Identyfikacja mikrogleju i makrofagów naciekających obwodowo w uszkodzonym rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej

Nasze badania identyfikują mikroglej i naciekające makrofagi w uszkodzeniu rdzenia kręgowego, aby wyjaśnić ich rolę w zapaleniu nerwów przy użyciu zoptymalizowanej cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa i wirowanie w gradionym spadku gęstości mają kluczowe znaczenie dla izolacji i fenotypowania komórek odpornościowych ośrodkowego układu nerwowego z wysoką swoistością i wydajnością. Rozróżnienie morfologicznie podobnych mikrogleju i makrofagów, zminimalizowanie utraty komórek podczas izolacji oraz gorsza mikrospecyficzność w dynamicznych mikrośrodowiskach urazów pozostają kluczowymi przeszkodami. Istniejące metody nie są w stanie niezawodnie oddzielić osiadłego mikrogleju od infiltrujących makrofagów. Nasze podejście oparte na markerach rozwiązuje to krytyczne ograniczenie w badaniach nad urazami rdzenia kręgowego.

[Prezenter] Aby rozpocząć, przeanalizuj rurkę kontrolną izotypu za pomocą cytometru przepływowego z kompatybilnym oprogramowaniem. Dostosuj napięcia rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego, aby ustawić populację komórek w odpowiednim zakresie. Ustaw dwa dodatkowe wykresy, jeden z IgG APC na osi X i IgG PE na osi Y, drugi z IgG-FITC na osi X i IgG APC-Cy7 na osi Y. Następnie dostosuj napięcia kanału fluorescencji dla IgG APC, IgG PE, IgG FITC i IgG APC-Cy7, aby ustawić populację komórek w zakresie od 10 do potęgi trzech z obszaru podwójnie ujemnego. Po potwierdzeniu zoptymalizowanych napięć za pomocą rurki kontrolnej izotypu, zachowaj wszystkie ustawienia. Przystąp do analizy probówek eksperymentalnych wybarwionych przeciwciałami. Ustal wykres z CD11b PE na osi X i rozproszeniem bocznym na osi Y. Skonfiguruj kolejny wykres z CD68 FITC i CCR7 APC-Cy7. Używając kontrolki izotypu jako odniesienia, nakreśl region dodatni CD11b i zdefiniuj go jako bramkę P1. Wybierz wykres CD68 FITC i CCR7 APC-Cy7. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby otworzyć Pokaż populację, a następnie przypisz kolumnę F4 do P1. Po uzyskaniu danych dostosuj kompensację fluorescencji zgodnie z potrzebami. Analizuj i rejestruj procent populacji komórek CD11b, CD68 CCR7-dodatnich i CD11b CD68-dodatnich CCR7-ujemnych. Rozpocznij analizę probówek eksperymentalnych przy użyciu ustawień napięcia z probówki kontrolnej izotypu. Utwórz wykres za pomocą CD45 APC i CD11b PE. Następnie skonfiguruj dwa wykresy z CD68 FITC i CCR7 APC-Cy7. Rejestruj 50 000 zdarzeń na próbkę i dostosuj kompensację fluorescencji po zebraniu danych. Na pseudokolorowych wykresach CD45 i CD11b zidentyfikuj i przeanalizuj regiony dla CD11b-dodatnich, CD45-ujemnych niskich i CD11b-dodatnich komórek CD45. Następnie przeanalizuj populacje CD68-dodatnich CCR7-dodatnich i CD68-dodatnich CCR7-ujemnych w każdym regionie. Zintegruj wszystkie analizy, aby określić procent mikrogleju i makrofagów podobnych do M1 i M2 w zdefiniowanych regionach. Uruchom oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej. Przeciągnij pliki eksperymentu cytometrii przepływowej do sekcji Wszystkie próbki interfejsu. Kliknij dwukrotnie próbkę kontrolną izotypu, aby otworzyć dwuwymiarowy wykres punktowy. Wybierz FSCA dla osi X i SSCA dla osi Y, a następnie kliknij przycisk prostokątnej bramki i użyj go, aby wybrać obszar z wyłączeniem zanieczyszczeń komórkowych. Kliknij dwukrotnie obszar bramkowany, aby otworzyć nowy wykres histogramu. Następnie wybierz FITC dla osi X i histogram dla osi Y. Kliknij przycisk bramki regionu, aby zdefiniować próg między ujemnymi i dodatnimi sygnałami fluorescencyjnymi. Dla każdego z czterech przeciwciał fluorescencyjnych określić próg między sygnałami ujemnymi i dodatnimi, używając próbki kontrolnej izotypu. Sekwencyjnie zmieniaj fluorochrom osi X na PE-APC i APC-Cy7, zachowując histogram osi Y. Użyj narzędzia bramki regionu w każdym histogramie, aby sfinalizować bramki do rozróżniania ujemnych i dodatnich sygnałów fluorescencyjnych dla czterech przeciwciał. Następnie kliknij dwukrotnie próbkę eksperymentalną, aby otworzyć wykres kropkowy. Wybierz FSCA dla osi X i SSCA dla osi Y, kliknij przycisk prostokątnej bramy, aby przebramować populację po usunięciu gruzu. Kliknij dwukrotnie region bramkowany, aby otworzyć nowy wykres punktowy. Wybierz CD11b PE dla osi X i SSCA dla osi Y. Kliknij przycisk bramki prostokątnej i użyj progu PE z kontrolki isotype, aby zdefiniować bramkę dodatnią CD11b. Teraz kliknij dwukrotnie region dodatni CD11b, aby otworzyć kolejny wykres punktowy, wybierz CD68 FITC dla osi X i CCR7 APC-Cy7 dla osi Y. Kliknij przycisk krzyża i użyj progów FITC i APC-Cy7 pochodzących od izotypu, aby skategoryzować komórki na typy podobne do M1 i M2. Odsetek komórek CD45 o wysokim CD11b-dodatnim CD68-dodatnim CCR7 był znacznie zwiększony w grupie nośnej z uszkodzeniem rdzenia kręgowego lub SCI w porównaniu z grupą pozorowaną, a leczenie CRID3 nie zmieniło tego poziomu. Odsetek komórek CCR7-dodatnich CD45-ujemnych i nisko CD11b-dodatnich CD68-dodatnich był znacznie wyższy w grupie nośnika SCI w porównaniu z pozorami i był znacznie zmniejszony po leczeniu CRID3. Proporcje CD11b-dodatnich CD68-dodatnich komórek CCR7-dodatnich były znacznie zwiększone w grupie nośnika SCI w porównaniu z pozorowanym i znacznie zmniejszyły się po leczeniu CRID3. CD11b-dodatnie, CD68-dodatnie, CCR7-ujemne i CD45-ujemne, niskie CD11b-dodatnie, CD68-dodatnie proporcje komórek CCR7-ujemnych były znacznie zmniejszone w obu grupach nośników SCI w porównaniu z pozorowanymi i zwiększone po leczeniu CRID3.