze badanie wprowadza nową metodę cytometrii przepływowej, mającą na celu lepsze zrozumienie neurostanów zapalnych w urazach rdzenia kręgowego.
- Uzyskane wnioski mogą pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych w chorobach ośrodkowego układu nerwowego związanych z dysregulacją komórek odpornościowych.
- W ostateczności praca ta poszerza wiedzę w tej dziedzinie na temat mechanizmów neuronalnych i reakcji na uraz.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne rozróżnianie mikrogleju i makrofagów naciekających w modelach uszkodzeń rdzenia kręgowego ma kluczowe znaczenie dla ograniczania ryzyka związanego z celami neurozapalnymi oraz wyjaśniania roli komórek odpornościowych w patologii OUN. Ten oparty na markerach przepływ cytometryczny umożliwia ilościowe fenotypowanie populacji typu M1/M2, co zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków oraz w badaniach translacyjnych. Podejście to rozwiązuje główny problem w walidacji celów i badaniach mechanistycznych w ramach projektów dotyczących chorób neurozapalnych i neurodegeneracyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną identyfikację populacji komórek odpornościowych rezydentnych w przeciwieństwie do naciekających w modelach uszkodzeń OUN.
- Wspiera mechanistyczną analizę ryzyka poprzez rozróżnianie fenotypów typu M1 i M2 przy użyciu zwalidowanych paneli markerów.
- Ułatwia badanie szlaków neurozapalnych w oparciu o hipotezy, co jest istotne przy wyborze celu terapeutycznego.
- Zwiększa pewność prognostyczną w przypadku rozwoju kandydatów na leki immunomodulujące.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną i powtarzalną strategię bramkowania dla fenotypowania komórek odpornościowych w cytometry la przepływowej.
- Dostarcza ilościowe wyniki dotyczące proporcji populacji komórek, co umożliwia rzetelne opracowywanie testów.
- Wspiera późniejszy screening związków poprzez zapewnienie niezawodnej identyfikacji komórek odpornościowych.
- Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w modelach urazów i stanów zapalnych OUN.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie fenotypowania komórek odpornościowych do modeli uszkodzeń OUN istotnych dla danej choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka poprzez ilościowe określenie wpływu leczenia na dynamikę komórek odpornościowych.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów dla punktów końcowych stanu zapalnego w obrębie układu nerwowego, gdy jest to uzasadnione danymi.
- Zapewnia wgląd w mechanizmy terapeutycznej modulacji odpowiedzi immunologicznej OUN.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół cytometrii przepływowej integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych w programach dotyczących neurozapalenia i uszkodzeń OUN.
- Biologia odkrywcza: Rozwiązuje problem niejednoznaczności pochodzenia i fenotypu komórek odpornościowych, wspierając rygorystyczną weryfikację hipotez.
- Przesiewy: Standaryzuje bramkowanie i kwantyfikację komórek odpornościowych w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności testów.
- Analityka: Dostarcza ilościowych odczytów populacji mikrogleju i makrofagów typu M1/M2 do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z walidacją przedkliniczną w modelach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalną zdolność analityczną do fenotypowania komórek odpornościowych OUN w ramach różnych programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad neurozapaleniem.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów fenotypowania komórek odpornościowych.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz poprawia efektywność kapitałową poprzez wyjaśnienie roli komórek odpornościowych w patologii.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów ukierunkowanych na OUN.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie cytometrii przepływowej, strategii bramkowania (gatingu) oraz przetwarzania tkanek OUN.
- Wymaga dostępu do wielokolorowych cytometrów przepływowych oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego.
- Konieczna jest standaryzacja paneli markerów i progów bramkowania pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych modeli urazów lub chorób OUN.
- Potencjalne ograniczenia obejmują utratę komórek podczas izolacji oraz nakładanie się markerów w dynamicznym środowisku urazu.
